CN1906173A - 蛋白修饰物生成抑制剂 - Google Patents

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Abstract

(课题)提供蛋白修饰物生成抑制剂，其能够抑制作为副作用的维生素B6缺乏症，尤其是提供肾保护剂。(解决手段)使用作为活性成分的游离形式或盐形式的式(I)化合物或式(II)化合物[其中R1是取代或未取代的芳环基；R2、R3和R4分别为氢原子或1价有机基团，或者R2和R3两者一起形成稠环或R3和R4两者一起代表2价有机基团，条件是R3和R4不同时为氢原子]。

Description

蛋白修饰物生成抑制剂
技术领域
本发明涉及蛋白修饰物生成抑制剂，尤其涉及抑制蛋白修饰物如糖化最终产物(advanced glycation end products；下文中称为AGEs)和脂质过氧化最终产物(advanced lipoxidation end products；下文中称为ALEs)产生的药物，其中所述蛋白修饰物通过与羰基化合物在非酶促条件下反应形成。
发明背景
糖化反应是指由肽或蛋白质等的氨基部分与还原糖等的羰基部分之间的非酶促反应开始的链反应(美拉德反应；参见非专利文献1)，并且大致可分为初期阶段和后期阶段。初期阶段包括依赖于糖浓度和反应时间的可逆反应，其中氨基部分与羰基部分非酶促反应形成席夫碱，然后通过阿马道里重排形成阿马道里化合物。
在后期阶段，初期阶段形成的阿马道里化合物不可逆地受到脱水、缩合、环化、氧化、片段化、聚合、重排等而产生最终称为“AGEs”的蛋白修饰物。通过糖的自动氧化等，可产生高反应性的二羰基化合物如3-脱氧葡糖醛酮(下文中称为“3-DG”)、乙二醛(下文中称为“GO”)和甲基乙二醛(下文中称为“MGO”)，它们可进一步与蛋白质反应，在许多情况下产生蛋白质的赖氨酸残基或精氨酸残基等被修饰的AGEs。
在氧化应激时，体内丰富存在的糖、脂类、氨基酸等被氧化为高反应性的羰基化合物。所产生的GO、MGO、阿拉伯糖、乙醇醛等化合物成为AGEs的前体物质。抗坏血酸氧化所形成的脱氢抗坏血酸也成为AGEs的前体物质。这些前体物质均具有羰基，其非酶促地与蛋白质的氨基部分反应以产生席夫碱，然后形成AGEs(参见非专利文献2)。
在氧化应激下，也进行脂质过氧化，并形成了多种羰基化合物如丙二醛(malondialdehyde)、羟基壬烯醛和丙烯醛(参见非专利文献3)。这些羰基化合物与蛋白质的氨基部分等反应，形成称为ALEs的蛋白修饰物，如丙二醛修饰的赖氨酸和羟基壬烯醛修饰物(参见非专利文献2)。
此外，通过氧化氨基酸如丝氨酸和苏氨酸形成羰基化合物如丙烯醛和GO，形成蛋白修饰物(参见非专利文献4)。大量的羰基化合物通过氧化途径形成，但一些羰基化合物如3-DG通过非氧化途径形成。
作为产生AGEs的已知途径，存在(i)由席夫碱或阿马道里化合物经由3-DG的AGEs途径，(ii)氧化席夫碱为羟基乙醛烷基亚胺，然后将后者经由氧代胺转化为AGEs的途径，(iii)将氧代胺经由乙二醛单烷基亚胺转化为AGEs的途径，(iv)将阿马道里化合物经由2，3-烯二醇转化为中间体MGO，然后将该MGO转化为AGEs的途径，以及(v)其他途径。
近来揭示作为一种AGEs的羧甲基赖氨酸产生自GO，其中所述GO由不饱和脂肪酸的脂氧化形成。因此认为糖化反应/氧化反应和脂氧化反应在共同的基础上进行。
由上可见，从糖、脂类、氨基酸和抗坏血酸通过氧化或非氧化途径产生的羰基化合物对蛋白质非酶促地修饰，并最终产生蛋白修饰物如AGEs和ALEs。特别地，将由多个反应途径形成的羰基化合物使蛋白修饰反应处于提高的状态称为过量羰基所致的蛋白修饰，即“羰基应激”。
已知的AGEs包括戊苷糖(pentosidine)(参见非专利文献5)、交联体(crossline)(参见非专利文献6)、X1(fluorolink)、焦吡啶(参见非专利文献7)、pyrarine(参见非专利文献8)、羧甲基赖氨酸(参见非专利文献9)、咪唑啉酮化合物(参见非专利文献10)、羧乙基赖氨酸(参见非专利文献11)、MGO二聚体(参见非专利文献12)、GO二聚体(参见非专利文献13)、咪唑并赖氨酸(参见非专利文献14)、精氨基嘧啶(argupyrimidine)(参见非专利文献15)等。
现在已克隆的AGEs受体包括RAGE(参见非专利文献16)、巨噬细胞清道夫受体A类(参见非专利文献17)、半乳凝素3(参见非专利文献18)、OST-48和80K-H(参见非专利文献17)等。
已报道在血管组织中，RAGE(属于免疫球蛋白超家族的一种细胞膜透过型蛋白)与AGE结合，由此细胞内产生的活性氧活化p21ras/MAPK途径(参见非专利文献19)，从而诱导转录因子NF-κB的活化，导致血管损伤相关因子如VCAM-1的表达(参见非专利文献20)。也已报道AGEs通过RAGE调节微小血管的内皮细胞增殖，并抑制对维持稳态具有重要作用的外膜细胞的增殖，从而发挥毒性作用(参见非专利文献21)。
此外，已报道AGEs通过RAGE直接作用于微小血管的内皮细胞而促进血管生成并抑制PGI2产生，导致血栓倾向(参见非专利文献22)。另外，作为AGEs和ALEs的生理学活性，已报道了促进系膜细胞的基质产生、促进单核细胞游走能力、自巨噬细胞释放炎性因子、促进滑膜细胞产生胶原酶、活化破骨细胞、增殖血管平滑肌、促进血小板凝集、NO活性和抑制平滑肌松弛(参见非专利文献23)。
与AGEs相关的疾病包括(i)作为糖尿病并发症的肾病(参见非专利文献24)、神经病(参见非专利文献25)、网膜病(参见非专利文献21)和白内障，(ii)动脉硬化(参见非专利文献26)，(iii)作为透析并发症的透析演粉状蛋白病(参见非专利文献27)和腹膜透析患者的腹膜硬化症，(iv)作为中枢神经疾病的阿尔茨海默氏症(参见非专利文献28)、皮克病和帕金森氏症，(v)类风湿性关节炎(参见非专利文献29)，(vi)日光弹性纤维症，(vii)老化，(viii)肾功能衰竭(参见非专利文献30)等。此外，已报道在糖尿病时，AGEs抑制血管内皮细胞来源的血管扩张(参见非专利文献31)，以及促进肾硬化(参见非专利文献32)。
由上可见，蛋白修饰物如AGEs对生物体直接或通过受体产生不利影响。
另外，已知随着肾功能的降低，AGEs的血液浓度上升。肾功能的降低导致分子量不超过5kDa的羰基化合物的体内积聚。在为戊苷糖或pyrarine的情况下，它们可以游离型存在，但大部分以与血清白蛋白等的结合形式存在(参见非专利文献33)。此外，已报道戊苷糖的血液水平受肾小球滤过功能的影响很大(参见非专利文献34)。
这样，在健康时大部分的AGEs自肾脏清除，并维持低的血液浓度。但是，当肾功能降低时，它们作为尿毒症毒素产生慢性生物学活性。
透析治疗可去除游离型的AGEs，但几乎不去除与蛋白质呈结合形式或分子内桥形式的AGEs(参见非专利文献35)。因此，随着肾功能衰竭的进展，在生物体内蛋白修饰物的蓄积增加。而且，除了在生物体内糖反应的基本过程产生的AGEs外，自食物提供的游离型AGEs以及自在生物体内已形成的阿马道里化合物等产生的高活性中间体如3-DG、GO和MGO接下来与蛋白质反应，促进AGEs的产生。而且，由于血液与透析膜接触，导致例如补体和白细胞等的活化，产生自由基。因此，透析治疗本身促进氧化，并为AGEs产生的原因之一。
因此，在透析疗法中重要的是在透析的早期阶段去除游离型物质并尽量控制结合型AGEs的产生。如上所述，因为透析疗法难于去除结合型AGEs，对于透析疗法而言研发抑制蛋白修饰物形成的药物是高度需求的。
另外，据认为不仅肾功能降低而且伴随肾功能衰竭的抗氧化保护机制的降低与蛋白修饰物的积聚相关。在肾功能衰竭患者中，已提出称为血中相对还原型谷胱甘肽的氧化型谷胱甘肽上升(参见非专利文献36)、谷胱甘肽依赖的酶活性降低、在保存期肾功能衰竭血浆中谷胱甘肽过氧化物酶的降低(参见非专利文献37)、血中谷胱甘肽的降低(参见非专利文献38)和针对血浆中硒浓度的降低血浆超氧化物歧化酶活性的增加(参见非专利文献39)的此类抗氧化能力的失衡(参见非专利文献40)。
另外，据报道在患有慢性肾功能衰竭的患者中，在血液和组织中通常明显积聚有大量高反应性羰基化合物和AGEs，而与高血糖的有无无关(参见非专利文献41)。在肾功能衰竭时，通过非酶促化学反应使羰基化合物处于高负荷状态(羰基应激)，从而导致蛋白修饰物增加的疾病。据认为是由于来自糖和脂类的羰基化合物对所产生的蛋白质进行修饰所致(参见非专利文献42)。
因此，抑制由于种种原因引起蛋白质修饰物的产生可减轻组织损伤、并预防或治疗与蛋白修饰物如AGEs相关的疾病。
对慢性肾功能衰竭患者的透析包括血液透析和腹膜透析。在腹膜透析时，血中的废物通过腹膜排泄入腹膜透析液中。高渗透压的腹膜透析液(其含有葡萄糖、icodextrin、氨基酸等)可以将肾功能衰竭患者血液中积聚的高反应性羰基化合物(例如随着肾功能衰竭患者血液中的氧化应激而积聚的来自碳水化合物的羰基化合物(如阿拉伯糖、GO、MGO、3-DG)、来自抗坏血酸的羰基化合物(如脱氢抗坏血酸)和来自脂类的羰基化合物(如羟基壬烯醛，丙二醛，丙烯醛)通过腹膜集中至腹腔内的腹膜透析液中。
另外，已知高反应性羰基化合物(如3-DG、5羟甲基呋喃亚甲基、甲醛、乙醛、GO、MGO、乙酰丙酸、呋喃亚甲基、阿拉伯糖)在腹膜透析液的灭菌或保存中可在腹膜透析液中产生(参见非专利文献43)。
因此，在腹膜透析液中上述羰基化合物的浓度增加，并且蛋白修饰物的形成增强。结果认为它们参与了腹膜功能降低，并因此降低了除水能力和向腹膜硬化症的发展(参见非专利文献44)。
事实上，对内皮和间皮的免疫组织学研究表明在腹膜透析患者中，所导入的葡萄糖使腹腔内为羰基应激状态(参见非专利文献45)。
由此，推测在透析患者中通过羰基化合物产生的蛋白修饰物引起了腹膜的形态学改变和功能(除水功能)的降低。
将以上事实和多种疾病如肾功能衰竭相结合进行考虑，据认为羰基化合物的积聚为增强AGEs产生的原因之一(参见非专利文献46)。因此，认为抑制AGEs产生为治疗与AGEs相关疾病的一种有效方法。
代表性的AGEs产生抑制剂为氨基胍，认为其是通过与自葡萄糖、席夫碱或阿马道里化合物产生的二羰基化合物如3-DG反应形成噻唑啉而抑制AGEs产生。使用糖尿病动物模型的分析证实所述化合物可有效延迟糖尿病性肾病(参见非专利文献47)、网膜症(参见非专利文献48)和白内障(参见非专利文献49)的进展。
其它实例有吡哆胺衍生物(如pyridorine)。在为OPB-9195(即(±)2-异丙叉腙-4-氧代-噻唑烷-5-基-N-乙酰苯胺)时，阱部分的氮原子与羰基反应形成稳定的结构，通过捕捉游离的或与蛋白质结合的活性羰基(参见非专利文献50)而体外抑制AGEs和ALEs的产生。由于双胍类化合物如甲福明(metformin)或丁双胍(buformin)也可捕捉羰基化合物(参见非专利文献51)，它们也可用作AGEs形成抑制剂。而且，也建议使用能够切断作为AGEs特征性桥的一类AGEs抑制剂和能够降解阿马道里化合物的酶(即阿马道里酶)。
也研究了通过去除羰基化合物而防止AGEs和/或ALEs形成的可能性。有几种酶和酶促途径用于去除羰基化合物，其中例如羟醛还原酶、醛脱氢酶和乙二醛酶途径(参见非专利文献52)。氧化还原型辅酶如还原型谷胱甘肽(GSH)和NAD(P)H为这些途径的活性重要的因素。
降低这些去除途径同时导致多种羰基化合物的增加。羰基化合物如MGO和GO与GSH的巯基反应，结果通过一种酶即乙二醛酶代谢。NAD(P)H活化谷胱甘肽还原酶并提高GSH水平。即，认为由于细胞内氧化还原机制的不平衡降低了GSH或NAD(P)H，从而抑制了羰基化合物的除去体系，这导致AGEs和ALEs的蓄积。对于糖尿病，暗示通过高血糖活化多元醇途径、降低NAD(P)H和GSH，结果降低了羰基化合物的除去系统。
如果GSH和NAD(P)H等的巯基浓度的降低减少了羰基化合物的去除，并因此导致上述AGEs或ALEs形成，这可能是因为巯基水平的上升可减少羰基化合物。为此提出了可用GSH、半胱氨酸、乙酰半胱氨酸等补充巯基，用维生素E、泛醌醇等降低对GSH的需要，以及用醛糖还原酶抑制剂抑制多元醇系统。也提出了通过使用氨基胍、吡哆胺、阱、双胍化合物或含SH化合物捕获羰基化合物(参见专利文献1)。
如以上所详述，抑制AGEs和ALEs形成是预防和治疗与它们相关的疾病的方法。
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发明概述
发明欲解决的课题
基于上述发现，发明人进行了进一步的研究，以提供用于预防和治疗与通过和羰基化合物在非酶促条件下反应生成蛋白修饰物(即AGEs和/或ALEs)相关的疾病。结果，发明人发现3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮及其可药用盐可有效抑制蛋白修饰物如AGEs、ALEs等形成，并且基于此发现，完成了包含作为活性成分的所述化合物的蛋白修饰物生成抑制剂的发明(日本专利申请号2003-076955)。
本发明人进行了进一步研究，发现将上述3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮的1位苯基和3位甲基转化为其它取代基的类似物也呈现出相似的活性，并且将所述3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其类似物施与生物体时引起维生素B6缺乏症。为解决此问题进行了进一步的研究。结果，本发明人发现此种维生素B6缺乏症是由于在血液中的维生素B6分子被3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其类似物的基本骨架2-吡唑啉-5-酮环捕捉所致。还发现此种捕捉是由于所述2-吡唑啉-5-酮环的4位亚甲基与维生素B6分子的结合所致。
用于解决课题的手段
基于上述事实完成了本发明，其目的是抑制维生素B6缺乏症，其中所述维生素B6缺乏症是与有用的蛋白修饰物生成抑制剂3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其类似物有关的不可避免的副作用。该目的通过本发明实现，即在4位亚甲基部分导入抑制维生素B6分子结合至3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其类似物的取代基。
但是，导入4位亚甲基的取代基根据其种类不必总是稳定存在的。例如当欲将吡哆醛残基导入4位亚甲基时，使3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与吡哆醛反应，实际获得的并非是4-(3羟基-5羟甲基-2-甲基吡啶-4-基-亚甲基)-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，而是1-(5羟基-3-甲基-1-苯基-1H-4-基)-6-甲基-1，3-二氢呋喃并[3，4-c]吡啶-7-醇。
认为这是如下式所示，一旦前者形成，其后发生分子内重排以形成后者：
Figure A20048004106500171
根据以前的研究，为了防止结合维生素B6分子而在4位亚甲基导入取代基的化合物不管是否为如上所述的分子内重排所致，通常发挥对蛋白修饰物形成的抑制作用。
用于实施发明的最佳方案
即，本发明提供了包含作为活性成分的这样的化合物的蛋白修饰物生成抑制剂，所述化合物具有蛋白修饰物生成的抑制作用，并抑制作为副作用的维生素B6缺乏症。本发明的技术范围具体地包含以下的技术实施方案：
(i)包含作为活性成分的这样的化合物或其分子内重排物的蛋白修饰物生成抑制剂，所述化合物为在其游离形式或盐形式的1-取代或未取代的-3-取代或未取代的-2-吡唑啉-5-酮的4位导入了防止结合维生素B6分子(包含衍生自维生素B6分子的分子)的取代基；
(ii)根据(i)的蛋白修饰物生成抑制剂，其中作为活性成分的化合物选自游离形式或盐形式的式(I)化合物：
或式(II)化合物
[其中R1是取代或未取代的芳环基；R2、R3和R4分别为氢原子或1价有机基团，或者R2和R3两者一起形成稠环或R3和R4两者一起代表2价有机基团，条件是R3和R4不同时为氢原子]。
(iii)根据(ii)的蛋白修饰物生成抑制剂，其中R1所表示的芳环基为具有不超过20个环构成原子的碳环或杂环的芳环基，任选地包含不超过4个杂原子且任选地具有不超过3个取代基。
(iV)根据(ii)或(iii)的蛋白修饰物生成抑制剂，其中R2、R3或R4代表的1价有机基团分别独立地为具有不超过30个碳原子的直链或环状脂肪族、脂环式或芳族烃基，任选地具有不超过3个取代基，或者为卤素、硝基、氨基、羟基、巯基、羧基、羧基(低级)烷基、低级烷氧基羰基、甲酰基、低级烷酰基、低级烷基氨基、二(低级)烷基氨基、低级烷酰基氨基、芳基(低级)烷酰基、芳氧基氨基、磺酸基或3至7元杂环基，任选地具有取代基；
(v)根据(ii)或(iii)的蛋白修饰物生成抑制剂，其中R2和R3两者一起形成稠环，其为5或6元饱和碳环，任选地具有取代基；
(vi)根据(ii)或(iii)的蛋白修饰物生成抑制剂，其中R3和R4两者一起形成2价有机基团，其选自苯基亚甲基、苯基链烯基亚甲基、喹啉基亚甲基、呋喃基亚甲基、二唑基亚甲基、氨基亚甲基、二(低级)烷基氨基亚甲基、吡啶基亚甲基和噻吩基亚甲基，任选地具有取代基；
(vii)根据(iii)至(vi)中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂，其中取代基选自低级烷基、低级链烯基、低级烷氧基、低级链烯基氧基、低级烷酰基、卤代(低级)烷基、羧基、低级烷氧基羰基、羧基(低级)烷基、卤素、硝基、氨基、低级烷基氨基、二(低级)烷基氨基、低级烷酰基氨基、羟基、巯基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、芳基(低级)烷酰基、芳氧基氨基、芳基、芳基(低级)烷基、环(低级)烷基、环(低级)链烯基、环(低级)烷基(低级)烷基和3至7元杂环基；
(viii)根据(ii)的蛋白修饰物生成抑制剂，式(I)中R1是苯基，R2是甲基，R3和R4两者一起形成3-羟基-5-羟甲基-2-甲基吡啶-4-基-亚甲基；
(ix)根据(ii)的蛋白修饰物生成抑制剂，式(II)中R1是苯基，R2是甲基，R3是6-甲基-1，3-二氢呋喃并-[3，4-c]-吡啶-7-醇基；
(x)根据(i)至(ix)中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂，其中蛋白修饰物选自AGEs、ALEs及它们的组合；
(xi)根据(x)的蛋白修饰物生成抑制剂，其中蛋白修饰物为AGEs；
(xii)根据(xi)的蛋白修饰物生成抑制剂，其中AGEs为戊苷糖；
(xiii)肾组织保护剂，其包含根据(i)至(xii)中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂；
(xiv)腹膜透析液，其包含根据(i)至(xii)中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂；
(xv)血液透析液，其包含根据(i)至(xii)中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂；
(xvi)降低液体样品中羰基化合物含有量的方法，其包括将根据(i)至(xii)中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂与液体样品接触；
(xvii)抑制在患者血液或腹膜透析液中蛋白修饰物生成的方法，其包括将根据(i)至(xii)中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂与所述血液或腹膜透析液接触；
(xviii)用于抑制由蛋白修饰物生成抑制剂引起的维生素B6缺乏症的方法，其包括将作为蛋白修饰物生成抑制剂的有用的游离形式或盐形式的1-取代或未取代的-3-取代或未取代的-2-吡唑啉-5-酮的4位导入防碍结合维生素B6分子(包含衍生自维生素B6分子的分子)的取代基；
(xix)根据(xviii)的方法，其中1-取代或未取代的-3-取代或未取代的-2-吡唑啉-5-酮是下式：
[其中R1为氢原子或取代或未取代的芳环基；且R2为氢原子或1价有机基团]；
(xx)根据(xvi)的方法，其中在4位导入的防止结合维生素B6分子的取代基选自有机基团；
(xxi)化合物或其分子内重排物，所述化合物为在其游离形式或盐形式的1-取代或未取代的-3-取代或未取代的-2-吡唑啉-5-酮的4位导入了防止结合维生素B6分子(包含衍生自维生素B6分子的分子)的取代基；
(xxii)游离或盐形式的式(I)化合物：
Figure A20048004106500202
或式(II)化合物
[其中R1是取代或未取代的芳环基；R2、R3和R4分别为氢原子或1价有机基团，或者R2和R3两者一起形成稠环或R3和R4两者一起代表2价有机基团，条件是R3和R4不同时为氢原子]；
(xxiii)根据(xxii)的化合物，其中式(I)中R1是苯基，R2是甲基，R3和R4两者一起形成3-羟基-5-羟甲基-2-甲基吡啶-4-基-亚甲基；
(xxiv)根据(xxii)的化合物，其中式(II)中R1是苯基，R2是甲基，R3是6-甲基-1，3-二氢呋喃并-[3，4-c]-吡啶-7-醇基；
(xxv)根据(xxi)至(xxiv)中任意一项所述的化合物的用途，用于制备蛋白修饰物生成抑制剂；
(xxvi)治疗由蛋白修饰物生成而介导的疾病的方法，其包括将治疗有效量的根据(xxi)至(xxiv)中任意一项所述的化合物施与需要此种治疗的受试者。
术语″蛋白修饰物″是指在非酶促条件下通过与羰基化合物反应而产生的蛋白修饰物(如AGEs、ALEs等)，除非特意声明均包含AGEs和ALEs。因此蛋白修饰物可以是AGEs或ALEs，或它们的组合。AGEs的实例是戊苷糖、交联体、X1(fluorolink)、焦吡啶、pyrarine、羧基甲基-赖氨酸、咪唑啉酮化合物、羧乙基-赖氨酸、MGO二聚体、GO二聚体、咪唑并赖氨酸和精氨基嘧啶。ALEs的实例是丙二醛赖氨酸、羟基壬烯醛修饰物等。
术语“羰基化合物”是指具有引起蛋白修饰的羰基的化合物，不管其是来自生物体或非生物体，其包含二羰基化合物。羰基化合物的实例包括阿拉伯糖、GO、MGO、3-DG、羟基乙醛、脱氢抗坏血酸、羟基壬烯醛、丙二醛、丙烯醛、5羟基-甲基呋喃亚甲基、甲醛、乙酰丙酸、呋喃亚甲基等。
术语“维生素B6缺乏症”是指几种由于缺乏维生素B6而引起的疾病，包括口角炎、口内炎、舌炎、口唇炎、急性和慢性湿疹、接触性皮炎、末梢神经炎、贫血、淋巴细胞减少症、神经病等。“维生素B6分子”包含吡哆素、吡哆醛、吡哆胺及它们的磷酸酯。
作为“蛋白修饰物生成抑制剂”的活性成分的这样的化合物或其分子内重排物不管是直接体内、间接体内和/或体外，均可最终抑制蛋白修饰物生成，其中所述化合物为在其游离形式或盐形式的1-取代或未取代的-3-取代或未取代的-2-吡唑啉-5-酮的4位导入了防止结合维生素B6分子(包含衍生自维生素B6分子的分子)的取代基。术语“最终抑制”可以是通过捕获羰基化合物的作用，也可以是通过抑制生成蛋白修饰物的反应，从而最终抑制蛋白修饰物的生成，对其作用机制没有限制。此外，术语″抑制剂″或″保护剂″包括预防和/或治疗用药物。
根据本发明的蛋白修饰物生成抑制剂的活性成分是式(I)或式(II)的化合物。
在式(I)和(II)中，R1代表氢原子或未取代的或取代的芳环(包括杂环)基。″芳环基″包含具有不超过20个的环构成原子(其中可存在杂原子如氧原子、硫原子或氮原子，并且它们的数不超过4个)，特别地优选具有6至10个环构成碳原子的芳基(如苯基或萘基)。
取代基可选自一个或多个的例如低级烷基、低级链烯基、低级烷氧基、低级链烯氧基、低级烷酰基、卤代(低级)烷基、羧基、低级烷氧基羰基、羧基(低级)烷基、卤素(如氯、溴、碘、氟)、硝基、氨基、低级烷基氨基、二(低级)烷基氨基、低级烷酰基氨基、羟基、巯基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、芳基(低级)烷酰基、芳氧基氨基、芳基、芳基(低级)烷基、环(低级)烷基、环(低级)链烯基、环(低级)烷基(低级)烷基、3-至7-元杂环(如二唑基、噻二唑基)。对取代基的数量没有限制，但通常不超过3个。
取代或未取代的芳环基R1包括以下实例：苯基、萘基、邻-、间-或对-低级烷基苯基(如邻-甲基苯基、对-甲基苯基、对-乙基苯基)、邻-、间-或对-低级烷氧基苯基(如邻-、间-或对-甲氧基苯基，邻-，间-或对-乙氧基苯基)、邻-、间-或对-氨基苯基、邻-、间-或对-硝基苯基、邻-、间-或对-卤代苯基(如邻-、间-或对-氯苯基，邻-、间-或对-氟苯基)、邻-、间-或对-卤代(低级)烷基苯基(如邻-、间-或对-三氟甲基苯基)、邻-、间-或对-氨磺酰苯基、邻-、间-或对-羧基苯基、邻-、间-或对-低级烷氧基羰基苯基(如邻-、间-或对-甲氧基羰基苯基，邻-、间-或对-乙氧基羰基苯基，邻-、间-或对-异丙氧基羰基苯基)、邻-、间-或对-低级烷酰基苯基(如邻-、间-或对-乙酰苯基)、二(低级)烷基苯基(如3，4-二甲基苯基)、二羟基苯基(如2，4-二羟基苯基)、2-氨基-4-羧基苯基、3-氨基-5-羧基苯基、3-低级烷氧基-4羟基苯基(如3-甲氧基-4羟基苯基)、3-羧基-4-卤代苯基(如3-羧基-4-氯苯基)。
每一R2、R3和R4独立地代表氢原子或1价有机基团。术语″1价有机基团″是指取代或未取代的烃基、卤基、硝基、氨基、羟基、巯基、羧基、羧基(低级)烷基、低级烷氧基羰基、甲酰基、低级烷酰基、低级烷基氨基、二(低级)烷基氨基、低级烷酰基氨基、芳基(低级)烷酰基、芳氧基氨基、磺基和3-至7-元杂环基。术语″烃基″是指包含不超过30个，优选地不超过8个碳原子的直链或环状脂肪族、脂环式或芳族烃基。特别地，例如烷基、链烯基、炔基、环烷基、环链烯基和芳基。术语″3-至7-元杂环基″包含作为环构成原子的不超过3个杂原子的杂环基。例如，包括吡咯烷、哌啶子基、吗啉基和硫代吗啉基。取代基的种类和数量如在R1中定义的。条件是，R3和R4不同时为氢原子。
另外，R2和R3两者一起形成稠环。在所述稠环中，优选5-或6-元饱和的碳环(即R2+R3＝三亚甲基或四亚甲基)，任选地具有取代基。另外，R3和R4两者一起形成2价有机基团。在所述2价有机基团中包括例如亚甲基类和螺类。在亚甲基类中包括例如苯基亚甲基，苯基链烯基亚甲基，喹啉基亚甲基，呋喃基亚甲基，二唑基亚甲基，氨基亚甲基，二(低级)烷基氨基-亚甲基，吡啶基亚甲基和噻吩基亚甲基，任选地具有取代基。在此类稠环或2价有机基团中取代基的种类和数量如在R1中所定义的。
在谈及烷基、烷氧基、烷酰基等时使用的术语″低级″文中是指最多包含8个碳原子，优选地最多包含5个碳原子的基团。
本发明的化合物(I)或(II)的例子如下：
1.2-(3-氨基-5-氧代-1-苯基-4，5-氢-1H-吡唑-4-基)-2-氧代-N-苯基-乙酰胺；
2.2-(3-氨基-5-氧代-1-苯基-4，5-氢-1H-吡唑-4-基)-2-氧代-N-噻唑-2-基-乙酰胺；
3.2-(3-氨基-5-氧代-1-苯基-4，5-氢-1H-吡唑-4-基)-2-氧代-乙酰胺；
4.2-(3-氨基-5-氧代-1-苯基-4，5-氢-1H-吡唑-4-基)-N-(3，4-二甲基-苯基)-4-氧代-丁酰胺；
5.2-(4-氨基-苯基)-4-(2羟基-乙基)-5-甲基-2，4-氢-吡唑-3-酮；
6.5-氨基-2-苯基-4-(1-苯基-1H-四唑-5-基-硫烷基)-2，4-二氢吡唑-3-酮；
7.3-(3-甲基-5-氧代-1-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-4-基)-丙酸；
8.N-(3-甲基-5-氧代-1-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-4-基)-乙酰胺；
9.4-[(5羟基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)-苯基-甲基]-5-甲基-2-苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
10.2-苯基-3a，4，5，6-四氢-2H-环戊并吡唑-3-酮；
11.4-甲基-N-(3-甲基-5-氧代-1-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-4-基)-苯磺酰胺；
12.N-(3-甲基-5-氧代-1-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-4-基)-乙酰胺；
13.5-甲基-2-(3-硝基-苯基)-4-(1-苯基-1H-四唑-5-基-硫烷基)-2，4-二氢吡唑-3-酮；
14.N-[5-氧代-1-苯基-4-(1-苯基-1H-四唑-5-基-硫烷基)-4，5-二氢-1H-吡唑-3-基]-苯甲酰胺；
15.4-(羟基-苯基-甲基)-2-苯基-5-三氟甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
16.4-(1羟基亚氨基-乙基)-2，5-二苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
17.5，5’-二甲基-2，2’-二苯基-2，4，2’，4’-四氢-[4，4’]-二吡唑-3，3’-二酮；
18.2-(4-氯苯基)-4-乙基-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
19.4-[4-(4-甲氧基-苯基)-噻唑-2-基-硫烷基]-5-甲基-2-苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
20.4-(2-氧代-2-苯基-乙基)-2-苯基-5-丙基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
21.5-甲基-2-苯基-4-(4-对甲苯-噻唑-2-基-硫烷基)-2，4-二氢吡唑-3-酮；
22.2-(4-氟苯基)-4-[[1-(4-氟苯基)-5羟基-3-甲基-1H-吡唑-4-基]-(2羟基-苯基)-甲基]-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
23.N-(3，4-二甲基-苯基)-2-(3-甲基-5-氧代-1-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-4-基)-2-氧代-乙酰胺；
24.5-(4-氯-苯甲酰基)-4，4-二羟基-2-苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
25.4羟基-3-甲基-5-氧代-1-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-4-磺酸钠；
26.5-甲基-4，4-二吗啉-4-基-2-苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
27.3-苯甲酰基氨基-4羟基-5-氧代-1-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-4-磺酸钠；
28.3-甲基-1-苯基-5-氧代-4-螺-(3-氧代-2，3-二氢-苯并[b]噻吩-2-基)-4，5-二氢-1H-吡唑；
29.4，4，5-三甲基-2-苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
30.4，10-二甲基-2，8，11-三苯基-2，3，8，9-四氮-二螺[4.0.4.1]十一碳-3，9-二烯-1，7-二酮；
31.2-(2-氯-苯基)-4-(3-乙氧基-4羟基-苄叉)-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
32.2-(2-氯-苯基)-4-(4-二甲基氨基-苄叉)-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
33.5-甲基-4-(3-苯基-亚2-丙烯基)-2-(3-三氟甲基-苯基)-2，4-二氢吡唑-3-酮；
34.3-{5-[3-甲基-5-氧代-1-(4-氨磺酰-苯基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基甲基]-呋喃-2-基}-苯甲酸；
35.4-(4-二甲基氨基-苄叉)-2-(3-氟苯基)-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
36.3-{4-[4-(3-氯-4，5-二氢吡唑-1-基)-苄叉]-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡唑-1-基}-苯甲酸；
37.3-[4-(2羟基-苄叉)-5-氧代-3-苯基-4，5-二氢吡唑-1-基]-苯甲酸；
38.3-[1-(3-氯-苯基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基甲基]-1H-喹啉-2-酮；
39.3-{5-[3-甲基-5-氧代-1-(4-氨磺酰-苯基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基甲基]-呋喃-2-基}-苯甲酸甲酯；
40.4-(4-苯并[1，3]二氧代-5-亚基甲基-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡唑-1-基)-苯甲酸甲酯；
41.4-{3-甲基-5-氧代-4-[5-(4-氨磺酰-苯基)-呋喃-2-亚基-甲基]-4，5-二氢吡唑-1-基}-苯甲酸甲酯；
42.2-(4-氯-苯基)-4-(2，4-二羟基-苄叉)-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
43.2-(4-氯-苯基)-4-(3羟基-苄叉)-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
44.4-(3，4-二羟基-苄叉)-5-甲基-2-对甲苯酰-2，4-二氢吡唑-3-酮；
45.3-[1-(4-乙酰苯基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-1，3-二氢吲哚-2-酮；
46.2-(4-氟苯基)-4-(5羟基-3-甲基-1-邻甲苯酰-1H-吡唑-4-亚基-甲基)-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
47.2-(4-氯-苯基)-4-(4羟基-3-甲氧基-苄叉)-5-三氟甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
48.2-(4-乙基-苯基)-4-(4羟基-苄叉)-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
49.4-[4-(4羟基-苄叉)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡唑-1-基]-苯磺酰胺；
50.4-(5-氧代-4-噻吩-2-亚基-甲基-3-三氟甲基-4，5-二氢吡唑-1-基)-苯甲酸乙酯；
51.4-[4-(4-二甲基氨基-苄叉)-5-氧代-3-三氟甲基-4，5-二氢吡唑-1-基]-苯磺酰胺；
52.4-异丙叉-5-甲基-2-苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
53.4-(4羟基-苄叉)-2-苯基-5-三氟甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
54.4-(2，4-二羟基-苄叉)-2-(3，4-二甲基-苯基)-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
55.3-[4-(3-乙氧基-4羟基-苄叉)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡唑-1-基]-苯甲酸；
56.4-[4-(3，5-二叔丁基-4羟基-苄叉)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡唑-1-基]-苯甲酸；
57.3-[3-(4羟基-3-甲氧基-苄叉)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡唑-1-基]-苯甲酸；
58.3-[3羟基-4-(4羟基-3-甲氧基-苄叉)-5-氧代-吡唑烷-1-基]-苯甲酸；
59.4-(3羟基-2，4-甲氧基-苄叉)-5-甲基-2-苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
60.4-[4-(4羟基-3-甲氧基-苄叉)-3-甲基-5-氧代-吡唑烷-1-基]-苯甲酸-异丙酯；
61.2-氯-5-[4-(2-氯-4羟基-5-甲氧基-苄叉)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡唑-1-基]-苯甲酸；
62.4-[4-(4羟基-苄叉)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡唑-1-基]-苯甲酸乙酯；
63.4-[4-(4羟基-苄叉)-5-氧代-3-三氟甲基-4，5-二氢吡唑-1-基]-苯甲酸乙酯；
64.4-[4-(4羟基-苄叉)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡唑-1-基]-苯甲酸；
65.4-二甲基氨基亚甲基-5-甲基-2-苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
66.4-(5羟基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-亚基-甲基)-5-甲基-2-苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
67.4-(4-氯-苄叉)-5-甲基-2-苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
68.1-(5羟基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)-6-甲基-1，3-二氢呋喃并[3，4-c]吡啶-7-醇；
69.1-(5羟基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)-6-甲基-1，3-二氢呋喃并[3，4-c]吡啶-7-醇(盐酸盐)；
70.4-(4羟基-苄叉)-5-甲基-2-苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
71.2-(3-氯-苯基)-4-(4羟基-苄叉)-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
72.4-(4-苄氧基-苄叉)-5-甲基-2-苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
73.2-(3-氯-苯基)-5-甲基-2H-吡唑-3，4-二酮4-肟；
74.5-(5-氧代-1，3-二苯基-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-4-苯基-4，5-二氢-[1，3，4]噻唑-2-羧酸乙酯；
75.4-[1，3]二硫戊环-2-亚基-5-甲基-2-苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
76.5-(4-氯-苯基硫烷基甲基)-2-苯基-4-[N’-(3-三氟甲基-苯基)-阱基]-2，4-二氢吡唑-3-酮；
77.4-(5-苯甲酰基-3-苯基-3H-[1，3，4]噻二唑-2-亚基)-2，5-二苯基-2，4-二氢吡唑-3-酮；
78.单-[5羟基-6-甲基-4-(3-甲基-5-氧代-1-苯基-1，5-二氢吡唑-4-亚基甲基)-吡啶-3-基-甲基]磷酸酯。
为了制备本发明的目的化合物(I)，通常将下式的1-取代的或未取代的-3-取代的或未取代的-2-吡唑啉-5-酮(III)根据应导入4位的取代基种类而进行合适的本身已知的化学反应：
[其中R1是氢原子或取代或未取代的芳环；且R2是氢原子或1价有机基团]。
例如，通过将化合物(III)与式R3-CHO(IV)所表示的醛反应形成化合物(I)。化合物(I)可通过分子内重排而获得化合物(II)。反应通常将化合物(III)与醛(IV)在碱性条件下于水性介质中，或者在有机溶剂(如四氢呋喃、二烷)中于有机或无机碱存在下，-20至100℃实施。
起始物质化合物(III)是本身已知的，或可通过任一常规的化学反应制备。例如，3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(在化合物(III)中，R1是苯基且R2是甲基)的通用名为依达拉奉(edaravone)。该化合物具有自由基去除作用，并且已知作为脑功能正常化药物(特公平5-31523号公报)、过氧化脂质生成抑制剂(特公平5-35128号公报)、抗溃疡剂(日本专利第2906512号)、血糖上升抑制剂(日本专利第2906513号)。但是，在日本专利申请2003-076955之前，尚不知道依达拉奉捕捉羰基化合物，改善羰基应激条件，因此有效预防或治疗由于羰基应激引起的多种疾病，即可用作蛋白修饰物生成抑制剂。
如上所述，化合物(I)或(II)为在生物体内显示蛋白修饰物生成抑制作用且不产生作为副作用的维生素B6缺乏症。这可通过以下试验证实：
(A)证实化合物(I)本身显示蛋白修饰物生成抑制作用的试验：
(1)以代表性的AGEs即戊苷糖作为指标，自非糖尿病的肾功能衰竭透析患者采集血浆样本，加入本发明的化合物，一段时间后测定戊苷糖的产生量。
(2)在羟基存在下将苯丙氨酸与羟基反应以形成邻-或间-酪氨酸。接下来，将酪氨酸在过硝酸盐存在下与NO自由基反应以形成硝基酪氨酸。自由基引起使身体的肾脏损害。因此，测定了在苯丙氨酸-自由基反应体系中本发明化合物捕获自由基的能力。
(B)证实化合物(I)不引起维生素B6缺乏症的试验：
(1)向维生素B6溶液中加入本发明的化合物，一段时间后测定维生素B6残存量。
(2)向正常大鼠施与本发明的化合物，一段时间后测定有无维生素B6缺乏症。
含有作为活性成分的化合物(I)或(II)的本发明蛋白修饰物生成抑制剂可用于预防和/或治疗以下疾病：肾功能衰竭、糖尿病合并症(肾病、神经病、网膜症、白内障等)、动脉硬化、作为透析合并症的透析淀粉样变性、腹膜透析患者的腹膜硬化症、中枢神经病的阿耳茨海默症、皮克病和帕金森氏症、类风湿性关节炎、日光弹性纤维症、老化等。该抑制剂尤其用于预防和/或治疗肾病。
本发明的化合物(I)或(II)作为预防剂或治疗剂使用时，可直接使用或经过用水稀释等多种处理而使用，并且可与药物或准药物组合使用。此时的混合量根据疾病和制品，可进行合适的选择，但通常对于全身施与制剂，可为0.001至50重量％的化合物，尤其是0.01至10重量％的化合物。当包含小于0.001重量％时，可能不能达到足够的预防或治疗作用，另外，当包含多于5重量％时，可能会影响制品的稳定性和香味等特性，因此是不优选的。
本发明的化合物(I)或(II)可以游离形式或盐形式包含在制剂中。盐形式包括可药用盐，如与无机碱或有机碱形成的盐、酸加成盐如无机酸、有机酸、碱性或酸性氨基酸加成盐。与无机碱形成的盐包括如碱金属(如钠或钾)盐、碱土金属(如钙、镁)盐、铝盐和氨盐。与有机碱形成的盐包括例如与伯胺(如乙醇胺)、仲胺(如二乙基胺、二乙醇胺、二环己胺、N，N’-二苄基乙烯二胺)、以及叔胺(如三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、三乙醇胺)。
与无机酸形成的盐可例举与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸和磷酸等形成的盐；与有机酸形成的盐可例举与蚁酸、乙酸、乳酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、苯甲酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸。此外，与碱性氨基酸形成的盐可例举与精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸形成的盐，与酸性氨基酸形成的盐可例举与天冬氨酸和谷氨酸形成的盐。
本发明的化合物(I)或(II)根据需要可与已知的药物联合，如与氨基胍、吡哆胺衍生物、OPB-9195、双胍化合物、桥形成抑制剂、降解阿马道里化合物的酶、GSH、半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、维生素E、泛醌醇、醛糖还原酶抑制剂、羰基化合物捕获剂联合以增强蛋白修饰物生成抑制作用的持续性。此外可鉴定失活或分解化合物(I)或(II)的物质，选择抑制所鉴定物质的物质，并将所选择的植物联用或混合，以稳定组合物中的活性成分。
本发明药物的施用方法除了经口施与和静脉内施与外，还可合适地选自经粘膜施与、经皮施与、肌内施与、皮下施与、直肠内施与。根据施与方法，可使用多种制剂。下文中记载了每一制剂，但本发明可用的剂型并不限于此，可使用医药领域中通常使用的多种制剂。
用作蛋白修饰物参与所致疾病的预防剂或治疗剂时，化合物(I)或(II)的经口施用量优选地通常为0.03mg/kg至100mg/kg，更优选地0.1mg/kg至50mg/kg。当全身施用时，尤其是静脉内施用时，根据性别、年龄、体重等有变化，但通常以施用后有效血中浓度为0.2μg/mL至20μg/mL，更优选地0.5μg/mL至10μg/mL。
作为经口施用的剂型，包括粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、片剂、酏剂、悬浮剂、乳剂和糖浆剂，可适宜地选择。另外，作为口腔内局部施用时的剂型，包括咀嚼剂、舌下剂、颊剂(buccals)、锭剂、软膏剂、贴剂和液体剂，可适宜地选择，此外，可对上述制剂进行缓释化、稳定化、易崩解化、难崩解化、肠溶性化、易吸收化等修饰。
对于上述各剂型，可采用任一已知的药物递送体系(DDS)。DDS制剂在文中是指基于施用途径、生物利用度、副作用等而确定的最合适的制剂形式，如缓释制剂、局部施用制剂(如锭剂、颊剂和舌下剂等)、药物控释制剂、肠溶性制剂和胃溶性制剂等。
DDS的构成要素中包含基本性的药物、药物释放组件、包囊体和治疗方案。对于每一构成要素，特别是当药物停止释放时，优选血药浓度快速降低的半衰期短的药物，优选与施与部位的生物体组织无反应的包囊体，进一步地，优选治疗方案在特定期间维持最佳的药物水平。药物释放组件具有基本的药物贮藏库、控释部分、能源和释放孔或释放表面。不必全部具有这些基本的构成要素，可进行合适的添加或去除，从而选择最佳的形式。
作为DDS可使用的材料，可选择高分子、环糊精衍生物和卵磷脂。高分子选自不溶性高分子(如硅氧烷、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、乙烯-乙烯醇共聚物、乙基纤维素和纤维素醋酸酯)、可溶性高分子和羟基凝胶形成高分子(如聚丙烯酰胺、聚羟基乙基甲基丙烯酸酯交联物、聚丙烯酰交联物、聚乙烯醇、聚环氧乙烷、水溶性纤维素衍生物、交联的泊洛沙姆(poloxamer)、甲壳质、脱乙酰壳多糖)、持续可溶性高分子(如乙基纤维素、甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物的部分酯)、胃溶性高分子(如羟基丙基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸二甲基氨基乙基-甲基丙烯酸甲酯共聚物)、肠溶性高分子(如羟基丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸邻苯二甲酸纤维素、羟基丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯、羧甲基乙基纤维素、丙烯酸类聚合物)、生物可降解的高分子(如热凝固或交联白蛋白、交联明胶、胶原蛋白、血纤维蛋白、聚氰基丙烯酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚β羟基乙酸、聚己内酰胺等)，可根据剂型合适地选择。
尤其是，硅氧烷、乙烯-乙酸乙烯共聚物、乙烯乙烯醇共聚物和甲基乙烯醚-无水马来酸共聚物的部分酯可用于药物的释放调控，且纤维素乙酸酯可用作渗透压泵的材料，乙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羟基丙基纤维素和甲基纤维素可用作缓释制剂的膜材料，聚丙烯酰交联体可用作口腔粘膜或眼粘膜的附着剂。
此外，根据剂型的不同(如用于经口施用剂、注射剂、栓剂等)，在制剂中可混合合适的添加剂，如溶剂、赋形剂、包衣剂、基质、结合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、悬浮剂、粘稠剂、乳化剂、稳定剂、缓冲剂、等张剂、润肤剂、防腐剂、矫味剂、芳香剂和/或着色剂。对于此类添加剂，下面列举了具体的例子，但不限于此。
溶剂包括纯化水、注射用水、生理盐水、花生油、乙醇和甘油。赋形剂包括淀粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、结晶纤维素、硫酸钙、碳酸钙、滑石、氧化钛、海藻糖和木糖醇。包衣剂包括蔗糖、明胶、乙酸邻苯二甲酸酯纤维素和上述高分子。基质包括石蜡油、植物油、聚乙烯二醇、水包油型乳剂性基质和油包水型乳剂性基质。
结合剂包括淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、明胶、藻酸钠、黄蓍胶、天然高分子如阿拉伯树胶、合成高分子如聚乙烯吡咯烷酮、糊精和羟丙基淀粉。润滑剂包括硬脂酸及其盐、滑石、蜡、小麦淀粉、聚乙烯二醇、氢化植物油、蔗糖脂肪酸酯和聚乙二醇、崩解剂包括淀粉及其衍生物、琼脂、明胶粉、碳酸氢钠、纤维素及其衍生物、羧甲醚纤维素钙、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素及其盐和交联物、低取代的羟基丙基纤维素。
助溶剂包括环糊精、乙醇、丙二醇和聚乙二醇等。悬浮剂包括阿拉伯树胶、黄蓍胶、藻酸钠、单硬脂酸铝、柠檬酸和多种表面活性剂。粘稠剂包括羧甲醚纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、聚乙烯醇、黄蓍胶、阿拉伯树胶和藻酸钠。乳化剂包括阿拉伯树胶、胆固醇、黄蓍胶、甲基纤维素、多种表面活性剂和卵磷脂。
稳定剂包括亚硫酸氢钠、抗坏血酸、生育酚、螯合剂、惰性气体和还原性物质。缓冲剂包括磷酸氢钠、乙酸钠和硼酸。等张剂包括氯化钠和葡萄糖。润肤剂包括盐酸普鲁卡因、利多卡因和苄基醇。防腐剂包括苯甲酸及其盐、对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、阳离子皂、苄基醇、酚和水杨酸甲酯。矫味剂包括蔗糖、糖、甘草提取物、山梨糖醇、木糖醇和甘油。芳香剂包括云杉气味和玫瑰油。着色剂包括水溶性食用色素和湖色素。
如上所述，通过制备DDS制品如持续释放制品、肠溶性制品或受控的药物释放制品可期待药物的有效血药浓度的持续化、增强的生物利用度等效果。然而，化合物(I)或(II)在生物体内被失活或降解，结果可能会使所需要的效果降低或消失。因此，将抑制失活或降解化合物(I)或(II)的物质的物质与本发明的用于预防或治疗涉及蛋白修饰物的疾病的组合物联合，可进一步持续所述成分的效果。此类物质可在制剂中混合，或可分别施与。本领域技术人员可通过鉴定失活或降解化合物(I)或(II)的物质，选择抑制其的物质，然后混合或一起使用。
在制剂中，可使用除了上述组分外的通常用于组合物中作为添加剂的成分，此类成分的量在不影响本发明效果的范围内选择。
本发明的化合物(I)或(II)也可用于抑制腹膜透析和血液透析中由蛋白修饰物质引起的伤害。即，可将作为蛋白修饰物生成抑制剂的化合物(I)或(II)添加至常规的腹膜透析液或血液透析液中。
本发明的减少液体样本中羰基化合物量的方法包括将所述液体样本与作为蛋白修饰物生成抑制剂的化合物(I)或(II)接触的步骤。
此外，本发明的抑制蛋白修饰物生成的方法包括将来自患者的血液或腹膜透析液与作为蛋白修饰物生成抑制剂的化合物(I)或(II)接触。透析中的蛋白修饰物包括由来自接受腹膜透析或血液透析的患者的羰基化合物产生的蛋白修饰物和由来自腹膜透析液或血液透析液本身的羰基化合物产生的蛋白修饰物。
欲添加本发明化合物(I)或(II)的腹膜透析液或血液透析液的组分可以为公知的组分。通常的腹膜透析液包含渗透压调节剂(如葡萄糖)、缓冲剂(如乳糖、柠檬酸、苹果酸、乙酸、丙酮酸、琥珀酸和碳酸氢钠)、以及无机盐(如钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和氯离子)。已添加本发明化合物(I)或(II)的腹膜透析液或血液透析液可直接密封并加热灭菌。由此，在加热灭菌或保存时，可抑制由这些主成分产生蛋白修饰物。
另外，将液体如腹膜透析等的液体包装在具有第一室和第二室的分别的容器中，其中第一室包装有还原糖，并且第二室包装有化合物(I)或(II)，可在使用前混合它们。当包含氨基酸时，本领域技术人员可采用最佳方案如设置适宜的第三室。
由于腹腔内或静脉内施用后，化合物(I)或(II)抑制蛋白修饰物生成，因此可减轻副反应如腹膜硬化。而且，预计对其它疾病(如糖尿病合并症)也可发挥预防和/或治疗效果。透析液中除化合物(I)或(II)外，可包含已知的药物如氨基胍。另外，也可应用于粉末型透析剂。
化合物(I)或(II)可注入装备有合适共注入用连接器的透析回路中。另外，可将化合物(I)或(II)直接注入腹腔内，在腹腔内与腹膜透析液混合。另外，患者在注入腹膜透析液前，或当它在腹腔内贮留时，可静脉内注射化合物(I)或(II)，以有效抑制蛋白修饰物的生成。
将透析液充填入合适的密闭容器并灭菌。通过高压蒸汽灭菌和热水灭菌等的加热灭菌是有效的。此时，使用高温时不溶出有害物质、且灭菌后具有耐运输的足够强度的容器。特别地，可例举包含如由聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚脂、乙烯醋酸乙烯共聚物制备的可交换塑料袋。此外，为了避免由于环境空气的影响所致液体的降解，可将填充了透析液的容器进一步用具有高的气体屏障特性的包装材料包装。
当通过包括高压加热灭菌在内的加热灭菌进行灭菌处理时，如果所使用的化合物(I)或(II)对处理如热具有足够的稳定性，可将化合物(I)或(II)事先加至透析液中，然后灭菌混合的透析液。当所使用的化合物(I)或(II)对加热灭菌不具有稳定性时，可进行非加热灭菌。此类非加热灭菌包括例如通过过滤灭菌。
例如，此类灭菌可使用装备有孔径约0.2μm的膜滤器的精密过滤器过滤而进行。通过过滤灭菌的透析液填充入容器如柔软的塑料袋中，然后密封。此外，对于事先加热灭菌的腹膜透析液等，可以后添加化合物(I)或(II)。
对添加的时间没有特别的限定。可在灭菌前或灭菌后添加化合物(I)或(II)，可在即将透析前或透析同时添加化合物(I)或(II)，可在透析液注入后直接将化合物(I)或(II)注入腹膜。
本发明的腹膜透析液可用于进行与目前的腹膜透析液或血液透析液同样的透析处理。即，对于腹膜透析，将合适量的根据本发明的腹膜透析液注入透析患者的腹腔内，以将体内的低分子量成分通过腹膜转移入腹膜透析液。间歇性地循环腹膜透析液，根据患者的症状继续透析。此时，化合物(I)或(II)抑制在透析液中或生物体内的蛋白修饰物生成。羰基化合物与透析成分如肌酸酐、无机盐或氯离子一起自血液或腹膜内转移入腹膜透析液。由此，减少了蛋白修饰物对生物体的副作用。
化合物(I)或(II)不仅可用于透析液，还可用于营养输液、电解质输液、经肠或经管营养剂等所用的液体制剂。
本发明的化合物虽然可作为注射剂用于治疗，但在液体状态下立即开始分解，12小时(25℃)后包含分解了约40％的化合物。本发明者们通过深入研究发现了含有可以稳定状态施用的本发明化合物的注射剂。因此，本发明还提供了含有可以稳定状态施用的本发明化合物的注射剂。
发明的效果
本发明提供了有效抑制蛋白修饰物如AGEs或ALEs生成的蛋白修饰物生成抑制剂。特别地，本发明提供了预防和/或治疗肾功能衰竭、糖尿病合并症(如肾病、神经病、网膜症、白内障等)、动脉硬化、作为透析合并症的透析淀粉样变性、腹膜透析患者的腹膜硬化症、中枢神经病的阿耳茨海默症、皮克病和帕金森氏症、类风湿性关节炎、日光弹性纤维症、老化等的药物。特别地，可作为肾功能衰竭和作为糖尿病合并症的糖尿病性肾病的降血压剂的肾保护药应用，可提供根据本发明的不具有降血压的药理作用并可大范围使用于众多患者的肾保护药。进一步地，从本发明的化合物抑制内质网应激(ER应激)这一点，显示本发明的化合物可用于治疗如糖尿病、帕金森氏症、类风湿性关节炎等疾病。
实施例
以下，本发明通过实施例进行更具体的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。
制备实施例1
制备1-(5羟基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)-6-甲基-1，3-二氢呋喃并[3，4-c]吡啶-7-醇
Figure A20048004106500361
将3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(1.74g)(下文中称为依达拉奉)在0.1MNaOH(100mL)中室温搅拌溶解，边搅拌边滴加溶于水(100mL)的吡哆醛盐酸盐(2.44g)的溶液，并反应。滴加结束后，搅拌约30分钟，将认为白色沉淀的析出停止的时间点作为反应的结束点。将混合物在4℃的低温室冷却，使沉淀物充分析出。将该反应液过夜冷却后，过滤所析出的白色沉淀，得到1-(5羟基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)-6-甲基-1，3-二氢呋喃并[3，4-c]吡啶-7-醇的粗产物(湿)(23.7g)。
将所述粗产物悬于甲醇(50mL)，并于超声波搅拌器中50℃搅拌60分钟，然后将残留的不溶物滤除，并将滤液浓缩至10mL，然后至于4℃的低温室中过夜冷却而析出结晶。滤出所述结晶并在真空干燥器中避光干燥，得到1-(5羟基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)-6-甲基-1，3-二氢呋喃并[3，4-c]吡啶-7-醇的纯化结晶(0.22g)。产率：6.8％。外观性状：结晶性粉末，淡黄白色。融点：207-209℃(褐变溶融)。
制备实施例2
制备1-(5羟基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)-6-甲基-1，3-二氢呋喃并[3，4-c]吡啶-7-醇盐酸盐
Figure A20048004106500362
将0.5006g 1-(5羟基-3-甲基-1-苯基-1-H-吡唑-4-基)-6-甲基-1，3-二氢呋喃并[3，4-c]吡啶-7-醇溶于150mL甲醇，加入2N盐酸甲醇(1.65mL)并搅拌。将该溶液浓缩至约20mL，并且在结晶开始析出时，为了替换结晶溶剂，加入50mL乙醇并浓缩。重复该操作2次后，浓缩至约5mL。将该浓缩液于低温室(4℃)过夜冷却，滤取析出的结晶并在真空干燥器中干燥，以产生1-(5羟基-3-甲基-1-苯基-1-H-吡唑-4-基)-6-甲基-1，3-二氢呋喃并[3，4-c]吡啶-7-醇盐酸盐(0.5011g)。产率90.0％。外观性状：结晶性粉末，淡黄白色。融点：247-249℃(褐变溶融)。
试验实施例1
戊苷糖生成抑制效果
对于1-(5羟基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)-6-甲基-1，3-二氢呋喃并[3，4-c]吡啶-7-醇(下文中称为″TM-2002″)，检测了对作为代表性AGEs的戊苷糖的生成抑制效果。
在透析前，在经同意下收集血液透析患者的透析前血浆，并过滤灭菌。向该血浆(450μL)中加入TM-2002在二甲亚砜(50μL)中的溶液(终浓度：0.8，2.0，5.0mM)，37℃孵育1周。然后测定戊苷糖的量。
如下测定戊苷糖的量：向每一孵育后的样本(50μL)添加等量的10％三氯醋酸，然后5000g离心5分钟；去除上清，用5％三氯醋酸(300μL)洗沉淀；在减压下干燥沉淀，并在氮环境下于6N HCl溶液中(100μL)110℃加水分解16小时；接下来向酸加水分解物中添加5N NaOH(100μL)和0.5M磷酸缓冲液(pH 7.4)(200μL)，然后通过0.5μm孔的孔滤器并用PBS稀释。游离的戊苷糖浓度通过使用荧光检测器(RF-10A，岛津制作所)的逆相HPLC测定(Miyata，T.等人：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.93，p.2353-2358，1996)。在335/385nm的激发波长/发射波长处监测流出物。将合成的戊苷糖作为标准品使用。戊苷糖的检出限为0.1pmol/mg蛋白质。
通过与以TM-2002同样的方式反应的阳性对照(吡哆胺(Sigma))比较评估抑制作用。另外，以同样方式评估氨基胍、奥美沙坦(olmesartan)和依达拉奉的抑制作用。结果(戊苷糖量nmol/ml)示于图1(图中，“对照”是指仅使用溶剂的阴性对照。下文中同样)。由该结果可见TM-2002与阳性对照吡哆胺相比较，显著抑制戊苷糖生成。
试验实施例2
抑制羟基对苯丙氨酸的羟化反应的作用
将苯丙氨酸(终浓度：1mM)、TM-2002(终浓度：0.1，0.5，2.5mM)、过氧化氢(终浓度：5mM)和硫酸铜(终浓度：0.1mM)溶于200mM磷酸缓冲液(pH7.4)(总体积500μL)，然后37℃孵育4小时。然后加入DTPA(终浓度：1mM)和260单位的过氧化氢酶终止反应。通过以下HPLC分析邻酪氨酸和间酪氨酸的产生量：一定时间后，将反应混合物100倍稀释；取20μL稀释液注射入HPLC，用C18柱(4.6×250mm，5μm；Nomura Kagaku)分离后，用荧光检测仪(RF-10A：Shimazu Seisakusho)在激发波长275nm和荧光波长305nm处检测。流动相的流速为0.6mL/分钟且缓冲液B的浓度在25分钟内从6.5％变化为10％(缓冲液A：0.10％三氟醋酸；缓冲液B：含有0.08％三氟醋酸的80％乙腈)。氨基胍、吡哆胺和奥美沙坦的结果如图2和3所示。
试验实施例3
抑制过硝酸盐对酪氨酸硝化反应的作用
根据Pannala，A.S.等人(Free Radic.Biol.Med.，24：594-606，1998)的方法实施实验。即，将酪氨酸(终浓度：100μM)、TM-2002(终浓度：0.1，0.5，2.5和5mM)和过硝酸盐(Dojin Kagaku)(终浓度：500μM)溶于200mM磷酸缓冲液(pH7.4)(体积500μL)并37℃孵育15分钟。孵育后，如下测定硝基酪氨酸的产生量：一定时间后，将反应混合物(20μL)注射入HPLC，用C18柱(4.6×250mm，5μm：Waters)分离并用紫外检测仪(RF-10A：Shimazu Seisakusho)在波长280nm处检测。流动相的流速为0.6mL/分钟且缓冲液B的浓度在30分钟内从5.0％变化为30％(缓冲液A：0.10％三氟醋酸；缓冲液B：含有0.08％三氟醋酸的80％乙腈)。4羟基-3-硝基苯甲酸(100μM)用作内部标准。氨基胍、吡哆胺和奥美沙坦的结果如图4所示。
试验实施例4
不使用患者血浆，而使用BSA和阿拉伯糖，其余与试验实施例1同样，测定了其它的化合物(I)或(II)对戊苷糖产生的抑制作用。结果如表1所示。其中，″-″是指未进行试验。
表1
Figure A20048004106500421
Figure A20048004106500451
Figure A20048004106500471
Figure A20048004106500481
Figure A20048004106500491
Figure A20048004106500501
试验实施例5
用气囊伤害模型进行研究
通过作为血管扩张术后再狭窄模型的大鼠颈动脉气囊伤害模型研究对血管内皮肥厚的抑制作用。
将TM-2002使用乳钵悬于羧甲基纤维素钠(CMC)水溶液(CMC)(0.5％)，使用测定量筒制备为12.5mg/mL。
氨基胍盐酸盐(Sigma)用作阳性对照，以相同方式使用乳钵悬于CMC水溶液(0.5％)，使用测定量筒制备为11.25mg/mL。各制备液在用时制备，并使用一次性注射筒和经口探子边悬浮边强制经口施与。
溶剂组(n＝10)施与CMC水溶液(0.5％)，每次4mL/kg，一天两次(8mL/kg/天)。TM-2002(受试化合物)组(n＝10)经口施与，每次50mg/kg的1-(5羟基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)-6-甲基-1，3-二氢呋喃并[3，4-c]吡啶-7-醇盐酸盐，一天两次(100mg/kg/天)。氨基胍组(n＝10)经口施与，每次45mg/kg的氨基胍盐酸盐，一天两次(90mg/kg/天)。
气囊伤害前一天开始施用，共进行15天(以伤害天为第1天，施用至第14天)，一天早晚两次，超过6小时间隔(气囊伤害的第15天解剖，在第15天不施用)。
使用9周龄(当气囊伤害时是10周龄)SD品系雄性大鼠(Japan SLC)。受试动物通过肉眼检查其健康状况，并将健康动物置于笼中。自动物到来时开始预饲养6天或以上，将健康良好的个体进行试验。每组10只大鼠，基于施与开始前的体重分为溶剂组、受试化合物组、氨基胍组。
在戊巴比妥钠(40mg/kg，i.p.)麻醉下切开大鼠颈部和大腿部，露出左颈动脉和大腿动脉。切开大腿动脉并插气囊导管(2Fr，fogaty导管；Baxter)，将其前部导入左颈动脉的内外颈动脉分支部。通过裸眼观察确认气囊导管确实在颈动脉内，然后向气囊内注入空气(0.3mL)。在使气囊膨胀的同时，将气囊导管拔出大动脉弓。重复该操作三次并造成血管内膜伤害。拔出气囊导管后，结扎大腿动脉。缝合切开部，使用去甲羟基安定溶液充分消毒伤口。另外，将未受损伤的右颈动脉作为每一个体的对照。
试验过程中，对每一个体每日观察其存活和手术部位的情况。自伤害前1天开始至气囊伤害后第14天一天测定一次体重。每一个体根据其体重算出施用量。
气囊伤害后第15天，乙醚麻醉下自腹部大静脉取血。取血后，取下左颈动脉并分成3份，每份取约5mm；取出右颈动脉，自中央部分切出约5mm；将它们分别固定在10％的中性缓冲福尔马林中。经福尔马林固定的颈动脉样本石蜡包埋后，切片并进行HE染色。使用图像分析仪(VM-30，Olympus photology)计测血管内腔面积、内弹性板包围的面积和外弹性板包围的面积。
对每一切片(3部分)，根据测定的面积计算血管的新生内膜面积、中膜面积、以及新生内膜面积/中膜面积之比。使用对各个体求得的3部位的平均值评估内膜肥厚。结果如图5(A、B和C)所示。由该结果可见，TM-2002组显示与阳性对照氨基胍组相当的抑制血管内皮肥厚的效果。
试验实施例6
研究与维生素B6的反应性
维生素B6(吡哆醛-5′磷酸)(50μM)和TM-2002(0.5μM)在磷酸缓冲盐中(PBS)37℃孵育。为了测定0至20小时之间的动力学，使用HPLC测定残存的吡哆醛-5′-磷酸浓度。即，一段时间后，将反应混合物(10μL)注射入HPLC，使用Purecil C18柱(4.6×250mm，5μm：Waters)分离后，使用荧光检测仪(RF-10A；Shimazu Seisakusho；激发波长300nm和荧光波长400nm)进行测定。流动相的流速为0.6ml/L，并且缓冲液B的浓度在25分钟内自0％变化为3％(缓冲液A：0.10％三氟醋酸；缓冲液B：含0.08％三氟醋酸的80％乙腈)。作为对照，使用了维生素B6捕捉作用已知的氨基胍。
20小时后，TM-2002组的吡哆醛-5′磷酸残存率为97％，而作为对照的氨基胍组的吡哆醛-5′-磷酸残存率仅为0.2％。因此，显示TM-2002不与维生素B6反应。
此外，其它的化合物(I)和(II)显示与TM-2002同样的结果。
试验实施例7
对维生素B6缺乏症的抑制效果
将TM-2002施与正常大鼠(WKY大鼠：日本SLC)以研究维生素B6缺乏症的有无。以已知具有维生素B6捕捉作用的氨基胍用作对照。每组10只大鼠，分别施与悬于羧甲基纤维素(0.5％)中的TM-2002或氨基胍，施用量为13mg/kg/大鼠/次，使用探子一天两次强制经口施用，施用20周。使用常规膳食(CRF1：Oriental yeast)。
20周后，观察WKY大鼠的外观性状。在TM-2002组，完全没有观察到由于维生素B6缺乏引起的疾病如口角炎、口内炎、舌炎、口唇炎、急性和慢性湿疹、接触性皮炎、末梢神经炎、贫血、淋巴细胞减少症、神经病等。相反，在氨基胍组，观察到了皮肤炎、癫痫和由于脑疾病引起的惊厥。
此外，其它的化合物(I)和(II)显示出与TM-2002同样的结果。
试验实施例8
在SHR/NDmcr-cp大鼠和Wistar Kyoto大鼠中的肾保护作用
使用SHR/NDmcr-cp(SHR等疾病模型研究协会)大鼠研究肾保护作用，该大鼠已知显示有高血压、高血糖、高脂血症、肥胖和高胰岛素血症，并且随着年龄的增加出现肾功能紊乱。
将9周龄SHR/NDmcr-cp大鼠和Wistar Kyoto大鼠(SHR等疾病模型研究协会)驯化3周后，测定施用前的体重并采血。每组5只大鼠(体重440g±32g)。分组后，将赋形剂(阴性对照)、阳性对照化合物和受试化合物施与20周。以羧甲基纤维素(羧甲基纤维素钠/Wako)溶液作为赋形剂，以已知具有肾保护作用的血管紧张素II受体拮抗剂之一奥美沙坦作为阳性对照化合物，用来证实TM-2002(受试化合物)的效果。奥美沙坦的剂量为3mg/kg体重，TM-2002为50mg/kg体重。通过将奥美沙坦以需要量悬于或溶解于1.0ml 0.5％羧甲基纤维素溶液或蒸馏水中制备，将TM-2002以需要量与30g膳食(一天)混合。由于受试动物的体重增加明显，根据每周测定的体重结果改变阳性对照化合物和受试化合物的量。阴性对照的剂量途径为经口施用作为赋形剂的1ml 0.5％羧甲基纤维素溶液，阳性对照的剂量途径为使用探子经口施用1ml调整了所需奥美沙坦量的0.5％羧甲基纤维素溶液。受试化合物组的剂量途径为自由摄取混合有调整了所需TM-2002量的饲料1日施与量。每组动物的饲料摄取量均为30g/天(作为阴性对照的赋形剂组、阳性对照化合物组和受试化合物组)。在施用期间，每周测定体重；在4周龄前每2周采血、采尿和测定血压；并且5周龄后每4周进行采血、采尿和测定血压。采血时将动物在38℃的保温器中温暖后，自尾静脉采血800μl(肝素处理：1ml血使用15μl肝素)。采尿是使用采尿代谢笼(日本Clea公司制)进行的。采尿时测定1日尿量。使用非侵入性血压测定装置测定血压(Softron)。
血样用于确定葡萄糖水平、甘油三酯浓度、总胆固醇浓度、血红蛋白A1c和胰岛素浓度。尿样用于确定尿蛋白量、肌酸酐量和尿素氮量。这些测定由日本SRL株式会社进行。
通过该试验在33周龄的肾保护效果的结果表明阴性对照的赋形剂呈现出高血压、高尿蛋白和肾功能障碍。在阳性对照组，由于奥美沙坦是降压剂，观察到血压下降、抑制尿蛋白和肾功能改善。另外，在受试化合物组，与阴性对照相比较尽管没有观察到血压降低，但尿蛋白受到明显的抑制，并且与阳性对照相比较，该抑制作用更强，从而显示了良好的肾保护效果。由该结果可见作为肾疾病治疗药是有用的，用于对不伴有高血压症的肾疾病的治疗、与不具有肾保护作用的降压药联用治疗肾疾病、以及进一步地，与具有肾保护作用的降压药联用可预期协同作用。该结果在图7和8中示出。
试验实施例9
对Thy-1肾炎模型大鼠的肾保护作用
将1.2mg/kg抗Thy-1抗体OX-7尾静脉施与wister大鼠(雄性，体重150g，6周龄)以制备呈现血管系膜增殖性肾炎的典型的肾小球肾炎模型。施用抗Thy-1抗体后，将受试化合物(TM-2002，50mg/kg体重，一天两次)悬于0.5％羧甲基纤维素，连续5天使用探子强制施与，在第6天取样，采肾脏进行病理分析(计数肾小球细胞)。具体地，根据常规方法将细胞通过PAS染色，对染色图像通过3CCD相机(Olympus)拍摄，然后使用ImageGraver PCI(FUJI shashin film)和Mac Aspect(Mitani kabushiki kaisha)的软件分析肾小球细胞数。另外，进行血液和尿的生物化学分析(contractclinical analysis organization：SRL)。结果，在TM-2002组，尿蛋白值改善，随着BUN值显著(p＜0.01)改善，伴随疾病而增殖的肾小球细胞数也显著地抑制(p＜0.0001)，显示了其肾保护作用。结果如图8至10所示。
试验实施例10
对缺血再灌流模型大鼠的肾保护作用
该疾病模型是典型的急性肾功能衰竭模型。作为制备方法，进行wister大鼠(雄性，体重150g，6周龄)右肾的摘除，第二天在全身麻醉下对剩下的左肾的肾动脉进行钳夹结扎。钳夹术后，将大鼠置于加温器上以便体温不降低并观察45分钟(缺血)后，除去钳子，以进行再灌流。制备缺血再灌流模型后，将受试化合物(TM-2002，50mg/kg体重，一天两次)悬于0.5％羧甲基纤维素，连续2天使用探子强制施与，在第3天取肾脏进行病理分析(肾小管间质损伤的分值)。具体地，对根据常规方法通过PAS染色的肾染色图像评估肾小管间质损伤中是否存在肾小管坏死、肾小管肥大、肾小管萎缩、肾小管基底膜肥厚和歪斜(cast)。同时进行血液的生物化学分析(contract clinical analysis organization：SRL)。结果，在TM-2002施用组，尿蛋白值和BUN值改善，并且，伴随疾病而增殖的肾小球细胞数也被显著地抑制(p＜0.0001)，显示了其肾保护作用。结果如图11至13所示。
试验实施例11
大脑中动脉缺血再灌流模型中的脑保护作用
将体重270至350g的CD(SD)IGS雄性大鼠(Japan CharsriverKabushiki kaisha，日野生产厂22号室特定生产)(每组8只大鼠)通过2％异氟醚(70％N2O(笑气)和30％O2的混合气体)麻醉，使不动后，将大鼠置于温板上并使动物的直肠温度和脑温度保持在37至38℃。然后，为了观察实验上的稳定性，将聚乙烯(PE-50，Becton Dickinson)制的插管插入并留在所述动物的尾动脉，由此进行采血和血压测定，监测生物化学参数如血糖水平、血细胞比容、CO2浓度、氧分压、pH、血压等。此外，皮质中的脑血流量使用激光多普勒荧光分析法(Neuroscience.inc：OMEGAFLOW(FLO-C1))，将检出部位直接置于距离前囟左4mm位置处的头颅。切开此动物的左颈部，并在颈总动脉的内颈和外颈动脉杈至内颈动脉的上游通过并留置尼龙制外科用线(长16mm，直径0.2至0.3mm，前部的3mm用硅氧烷包被)，闭塞大脑中动脉2小时。然后，去除线以开放大脑中动脉，再灌流血液21小时。对每一动物，在大脑中动脉阻塞后5分钟和5小时时通过留置在尾动脉中的导管分别施与作为对照的依达拉奉3.0mg/kg和作为受试药物的TM-2002 5.58mg/kg 2次。在所述操作之后，从所述动物取下脑，制备7枚2mm厚的脑切片后，在TTC染液(0.8g氯化2，3，5-三苯基四唑(Sigma)溶于40ml盐水)中37℃浸湿15分钟染色，并通过10％中性福尔马林液体固定而制备样本。将此类样本通过CCD相机产生图像，然后使用Swanson等人(J Cereb Blood Flow Metab 10：290-293；1994)的方法进行分析。结果，与单独施用赋形剂相比较，对照药物依达拉奉和受试药物TM-2002的脑梗塞巢显著缩小。该结果如图14和图15所示。此外，评估了施行手术的大鼠的神经状态，将施行手术的大鼠置于水平桌上，根据Bederson等人(Stroke 17：472-476，1990)的方法分成4阶段：0级，当从侧面推时，无麻痹，正常行走；1级，当从侧面推时，有抵抗并径直走到前面，呈现前脚屈曲；2级，当从侧面推时，没有抵抗并径直走到前面；3级，当从侧面推时，没有抵抗并且不能径直走到前面(旋转或跌倒)。而且，通过评估使小鼠在旋转转子上走的步行状态的程度如何的方法，在施术前后通过旋转棒进行功能恢复的评价。结果，观察到依达拉奉(对照药物)和TM-2002(受试化合物)与仅施与赋形剂的组比较，在改善神经状态和恢复功能存在显著不同。结果示于表2。
表2
试验名称   一次施用赋形剂   依达拉奉   TM-3001
  平均值   标准差   平均值   标准差   平均值   标准差
  神经状态评估试验*闭塞后    10分钟闭塞后    2小时再灌流后  10分钟再灌流后  3小时再灌流后  4小时再灌流后  22小时 2.92.92.42.32.31.6 0.30.31.11.11.11.4 2.82.72.22.12.01.5 0.40.51.01.01.21.2 2.82.61.51.32.02.0 0.71.11.61.51.41.4
  旋转棒试验**闭塞前再灌流相对于闭塞前的比率 202.767.181.4 123.070.5131.8 197.0153.1160.4 123.4132.5190.0 183.4160.678.1 138.0128.630.6
  (％)
*：神经状态评估试验的数值是通过Bederson等人的分级体系算出的；
**：旋转棒试验的数值是读取的旋转棒机器的计数。
试验实施例12
溶解性的研究试验
将TM-2002添加至纯水至10mg/1ml，并且添加盐酸调节至pH2.0。然后，将该溶液通过1N氢氧化钠调整为pH 7.0，8.0以及2，0(未调整)，从而制备了3种溶液。将这些溶液置于温室的冷暗处，24小时后观察溶液的状态。pH2.0的溶液，维持清亮的溶液状态；而pH7.0、pH8.0的溶液观察到沉淀。特别地，在pH7.0和pH8.0的溶液也观察到了色调的变化。该结果暗示，在TM-2002注射制剂中，可通过使用无机酸如盐酸、硫酸或多种有机酸维持酸性条件，使用该多种酸制备的TM-2002盐酸盐或硫酸盐用于原料中制备溶解性方面稳定的制剂。
试验实施例13
稳定剂的研究
通常，为了稳定疾病治疗用药物而使用多种稳定剂，熟知的有效方法为添加抗氧化剂。特别地，对于容易受到氧化的化合物的稳定，可使其与氧化还原电位低的物质共存。因此，对于通常用于注射制剂等中的亚硫酸氢钠(NaHSO3)和L-半胱氨酸(C3H7O2S·HCl)，进行了添加至TM-2002盐酸盐水溶液的实验，研究其稳定性。
首先研究了添加亚硫酸氢钠对TM-2002盐酸盐的溶解状态。实验方法为：分别准备1ml纯水、溶解有亚硫酸氢钠(0.5mg)的水溶液1ml和溶解有亚硫酸氢钠(1mg)的水溶液1ml；向它们中分别添加63mg TM-2002盐酸盐，搅拌并溶解；将这些溶液室温放置，并观察溶解状态。结果，添加0.5mg和1mg亚硫酸氢钠随时间而析出结晶性的沉淀物，24小时后观察到明显的沉淀物的存在。与之相反，仅溶解于纯水中的pH为2至2.5的溶液，24小时后也没有观察到溶解状态的变化，此外也观察到明显抑制TM-2002的降解。因此，TM-2002自身的稳定性通过使用盐酸盐而增大。
不使用亚硫酸氢钠，而使用亚硫酸钠(Na2SO3)、焦亚硫酸钠(Na2S2O5)进行了同样的实验，观察到在添加这些稳定剂的所有溶液中析出结晶性沉淀物。
接下来，研究了添加L-半胱氨酸盐酸盐的TM-2002盐酸盐溶液的溶解状态。实验方法为：将1mg和2mg L-半胱氨酸盐酸盐分别溶于1ml纯水中；调节pH至6.5。然后，向这些溶液中分别加入63mg TM-2002盐酸盐，充分搅拌并溶解。将这些溶液室温放置，并观察溶解状态。结果，任何溶液中均没有观察到沉淀物、析出物，24小时后也没有观察到溶解状态的改变。另外，通过薄层层析(TLC/硅胶60F254(Merck Japan)/展开溶剂：氯仿∶甲醇＝9∶1/检测：UV＝254nm)观察降解性。化合物室温放置24小时或以上时缓慢分解，但通过添加L-半胱氨酸而明显稳定。在-20℃保存该溶液1周，该溶液仍稳定。因此，根据本发明，将包含L-半胱氨酸的TM-2002盐酸盐溶液低温处理并冷冻干燥，可得到TM-2002的冷冻干燥制剂。
制备TM-2002的注射用冷冻干燥制剂
将L-半胱氨酸盐酸盐(160mg)添加至80ml纯水，搅拌并溶解。使用1N氢氧化钠将该溶液的pH调节至6.7。加入1g TM-2002盐酸盐并充分搅拌和溶解后，使用容量瓶通过加入纯水定容至100ml。将该溶液分别取6.3ml置于50ml容积的小瓶中，立即用干冰冷冻后，置于-80℃完全冷冻。接下来，将其置于冷冻干燥机中冷冻干燥3天。冷冻干燥后，盖上橡皮盖并用紧固机封上铝盖，获得TM-2002的注射用冷冻干燥制剂。
TM-2002的注射用冷冻干燥制剂的溶解性和稳定性
向每瓶上述制备的TM-2002的注射用冷冻干燥制剂添加20ml纯水。该冷冻干燥物立即溶解，产生淡黄色的透明溶液。向1ml该溶液中添加1.5ml生理盐水，在室温放置状态下，观察溶解后3小时、6小时和10小时的溶解状态和稳定性。使用TLC(Kiezel gel 60F254/展开溶剂：CHCl3∶MeOH＝9∶1/检测：UV＝254nm)检测有无成分变化。结果，该溶液在溶解后10小时也没有观察到沉淀、结晶和不溶物的析出等和颜色的变化。对于成分的稳定性，虽然在作为对照的TM-2002盐酸盐的水溶液中10小时时观察到了分解物，但该可注射的制剂没有观察到分解物。其TLC结果如图16所示。当该溶液进一步用生理盐水稀释，明确了其稳定性同样。此外，将所述可注射的冷冻干燥制剂室温放置30天，通过同样的方式观察溶解性和稳定性，与制备后即刻的冷冻干燥制剂没有区别。作为用时调制用的注射用冷冻干燥制剂，其可发挥充分的性能、稳定而且实用。
试验实施例14
对TM-2002的体内内质网应激(ER应激)减轻作用的评估
使用现有技术已知的呈现高血压、高血糖、高脂血症、肥胖和高胰岛素血症，并且随着年龄的增加出现肾功能紊乱的SHR/NDmcr-cp(SHR等疾病模型研究协会)大鼠的肾组织，通过抗ORP150抗体进行免疫染色评估TM-2002对内质网应激的减轻作用。染色使用的染色切片样本如下制备：通过膳食(30g/天)向SHR/NDmcr-cp大鼠施与目的量的受试化合物TM-2002(剂量：100mg/1kg体重)；向SHR/NDmcr-cp大鼠不施与药物；作为比较对照而设置的SHR(高血压)大鼠和Wistar Kyoto大鼠；在药物施用期结束后(33周龄)取每一大鼠的肾组织；所有组织经karnoa固定并包埋于石蜡中。根据Catalyzed Sifnal Amplification(CSA)System(DAKO)的方法进行。简而言之，脱石蜡通过Histo-Clear(pational diagnotics)5分钟，共3次；100％乙醇3分钟，共3次；和蒸馏水中5分钟进行。然后，将样本置于10mM柠檬酸钠水溶液(pH 6.0)并用微波炉加热5分钟至沸腾，以活化抗原；将样本冷却至室温，并用TBS-T(0.05M Tris-HCl pH7.6，0.3M NaCl，0.1％吐温20)洗4分钟，洗3次；将样本在3％过氧化氢溶液(DACO)中漂洗3分钟，以封闭内源性过氧化物酶；接下来，将样本用PROTEINBLOCK(DACO)处理5分钟，以阻止抗体的非特异性反应；与用1.5％山羊血清400倍稀释的抗ORP150抗体(一级抗体)反应15分钟，用TBS-T洗4分钟，洗3次；与生物素标记的山羊抗兔抗体(200倍稀释；二级抗体)反应15分钟，并用TBS-T洗4分钟，洗3次；与链亲和素-生物素复合体(DACO)反应15分钟，并用TBS-T洗4分钟，洗3次；与AmplificationReagent(DACO)反应15分钟，并用TBS-T洗4分钟，洗3次；与链亲和素-过氧化物酶(DACO)反应15分钟，并用TBS-T洗4分钟，洗3次；通过底物-发色团溶液进行DAB发色，蒸馏水洗，100％乙醇脱水3分钟，进行3次，Histo-Clear(pational diagnotics)5分钟，进行3次，并包埋，从而完成标本。该标本通过光学显微镜(Olympus)镜检并分析结果。结果观察到在Wistar Kyoto大鼠(对照)和SHR大鼠(高血压模型)没有ORP150阳性染色部位，而在SHR/NDmcr-cp大鼠(II型糖尿病高血压模型)观察到阳性染色部位，并观察到在SHR/NDmcr-cp大鼠中内质网应激的增强。在施与TM-2002的SHR/NDmcr-cp大鼠组中，观察到阳性染色部位的减少和抑制ER应激(参见图17)。
试验实施例15
TM-2002在ER应激诱导分子的表达改变中的药效评价。
大鼠脾β细胞株(RIN-5F)接种于6孔培养板至1.0×105个细胞/孔，24小时后，添加在DMSO中的TM-2002(200mM，50mM)至终浓度200μM、50μM。经1小时后，加入在甲醇中的衣霉素(1mg/ml)(Sigma)0.2μl。培养8小时后，将细胞用2ml PBS(+)洗2次后，用100μl裂解液(50mMTris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，100mM NaF，100mM磷酸钠(pH7.4)，2mM Na3VO4，0.1％蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)，1％Triton X-100)裂解细胞。为了去除该细胞裂解液的不溶级分，12,000xg离心10分钟，回收上清作为细胞提取液。将得到的细胞提取液使用DC protein assay kit(BioRad)定量其蛋白浓度，并将每一样本(1μg)通过SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜。用5％脱脂奶/0.1％吐温20-TBS室温封闭膜1小时，并分别与在5％脱脂奶/0.1％吐温20-TBS中的抗ORP150抗体(2000倍：特异性抗体)、在5％脱脂奶/0.1％吐温20-TBS中的抗GRP78抗体(Santa Cruz)(100倍)和在5％脱脂奶/0.1％吐温20-TBS中的抗肌动蛋白抗体(Sigma)(200倍)反应2小时。用0.1％吐温20-TBS洗10分钟，洗3次，对于检测ORP150和肌动蛋白，将HRP-标记的抗兔抗体(BIO-Rad；二级抗体)在5％脱脂奶/0.1％吐温20-TBS中稀释(2000倍)，对于检测GRP78，碱性磷酸酶标记的抗山羊抗体在5％脱脂奶/0.1％吐温20-TBS中稀释(5000倍)，并室温反应1小时。用0.1％吐温20-TBS洗10分钟，洗3次，使用ECL western印迹检测试剂(Amersham Bioscience)进行检测。通过Lane analyzer(ATTO)分析检测信号，算出信号强度。结果，在添加衣霉素的样本中，相对于对照样本而言，ORP150和GRP78表达分别增加1.88倍和1.46倍，这表明引起了ER应激。在同时添加TM-2002和衣霉素的样本中，抑制由衣霉素引起的ORP150和GRP78的过量表达，这表明由衣霉素引起的ER应激被减轻(参见图18和19)。
附图简述：
图1为显示TM-2002对戊苷糖形成的抑制效果的图。
图2为显示TM-2002对通过羟基羟化苯丙氨酸的抑制效果(以邻-酪氨酸形成抑制作为指标)的图。
图3为显示TM-2002对通过羟基羟化苯丙氨酸的抑制效果(以间-酪氨酸形成抑制作为指标)的图。
图4为显示TM-2002对通过过硝酸盐硝化酪氨酸的抑制效果的图。
图5为在大鼠颈动脉气囊伤害模型试验中TM-2002对血管内皮肥厚的抑制效果的照片(A为对照；B为施用50mg/kg TM-2002；C为施用45mg/kg氨基胍)。
图6为显示TM-2002缺乏降血压作用的图。
图7为显示TM-2002具有尿蛋白抑制作用的图。
图8为显示TM-2002在Thy-1肾炎模型中使BUN值减小的图。
图9为显示TM-2002在Thy-1肾炎模型中使尿蛋白值减小的图。
图10为显示TM-2002在Thy-1肾炎模型中使肾小球细胞数减少的图。
图11为显示TM-2002在缺血再灌流模型中使BUN值减小的图。
图12为显示TM-2002在缺血再灌流模型中使尿蛋白值减小的图。
图13为显示TM-2002在缺血再灌流模型中使间质损害值减小的图。
图14为显示TM-2002使脑梗塞巢缩小的图。
图15为显示TM-2002使脑梗塞巢缩小的图。
图16为显示TM-2002注射用冷冻干燥剂水溶液稳定性的图。
图17为TM-2002使SHR/NDmcr-cp的阳性染色部位减少的图。
图18显示TM-2002对通过衣霉素所致OPR150表达增强的抑制。
图19显示TM-2002对通过衣霉素所致GRP78表达增强的抑制。

Claims (26)

1.蛋白修饰物生成抑制剂，其以在游离形式或盐形式的1-取代或未取代的-3-取代或未取代的-2-吡唑啉-5-酮的4位导入了防止结合维生素B6分子(包含衍生自维生素B6分子的分子)的取代基的化合物或其重排物作为活性成分。
2.权利要求1所述的蛋白修饰物生成抑制剂，其中作为活性成分的化合物选自游离形式或盐形式的式(I)化合物：
Figure A2004800410650002C1
或式(II)化合物
[其中R1是取代或未取代的芳环基；R2、R3和R4分别为氢原子或1价有机基团，或者R2和R3两者一起形成稠环或R3和R4两者一起代表2价有机基团，条件是R3和R4不同时为氢原子]。
3.权利要求2所述的蛋白修饰物生成抑制剂，其中R1所表示的芳环基为具有不超过20个环构成原子的碳环或杂环的芳环基，任选地包含不超过4个杂原子且任选地具有不超过3个取代基。
4.权利要求2或3所述的蛋白修饰物生成抑制剂，其中R2、R3或R4代表的1价有机基团分别独立地为具有不超过30个碳原子的直链或环状脂肪族、脂环式或芳族烃基，任选地具有不超过3个取代基，或者为卤素、硝基、氨基、羟基、巯基、羧基、羧基(低级)烷基、低级烷氧基羰基、甲酰基、低级烷酰基、低级烷基氨基、二(低级)烷基氨基、低级烷酰基氨基、芳基(低级)烷酰基、芳氧基氨基、磺酸基或3至7元杂环基，任选地具有取代基。
5.权利要求2或3所述的蛋白修饰物生成抑制剂，其中R2和R3两者一起形成稠环，其为5或6元饱和碳环，任选地具有取代基。
6.权利要求2或3所述的蛋白修饰物生成抑制剂，其中R3和R4两者一起形成2价有机基团，其选自苯基亚甲基、苯基链烯基亚甲基、喹啉基亚甲基、呋喃基亚甲基、二唑基亚甲基、氨基亚甲基、二(低级)烷基氨基亚甲基、吡啶基亚甲基和噻吩基亚甲基，任选地具有取代基。
7.权利要求3至6中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂，其中取代基选自低级烷基、低级链烯基、低级烷氧基、低级链烯基氧基、低级烷酰基、卤代(低级)烷基、羧基、低级烷氧基羰基、羧基(低级)烷基、卤素、硝基、氨基、低级烷基氨基、二(低级)烷基氨基、低级烷酰基氨基、羟基、巯基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、芳基(低级)烷酰基、芳氧基氨基、芳基、芳基(低级)烷基、环(低级)烷基、环(低级)链烯基、环(低级)烷基(低级)烷基和3至7元杂环基。
8.权利要求2所述的蛋白修饰物生成抑制剂，式(I)中R1是苯基，R2是甲基，R3和R4两者一起形成3-羟基-5-羟甲基-2-甲基吡啶-4-基-亚甲基。
9.权利要求2所述的蛋白修饰物生成抑制剂，式(II)中R1是苯基，R2是甲基，R3是6-甲基-1，3-二氢呋喃并-[3，4-c]-吡啶-7-醇基。
10.权利要求1至9中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂，其中蛋白修饰物选自AGEs、ALEs及它们的组合。
11.权利要求10所述的蛋白修饰物生成抑制剂，其中蛋白修饰物是AGEs。
12.根据权利要求11的蛋白修饰物生成抑制剂，其中AGEs是戊苷糖。
13.肾组织保护剂，其包含根据权利要求1至12中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂。
14.腹膜透析液，其包含根据权利要求1至12中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂。
15.血液透析液，其包含根据权利要求1至12中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂。
16.降低液体样品中羰基化合物含有量的方法，其包括将根据权利要求1至12中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂与液体样品接触的步骤。
17.抑制蛋白修饰物生成的方法，其包括将根据权利要求1至12中任意一项所述的蛋白修饰物生成抑制剂与患者的血液或腹膜透析液接触的步骤。
18.用于抑制由蛋白修饰物生成抑制剂引起的维生素B6缺乏症的方法，其特征在于：将作为蛋白修饰物生成抑制剂的有用的游离形式或盐形式的1-取代或未取代的-3-取代或未取代的-2-吡唑啉-5-酮的4位导入防止结合维生素B6分子(包含衍生自维生素B6分子的分子)的取代基。
19.权利要求18所述的方法，其中1-取代或未取代的-3-取代或未取代的-2-吡唑啉-5-酮是选自式(III)所示的化合物：
[其中R1为氢原子或取代或未取代的芳环基；且R2为氢原子或1价有机基团]。
20.权利要求18或19所述的方法，其中在4位导入的防止结合维生素B6分子的取代基选自有机基团。
21.化合物或其分子内重排物，所述化合物为在其游离形式或盐形式的1-取代或未取代的-3-取代或未取代的-2-吡唑啉-5-酮的4位导入了防止结合维生素B6分子(包含衍生自维生素B6分子的分子)的取代基。
22.游离形式或盐形式的式(I)化合物：
或式(II)化合物
Figure A2004800410650005C1
[其中R1是取代或未取代的芳环基；R2、R3和R4分别为氢原子或1价有机基团，或者R2和R3两者一起形成稠环或R3和R4两者一起代表2价有机基团，条件是R3和R4不同时为氢原子]。
23.权利要求22所述的化合物，其中式(I)中R1是苯基，R2是甲基，R3和R4两者一起形成3-羟基-5-羟甲基-2-甲基吡啶-4-基-亚甲基。
24.权利要求22所述的化合物，其中式(II)中R1是苯基，R2是甲基，R3是6-甲基-1，3-二氢呋喃并-[3，4-c]-吡啶-7-醇基。
25.根据权利要求21至24中任意一项所述的化合物的用途，用于制备蛋白修饰物生成抑制剂。
26.治疗由蛋白修饰物生成而介导的疾病的方法，其包括将治疗有效量的根据权利要求21至24中任意一项所述的化合物施与需要此种治疗的受试者。
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