CN1890252A - 新类型的γδT细胞活化剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一类新的具有γδT细胞活化性能的化合物、包括这些化合物的组合物、以及包括给予这些化合物的步骤的用于调节受治疗者体内免疫应答的方法。

Description

新类型的γδT细胞活化剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种新类型的具有γδT细胞活化性能的化合物、包括这些化合物的一种组合物、以及包括给予这些化合物的步骤、用于调节受治疗者体内免疫应答的方法。
背景技术
大多数的人类外周血γδT细胞表达由Vγ9/Vδ2基因编码的γδTCR异源二聚体、某些用于I类MHC的NK-谱系受体并且几乎不表达CD4或CD8。已经表明这些细胞对于病毒感染的细胞(Pocciaet al(1999)，parasite-infected cells(Constant et al(1995))、或肿瘤细胞(Fournie et Bonneville(1996))表现出强的、不受MHC限制的细胞溶解活性。这些细胞还在几种不相干的传染性疾病，如结核病、疟疾、兔热病、大肠杆菌病的环境中被生理扩增，并且还被B-细胞肿瘤生理扩增(参见Hayday，2000)。
除了它们的抗传染活性之外，在短期细胞毒性测定中表明Vγ9/Vδ2T细胞能够溶解各种源于极不相同起源的肿瘤细胞系：源于B-细胞、T-细胞或髓细胞谱系的淋巴瘤和白血病(Fisch et al.，1997；Selin et al.，1992；Sicard et al.，2001；Sturm et al.，1990；Zheng et al.，2001a)、乳腺癌(Bank et al.，1993)、成胶质细胞瘤(Fujimiya et al.，1997；Yamaguchi et al.，1997)、肾细胞癌(Choudhary et al.，1995；Kobayashi et al.，2001；Mitropoulos et al.，1994)、鼻咽癌(Zheng et al.，2001b)、肺腺癌(Ferrarini et al.，1996)。
在微生物中，Vγ9/Vδ2+淋巴细胞自发地识别出结构相关的一组非肽抗原，称为天然的磷酸抗原(phosphoantigen)和烷基胺。在B细胞肿瘤中，对于γδT细胞的抗原的性质仍然没有被确认。Vγ9/Vδ2+淋巴细胞还对多种病毒性感染的、活化的或以前未接触过的肿瘤细胞类型有应答。同样，在这些情形下，起作用的抗原仍然是未知的(参见Fisch，2000)。已经表明：在体外，Vγ9/Vδ2+淋巴细胞对诸如治疗用氨基二磷酸酯(参见Espinosa，2001)的合成药物有应答，从而导致它们在体外的活化。天然非肽抗原的识别是由γδTCR通过位于Vγ9-和Vδ2-CDR3两个区域的氨基酸残基介导的。尽管都不涉及由CD1或MHC分子的处理和表达，但是由非肽抗原进行的Vγ9/Vδ2+淋巴细胞活化似乎需要细胞与细胞的接触(Lang，1995；Morita，1995；Miyagawa，2001；Rojas，2002)。
已经表明刺激性的细菌抗原是小的非肽化合物，典型的是称之为磷酸抗原(Behr et al.，1996；Belmant et al.，2000；Constant et al.，1994；Poquet et al.，1998；Tanaka et al.，1995)，原因是在多数情况下存在磷酸根基团。
Vγ9/Vδ2T细胞还能够通过内源代谢物，如焦磷酸异戊烯基酯或IPP(Espinosa et al.，2001b；Tanaka et al.，1995)来活化(在微摩尔范围内起作用)，该内源代谢物是通过由微生物和哺乳动物细胞共有的常规的甲羟戊酸盐(酯)途径产生的。在后者的细胞中IPP的产生在细胞应激反应和转化的情形中可以被增量调节。特别是最新的研究报道了在肿瘤细胞中IPP的内源生产水平与它们对于Vγ9/Vδ2T细胞介导的溶解的敏感性之间的相关性(Gober et al.，2003)。
同样符合甲羟戊酸盐(酯)途径的内源代谢物对Vγ9/VδT细胞识别的直接贡献，用药理学试剂阻止IPP生物合成(如抑制素)或致使IPP积聚(如氨基二磷酸酯，参见下文)的细胞处理分别导致经处理细胞的Vγ9/VδT细胞刺激性能的降低或增强(Gober et al.，2003；Kato et al.，2001)。
氨基二磷酸酯被认为抑制FPP合成酶，这是甲羟戊酸盐(酯)途径中的一种酶，对该酶的抑制引起上游诸如IPP的类异戊二烯脂类的积聚和释放。氨基二磷酸酯(盐)化合物已经被用在人类治疗中，用于治疗癌症患者的骨转移，并对由磷酸抗原促效剂诱导的人类Vγ9/Vδ2+淋巴细胞在体内的扩展提供了第一组证据，报道称在治疗性静脉注射60-90mg的帕米膦酸钠(pamidronate)后一至三周内患有多发性骨髓瘤的成人体内增加了γδT细胞的循环(Kunzmann etal.，1999)。但是，这样的化合物要求提供抗原的细胞的存在，并且不能产生如同在纯Vγ9/Vδ2T细胞培养中由细胞因子分泌物所确定的对Vγ9/Vδ2T细胞活性的实质性刺激。而且，帕米膦酸钠表现出非常低的γδT细胞的活化效能，据报道γδT细胞计数最佳仅增加了2倍(Wilhelm et al.，2003)。
最近，公开了几种高度有效的γδT细胞活化的含有焦磷酸酯(盐)的化合物，它们直接活化γδT细胞。尤其是，由J.J.Fournie小组公开了磷酸卤代醇(phosphalohydrin)和磷酸环氧化物(phosphoepoxyde)化合物。(R，S)-3-(溴甲基)-3-丁醇-1-基-二磷酸酯，也称作BrHPP(溴代醇焦磷酸酯)，目前被用于正在进行的人类临床研究中，用来刺激在体外的γδT细胞的增殖。其他具有高比活性(毫微摩尔或更佳范围的EC50)的含有焦磷酸酯的化合物通过被称为“Rohmer”或“非甲羟戊酸盐(酯)”途径的类异戊二烯生物合成途径产生，该途径为原核微生物(pro-)和真核微生物的专用途径(Feurle et al.，2002；Jomaa et al(2003)；Jomaa et al.，1999a；Jomaa et al，.1999b；Rohmer et al.，1993)。
尽管如前所述，但仍对提供γδT细胞活化的新化合物，尤其是具有增加的效力和/或优选药效性能的化合物存在需要。这样的化合物对于应该是无毒性治疗的那些无生命威胁或慢性治疗适应症具有特别的优点。
发明内容
本发明现披露一种新类型的具有γδT细胞活化性能的化合物。这种新类型的化合物包括氨基磷酸酯。诸位发明人已经发现在此描述的这类化合物具有增加的效能，高于由本发明人以前试验的其他调节γδT细胞活性的化合物。另外，这类化合物在其EC100(组合物相对于γδT细胞的这种活性产生其最大应答或作用的有效浓度)处可实现比其他化合物更大的γδT细胞活化作用。
这些化合物可以用来有效地调节γδT细胞的活性，尤其是受治疗者体内的γδT细胞，优选为Vγ9/Vδ2T细胞的活化和增殖。这些新γδT细胞活化剂可以根据本文中所描述的任何方法来使用。这些化合物特别适合于免疫疗法，特别是治疗具有肿瘤的受治疗者或患有其他疾病，尤其是传染性疾病、自身免疫性疾病或过敏性疾病的受治疗者。根据本发明的化合物也可以用作疫苗佐剂。
在一个方面，本发明提供了一种化学式(I)的化合物(γδT细胞活化剂)：
Figure A20048003565700111
化学式(I)
其中，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)；
m是1到3的一个整数；
B是O、NH、或任何能够水解的基团；
Y＝O-Cat+、C1-C3烷基、-A-R基、或选自由核苷、寡聚核苷酸、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、单糖、寡聚糖、多糖、脂肪酸、单纯脂、复合脂、叶酸、四氢叶酸、磷酸、肌醇、维生素、辅酶、类黄酮、醛、环氧化物(epoxyde)以及卤代醇构成的组中的一个基团；
A是O、NH、CHF、CF2或CH2；以及
R是一个直链的、支链的、或环状的、芳香或非芳香的、饱和或不饱和的、C1-C50烃基，任选被至少一个杂原子中断，其中，所述烃基包括烷基、烯基、或炔基，优选烷基或烯基，该烃基能够被一个或几个选自由烷基、烯基、炔基、环氧烷基、芳基、杂环、烷氧基、酰基、醇、羧基(-COOH)、酯、胺、氨基(-NH2)、酰胺(-CONH2)、亚胺、腈、羟基(-OH)、醛基(-CHO)、卤素、卤代烷基、硫醇(-SH)、硫代烷基、砜、亚砜、及其组合构成的组中的取代基所取代。
在一个优选实施例中，所述活化剂是化学式(X)的一种化合物：
其中，相同或不同的R3、R4以及R5是氢或(C1-C3)烷基，W是-CH-或-N-，R6是(C2-C3)酰基、醛、(C1-C3)醇、或(C2-C3)酯，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)，B是O或NH，m是1到3的一个整数，以及Y是O-Cat+、核苷、-A-R基，其中，A是O、NH、CHF、CF2或CH2，并且R选自由1)、2)或3)构成的组。
在另一方面，所述活化剂选自由下列化学式所构成的组中的一种化合物：
化学式(XI)：
化学式(XII)：
化学式(II)：
Figure A20048003565700133
其中，在所述化学式II、XI以及XII中：X是卤素(优选选自I、Br和Cl)，B是O或NH，m是1到3的一个整数，R1是甲基或乙基，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)，并且n是2到20的一个整数，以及Y是O-Cat+、核苷、-A-R基，其中，A是O、NH、CHF、CF2或CH2，并且R选自由1)、2)或3)构成的组。
在另一实施例中，该γδT细胞活化剂是化学式(III)的一种化合物：
Figure A20048003565700141
在另一实施例中，该γδT细胞活化剂是化学式(V)的一种化合物：
Figure A20048003565700142
在另一实施例中，该γδT细胞活化剂是化学式(VI)的一种化合物：
Figure A20048003565700143
其中，R1是甲基或乙基，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)，B是O或NH，m是1到3的一个整数，并且n是2到20的一个整数，以及γ是O-Cat+、核苷、-A-R基，其中，A是O、NH、CHF、CF2或CH2，并且R选自由1)、2)或3)构成的组。
本发明还提供了包括一种根据本文中所描述的任何一个实施例的γδT细胞活化剂的药物组合物。同样提供了用于调节，优选活化γδT细胞的方法，该方法包括使γδT细胞与本文中所描述的γδT细胞活化化合物相接触。应当明了，本发明的化合物可以用来在体外或体内活化γδT细胞。在体外活化的γδT细胞经活化后可以用在任何适宜的方法中，包括疾病的治疗或预防。在一个优选实施例中，将活化的γδT细胞给予哺乳动物，优选给予人类。在一优选的方面，本发明包括一种治疗方法，其包括(a)使一个γδT细胞与本文中所描述的一种γδT细胞活化化合物相接触，以及(b)将步骤(a)的γδT细胞给予一名受治疗者。制备用于这类应用的γδT细胞的方法在本领域是已知的，例如可以用都是由Romagne和Laplace于2004年8月19日提交的US 10/505,252以及于2003年2月21日提交的PCT/FR 03/00585中所描述的方法来实施，将其全部内容通过引证结合于本文中。
还提供了调节，优选活化γδT细胞的方法，包括将本文中所描述的γδT细胞活化剂给予受治疗者。在诸优选实施例中，本发明提供了一种用于治疗或预防疾病的方法，包括将本文中所描述的γδT细胞活化剂以足以改善或预防所述疾病的量对受治疗者给药。还提供了将本发明的γδT细胞活化剂应用于制备对人类受治疗者体内的γδT细胞进行调节的药物组合物。优选所述疾病是一种肿瘤或增殖紊乱、传染性疾病、自身免疫性疾病或过敏性疾病。
本发明进一步提供了用于合成氨基磷酸酯化合物的方法。一方面，本发明提供一种用于制备氨基二磷酸单酯化合物的方法，其包括：
(a)在一个偶联步骤中使烷基卤R-X与氨基磷酸二乙酯或氯代磷酸二乙酯试剂进行反应；
(b)使在步骤(a)中制备的化合物在一个皂化步骤中进行反应，从而去除O-乙基；以及
(c)使在反应步骤(b)中制备的化合物在一个磷酸化步骤中进行反应，从而制备氨基二磷酸单酯，
其中，R是一个直链的、支链的、或环状的、芳香或非芳香的、饱和或不饱和的、C1-C50烃基，任选被至少一个杂原子中断，其中，所述烃基包括烷基、烯基、或炔基，优选烷基或烯基，该烃基能够被一个或几个选自由烷基、烯基、炔基、环氧烷基、芳基、杂环、烷氧基、酰基、醇、羧基(-COOH)、酯、胺、氨基(-NH2)、酰胺(-CONH2)、亚胺、腈、羟基(-OH)、醛基(-CHO)、卤素、卤代烷基、硫醇(-SH)、硫代烷基、砜、亚砜、及其组合构成的组中的取代基所取代，并且其中X是在适当条件下能够被氨基磷酸二乙酯基团替代的部分(moiety)。根据由R提供的官能团的类型和反应活性，技术人员能够调整下面的实施例，如果必要，可包括对敏感官能团或那些能与偶联反应相互作用的基团的保护/去保护的阶段。在一个实施例中，X是NH2基，而所述R-X化合物在一个偶联步骤中与氯代磷酸二乙酯化合物进行反应。在另一实施例中，X选自由I、Br和Cl构成的组。另一方面，本发明提供了制备(E)-2-(4-叠氮基-2-甲基丁-2-烯基氧基)四氢-2H-吡喃化合物的方法，包括提供一种(E)-2-(4-氯-2-甲基丁-2-烯基氧基)四氢-2H-吡喃化合物，并且在相转移催化剂存在下使所述化合物在水-戊烷两相混合物中与叠氮化钠进行反应。
文本中将进一步提供其他实施例及细节。
附图说明
图1示出了体外剂量应答曲线和本发明的N-HDMAPP化合物以及对照化合物BrHPP和HDMAPP的EC50值。本发明的化合物不仅表现出比在其之下最有效力的化合物增加了3-4倍的效能，而且当通过TNFα释放观察到增加了γδT细胞的绝对活化。
具体实施方式
定义
在本发明的上下文中，“调节γδT细胞的活性”的表述是指引起或有助于增加受治疗者体内的这种细胞的数量和/或生物活性。因此调节包括但不限于调制(例如，刺激)受治疗者体内的这种细胞的扩展和/或，例如，触发细胞因子分泌(例如，TNFα或IFNγ)。如所指出的那样，γδT细胞通常代表一个健康成人受治疗者体内的总循环淋巴细胞的在约1-10％之间。本发明可以用来显著增加受治疗者体内的γδT细胞群，尤其可达到总循环淋巴细胞的至少10％、12％、15％、20％、或30-90％，通常为40-90％，更优选为50-90％。在典型的实施例中，本发明允许受治疗者体内的γδT细胞选择性扩展，达到整个循环淋巴细胞的60-90％，优选70-90％，更优选为80-90％。调节还包括，以附加方式或替代方式调制受治疗者体内的γδT细胞的生物活性，尤其是它们的细胞溶解活性或它们的细胞因子分泌活性。本发明对于增加指向靶标细胞的γδT细胞的生物活性定义了新的条件和策略。
在使用“包括”一词之处，可优选将其替换为“基本上由……组成”，更优选将其替换为“由……组成”。
在前后文中所使用的数值项之处，其含义是包括表示上限和下限的数值。例如，“在1和3之间”代表“从包括1直到并包括3”的范围，并且“在从1到3的范围中”表示“从包括1直到并包括3”。其中当用表示数字的数词(例如，“三”)代替数字(例如，3)时，也是同样的意思。
在连同数量一起使用“约”之处，其优选的含义是数量+/-15％，更优选为数量加5％，最优选为数量本身没有“约”。例如，“约100”表示“从并包括85到并包括115”。在连同数值范围一起使用“约”之处，例如“约1到约3”、或“在约1到约3之间”，优选将前一句中对一个数量给出的“约”的定义应用于每一个分别定义一个范围的开始和结束的数量。优选地，在“约”可连同任何数值一起使用之处，该“约”可以被删除。
“每周”表示“约一周一次”(含义是在所做的多于一个治疗的各治疗之间有约一周的间隔)，在此，约优选的含义是+/-1天(也就是，翻译成“每6到8天”)；最优选地，“每周”表示“每7天一次”。
如本文中所使用的，有关调节γδT细胞活性的术语“EC50”指的是实验组合物相对于这种γδT细胞的活性产生其50％的最大应答或作用的有效浓度。
如本文中所使用的，有关调节γδT细胞活性的术语“EC100”指的是实验组合物相对于这种γδT细胞的活性产生其最大应答或作用的有效浓度。
新类型的γδT淋巴细胞活性剂：氨基磷酸酯
由本发明的发明人描述的新类型的化合物包括氨基磷酸酯。本发明人发现了这类化合物比本发明人以前所试验的调节γδT细胞活性的化合物表现出增加的效能。另外，本发明的化合物在它们的EC100处(组合物相对于这种γδT细胞的活性产生其最大应答和作用的有效浓度)能够比其他化合物实现更大的γδT细胞活化作用。虽然不希望被理论所限，但是本发明的发明人提出了NH基的存在可导致经对化合物的靶标的改性的键合-总体上增大了键合强度-例如与焦磷酸酯化合物相比可能是由于H键合的意义。这种对H键合意义的改性可以提供独特的药理学性质，例如靶标结合亲合力、ADME性质(吸收、分布、代谢和分泌)。在另一优选实施例中，本发明的化合物还具有理想的体内稳定性，优选比其它可获得的化合物具有更长的半衰期。在血液中增加的稳定性会对实现改善的整个体内γδT细胞的刺激很有用处。
根据本发明的新类型的γδT淋巴细胞活化剂包括化学式(I)的化合物：
Figure A20048003565700191
化学式(I)
其中，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)；
m是1到3的一个整数；
B是O、NH、或任何能够水解的基团；
Y＝O-Cat+、C1-C3烷基、-A-R基、或选自由核苷、寡聚核苷酸、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、单糖、寡聚糖、多糖、脂肪酸、单纯脂、复合脂、叶酸、四氢叶酸、磷酸、肌醇、维生素、辅酶、类黄酮、醛、环氧化物以及卤代醇构成的组中的一个基团；
A是O、NH、CHF、CF2或CH2；以及
R是一个直链的、支链的、或环状的、芳香或非芳香的、饱和或不饱和的C1-C50烃基，任选被至少一个杂原子中断，其中，所述烃基包括烷基、烯基、或炔基，优选烷烃基或烯烃基，该烃基能够被一个或几个选自由烷基、烯基、炔基、环氧烷基、芳基、杂环、烷氧基、酰基、醇、羧基(-COOH)、酯、胺、氨基(-NH2)、酰胺(-CONH2)、亚胺、腈、羟基(-OH)、醛基(-CHO)、卤素、卤代烷基、硫醇(-SH)、硫代烷基、砜、亚砜、及其组合构成的组中的取代基所取代。
在一特别的实施例中，上面定义的取代基被至少一个如上述限定的取代基所取代。
优选地，该取代基选自由下述基团构成的组：(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C2-C6)环氧烷基、芳基、杂环、(C1-C6)烷氧基、(C2-C6)酰基、(C1-C6)醇、羧基(-COOH)、(C2-C6)酯、(C1-C6)胺、胺基(-NH2)、酰胺(-CONH2)、(C1-C6)亚胺、腈、羟基(-OH)、醛基(-CHO)、卤素、(C1-C6)卤代烷基、硫醇(-SH)、(C1-C6)硫代烷基、(C1-C6)砜、(C1-C6)亚砜、及其组合。
更优选地，该取代基选自由下述基团构成的组：(C1-C6)烷基、(C2-C6)环氧烷基、(C2-C6)烯基、(C1-C6)烷氧基、(C2-C6)酰基、(C1-C6)醇、(C2-C6)酯、(C1-C6)胺、(C1-C6)亚胺、羟基、醛基、卤素、(C1-C6)卤代烷基、及其组合。
进一步更优选地，该取代基选自由下述基团构成的组：(C3-C6)环氧烷基、(C1-C3)烷氧基、(C2-C3)酰基、(C1-C3)醇、(C2-C3)酯、(C1-C3)胺、(C1-C3)亚胺、羟基、卤素、(C1-C3)卤代烷基、及其组合。优选地，R是(C3-C25)烃基，更优选的是(C5-C10)烃基。
在本发明的上下文中，术语“烷基”更具体地是指基团如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、以及它们的其他异构形式。(C1-C6)烷基更具体地指甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、以及它们的其他异构形式。(C1-C3)烷基更具体地指甲基、乙基、丙基、或异丙基。
术语“烯基”指的是上述定义的具有至少一个不饱和乙烯键的烷基，而术语“炔基”指的是上述定义的具有至少一个不饱和乙炔键的烷基。(C2-C6)烯基包括乙烯基、丙烯基(1-丙烯基或2-丙烯基)、1-或2-甲基丙烯基、丁烯基(1-丁烯基、2-丁烯基、或3-丁烯基)、甲基丁烯基、2-乙基丙烯基、戊烯基(1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基)、己烯基(1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基)、以及它们的其他异构形式。(C2-C6)炔基包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、或5-己炔基以及它们的其它异构形式。
术语“环氧烷基”指的是上述定义的具有环氧基的烷基。更具体地，(C2-C6)环氧烷基包括环氧乙基、环氧丙基、环氧丁基、环氧戊基、环氧己基、以及它们的其他异构形式。(C2-C3)环氧烷基包括环氧乙基和环氧丙基。
“芳”基是具有6到18个碳原子的单、双、或三-环芳香烃。实例尤其包括苯基、α-萘基、β-萘基或蒽基。
“杂环”基是含有5到18个环的基团，这些环包括一个或多个杂原子，优选1到5个桥环杂原子。它们可以是单、双或三环。它们可以是芳香的或者非芳香的。优选地，并且更具体地针对R5，它们是芳香杂环。芳香杂环的实例包括吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、呋喃、噻吩、吡咯、噁唑、噻唑、异噻唑、咪唑、吡唑、噁二唑、三唑、噻二唑以及三嗪基。双环的实例包括尤其是喹啉、异喹啉和喹唑啉基(有两个六元环)以及吲哚、苯并咪唑、苯并噁唑、苯并噻唑和吲唑(有一个六元环和一个五元环)。非芳香杂环包括尤其是哌嗪、哌啶等。
“烷氧基”对应于上述定义的烷基通过-O-(醚)键连接到分子上。(C1-C6)烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、以及它们的其他异构形式。(C1-C3)烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、以及异丙氧基。
“酰基”对应于上述定义的烷基通过-CO-(羰基)基连接到分子上。(C2-C6)酰基包括乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、及其其他的异构形式。(C2-C3)酰基包括乙酰基、丙酰基和异丙酰基。
“醇”基对应于上述定义的烷基含有至少一个羟基。醇可以是伯、仲或叔醇。(C1-C6)醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、以及它们的其他异构形式。(C1-C3)醇包括甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。
“酯”基对应于上述定义的烷基通过-COO-(酯)键连接到分子上。(C2-C6)酯包括甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、以及它们的其他异构形式。(C2-C3)酯包括甲酯和乙酯。
“胺”基对应于上述定义的烷基通过-N-(胺)键连接到分子上。(C1-C6)胺包括甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、以及它们的其他异构形式。(C1-C3)胺包括甲胺、乙胺、以及丙胺。
“亚胺”基对应于上述定义的烷基具有(-C＝N-)键。(C1-C6)亚胺包括亚甲胺、亚乙胺、亚丙胺、亚丁胺、亚戊胺、亚己胺、以及它们的其他异构形式。(C1-C3)亚胺包括亚甲胺、亚乙胺和亚丙胺。
卤素可以是Cl、Br、I、或F，更优选为Br或F。
“卤代烷”基对应于上述定义的烷基具有至少一个卤素。它们可以是含有相同或不同卤素原子的单卤代或多卤代的基团。例如，该基团可以是三氟代烷基(CF3-R)。(C1-C6)卤代烷基包括卤代甲基、卤代乙基、卤代丙基、卤代丁基、卤代戊基、卤代己基、以及它们的其他异构形式。(C1-C3)卤代烷基包括卤代甲基、卤代乙基和卤代丙基。
“硫代烷”基对应于上述定义的烷基通过-S-(硫醚)键连接到分子上。(C1-C6)硫代烷基包括硫代甲基、硫代乙基、硫代丙基、硫代丁基、硫代戊基、硫代己基以及它们的其他异构形式。(C1-C3)硫代烷基包括硫代甲基、硫代乙基和硫代丙基。
“砜”基对应于上述定义的烷基通过-SOO-(砜)键连接到分子上。(C1-C6)砜包括甲砜、乙砜、丙砜、丁砜、戊砜、己砜、以及它们的其他异构形式。(C1-C3)砜包括甲砜、乙砜和丙砜。
“亚砜”基对应于上述定义的烷基通过-SO-(亚砜基)连接到分子上。(C1-C6)亚砜包括亚甲砜、亚乙砜、亚丙砜、亚丁砜、亚戊砜、亚己砜、以及它们的其他异构形式。(C1-C3)亚砜包括亚甲砜、亚乙砜、亚丙砜和异亚丙砜。
“杂原子”指N、S、或O。
“核苷”包括腺(嘌呤核)苷、胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷。
在一特别实施例中，烃基是一环烯基，如环戊二烯或苯基，或一杂环，如呋喃、吡咯、噻吩、噻唑、咪唑、三唑、吡啶、嘧啶、吡喃、吡嗪。优选地，该环烯基或杂环选自由环戊二烯、吡咯、或咪唑构成的组。在一优选的实施例中，该环烯基或杂环由醇取代。优选地，所述醇是(C1-C3)醇。
在另一实施例中，烃基是具有一个或几个双键的烯基。优选地，该烯基具有一个双键。优选地，该烯基是(C3-C10)烯基，更优选地是(C4-C7)烯基。优选地，所述烯基被至少一个官能团取代。更优选地，该官能团选自由羟基、(C1-C3)烷氧基、醛基、(C2-C3)酰基、或(C2-C3)酯基所构成的组。在一个更优选的实施例中，该烃基是被-CH2OH基取代的丁烯基。任选地，所述烯基可以是反式(E)或顺式(Z)异构形式，更优选的为反式异构形式(E)。在一个最优选的实施例中，该烯基是(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基。在另一个优选实施例中，该烯基是异戊烯基、二甲基烯丙基或羟基二甲基烯丙基。
在另外一个实施例中，该烃基是被酰基取代的烷基。更优选地，该烃基是被(C1-C3)酰基取代的(C4-C7)烷基。
在一进一步优选的实施例中，R选自由下列基团构成的组：
其中，n是2到20的一个整数，R1是(C1-C3)烷基，并且R2是卤代的(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基-(C1-C3)烷基、卤代的(C2-C3)酰基或(C1-C3)烷氧基-(C2-C3)酰基。优选地，R1是甲基或乙基，并且R2是卤代甲基(-CH2-X，X是一卤素)、卤代(C2-C3)乙酰基、或(C1-C3)烷氧基-乙酰基。卤代甲基或乙酰基可以是单-、二-、或三-卤代的。优选地，n是2到10，或2到5的一个整数。在一更优选实施例中，n是2。在一最优选的实施例中，n是2，R1是甲基而R2是卤代甲基，更优选为单卤代甲基，再更优选的是溴代甲基。在一个特别优选的实施例中，n是2，R1是甲基，R2是溴代甲基。在一个最优选的实施例中，R是3-(溴甲基)-3-丁醇-1-基。
Figure A20048003565700251
其中，n是2到20的一个整数，并且R1是甲基或乙基。优选地，n是2到10，或2到5的一个整数。在一更优选的实施例中，n是2而R1是甲基。
Figure A20048003565700252
其中，相同或不同的R3、R4、以及R5是氢或(C1-C3)烷基，W是-CH-或-N-，并且R6是(C2-C3)酰基、醛基、(C1-C3)醇、或(C2-C3)酯。更优选地，R5是甲基而R3和R4是氢。更优选地，R6是-CH2-OH、-CHO、-CO-CH3或-CO-OCH3。再更优选地，R6是-CH2-OH。更优选地，W是-CH-。任选地，在W和C之间的双键是反式(E)或顺式(Z)构象。更优选地，在W和C之间的双键是反式(E)构象。
基团Y可以允许设计一个前药。因此，Y是不稳定酶基(enzymolabile group)，其可以在受治疗者的特定区域被分开。基团Y也可以是靶向基团。在一优选的实施例中，Y是O-Cat+、-A-R基、或选自由核苷、单糖、环氧化物以及卤代醇构成的组中的一个基团。优选地，Y是不稳定酶基。优选地，Y是O-Cat+、-A-R基、或核苷。在第一优选实施例中，Y是O-Cat+。在第二优选实施例中，Y是核苷。
在一优选实施例中，Cat+是H+、Na+、NH4 +、K+、Li+、(CH3CH2)3NH+、赖氨酸、或任何其他合适的药学可接受的阳离子。
在一优选实施例中，A是O、CHF、CF2或CH2。更优选地，A是O或CH2。
在一优选实施例中，B是O或NH。更优选地，B是O。
在一优选实施例中，m是1或2。更优选地，m是1。
在一个特别的实施例中，根据本发明的氨基磷酸酯包括化学式(II)的化合物：
Figure A20048003565700261
其中，X是卤素(优选选自I、Br和Cl)，B是O或NH，m是1到3的一个整数，R1是甲基或乙基，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)，并且n是2到20的一个整数，而Y是O-Cat+、核苷、或-A-R基，其中A是O、NH、CHF、CF2或CH2，并且R选自由1)、2)或3)构成的组。优选地，Y是O-Cat+或核苷。更优选地，Y是O-Cat+。优选地，R1是甲基。优选地，n是2。优选地，X是溴。优选地，B是O。优选地，m是1或2。更优选地，m是1。
例如，根据本发明的氨基磷酸酯包括化学式(III)的化合物：
Figure A20048003565700271
其中，X、R1、n、m以及Y具有上述含义。
在一个优选实施例中，根据本发明的氨基磷酸酯包括化学式(IV)的化合物：
Figure A20048003565700272
其中，X是卤素(优先选自I、Br和Cl)，R1是甲基或乙基，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)，并且n是2到20的一个整数。优选地，R1是甲基。优选地，n是2。优选地，X是溴。
在一最优选的实施例中，根据本发明的氨基磷酸酯包括化学式(V)的化合物：
优选地，x Cat+是1或2Na+。
在一个特定实施例中，根据本发明的氨基磷酸酯包括式(VI)的化合物：
其中，R1是甲基或乙基，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)，B是O或NH，m是1到3的一个整数，并且n是2到20的一个整数，而Y是O-Cat+、核苷、或-A-R基，其中A是O、NH、CHF、CF2或CH2，并且R选自由1)、2)或3)构成的组。优选地，Y是O-Cat+或核苷。更优选地，Y是O-Cat+。优选地，R1是甲基。优选地，n是2。优选地，B是O。优选地，m是1或2。更优选地，m是1。
例如，根据本发明的氨基磷酸指包括化学式(VII)的化合物：
Figure A20048003565700282
其中，R1、n、m以及Y具有上述含义。
在一个优选的实施例中，根据本发明的氨基磷酸酯包括化学式(VIII)的化合物：
Figure A20048003565700283
其中，R1是甲基或乙基，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)，并且n是2到20的一个整数。优选地，R1是甲基。优选地，n是2。
在一最优选的实施例中，根据本发明的氨基磷酸酯包括化学式(IX)的化合物：
Figure A20048003565700291
优选地，xCat+是1或2Na+。
在一个特定实施例中，根据本发明的氨基磷酸指包括化学式(X)的化合物：
其中，相同或不同的R3、R4、以及R5是氢或(C1-C3)烷基，W是-CH-或-N-，R6是(C2-C3)酰基、醛基、(C1-C3)醇、或(C2-C3)酯，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)，B是O或NH，m是1到3的一个整数，而Y是O-Cat+、核苷、或-A-R基，其中A是O、为NH、CHF、CF2或CH2，并且R是选自由1)、2)或3)构成的组。优选地，Y是O-Cat+，或核苷。更优选地，Y是O-Cat+。更优选地，R3和R4是氢并且R5是甲基。更优选地，R6是-CH2-OH、-CHO、-CO-NH2、-NH2或-CO-OCH3。再更优选地，R6是-CH2-OH。更优选地，W是-CH-。优选地，B是O。优选地，m是1或2。更优选地，m是1。任选地，在W和C之间的双键是反式(E)或顺式(Z)构象。更优选地，在W和C之间的双键是反式(E)构象。
例如，根据本发明的氨基磷酸酯包括化学式(XI)的化合物：
其中，R3、R4、R5、R6、W、m、以及Y具有上述含义。优选地，W是-CH-或-N-。优选地，R3和R4是氢。优选地，R5是甲基。优选地，R6是-CH2-OH。
在一最优选的实施例中，根据本发明的氨基磷酸酯包括化学式(XII)的化合物：
这些化合物可以根据各种技术，例如，利用PCT公开号为WO00/12516、WO 00/12519、WO 03/050128、以及WO 03/009855所披露的方法进行制备，将其全部内容通过引证的方式合并入本文中。
在一最优选的实施例中，合成的γδT淋巴细胞活化的化合物选自由N-HDMAPP、N-Epox-PP、以及N-BrHPP构成的组，更优选的为N-HDMAPP和N-BrHPP，再更优选的为N-HDMAPP。
根据本发明的氨基磷酸酯例如可以通过下面的反应(反应A、A(1)、A(2)、A(3)、B、C或C(1))来制备。
氨基二磷酸单酯方案：反应A
氨基二磷酸单酯可选替换方案：反应A(1)
Figure A20048003565700312
根据本发明的氨基二磷酸单酯还可以利用下面的两个反应(反应A(2)、A(3))来制备。这些合成方案优选用于较大规模的氨基二磷酸单酯的制备，并且牵涉到氨基单磷酸单酯中间体的形成，由于该中间体被认为是一个潜在的代谢或降解产物使人们有兴趣将其用于药物开发。
氨基二磷酸单酯的可选替换方案：反应A(2)：
当起始烷基前体(R-NH2)不易于取得时，就可有利地采用反应A(2)，该起始分子优选为烷基卤R-X，其中X＝I、Br或Cl。
Figure A20048003565700321
A(2)的偶联步骤包括锂盐从可商购的氨基磷酸二乙酯(NH2-P(OEt)2)的去质子化的原位制备。这种偶联步骤可以依照由Cox等人(2002)所报道的程序来进行，将其披露的内容通过引证的方式合并入本文中。
反应A(2)的皂化步骤包括导致O-乙基酯官能团完全去除的两步过程。该反应必须优选在自然或碱性条件下进行，以便防止氨基磷酸酯键(P-NH键)的水解。该反应可以用溴化三甲基硅烷(TMSBr)进行，随后按Valentijn等人(1991)所描述的用四丁基氟化铵(Bu4NF)或者按Valentijn等人(1995)所描述的在对称的三甲基吡啶(除酸剂)存在下利用TMSBr除去所得到的TMS-酯，并且随后用四丁基氢氧化铵(Bu4NOH)对得到的TMS-酯进行碱性水解。将上述参考文献披露的内容通过引证的方式合并入本文中。
反应A(2)的磷酸化步骤可以按两种方式进行：
(i)氨基单磷酸酯中间体与吗啉基磷酸酯试剂(四丁基铵盐)的反应，所述吗啉基磷酸酯试剂由可商购的氯代磷酸二甲酯进行的制备将在下面进行详细描述(反应A(2)(a))。该反应可以依照Valentijn等人(1991)用于焦磷酸酯类似物的合成过程来进行；或
(ii)氨基单磷酸酯中间体与作为偶联剂的三氯乙腈(CCl3CN)以及少于2当量的可商购磷酸二氢四丁铵(Bu4N)H2PO4反应。
吗啉基磷酸酯试剂的制备：反应A(2)(a)：
氨基二磷酸单酯的可选替换方案：反应A(3)：
反应A(3)的偶联步骤包括在三乙胺(TEA)存在下烷基胺前体与可商购的氯化磷酸二乙酯的反应。该反应可以依照Nikolaides等人在(Conversion of Amines to Phosphoesters：decyl diethyl phosphate，Organic Synetheses，CV 9，194)中所描述的过程来进行。对于皂化和磷酸化步骤的条件与上述报道(反应A(2))的那些条件类似。
根据由R提供的官能团的类型和反应活性，本领域技术人员能够调整在此给出合成实例，如果必要包括对敏感官能团或那些与偶联反应相互作用的基团的保护/去保护阶段。
酰亚胺-氨基二磷酸单酯方案：反应B
氨基三磷酸单酯方案：反应C
Figure A20048003565700341
氨基三磷酸单酯的可选替换方案：反应C’
Figure A20048003565700342
A、B以及C反应可用如Sato等人(1990)和Chu等人(1983)所描述的利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)作为偶联试剂来进行。无机试剂Na2HP2O7(焦磷酸二钠)、Na4HNO6P2(亚氨二磷酸四钠)以及Na5O10P3(三磷酸五钠)是可商购的。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)经常用来在EDC存在下辅助碳化二亚胺偶联(Seghal & Vijay，1994)。将上述参考文献披露的内容通过引证的方式合并入本文中。
A、B以及C反应也可以在有如DCC(N，N’-二环己基碳化二亚胺)的碳化二亚胺试剂下利用二或三磷酸的有机盐在非水溶剂中进行。碳化二亚胺已经广泛用于正磷酸酯和焦磷酸酯、核苷、环状磷酸酯、寡核糖核苷酸、多核苷酸、核苷-5’-氨基磷酸酯、以及混合酸酐的合成(Azzi et al.，1984)，将其披露的内容通过引证的方式合并入本文中。
可选替换的反应A(1)和C’可以依照在Zhang和Poulter(1993)中描述的过程来进行(其披露内容通过引证的方式合并入本文中)，并用三氯乙腈(CCl3CN)作为偶联试剂。无机试剂磷酸二氢四丁铵(Bu4N)H2PO4是可商购的。
上述反应涉及能够与碳化二亚胺(EDC)或三氯乙腈(CCl3CN)试剂反应的化合物R-NH2的敏感官能团的保护。
氨基磷酸单酯可以根据由Zhang和Poulter(1993)所报道的方法用制备性HPLC在C18柱上进行提纯。或根据于2002年12月5日提交的国际专利申请公布第WO 03/05128号的方法利用含氨的异丙醇洗脱液用制备性色谱在硅胶上进行提纯。将上述参考文献披露的内容通过引证的方式合并入本文中。
包括以核苷作为Y基团的化合物，例如，可以通过下面的反应来制备。根据由Y提供的官能团的类型和反应活性，专业技术人员能够调整下面的实例，如果必要可以包括对敏感官能团或那些可以与偶联反应相互作用的基团的保护/去保护的阶段。
反应D
或
反应E
其中，-O-V是良好的离去基团，其开始于V，例如，选自甲苯磺酰基、甲磺酰基、三氟甲磺酰基、对溴苯磺酰基或溴，PP表示焦磷酸基，PPP表示三磷酸基，R-具有上述含义，并且Nucl是核苷。优选地，Nucl-O-V选自下面的组：5’-O-甲苯磺酰基腺苷、5’-O-甲苯磺酰基尿苷、5’-O-甲苯磺酰基胞苷、5’-O-甲苯磺酰基胸苷或5’-O-甲苯磺酰基-2’-脱氧腺苷。
例如，对于具有基团1)的R的化合物，反应过程可以如下：
Figure A20048003565700361
其中，-O-V是良好的离去基团，其开始于V，例如，选自甲苯磺酰基、甲磺酰基、三氟甲磺酰基、对溴苯磺酰基或溴，PP表示焦磷酸基，PPP表示三磷酸基，R-具有上述含义，并且Nucl是核苷。优选地，Nucl-O-V选自下面的组：如Davisson等人(1987)所描述的5’-O-甲苯磺酰基腺苷、5’-O-甲苯磺酰基尿苷、5’-O-甲苯磺酰基胞苷、5’-O-甲苯磺酰基胸苷或5’-O-甲苯磺酰基-2’-脱氧腺苷，将其披露的内容通过引证的方式合并入本文中。
亲核取代反应可以在与由Davisson等人(1987)和Davisson等人(1986)所描述的那些条件相近的条件下进行，将其披露的内容通过引证的方式合并入本文中。
这个反应也可以用于制备包括以单糖作为基团Y的化合物。在这种情形下，Nucl-O-V被MonoSac-O-V代替，其中Monosac是单糖。例如，有可能利用与Nilsson和Mosbach(1980)的公开文献所描述的甲基-6-O-甲苯磺酰基-α-D-吡喃半乳糖苷化合物(将其通过引证的方式合并入本文中)、或可商购的甘露糖-三氟甲烷磺酸酯(mannose triflate)化合物相对应的MonoSac-O-Y基团。
这个反应可以进一步用来制备包括以寡聚糖作为基团Y的化合物。在这种情形下，Nucl-O-V被oligoSac-O-V代替，其中oligoSac是寡聚糖。例如，有可能利用与在公开文献(Organic synthesese，Vol.77，p225-228，将其披露的内容通过引证的方式合并入本文中)中所描述的6A-O-p-甲苯磺酰基-β-环糊精化合物相对应的oligoSac-O-Y基团。
这个反应可以用于制备包括以多糖作为基团Y的化合物。在这种情形下，Nucl-O-V被polySac-O-V代替，其中polySac是多糖。例如，有可能利用对应于在Nisson等人(1981)；以及Nisson和Mosbach(1980)的公开文献中所描述的甲苯磺酰化多糖的polySac-O-Y基团，将其披露的内容通过引证的方式合并入本文中。这种基于由甲苯磺酰化支持的多糖羟基的活化的偶联技术允许在水性或有机介质中共价偶联。
这个反应也可以用于制备包括以一个醛衍生物作为基团Y的化合物，这是通过在Nucl之外选择一个包含受保护的醛官能团的衍生物，其形式为一个乙缩醛或任何其他保护该官能团的基团。
可选替换地，包括以一个核苷作为基团Y的化合物可以通过下面的反应进行制备：
反应F
其中，PPP表示三磷酸基，R-具有上述含义，DMF是二甲基甲酰胺，而Nucl是核苷。这个反应可以在与由Knorre等人(1976)描述的、或由Bloom等人在美国专利第5,639,653号(1997)中所描述的那些条件相近的条件下由醇和具有化学式Nucl-O-PPP的核苷进行反应，将其披露的内容通过引证的方式合并入本文中。
例如，对于具有基团1)的R的化合物，反应过程可以如下：
其中，PPP表示三磷酸基，DMF是二甲基甲酰胺，而Nucl是核苷。
这个反应也可以用于由Knorre等人(1976)的公开文献的作者们指出的寡聚核苷酸5’-三磷酸某酯的制备。
包括以核酸，更具体地以核糖核酸作为Y基团的化合物可以在与F.Huang等人(1997)描述的那些条件相近的条件下进行制备。这些作者描述了从催化RNA开始的一个通用方法，它适用于包括一个自由端磷酸酯基的任何分子。这些作者利用或提到在结构上涉及到诸如焦磷酸异戊烯酯或硫胺素焦磷酸的磷酸卤代醇基的化合物(参见p.8968 of F.Huang et al(1997))。也须指出在第8965页上《Reaction of Isolate 6 pppRNA with phosphate containingNucleophiles》的章节中所描述的用于偶联过程的实验条件(特别是pH条件)可与卤代醇官能团的存在相容。
包括以氨基酸、肽或蛋白质衍生物作为Y基团的化合物，可以利用其在环氧官能团上的伯胺或硫醇官能团的熟知的反应活性而获得(SN2反应)。这种偶联类型通常包括仍被称作“连接剂(linker)”的带有环氧官能团的一个中间基团。在下面提供了利用这种偶联类型的反应过程的一个实例。
                                                反应G
其中，PP表示焦磷酸基，R-具有上述含义，并且R’-SH是一种氨基酸、肽或蛋白质衍生物。第一阶段可以在与由Davisson等人(1987)和Davisson等人(1986)所描述的那些条件相近的条件下由起始化合物的四丁基铵盐与可商购的化合物如甲苯磺酸缩水甘油酯或表氯醇开始进行反应，将其披露的内容通过引证的方式合并入本文中。这个反应也可以用三磷酸酯化合物来进行。可选替换地，可以用伯胺R’-NH2代替R’SH。没有了与R’-SH的反应，第一反应可以用于制备包括一个环氧衍生物的化合物。
可选替换地，包括以氨基酸、肽或蛋白质衍生物作为Y基的化合物可以用下面的反应来制备：
反应H
其中，PPP表示三磷酸基，PP表示焦磷酸基，P表示磷酸基，R-具有上述含义，并且R’-NH是一种氨基酸、肽或蛋白质衍生物。该反应可以在与由Knorre等人(1976)所描述的那些条件相近的条件下由化合物(R-NH-PPP)与具有化学式为R’-NH2的一种氨基酸、肽或蛋白质开始进行，将其披露的内容通过引证的方式合并入本文中。这个反应涉及能够与碳化二亚胺反应的化合物R’-NH2的敏感官能团(尤其是，羰基官能团)的保护。
磷酸、焦磷酸、三磷酸、四磷酸或多磷酸的三或四-正丁基铵盐可以由可商购的相应的酸进行制备。与在Liu等人(1999)的公开文献中所描述的诸如甲烷三膦酸(methanetriphosphonic acid)的衍生物具有相关结构的衍生物也可以根据所述反应过程来制备，将其披露的内容通过引证的方式合并入本文中。
上述反应通过利用羟基、胺、磷酸酯或硫羟基官能团的反应活性可以外推到非常大范围的分子或生物分子。因此，纤维醇衍生物可以根据反应D或E通过羟基官能团的活化而制备。叶酸(维生素B9)或四氢叶酸的衍生物可以根据反应G或H通过借助于伯胺官能团的反应活性而制备。
当然，可以考虑到其他类型的偶联，并且专业技术人员可对大量的反应进行选择。
因此，通过羧酸或苯基的磷酸化的偶联可以用于形成脂肪酸、类脂或某些类黄酮衍生物。
氨基磷酸酯γδT淋巴细胞活化化合物可以是在体外或在体内产生的分子。其可以是经纯化的或其他人工制造的(例如，通过化学合成，或通过微生物方法)内源配体、或其片断或衍生物、或具有大致相同的抗原特异性的抗体。根据本发明的氨基磷酸酯优选能够选择性地活化Vγ9Vδ2T淋巴细胞。Vγ9Vδ2T淋巴细胞的选择性活化表明该化合物对特定细胞群具有选择性作用，并且基本上不活化其他的T细胞亚型，如γδ1T细胞。如本申请所披露的，这种选择性意味着优选的化合物可以对Vγ9Vδ2T淋巴细胞的增殖或生物活性引起选择性的或靶向性的活化。
在一优选的方面，该γδT细胞活化剂可以提高γδT细胞的生物活性，优选提高γδT细胞的活化，尤其是在有或还没有刺激γδT细胞扩展的情况下增加从γδT细胞的细胞因子分泌或增加γδT细胞的细胞溶解活性。在一典型的实施例中，如在体外测定的，γδT细胞活化剂允许通过γδT细胞的细胞因子分泌增加至少2、3、4、10、50、100倍。
细胞因子分泌及细胞溶解活性可以利用任何适当的体外测定，或在本文实施例中所提供的那些测定来进行评价。例如，细胞因子分泌可以根据在Espinosa等人在(J.Biol.Chem.，2001，Vol.276，Issue 21，18337-18334)中所描述的方法来测定，其描述了在生物测定中利用TNF-α-敏感细胞对TNF-α释放的检测。简而言之，用在100μl的培养基中在37℃下24h内添加25单位的IL2/孔的刺激来孵育104γδT细胞/孔。然后，将50μl的上清液加入50μl的WEHI细胞，以3×104细胞/孔平铺在添加放射菌素D(2μg/ml)和LiCl(40mM)的培养基中，并在37℃下孵育20h。TNF-α-敏感细胞的成活度用溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓测定来检测。每孔中加入50μl的溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓(Sigma，在磷酸缓冲盐水中为2.5mg/ml)，在37℃下培养4h后，加入50μl的增溶缓冲液(20％SDS、66％二甲基甲酰胺，pH为4.7)，并测定吸光度值(570nm)。然后由利用提纯的人体rTNF-α(PeproTech，Inc.，Rocky Hill，NJ)所得到的标准曲线计算TNF-α释放的浓度。由活化的T细胞所释放的干扰素-γ用夹心法酶联免疫吸附测定法来进行检测。用在100μl的培养基中在37℃下24h内添加的25单位的IL2/孔的刺激来孵育5×104γδT细胞/孔。然后，获得50μl的上清液用于利用鼠单克隆抗体的酶联免疫吸附测定法(BIOSOURCE，Camarillo，CA)。
一优选用于细胞溶解活性的测定是51Cr释放测定。在示例性测定中，γδT细胞的细胞溶解活性的测定比照了自体同源常规细胞系和肿瘤靶细胞系、或对照组的诸如Daudi的敏感靶细胞系以及对照组的诸如Raji的抗性靶细胞系在4h内的51Cr释放测定。在一特定实例中，以2×103细胞/孔的量使用靶细胞，并以100μCi51Cr进行60分钟的标记。效应物/靶标(E/T)比率范围从30∶1到3.75∶1。特异性溶解(以百分比表示)利用标准公式[(试验-自发的释放/总体-自发的释放)×100]来计算。
根据本发明的γδT淋巴细胞活化剂的用途
本发明涉及包括根据本发明的γδT细胞活化剂的一种药物组合物。更具体地，所述药物组合物包括治疗有效量的γδT细胞活化剂、任选一起包括药学可接受的一个载体。本发明还包括根据本发明的γδT细胞活化剂在药物制备中的应用，其优选用于治疗癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病或过敏性疾病。
一方面，本发明披露了用于调节人类受治疗者体内γδT细胞的方法，所述方法包括，在至少一次治疗中，给予治疗有效量的根据本发明的γδT细胞活化剂的步骤，任选与药学可接受的一个载体一起给予。更具体地，所述方法目的在于刺激人类受治疗者体内的γδT细胞。
在一特定实施例中，所述γδT细胞活化剂的量足够将人类受治疗者体内的γδT细胞群扩展达到总循环淋巴细胞的至少10％、15％、20％、30％、40％、50％或60％，或在30-90％之间。在另一个实施例中，所述γδT细胞活化剂的量足以诱导受治疗者体内的γδT细胞群增加至少10倍。优选地，所述γδT细胞群在给予所述γδT细胞活化剂后的第4天至第8天之间进行评价，更优选的是在给予所述γδT细胞活化剂后的第5、6或7天进行评价。优选地，所述γδT细胞群通过流式细胞计数法进行评价。优选地，所述γδT细胞是Vγ9Vδ2T细胞。
在一优选实施例中，本发明涉及一种用于治疗受治疗者体内的癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病或过敏性疾病的方法，所述方法包括，在至少一次治疗中，给予治疗有效量的根据本发明的γδT细胞活化剂的步骤，任选与一个药学可接受的载体一起给予。
在上述方法和应用中，受治疗者优选为人类受治疗者，如患有癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病或过敏性疾病的受治疗者。的确，本发明适合于治疗由于存在对γδT细胞溶解敏感的病态细胞所引起的或相关的所有症状。
本发明尤其适于刺激具有实体肿瘤或造血细胞肿瘤(hematopoietic tumor)的受治疗者的抗肿瘤免疫力。优选地，所述肿瘤选自由肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或表皮样头或颈部肿瘤构成的组。在本发明的一优选方面，所述肿瘤是肾癌，优选转移性肾癌。可选替换地，所述肿瘤是选自由黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、成神经细胞瘤、头或颈癌、膀胱癌、肾癌、脑癌以及胃癌构成的组。在各优选实施例中，可用于治疗癌症的诸化合物于2003年12月2日提交的国际专利申请号为PCT/IB2003/006375中所描述，将其披露的内容结合于本文中。
本发明还适用于刺激由选自HIV、CMV、EBV、流感病毒、HCV、HBV等之中的某一病毒感染的受治疗者体内的抗病毒免疫应答。
本发明的化合物还适用于刺激具有由病原体引起的结核病、疟疾、兔热病、大肠杆菌病等的受治疗者的免疫应答的方法。
本发明的化合物还适用于治疗(例如，用于刺激受治疗者体内的免疫应答)具有诸如糖尿病、多发性硬化、风湿性关节炎等自身免疫性疾病的受治疗者，或具有包括哮喘、气道高反应性等过敏性疾病的受治疗者的方法。在各优选实施例中，该化合物被用于诸治疗适应症，并且是根据由Gelfand、Born、lahn和Kanehiro于2000年9月28日提交的国际专利申请号为WO2000US0026684；由Jomaa于1999年6月24日提交的国际专利公开号为WO 00/00182；以及由Tiollier于2004年4月26日提交的美国临时专利申请号为60/564,959当中的教导，将其每一个参考文献所披露的内容通过引证的方式合并入本文中。
优选地，根据本发明的氨基磷酸酯化合物用于治疗的剂量(单次给药量)是在约1μg/kg至约1.2g/kg之间。
应该认识到上述剂量涉及一组化合物、并且每个特定化合物的最佳剂量可以变化，如在本文中用于示例化合物的进一步描述。尽管如此，化合物优选以足以显著增加γδT细胞的生物活性或显著增加受治疗者体内的γδT细胞群的剂量给药。所述剂量优选通过静脉(i.v.)在2到180min内给予人体，优选在2到120min内，更优选在约5到约60min内，或最优选在约30min内或在约60min内。
在优选的试验化合物中，化学式II到XII的化合物以在约1μg/kg至约1.2g/kg之间，优选在约10μg/kg至约1.2g/kg之间，更优选在约20μg/kg至约100mg/kg之间的剂量给药(单次给药)。最优选地，对于三周一次或四周一次的治疗(每三周或第三周的治疗)的剂量(单次给药)是在约1μg/kg至约1.2g/kg之间，优选在约10μg/kg至约20mg/kg之间，更优选在约10μg/kg至约100mg/kg之间。该剂量优选通过静脉(i.v.)在2到180min内给入人体，优选在2到120min内，更优选在约5到约60min内，或最优选在约30min内或在约60min内。
活性组分可以通过不同的途径给药，通常通过注射或口服给药。注射剂可以在不同组织内进行，如通过静脉内、腹膜内、动脉内、肌内、皮内、皮下等。优选的用于活化剂的给药途径是静脉内和肌内。优选的用于细胞因子的给药途径是皮下、静脉内和肌内。
本发明提供了调节哺乳类受治疗者体内的γδT细胞的活性的方法，该方法包括根据治疗周期将有效量的γδT细胞活化剂给予对其有需要的一名受治疗者，在该周期中允许γδT细胞活性，优选为γδT细胞比率(γδT细胞的数量)，在该化合物的第二次给药之前大致回到基本比率。如在本文中进一步描述的，在诸优选实施例中，至少需要约一周，但更优选至少需要约两周使患者的γδT细胞比率大致回到基本比率。
周期少于约7天则不能提供γδT细胞活性的合适刺激。一个优选周期的过程是至少每周一次的周期，但更优选为至少两周一次的周期(至少约14天)，或更优选为至少三周一次或四周一次的周期，尽管两周一次至四周一次之间的任何周期均为优选。同样有效并可以考虑的是高达八周一次的周期，例如五周一次、六周一次、七周一次或八周一次。
在一个优选的实施例中，γδT细胞活化剂的给药在两周一次至四周一次的周期(即，约14到28天的重复周期)的第一天进行。在一优选实施例中，γδT细胞活化剂只在两周一次至四周一次，或优选三周一次的周期的第一天给药。
如所述的，一受治疗者优选进行至少两个周期的治疗，或更优选为至少三个周期。在其他方面，治疗可以延续更多的周期数，例如可以预期为至少4、5、6或更多个周期。
任选地，根据本发明的γδT细胞活化剂也可以与细胞因子联合使用。优选地，所述细胞因子是白介素2(IL-2)(ProleukinTM，Chiron，Emeryville CA，USA)或任何生物活性片段、变异体或其类似物，即，任何能够在本发明的方法中与IL-2受体结合并且能够诱导γδT细胞的活化的片段、变异体或类似物。优选地，所述γδT细胞活化剂与白介素-2多肽是分别给予该受治疗者。
因此，本发明的方法进一步包括给予细胞因子。虽然本发明的化合物可以在有或没有进一步给药的情况下被使用，但是在一优选的方面，可以给予细胞因子，其中，所述细胞因子能够增加用γδT细胞活化剂化合物处理的γδT细胞群的扩展，优选的是其中所述细胞因子能够诱导γδT细胞群的扩展，其大于在没有所述细胞因子下由γδT细胞活化剂化合物的给药所引起的扩展。一种优选的细胞因子是白介素-2多肽。
一种具有γδT细胞增殖诱导活性的细胞因子，最优选为白介素-2多肽，是以低剂量、并通常在包括1至10天之间的时间段内给药。该γδT细胞活化剂优选以单次剂量给药，并且通常在一周期的开始给药。优选地，该白介素-2多肽给药的日剂量包括每天0.2至2MU之间、再优选为0.2至1.5MU之间，进一步优选为0.2至1MU之间。该细胞因子，优选为白介素-2多肽的日剂量优选以单次注射或两次注射给药。
在各优选的方面，每天给予细胞因子，最优选为IL-2持续高达约10天，优选持续约3至10天之间，或最优选约7天的时间段。优选地，细胞因子的给药与γδT细胞活化剂给药在同一天(例如，在24小时内)开始。例如，在一个方面，细胞因子每天都给药，而在其他方面，细胞因子不需要每天给药。当细胞因子给药持续约7至约14天时，四周一次的治疗周期是优选的。当第一组分给药持续约4天时，三周一次的治疗周期是优选的。在诸优选实施例中，这些化合物可以根据在2003年12月2日提交的国际专利申请号为PCT/IB2003/006375中所描述的任何方法来使用，将其披露的内容通过引证的方式合并入本文中。
上述方法和治疗可以单独使用或与其他活性制剂或治疗联合使用。例如，对于肿瘤的治疗，本发明可以与其他诸如化学疗法、射线疗法或基因疗法的抗肿瘤剂或治疗联合使用。
本发明还涉及一种产品，包括根据本发明的γδT细胞活化剂以及白介素-2多肽，用于分开使用，以调节哺乳类受治疗者体内的γδT细胞的活性。
本发明涉及包括根据本发明的γδT细胞活化剂的疫苗组合物。本发明还涉及根据本发明的γδT细胞活化剂作为疫苗佐剂的用途。
因此，本发明披露了用于提高和/或增强哺乳动物，特别是人类体内对于一个抗原的免疫应答的方法和组合物，涉及利用(i)包括一个抗原的组合物，以及(ii)包括根据本发明的氨基磷酸酯化合物的佐剂使哺乳动物联合免疫(conjoint immunization)。优选的是所述包括抗原的组合物包括一种杀灭的、灭活的或减毒的病原体、微生物或寄生虫。在其他方面，包括抗原的所述组合物优选包括经富集或纯化的多肽、类脂、多糖、糖蛋白、糖脂或核酸抗原。优选的是所述组合物包括至少1、2、3、4、5、10或15种独特的抗原，例如至少1、2、3、4、5、10或15种独特的多肽、或编码这些多肽的核酸。在各优选实施例中，这些化合物可以如在2004年4月26日提交的美国临时专利申请号为60/564,959中所描述的那样使用，将其披露的内容通过引证的方式合并入本文中。
该佐剂组合物可以包括有效量的根据本发明的氨基磷酸酯化合物，所述量为能够引发体液应答、引发细胞毒素T淋巴细胞(CTL)应答、或针对至少一种抗原共同引发佐剂组合物的体液应答和CTL应答的有效量。优选的是当与一种抗原联合给入时，根据本发明的氨基磷酸酯化合物的存在量可以有效地在引发体液应答、细胞毒素T淋巴细胞(CTL)应答、或体液应答和CTL共同应答的过程中产生更大的免疫作用，超过没有佐剂存在时给入所述抗原所产生的免疫作用。
组合物的抗原组分可以选自近乎任何抗原、抗原决定簇或医药或兽药感兴趣的半抗原，尤其是希望对其增加免疫力的那些抗原。
因此，本发明涉及根据本发明的氨基磷酸酯化合物，更优选为N-HDMAPP或N-BrHPP作为免疫佐剂的应用。本发明进一步涉及一种免疫组合物，其中包括抗原或抗原组合，以及根据本发明的氨基磷酸酯化合物，更优选为N-HDMAPP或N-BrHPP。优选地，所述组合物包括治疗有效量的抗原以及免疫应答提高或免疫应答增强量的氨基磷酸酯γδT细胞活化剂。优选地，所述免疫组合物防止一种微生物感染。所述微生物感染由一种微生物所引起，它选自由病毒、真菌、寄生虫、酵母菌、细菌、以及原生动物构成的组。在一特定实施例中，所述免疫组合物是BCG免疫组合物。可替换地，所述免疫组合物预防或治疗一种肿瘤。
本发明进一步涉及一种免疫试剂盒，其中包括一适宜容器用于容纳根据本发明的免疫组合物，更具体地包括一种抗原或一种抗原组合、以及根据本发明的氨基磷酸酯化合物，更优选为N-HDMAPP或N-BrHPP。任选地，所述免疫试剂盒可以包括两个分开的适宜容器，其一容纳抗原或抗原组合，而其二容纳根据本发明的氨基磷酸酯化合物，更优选为N-HDMAPP或N-BrHPP。任选地，所述容器可以是一注射器。可替换地，所述免疫试剂盒包括一个或两个容器和一注射器。
本发明涉及一种改善受治疗者体内免疫效能、或使受治疗者对抗疾病，更具体的是对抗微生物感染的免疫方法，包括下列步骤：
对所述受治疗者给予包括一种抗原或抗原组合的组合物；以及
对所述受治疗者联合给予根据本发明的氨基磷酸酯化合物，更优选为N-HDMAPP或N-BrHPP，更具体的是该化合物的提高免疫应答的剂量。优选地，当用包括一种抗原的组合物联合给药时，γδT细胞活化剂的给药量足以提高免疫应答，使其超过用所述包括一种抗原的组合物在没有γδT细胞活化剂时所观察到的免疫应答。优选的是所述包括抗原的组合物包含一种杀灭的、灭活的或减毒的病原体、微生物或寄生虫。在其他方面，所述包括抗原的组合物优选包含一种经富集或提纯的多肽、类脂、多糖、糖蛋白、糖脂或核酸抗原。
本发明还涉及一种使受治疗者针对某一疾病，更具体的是受治疗者体内某一微生物感染的免疫方法，包括对所述受治疗者给予(i)包括一种抗原的组合物，以及(ii)根据本发明的一种氨基磷酸酯化合物，更优选为N-HDMAPP或N-BrHPP。优选地，γδT细胞活化剂是以一个提高免疫应答的量给药。优选的是该γδT细胞活化剂与该包括一种抗原的组合物是以治疗有效量作为一个单一的免疫组合物进行给药。
优选地，所述γδT细胞活化剂与一种药学可接受的载体在一起。在第一方面，所述抗原或抗原组合以及所述γδT细胞活化剂的所述给药是同时进行的。在第二方面，所述抗原或抗原组合以及所述γδT细胞活化剂的所述给药是顺序进行的。更具体地，所述γδT细胞活化剂可以在给予受治疗者用于免疫目的的抗原或抗原组合之前、同时、或之后给药。优选地，所述抗原或抗原组合为微生物抗原，优选为病毒、细菌、真菌、原生动物、酵母菌或寄生虫抗原。在一优选实施例中，所述抗原是一种牛型结核菌的抗原。任选地，所述抗原或抗原组合是一种肿瘤抗原。
本发明的进一步的方面和优点将会在下面的实例中进行披露，这些实例只是用于说明目的而不限制本申请的范围。
                    实施例
                    实施例1
    (E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基氨基焦磷酸酯
               (N-HDMAPP)的制作
(E)-4-氯-2-甲基丁-2-烯-1-醇的制备：
在氮气保护下将16ml(179mmol)的TiCl4加入到360ml的CH2Cl2中。将溶液冷却到90℃，并将在50ml的CH2Cl2中的10.0g(119mmol)的2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷溶液逐滴加入，并保持温度低于-80℃。然后在80℃下将红色溶液搅拌2小时，并用600ml的1M HCl进行骤冷。分离有机相，并用3×500ml的Et2O萃取水相。将合并的有机相经由MgSO4干燥，在350毫巴、25℃下过滤并蒸发，得到12.02g(99.7mmol，84％的产率)褐色油状的4-氯-2-甲基丁-2-烯-1-醇。所得的粗产物直接用于下一步反应。
(E)-2-(4-氯-2-甲基丁-2-烯基氧基)四氢-2H-吡喃的制备：
将26ml(286.11mmol)的二氢吡喃(DHP)加入到11.5g(95.37mmol)的4-氯-2-甲基丁-2-烯-1-醇在120ml CH2Cl2的溶液中。将溶液冷却到0℃，并将2.4g(9.53mmol)的对甲苯磺酸吡啶鎓盐(PPTS)分批加入。在0℃下将溶液搅拌3小时。用3×50ml的水洗涤有机相，经由Na2SO4干燥，过滤并浓缩而得到粗产物。然后通过在硅胶上的层析法利用己烷/EtOAc(9/1)作为洗脱液对产物进行纯化。分离出12.35g(60.33mmol，64％的产率)无色油状物的经保护的烯丙基醇。
(E)-2-(4-叠氮基-2-甲基丁-2-烯基氧基)四氢-2H-吡喃的制备：
将11.43g(175.86mmol)的叠氮化钠(NaN3)与2.20g(6.45mmol)的四丁基硫酸氢铵在60ml水中的溶液加入到12.0g(58.62mmol)的(E)-2-(4-氯-2-甲基丁-2-烯基氧基)四氢-2H-吡喃在300ml戊烷的溶液中。在室温下将反应混合搅拌过夜。分离有机相，并用3×150ml的Et2O萃取水相。将合并的有机相用盐水洗涤，经由Na2SO4干燥，过滤并浓缩而得到11.21g(53.06mmol，90％的产率)的叠氮化物异构体的混合物。未进行纯化，因为观测到在硅胶上进行分离是不可行的。产物未经进一步纯化即用在下一步骤中。
(F)-3-甲基-4-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)丁-2-烯-1-胺的制备：
将26g(98.8mmol)的三苯膦(PPh3)加入到前一步所得到的11.0g(52.07mmol)的粗叠氮化物与18ml水在180ml的THF的溶液中。在室温下将溶液搅拌过夜，并蒸发溶剂。通过在硅胶上的层析法(洗脱液：CH2Cl2/MeOH/Et3N 9/1/0.5)纯化得到的粗产物，得到6.47g(34.91mmol，67％的产率)黄色油状经纯化的烯丙基胺。基于1H-NMR分析，经纯化的产物中异构比(E∶Z)为大约90∶10。
(E)-3-甲基-4-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)丁-2-烯基氨基焦磷酸酯的制备：
将焦磷酸二钠(0.25mmol-1当量)与(E)-3-甲基-4-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)丁-2-烯-1-胺(46mg，0.25mmol-1当量)溶解在3ml的1/1(v/v)去离子水/乙腈混合物中，并引入玻璃反应器中。利用注射器逐滴加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(2.5mmol-10当量)的12.5ml 0.2M去离子水/乙腈溶液，同时在室温下搅拌。然后用离子色谱(HPAEC)监测反应进程。大约3小时后，在减压下将反应混合物浓缩至最终体积为大约5ml，并将在这一阶段获得的粗产物通过将水溶液流经含有过量的DOWEX50WX8-200(NH4 +型)树脂的一个柱体并用两个柱体积的去离子水洗脱过而转化成铵盐形式。该处理还得以除去未反应的碳化二亚胺和来自反应介质的阳离子副产物。然后将收集到的溶液在减压(20毫巴，40℃)下蒸发掉水而浓缩到最终体积为大约5ml，并在下一步中直接使用。
(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基氨基焦磷酸酯(N-HDMAPP)的制备：
通过使在前一步所得的粗溶液通过含有(10g，24毫克当量)DOWEX 50WX8-200(H+型)树脂的一个柱体并用两个柱体积的去离子水洗脱过，得以实现将保护性四氢吡喃基完全去除。将得到的酸性溶液收集到置于冰浴中的50ml-Falcon_管中。立即用10％的氢氧化铵溶液中和所得溶液至pH值为8。然后对产物的纯化是用阴离子交换色谱通过5g Sep-Pak Accell Plus QMA(Waters_)管分别连续用5mM、10mM、25mM、50mM、75mM、100mM以及200mM碳酸氢盐水溶液进行洗脱、并用离子色谱(HPAEC)监测洗脱部分(fraction)。然后合并相应纯化产物的各部分并进行冷冻-干燥，以便除去碳酸氢铵。基于HPAEC分析，纯化产物中异构体比(E∶Z)为87∶13。
通过将IonPac_AS11柱的多个组合色谱通道相结合，由色谱提纯法(HPAEC)获得纯(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基氨基焦磷酸酯。
为了进行生物试验，将产物的中性水溶液通过0.2μm过滤器的过滤法进行灭菌，并在-20℃下贮存。在体内进行试验的情况下，将溶液预先通过一个用两个柱体积的去离子水洗脱的DOWEX 50WX8-200阳离子树脂柱(Na+型)。
(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基氨基焦磷酸酯(N-HDMAPP)的合成根据下面的方案进行。对于这个合成方案的每一步骤，可以利用下面的参考文献作为进一步的指导：步骤1：Hecht et al.，TetrahedronLetters，43(2002)8929-8933；步骤2：Miyashita et al，J.Org.Chem.，42(1977)3772-3774，Solladiéet al，J.Org.Chem.1993，58，2181-2185，和Marshall et al，J.Org.Chem.1985，50(10)，1602-1606；步骤3：Deslongchamps et al，Can.J.Chem.1979，57，3262-3271；步骤4：Coperet et al，Tetrahedron 1996，52(35)11520-11544；步骤5：Sato etal，Chem.Pharm.Bull，38(8)，2287-2289(1990)；以及步骤6：Miyashitaet al，J.Org.Chem.，42(1977)3772-3774(只是去保护反应)。
Figure A20048003565700531
                    实施例2
    3-甲基丁-3-烯基氨基焦磷酸酯(N-IPP)的制作
3-甲基-3-丁烯-1-基-甲苯磺酸酯的制备：
在冰浴中冷却的一个250ml三颈烧瓶中，将甲苯磺酰氯(4.8g，25mmol)与4-(N，N-二甲氨基-)吡啶(3.4g，27.5mmol)在磁搅拌下与90ml的无水二氯甲烷相混合。然后用注射器通过烧瓶中的隔板缓慢引入3-甲基-3-丁烯-1-醇(2.2g，25mmol)在约10ml无水二氯甲烷中的溶液，然后去掉冰浴。通过硅胶TLC(戊烷/乙酸乙酯，85∶15(v/v))监测反应。在持续搅拌2h后，将混合物用己烷稀释成1升溶液来沉淀并过滤，并在减压下浓缩滤液。利用二乙醚重复进行这种过滤/悬浮步骤，并且将得到的油状物在硅胶上(戊烷/乙酸乙酯，85∶15(v/v))用液相色谱进行纯化，产出黄色油状的3-甲基-3-丁烯-1-基-甲苯磺酸酯(5.6g，23.5mmol，94％的产率)，在4℃干燥N2中保存。
4-叠氮基-2-甲基-1-烯的制备：
将820mg(12.48mmol)的叠氮化钠(NaN3)和125mg(催化量)的Nal加入到2.0g(8.32mmol)的3-甲基-3-丁烯-1-基-甲苯磺酸酯在20ml的DMSO的溶液中。在55℃下将反应混合物搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，并加入120ml水。用3×100ml的Et2O萃取得到的溶液。用100ml水、100ml盐水洗涤合并的有机相，并经由Na2SO4干燥，在室温、300mmHg下过滤并浓缩。分离出875mg(7.87mmol，95％的产率)的褐色油状4-叠氮基-2-甲基丁-1-烯。
3-甲基丁-3-烯-1-胺的制备：
在室温下将500mg(4.50mmol)的4-叠氮基-2-甲基丁-1-烯、3.92g(14.95mmol)的三苯膦PPh3与2.7ml水在27ml THF中的溶液搅拌过夜，并将溶剂蒸发。然后将得到的粗产物利用CH2Cl2/MeOH/Et3N(9/1/0.5)作为洗脱液在硅胶上通过色谱法进行提纯。以32％的分离收率分离出125mg(1.47mmol)黄色油状的3-甲基丁-3-烯-1-胺。在干燥N2下保存经纯化的胺，并在-20℃下贮存以用于下一步。
3-甲基丁-3-烯基氨基焦磷酸酯(N-IPP)的制备：
依照在实施例1中报导的用于3-甲基-4-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)丁-2-烯基氨基焦磷酸酯的制备过程来制备3-甲基丁-3-烯基氨基焦磷酸酯：
将焦磷酸二钠(0.25mmol-1当量)和3-甲基丁-3-烯-1-胺(0.25mmol-1当量)溶解在3ml的1/1(v/v)去离子水/乙腈混合物中，并引入一个玻璃反应器中。利用注射器逐滴加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(2.5mmol-10当量)的12.5ml 0.2M去离子水/乙腈溶液，同时在室温下搅拌。最后通过加入0.1N的HCl水溶液来调节pH值并保持在6-6.5的范围内。然后用离子色谱(HPAEC)监测反应进程。大约3小时后，在减压下将反应混合物浓缩到最终体积为大约5ml，并将在这个阶段获得的粗产物通过将水溶液流经含有过量的DOWEX 50WX8-200(NH4 +型)树脂的柱体并用两个柱体积的去离子水洗脱过而转化成铵盐形式。
用阴离子交换色谱通过一个Sep-Pak Accell Plus QMA(Water_)管依照在实施例1中所报导的用于制备N-HDMAPP的过程来实现粗溶液的提纯。
N-IPP、5-溴-4-羟基-4-甲基戊基氨基焦磷酸酯(N-BrHPP)(实施例3)以及N-EpoxPP(实施例4)的合成根据下面的方案进行。对于这个合成方案的每一步骤，可以利用下面的参考文献作进一步的指导：步骤1：Davisson et al.，J.Org.Chem.，1986，51，p4768-4779；步骤2：Grieco et al，Tetrahedron 1986，42(11)，2847-2853和Sahasrabudhe，K.et al.，J，Am.Chem.Soc.2003，125(26)，7914-7922；步骤3：Brettle R.et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，Vol.6.p291(1996)；步骤4：Sato et al，Chem.Pharm.Bull，38(8)，2287-2289(1990)；步骤5：Espinosa，et al，(2001a)J.Biol.Chem 276，18337-18344；以及步骤6：国际专利申请公开号WO 00/012519。
                    实施例3
5-溴-4-羟基-4-甲基戊基氨基焦磷酸酯(N-BrHPP)的制作
如下面的合成方案所表明，可以从实施例2中所描述的化合物N-IPP开始，通过将溴水加成到烯官能团上，接着在DOWEX50WX8-200(Na+型)树脂上通过中和而制备化合物N-BrHPP。粗产物的溴代醇官能团的形成以及接下来的纯化可以根据在WO00/12516中所提供的用于制备3-(溴甲基)-3-丁醇-1-基二磷酸酯(BrHPP)的实验方案或如在Espinosa等人的J Biol Chem，276，(2001)18337-18344中所描述的那样进行。
Figure A20048003565700571
                    实施例4
2-(2-甲基环氧乙烷-2-基)乙基氨基焦磷酸酯(N-EpoxPP)的制作
如下面的合成方案所表明，可以从实施例3中所描述的化合物N-BrHPP开始，通过用1M氢氧化铵溶液处理(环氧化反应)，接着在DOWEX 50WX8-200(Na+型)树脂上通过阳离子交换步骤而制备化合物N-EpoxPP。该环氧化反应以及随后粗产物的纯化可以根据在WO 00/12519中所提供的用于制备3，4-环氧-3-甲基-1-丁基-二磷酸酯(EpoxPP)的实验方案进行。
                    实施例5
    对于N-HDMAPP化合物在体外及体内的剂量反应
细胞因子释放测定
将细胞(主要是多克隆的人类Vγ9/Vδ2T细胞，其已经在体外扩展并且在扩展的12-15天被冷冻贮存)解冻并漂洗两次，再进行离心。去除细胞的上清液并将细胞再次悬浮，在37℃、并在IL2 100IU/ml(最终浓度)存在下将细胞孵育24h。将细胞进行清洗和离心，接着除去上清液并将细胞再次悬浮，并调整到适当的最终浓度。将细胞加入到96-孔板的孔中。
将3-(溴甲基)-3-丁醇-1-基-二磷酸酯(BrHPP)的标准稀释系列溶液加入到一排孔中。将待试验的化合物，本试验中将本发明的(E)-4-羟基-3-甲基2-丁烯基氨基焦磷酸酯(HDMAPP)和N-HDMAPP化合物在几次稀释之后加入到试验孔中。
如下面进一步描述的，在37℃下将整个板孵育24小时，以便利用试验化合物和对照化合物，在本试验中为N-HDMAPP、BrHPP以及HDMAPP对γδT细胞进行刺激。在此时间之后，取出100μl的培养基上清液用于TNFα剂量。释放的TNFα剂量的检测按厂商在TNFα酶免疫测定试剂盒的说明书中的描述来进行(参见11121，Immunotech-Bechman Coulter)。读出在405nm处的OD值，该OD值与在培养基上清液中释放的TNFα的浓度成正比。用Excel软件对数据进行处理，用以将试验化合物的浓度对照TNFα的浓度进行比较，并用于每个试验化合物EC50的计算。
N-HDMAPP在体外的生物活性
利用如上所述的TNFα释放测定对化合物N-HDMAPP的生物活性进行评价。图1示出了体外活性。为了对比的目的还包括了化合物BrHPP和HDMAPP。然后在这种体外相对的筛查试验中评价了体外EC50，其中由标定的细胞利用BrHPP-标准组合物的已有测定对于BrHPP表现出约15nM的EC50。如所理解的，任何其他合适的测定，诸如细胞扩增法，也可以用于评价化合物。对于N-HDMAPP的EC50测定为0.63nM，而对于HDMAPP的体外EC50为2.1nM，并且对于BrHPP的体外EC50为37.7nM。由于该测定提供的是相对结果而不是绝对EC50值，该结果表明N-HDMAPP化合物具有比至今所试验的最有效的化合物高3-4倍的效能。
还评价了TNFα释放的最大浓度。如图1所示，N-HDMAPP化合物产生大于所试验的其他化合物的一个最大TNFα释放。虽然所试验的其他化合物的效能(EC50)不同，但是它们表现出了相近的最大TNFα释放浓度-在约1200至1500pg/ml之间的TNFα释放。然而，N-HDMAPP化合物对最大TNFα释放产生了统计学上显著增加的高于约1800pg/ml TNFα释放，提示N-HDMAPP有可能在体内引起的绝对Vγ9/Vδ2T细胞活化大于在任何浓度的其他化合物可以获得的水平。
参考文献
将所有引用的参考文献通过引证的方式合并入本文中。
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Claims (22)

1.一种化学式(I)的γδT细胞活化剂：
Figure A2004800356570002C1
           化学式(I)
其中，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)；
m是1到3的一个整数；
B是O、NH、或任何能够被水解的基团；
Y＝O-Cat+、一个C1-C3烷基、一个-A-R基、或选自由核苷、寡聚核苷酸、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、单糖、寡聚糖、多糖、脂肪酸、单纯脂、复合脂、叶酸、四氢叶酸、磷酸、肌醇、维生素、辅酶、类黄酮、醛、环氧化物以及卤代醇构成的组中的一个基团；
A是O、NH、CHF、CF2或CH2；以及
R是一个直链的、支链的、或环状的、芳香或非芳香的、饱和或不饱和的C1-C50烃基，任选被至少一个杂原子中断，其中，所述烃基包括烷基、烯基、或炔基，优选烷基或烯基，该烃基能够被一个或几个选自由烷基、烯基、炔基、环氧烷基、芳基、杂环、烷氧基、酰基、醇、羧基(-COOH)、酯、胺、氨基(-NH2)、酰胺(-CONH2)、亚胺、腈、羟基(-OH)、醛基(-CHO)、卤素、卤代烷基、硫醇(-SH)、硫代烷基、砜、亚砜、及其组合构成的组中的取代基所取代。
2.根据权利要求1所述的γδT细胞活化剂，其中，所述活化剂是化学式(X)的一种化合物：
Figure A2004800356570003C1
其中，相同或不同的R3、R4以及R5是氢或(C1-C3)烷基，W是-CH-或-N-，R6是(C2-C3)酰基、醛、(C1-C3)醇、或(C2-C3)酯，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)，B是O或NH，m是1到3的整数，以及Y是O-Cat+、核苷、或-A-R基，其中，A是O、NH、CHF、CF2或CH2，并且R是选自由1)、2)或3)构成的组。
3.根据权利要求2所述的γδT细胞活化剂，其中，所述活化剂是化学式(XI)的一种化合物
Figure A2004800356570003C2
4.根据权利要求3所述的γδT细胞活化剂，其中，所述活化剂是化学式(XII)的一种化合物
5.根据权利要求1所述的γδT细胞活化剂，其中，所述活化剂是化学式(II)的一种化合物：
Figure A2004800356570004C1
其中，X是卤素(优先选自I、Br和Cl)，B是O或NH，m是1到3的一个整数，R1是甲基或乙基，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)，并且n是2到20的一个整数，以及Y是O-Cat+、核苷、或-A-R基，其中，A是O、NH、CHF、CF2或CH2，并且R是选自由1)、2)或3)构成的组。
6.根据权利要求5所述的γδT细胞活化剂，其中，所述活化剂是化学式(III)的一种化合物
Figure A2004800356570004C2
7.根据权利要求5所述的γδT细胞活化剂，其中，所述活化剂是化学式(V)的一种化合物
8.根据权利要求1所述的γδT细胞活化剂，其中，所述活化剂是化学式(VI)的一种化合物：
Figure A2004800356570004C4
其中，R1是甲基或乙基，Cat+表示一个(或几个、相同或不同的)有机或无机阳离子(包括质子)，B是O或NH，m是1到3的一个整数，并且n是2到20的一个整数，以及Y是O-Cat+、核苷、或-A-R基，其中，A是O、NH、CHF、CF2或CH2，并且R是选自由1)、2)或3)构成的组。
9.一种药物组合物，包括根据权利要求1-8任一项所述的γδT细胞活化剂。
10.根据权利要求1-8任一项所述的γδT细胞活化剂在制备用于调节人类受治疗者体内的γδT细胞的药物组合物中的应用。
11.根据权利要求1-8任一项所述的γδT细胞活化剂在制备用于治疗患有或易患癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病或过敏性疾病的受治疗者的药物组合物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其中，所述癌症是实体肿瘤。
13.根据权利要求1-8任一项所述的γδT细胞活化剂作为一种疫苗佐剂的应用。
14.一种疫苗组合物，包括作为疫苗佐剂的权利要求1-8任一项所述的一种γδT细胞活化剂。
15.一种用于制备氨基二磷酸单酯化合物的方法，包括：
(a)在一个偶联步骤中使一个烷基卤R-X与一个氨基磷酸二乙酯或氯代磷酸二乙酯试剂进行反应；
(b)使在步骤(a)中制备的化合物在一个皂化步骤中进行反应，从而去除O-乙基；以及
(c)使在步骤(b)中制备的化合物在一个磷酸化步骤中进行反应，从而制备氨基二磷酸单酯，
其中，R是一个直链的、支链的、或环状的、芳香或非芳香的、饱和或不饱和的C1-C50烃基，任选被至少一个杂原子中断，其中，所述烃基包括烷基、烯基、或炔基，优选烷基或烯基，该烃基能够被一个或几个选自由烷基、烯基、炔基、环氧烷基、芳基、杂环、烷氧基、酰基、醇、羧基(-COOH)、酯、胺、氨基(-NH2)、酰胺(-CONH2)、亚胺、腈、羟基(-OH)、醛基(-CHO)、卤素、卤代烷基、硫醇(-SH)、硫代烷基、砜、亚砜、及其组合构成的组中的取代基所取代，并且
其中，X是在适当条件下能够被一个氨基磷酸二乙酯基替代的部分(moiety)。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，X是一个NH2基，并且所述R-X化合物在一个偶联步骤中与一个氯化磷酸二乙酯化合物进行反应。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，X选自由I、Br以及Cl构成的组。
18.一种制备(E)-2-(4-叠氮基-2-甲基丁-2-烯基氧基)四氢-2H-吡喃化合物的方法，包括提供一个(E)-2-(4-氯-2-甲基丁-2-烯基氧基)四氢-2H-吡喃化合物，并且使所述化合物在相转移催化剂存在下与叠氮化钠在水—戊烷两相混合物中进行反应。
19.一种活化γδT细胞的方法，所述方法包括使一个γδT细胞与根据权利要求1-8任一项所述的一个γδT细胞活化剂相接触。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述γδT细胞是在体外与所述γδT细胞活化剂相接触。
21.一种根据权利要求19或20所述的方法活化的γδT细胞。
22.根据权利要求21所述的一种γδT细胞在制备一个药物组合物中的应用。
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