CN1884577A - 检测两优培九种子纯度的引物及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明检测两优培九种子纯度的引物及其方法，属于生物技术领域。专用于两优培九种子纯度的快速准确检测。以两系杂交稻“两优培九”及其双亲的DNA为摸板，选择两对SSR引物组合后，在F₁中扩增得到6条电泳迁移率明显不同的条带(其中两条来自母本，四条来自父本)，可以很清楚地区分“两优培九”杂种种子中混入的母本自交种子。进一步对“两优培九”南繁鉴定田中常见的几种类型杂株，用两对SSR引物进行二重PCR扩增，得到“两优培九”特征谱带。由此建立了“两优培九”种子纯度的分子鉴定体系，应用该体系可在5－7天内完成未知样品的检测，准确率在99.9％以上。

Description

检测两优培九种子纯度的引物及其方法

(一)技术领域

本发明检测两优培九种子纯度的引物及其方法，属于生物技术领域。专用于两优培九种子纯度的快速准确检测。

(二)背景技术

农作物种子纯度是种子定级的主要依据，是种子质量控制过程中最棘手的问题。多年来，许多种子工作者主要是通过田间检验(如海南检验)等方法鉴定杂交稻种子纯度，不但检验所需周期长，而且需要消耗大量的人力、物力、财力，无法满足种子经营工作的需要。也有利用苗期形态、同工酶电泳等方法进行鉴定的报道，由于重复性及可靠性不够好，影响检测的准确性，而未能广泛使用。因此，寻找一种稳定可靠又快速简便的种子纯度鉴定方法迫在眉睫。

水稻是单子叶分子生物学研究的模式植物，已完成了籼、粳两个亚种的全基因测序，已鉴定并开发出多种类型的分子标记，用于研究水稻起源、分化、有利性状的基因标记等研究。SSR标记(也称微卫星标记)在水稻基因组中广泛存在，由于具有操作简单、重复性好、成本相对低而受到众多研究者的青睐。

两系杂交稻“两优培九”于2001年通过全国审定。该组合表现优质、高产、抗病，综合性状好，已成为长江中下游稻区主栽品种，但母本培矮64 S是光温敏核不育系，在育性敏感期如气温连续3 d低于23.5℃时，会部分自交结实，从而降低杂交种纯度，会在生产上造成损失。如能在种子收购前或收购时，采用快速、准确的纯度鉴定方法，对拟收购或已收购的种子标样进行纯度检测，对于种子经营和第二年的生产有重要意义。本试验采用水稻基因组中广泛存在的SSR标记，对两优培九及其双亲进行分子水平的多态性分析，建立一套标准化快速鉴定体系，用于两优培九种子纯度的室内鉴定。

(三)发明内容

技术问题    本发明的目的是解决现有技术中两优培九种子纯度的田间鉴定检测方法所需时间长，消耗大的问题，提供两优培九种子纯度的室内检测方法，对两优培九种子进行SSR分子标记检测，快速、准确。

技术方案

检测两优培九种子纯度的引物，包括：

引物RM7117

上游引物AGTTGGCTGGTTGCTACCAC

下游引物AGGGTTCCCTGGCTACTCAC

和引物RM180

上游引物CTACATCGGCTTAGGTGTAGCAACACG

下游引物ACTTGCTCTACTTGTGGTGAGGGACTG

上述引物用于检测两优培九种子纯度的方法，包括：

1)材料的准备：供试种子培苗至3-5cm高度；

2)微量法提取植物DNA：取上述种子幼苗0.1g于1.5mLEp管中，将幼苗捣碎后加100μL DNA提取缓冲液，65℃水浴15min，取出后在室温放置片刻，取上清液1μL直接用做PCR模板进行PCR扩增；

所用DNA提取缓冲液为：PH＝8.0的Tris-HCL为100m moL，NaCl为0.5mol/L，TritonX-100体积比为0.3％；

3)PCR扩增：

PCR反应体系：0.2ml薄壁PCR反应管中，加1μL模板10ng/μL DNA，1μL 4pmol/μL SSR引物RM180，1μL 4pmol/μL SSR引物RM7117，0.2μL 2.5mM dNTP，0.25μL 2u/μL Tag酶，1.6ul PCR buffer，4.95μL无菌水，总体积10μL，混匀后于PCR扩增仪上进行PCR扩增；

PCR反应程序：

首先94℃预变性5min；

然后40个循环：94℃变性45s，55℃复性50s，72℃延伸1.5min；

接着72℃延伸10min；

最后4℃保存；

4)聚丙烯酰胺凝胶电泳：按照《分子克隆实验指南，第二版》，科学出版社1993年327-330页所述方法；

5)银染100mL：10％乙醇10mL，0.5％冰乙酸0.5mL固定12min，0.2％AgNO₃渗透12min，100mL超纯水漂洗30s、10％Na₂S₂O₃20μL漂洗30s，1.5％NaOH，甲醛1mL显色15min；

6)确定纯度：观察电泳结果，能扩增得到6条分子量分别为130bp、115bp、110bp、80bp、65bp、60bp条带的确定为两优培九种子，其余缺失或含有其他分子量的条带均为混杂种子，通过计算即可获得两优培九种子纯度。

有益效果  本发明与现有技术相比，其优点表现在：

(1)提供特异的SSR引物RM7117和RM180来检测两优培九种子的纯度，

RM7117上游引物AGTTGGCTGGTTGCTACCAC

     下游引物AGGGTTCCCTGGCTACTCAC

RM180上游引物CTACATCGGCTTAGGTGTAGCAACACG

     下游引物ACTTGCTCTACTTGTGGTGAGGGACTG

(2)一步法提取两优培九种子植物的DNA，方便易行。

(3)速度快：用SSR分子标记检测两优培九种子的纯度有重要的应用价值。两优培九种子纯度不高，给生产带来很大影响，如能在种子收购前或收购时，采用快速、准确的纯度鉴定方法，对拟收购或已收购的种子标样进行纯度检测，对于种子经营和第二年的大田生产有重要意义。而正常的海南鉴定所需时间长，投入的人力物力大，无法满足生产经营需要。此发明只需把种子发芽三到四天后提取DNA，用已经筛选好的SSR引物进行分子标记检测，“两优培九”种子纯度的分子鉴定体系，应用该体系可在5-7天内完成未知样品的检测，

(4)准确率高：SSR标记(也称微卫星标记)在水稻基因组中广泛存在，由于SSR标记位点具有高水平的等位基因多样性，表现为共显性的孟德尔遗传，简单重复序列长度多态性很容易通过PCR快速扩增和高分辨率的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。本发明在筛选的294对SSR引物中，有26对在双亲中表现出多态，为分子水平检测种子纯度提供了便利。通过进一步筛选，最后确定采用二重PCR技术在一次反应完成两对引物的扩增，从而增加了鉴定的可靠性。

(5)在2005年10月至2006年3月检测的100多个两优培九种子样品与海南鉴定结果非常吻合。

(6)实用简单：本方法鉴定杂交水稻种子纯度的整个程序，只是几次机械式的加样过程，易于操作，具有更好的商业化应用前景。

(四)说明书附图

图1部分二重PCR扩增的结果

A.引物66&219号    B.引物155&143号    C.引物143&66号    D.引物66&175号

图2本发明选定的两对引物PCR扩增的结果最后从四个组合中选取66号与175号这个组合来进行二重PCR扩增反应，该组合的六条PCR扩增产物编号为L1-L6、分子量分别为130bp、115bp、110bp、80bp、65bp、60bp左右。

具体实施方式

实例一：

1)植物材料与育苗：

不同纯度的两优培九(杂种F₁)样品3个，(样品A、样品B和样品C的纯度分别为99.3％、95％、85％)，所有种子均由江苏省明天种业有限公司提供。将供试种子表面消毒后，浸种两天(30℃)，催芽一天(28℃)后，播种在置有消毒石英砂的育苗盘中，在光照培养箱中(26℃)生长3-5天后取样，抽提DNA备用。

2)DNA提取：

取植物组织0.1g于1.5mLEp管中，先将组织捣碎，然后加100μL DNA提取缓冲液，65℃水浴15min，取出后在室温放置片刻，取上清液1μL直接用做PCR模板进行PCR。

所用DNA提取缓冲液为：C(Tris-HCL)＝100m moL(PH＝8.0)，C(NaCL)＝0.5mol/L，φ(TritonX-100)＝0.3％

3)PCR扩增：

PCR反应体系：0.2ml薄壁PCR反应管中(三和耀华公司)，加1μL模板DNA(10ng/μL)，1μLSSR引物RM180(4pmol/μL)，1μLSSR引物RM7117(4pmol/μL)，0.2μLdNTP(2.5mM)，0.25μL Tag酶(上海鼎国公司)(2u/μL)，1.6ul PCR buffer，4.95μL无菌水，总体积10μL，混匀后于PCR扩增仪(杭州博日)上进行PCR扩增。

PCR反应程序：

94℃预变性5min；

共40个循环：94℃变性45s，55℃复性50s，72℃延伸1.5min；

72℃延伸10min；4℃保存。

4)聚丙烯酰胺凝胶电泳：

按照《分子克隆实验指南(第二版)》(科学出版社1993年327-330页)方法，先用1％琼脂糖封边后，将8％的工作液灌入玻璃板空隙中(8％的凝胶工作液：每100mL中10×TBE10mL，40％丙烯酰胺(19∶1)20mL，超纯水70mL，TEMED 100μL，10％AP 1000μL)，插上梳子，等凝胶凝固后(约40分钟)，往槽中倒入足以覆盖住样品孔的0.5×TBE缓冲液，拔出梳子，10μLPCR扩增样品中加入2μL染色剂，加样2.5μL，170V电压下电泳2小时。

银染(100mL)：固定(10％乙醇10mL，0.5％冰乙酸0.5mL)12min，渗透(0.2％AgNO₃)12min，漂洗(100mL超纯水)30s、(10％Na₂S₂O₃20μL)30s，显色(1.5％NaOH，甲醛1mL)15min。

在胶片观察灯下观察结果：在两优培九(F₁)中扩增得到6条分子量分别60bp和115bp、130bp、110bp、80bp、65bp不同的条带(图2)，母本培矮64S扩增得到2条分子量分别60bp和115bp的条带，父本9311扩增得到4条分子量分别130bp、110bp、80bp、65bp的条带，说明两优培九(F₁)中扩增得到的6条条带中2条分子量为60bp和115bp的条带来自母本培矮64S，另外4条分子量为130bp、110bp、80bp、65bp的条带来自父本9311，可以很清楚地区分“两优培九”杂种种子中混入的母本自交种子。通过计算，三批样品A、B、C所测纯度分别为99.3％、95％、85％，与田间结果一致。

实施例2

2005年10月份至2006年3月一共为本公司检测种子样品100个，每个样品代表数量10000kg。具体操作方法：

供试种子表面消毒后，浸种两天，催芽一天后，播种在置有消毒石英砂的育苗盘中，在光照培养箱中湿润生长3-5天后取样，用微量法快速提取植物DNA。微量法：取植物组织0.1g于1.5mLEp管中，先将组织捣碎，然后加100μL DNA提取缓冲液，65℃水浴15min，取出后在室温放置片刻，取上清液1μL直接用做PCR模板进行PCR。

所用DNA提取缓冲液为：C(Tris-HCL)＝100m moL(PH＝8.0)，C(NaCL)＝0.5mol/L，φ(TritonX-100)＝0.3％

PCR扩增：

PCR反应体系：0.2ml薄壁PCR反应管中(三和耀华)，加1μL模板DNA(10ng/μL)，1μLSSR引物RM180(4pmol/μL)，1μLSSR引物RM7117(4pmol/μL)，0.2μLdNTP(2.5mM)，0.25μL Tag酶(上海鼎国)(2u/μL)，1.6ul PCR buffer，4.95μL无菌水，总体积10μL，混匀后于PCR扩增仪(杭州博日)上进行PCR扩增。

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃复性50s，72℃延伸1.5min，共40个循环；72℃延伸10min，；4℃保存；每个DNA模板每对引物，进行两次PCR重复。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：

按照《分子克隆实验指南(第二版)》(科学出版社1993年327-330页)方法，先用1％琼脂糖封边后，将8％的工作液灌入玻璃板空隙中(8％的凝胶工作液：每100mL中10×TBE10mL，40％丙烯酰胺(19∶1)20mL，超纯水70mL，TEMED 100μL，10％AP 1000μL)，插上梳子，等凝胶凝固后(约40分钟)，往槽中倒入足以覆盖住样品孔的0.5×TBE缓冲液，拔出梳子，10μLPCR扩增样品中加入2μL染色剂，加样2.5μL，170V电压下电泳2小时。

银染(100 mL)：固定(10％乙醇10mL，0.5％冰乙酸0.5mL)12min，渗透(0.2％AgNO₃)12min，漂洗(100mL超纯水)30s、(10％Na₂S₂O₃20μL)30s，显色(1.5％NaOH，甲醛1mL)15min。

在胶片观察灯下观察结果：在F₁中扩增得到6条电泳迁移率明显不同的条带(其中两条来自母本，四条来自父本)，可以很清楚地区分“两优培九”杂种种子中混入的母本自交种子。其中2条分子量为60bp和115bp的条带来自母本培矮64S，另外4条分子量为130bp、110bp、80bp、65bp的条带来自父本9311，可以很清楚地区分“两优培九”杂种种子中混入的母本自交种子。最终确定两优培九种子的纯度。

所得结果与海南鉴定结果比较统计为：与海南结果差距在0.5％以下的有45个样品；与海南结果差距在0.5％-1％的有51个样品；与海南结果差距在1％-2％的有4个样品。

Claims (2)

1、检测两优培九种子纯度的引物，包括：

引物RM7117

上游引物AGTTGGCTGGTTGCTACCAC

下游引物AGGGTTCCCTGGCTACTCAC

和引物RM180

上游引物CTACATCGGCTTAGGTGTAGCAACACG

下游引物ACTTGCTCTACTTGTGGTGAGGGACTG

2、权利要求1所述引物用于检测两优培九种子纯度的方法，包括：

1)材料的准备：供试种子培苗至3-5cm高度；

2)微量法提取植物DNA：取上述种子幼苗0.1g于1.5mLEp管中，将幼苗捣碎后加100μL DNA提取缓冲液，65℃水浴15min，取出后在室温放置片刻，取上清液1μL直接用做PCR模板进行PCR扩增；

所用DNA提取缓冲液为：PH＝8.0的Tris-HCL为100m moL，NaCl为0.5mol/L，TritonX-100体积比为0.3％；

3)PCR扩增：

PCR反应体系：0.2ml薄壁PCR反应管中，加1μL模板10ng/μL DNA，1μL 4pmol/μL SSR引物RM180，1μL 4pmol/μL SSR引物RM7117，0.2μL 2.5mMdNTP，0.25μL 2u/μL Tag酶，1.6ul PCR buffer，4.95μL无菌水，总体积10μL，混匀后于PCR扩增仪上进行PCR扩增；

PCR反应程序：

首先94℃预变性5min；

然后40个循环：94℃变性45s，55℃复性50s，72℃延伸1.5min；

接着72℃延伸10min；

最后4℃保存；

4)聚丙烯酰胺凝胶电泳：按照《分子克隆实验指南，第二版》，科学出版社1993年327-330页所述方法；

5)银染100mL：10％乙醇10mL，0.5％冰乙酸0.5mL固定12min，0.2％AgNO₃渗透12min，100mL超纯水漂洗30s、10％Na₂S₂O₃ 20μL漂洗30s，1.5％NaOH，甲醛1mL显色15min；

6)确定纯度：观察电泳结果，能扩增得到6条分子量分别为130bp、115bp、110bp、80bp、65bp、60bp条带的确定为两优培九种子，其余缺失或含有其他分子量的条带均为混杂种子，通过计算即可获得两优培九种子纯度。

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