CN1875112A - 生产类胡萝卜素化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生产玉米黄质、β－胡萝卜素或番茄红素的方法，包括：诱导产类胡萝卜素微生物的突变，该微生物相应于16S核糖体RNA的DNA碱基序列须与SEQ ID NO：1所述碱基序列基本同源；筛选类胡萝卜素总量中有高产物比例的玉米黄质、β－胡萝卜素或番茄红素的突变体，以得到玉米黄质、β－胡萝卜素或产番茄红素微生物；培养该突变体微生物；并从所得培养物中收获玉米黄质、β－胡萝卜素、番茄红素或者含这些物质的类萝卜素混合物。
Description
技术领域
本发明涉及生产玉米黄质、β-胡萝卜素、番茄红素或其类胡萝卜素混合物的微生物方法，这些物质作为天然黄色素、天然红色素，或抗氧化剂，用于饲料、食品、化妆品、药物等。
技术背景
玉米黄质在各种植物如玉米中存在，它作为天然黄色素被添加到饲料中，并已用于提高蛋黄、肉、或家禽皮肤(例如鸡)的颜色品质，也用作食品着色剂。它还具有强效抗氧化作用(Fisheries Science，62(1)：134-137，1996)，并报道具有抗癌作用(Biol.Pharm.Bull.，18(2)：227-233，1995)。已知玉米黄质与叶黄素共存于视网膜和晶状体中，并参与眼睛健康的维持(FOOD Style 21，3(3)：50-53，1999)。由于这些生理学作用，玉米黄质可用作健康食品、化妆品或药物材料。β-隐黄质存在于柑橘类果实中，已知具有抗癌作用(Biol.Pharm.Bull.，18(2)：227-233，1995)，可用于食品材料或饲料复合组分。β-胡萝卜素具有维生素原A和抗氧化作用，广泛用作饲料添加剂、食品添加剂、天然着色剂等。
已知的产玉米黄质方法是通过不对称还原氧代异佛儿酮(oxoisophorone)获得光学活性的羟基酮，使用其作为原料进行化学合成(Pure Appl.Chem.，63(1)：45，1991)；以及从玉米种子中提取得到(Seitai Shikiso(Biochrome)，1974，Asakura-shoten)。从金盏花(marigold)提取也是已知的(日本专利公开No.08-092205A(1996))，但是从金盏花得到的类胡萝卜素主要包含叶黄素和较少量的玉米黄质。此外，用于生产这些物质的微生物包括螺旋藻(Spirulna algae)(日本专利公开No.10-155430A(1998))、微绿小球藻(Nannochloris spp.microalgae)(日本专利公开No.07-059558A(1995))、屈挠属菌(Flexibacter spp.Bacteria)(日本专利公开No.05-328978A(1993))、交替单胞属菌(Alteromonas spp.Bacteria)(日本专利公开No.05-049497A(1993))、黄杆菌属菌(Flavobacterium spp.)(Carotenoids，in MicrobialTechnology，2nd edn，Vol.1，529-544，New York：Academic Press)、海洋细菌(Agrobacterium aurantiacum)(FEMS Microbiology Letters，128：139-144，1995)和属于新属的菌株E-396(FERM BP-4283)(日本专利公开No.07-079796A(1995)，日本专利公开No.08-009964A(1996)、美国专利5,607,839和5,858,761)。
β-胡萝卜素是天然黄色类胡萝卜素，存在于绿色和黄色蔬菜例如胡萝卜中，并广泛用作食品例如面糊和人造黄油的着色剂。它也有维生素原A活力，并且是重要的人体营养素。这种物质已知有抗氧化作用(Fisheries Science，62(1)：134-137，1996)，并有报道称具有抗肿瘤和抗癌作用(BioI.Pharm.Bull.，18(2)：227-233，1995)。由于这些生理功能，β-胡萝卜素不仅可作为着色剂，也可作为功能原料用于饲料、食品、化妆品或药物。
已知的产β-胡萝卜素微生物方法是用β-紫罗酮作为原料化学合成(Pure Appl.Chern.，63(1)：45，1979)，或者从绿色和黄色蔬菜提取得到，蔬菜例如胡萝卜、甘薯和南瓜(Tennen hakusyokuryo(NaturalColoring Agents)Handbook，Korin Publishing Co.，Ltd.，TennenChakusyokuryo Handbook Editorial board ed.)。此外通过微生物生产β-胡萝卜素的实例已知为通过杜氏藻(Dunaliella algae)(J.Phycol，23：176，1987)、三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)(丝状真菌)(AppI.Environ.MicroBiol.36：639-642，1979)、红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)(酵母)(日本专利公开No.05-168465A(1993))、红酵母(Rhodotorulaspp.Yeasts)(日本专利公开No.06-022748A(1994))、海洋细菌(Agrobacterium aurantiacum)(FEMS Microbiology Letters，128：139-144，1995)或属于新属的菌株E-396(FERM BP-4283)(日本专利公开No.07-079796A(1995)、日本专利公开No.08-009964A(1996)、美国专利5,607,839和5,858,761)。
番茄红素是存在于番茄中的天然红色类胡萝卜素，用作食品着色剂。它也具有强效抗氧化作用(Arch.Biochem.Biophys.，271：532，1989)，已知它抑制动脉硬化相关的低密度脂蛋白氧化(Nutr.Metab.Cordiovasc.Dis 7：433，1997)，并据报道可抑制癌细胞的增殖(J.Natl.Cancer Inst.91：313，1999)。由于这些生理功能，番茄红素可用作饲料、食品、化妆品或药物的原料。
已知的番茄红素生产方法是用沉香醇或香叶醇作为原料化学合成(日本专利公开No.2001-039943A(2001))，和从番茄中分离并精制(日本专利公开No.2002-193850A(2002))。此外用于生产番茄红素的微生物包括杜氏藻(Dunaliella algae)(日本专利公开No.2001-161391A(2001))、ChIarella algae(日本专利公开No.2000-152778A(2000))和Rhadabacter spp.细菌(日本专利公开No.08-239658A(1996))。也已知属于新属的菌株E-396(FERM BP-4283)(日本专利公开No.07-079796A(1995)、日本专利公开No.08-009964A(1996)、美国专利5,607,839和5,858,761)可生产高浓度的类胡萝卜素化合物，但番茄红素产量非常低。
不过，上述化学合成玉米黄质、β-胡萝卜素和番茄红素的方法在安全和近年对天然产物的趋向方面有问题，因为它们使用有机溶剂。而且，常规的微生物培养方法因为其低生产率并不实用，而植物提取法(例如玉米、胡萝卜、番茄等)的缺陷在于所需类胡萝卜素化合物的含量低而成本太高，并且由于依赖气候状况其供应也难稳定。已知用于生产类胡萝卜素化合物的微生物菌株E-396，虽然它提供了工业规模生产高浓度类胡萝卜素化合物的确定方法，该类胡萝卜素化合物包含虾青素，安全性也被多种试验证实，但类胡萝卜素化合物总量中玉米黄质、β-胡萝卜素和番茄红素的含量比例低。
因此，需要低成本、高安全性、可稳定提供的生产玉米黄质、β-胡萝卜素和番茄红素的方法。
发明公开
本发明人为了解决上述问题进行了深入的研究，他们发现产生类胡萝卜素化合物(例如虾青素)的微生物对诱变处理敏感，由此容易的得到类胡萝卜素总量中有高比例含量的玉米黄质、β-胡萝卜素和番茄红素的微生物，从而完成了本发明。
因此，本发明提供以下各发明。
(1)一种生产玉米黄质或含玉米黄质的类胡萝卜素混合物的方法，包括：诱导产虾青素微生物的突变，其中相应于16S核糖体RNA的DNA碱基序列与SEQ ID NO：1所述碱基序列基本同源；筛选相比亲代菌株在类胡萝卜素总量中有更高产物比例(质量百分比)的玉米黄质的微生物突变株；培养生产玉米黄质的微生物；并从所得培养物中收获玉米黄质或含玉米黄质的类胡萝卜素混合物。
(2)以上发明(1)描述的方法，其中筛选以得到相比亲代在类胡萝卜素总量中有更高产物比例(质量百分比)玉米黄质的突变株的步骤包括，在固体培养基上选择黄色到橙色的菌落。
(3)以上发明(1)或(2)描述的方法，其中产玉米黄质微生物的类胡萝卜素总量中玉米黄质的比例为20％质量或更高。
(4)任何以上发明(1)至(3)描述的方法，其中产玉米黄质微生物产生的类胡萝卜素总量中，海胆酮、3-羟基海胆酮、海星酮(asteroidenone)、角黄素、侧金盏花玉红素(adonirubin)、侧金盏花黄质(adonixanthin)和虾青素的比例各自均低于10％质量。
(5)任何以上发明(1)至(4)描述的方法，其中含有玉米黄质的类胡萝卜素混合物包含β-隐黄质和/或β-胡萝卜素。
(6)以上发明(1)至(5)任何一项描述的方法，其中产虾青素微生物选自菌株E-396(FERM BP-4283)及其突变体和菌株A-581-1(FERMBP-4671)及其突变体。
(7)一种生产β-胡萝卜素或含有β-胡萝卜素的类胡萝卜素混合物的方法，包括：将产类胡萝卜素微生物作为亲代菌株诱导突变，突变株中相应于16S核糖体RNA的DNA碱基序列与SEQ ID NO：1所述碱基序列基本同源，并且产生至少一种选自海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素的类胡萝卜素化合物；筛选相比亲代菌株在类胡萝卜素总量中有更高产物比例(质量百分比)的β-胡萝卜素的突变株，以提供产β-胡萝卜素微生物；培养该产β-胡萝卜素微生物；和从所得培养物中收获β-胡萝卜素或含β-胡萝卜素的类胡萝卜素混合物。
(8)以上发明(7)所述的方法，其中包括使用产类胡萝卜素微生物作为亲代菌株进行诱变，以获得角黄素和海胆酮合计量占总类胡萝卜素产量的50％质量或更高。
(9)以上发明(7)或(8)所述的方法，其中包括使用产类胡萝卜素微生物作为突变用亲代菌株，它的玉米黄质和β-隐黄质合计量占类胡萝卜素总量质量的50％或更高。
(10)任何以上发明(7)至(9)描述的方法，其中筛选相比亲代在类胡萝卜素总量中有更高产物比例(质量百分比)β-胡萝卜素的突变株的步骤包括，在固体培养基上选择黄色到橙色的菌落。
(11)任何以上发明(7)至(10)描述的方法，其中产β-胡萝卜素微生物产生的β-胡萝卜素含量占总类胡萝卜素产量的50％质量或更高。
(12)任何以上发明(7)至(11)描述的方法，其中产β-胡萝卜素微生物产生的类胡萝卜素总量中，海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素各自比例均低于20％质量。
(13)以上发明(7)至(12)中任何一项描述的方法，其中产类胡萝卜素微生物选自菌株E-396(FERM BP-4283)及其突变体和菌株A-581-1(FERM BP-4671)及其突变体。
(14)一种生产番茄红素或者含有番茄红素的类胡萝卜素混合物的方法，包括：将产类胡萝卜素微生物作为亲代菌株诱导突变，其中相应于16S核糖体RNA的DNA碱基序列与SEQ ID NO：1所述序列基本同源，并且产生至少一种选自类β-胡萝卜素、海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素的胡萝卜素化合物；筛选相比亲代菌株在类胡萝卜素总量中有更高产物比例(质量百分比)的番茄红素的突变株，以得到产番茄红素微生物；培养该产番茄红素微生物；和从所得培养物中收获番茄红素或含番茄红素的类胡萝卜素混合物。
(15)以上发明(14)所述的方法，其中筛选相比亲代在类胡萝卜素总量中有更高产物比例(质量百分比)番茄红素的突变株的步骤包括，在固体培养基上选择粉红色到微红紫色的菌落。
(16)以上发明(14)或(15)所述的方法，其中产番茄红素微生物产生的番茄红素比例占总类胡萝卜素产量的40％质量或更高。
(17)以上发明(14)至(16)中任何一项所述的方法，其中产番茄红素微生物的类胡萝卜素总量中，β-胡萝卜素、海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素各自的比例均低于20％质量。
(18)以上发明(14)至(17)中任何一项所述的方法，其中产类胡萝卜素微生物选自菌株E-396(FERM BP-4283)及其突变体和菌株A-581-1(FERM BP-4671)及其突变体。
下文将详细描述本发明。
本发明的方法使用可产生虾青素或类胡萝卜素的微生物作为突变用亲代菌株，其中相应于16S核糖体RNA的DNA碱基序列与SEQID NO：1所述碱基序列基本同源。本文所用的“基本同源”是指考虑到DNA测序中的错误频率等，同源性为98％或更高。
具有与上述序列基本同源的序列的虾青素或产类胡萝卜素微生物的具体实例可包括菌株E-396(FERM BP-4283)、菌株A-581-1(FERM BP-4671)和对菌株E-396或A-581-1及近缘种进行突变和修饰得到的各种突变株。SEQ ID NO：1的DNA碱基序列相应于菌株E-396的核糖体RNA；SEQ ID NO：2的DNA碱基序列相应于菌株A-581-1的核糖体RNA。菌株E-396和A-581-1的16S核糖体RNA间的同源性为99.4％，证明它们是近缘菌株。因此，这些菌株构成了一组产生类胡萝卜素的细菌。本发明方法中用于突变的亲代菌株定义为产虾青素或类胡萝卜素菌株E-396和A-581-1，和这些菌株的近缘种及其突变体，其中相应于16S核糖体RNA的DNA碱基序列与SEQ IDNO：1所述碱基序列有98％或更高的同源性。
描述了在本发明里将菌株E-396作为虾青素或产类胡萝卜素微生物的实例。该菌株由本发明的发明人新近分离，并在1993年4月27日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，编号FERM BP-4283。此外，其它微生物的具体实例可包括菌株A-581-1。该菌株由本发明的发明人新近分离，并在1994年5月20日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，编号FERM BP-4671。
对产虾青素微生物的突变处理和产玉米黄质突变株的选择
产虾青素微生物的诱变方法没有具体限定，只要它能够诱导突变即可。例如，可使用化学方法如使用诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和甲磺酸乙酯(EMS)；物理方法如紫外辐射和X射线辐射；生物学方法，如使用基因重组、转座子等。突变处理可进行一次或两次或更多，例如诱变处理方式为用诱变提供产类胡萝卜素微生物的突变体，再作诱变处理。
然后从上述所得的产虾青素微生物突变体中，选择出相比亲代菌株类胡萝卜素总量中玉米黄质产物比例(质量％)更高的突变体，以得到产玉米黄质微生物。对于这种目的，突变处理后可在固体培养基上形成细菌菌落，随后随机挑选菌落，但相比亲代菌株红色到红橙色菌落，优选出黄色到橙色菌落，以有效得到产玉米黄质微生物(突变体)，因为产玉米黄质微生物的菌落通常表现为黄色到橙色。加上这个步骤显著提高了得到所需突变株的可能性，该菌株在类胡萝卜素总量中有高产物比例的玉米黄质。
再用常规方法培养上述选出的每个突变株的菌落，并在培养结束后分析每个突变株培养液中含有的类胡萝卜素化合物，以选出具有高产物比例玉米黄质的突变株。
突变株的培养可在如含有产生类胡萝卜素化合物成分的微生物生长必需的培养基中进行。培养方法可是任何方法，包括使用试管、烧瓶等的振摇培养、通气搅动培养等。分析类胡萝卜素化合物的方法可是任何方法，只要它能够分离并检测类胡萝卜素化合物；例如可用高效液相色谱、薄层层析或者纸层析。
根据本发明，产玉米黄质微生物通过筛选出类胡萝卜素总量中有高产物比例玉米黄质的突变株得到；本文所用的“类胡萝卜素总量”指类胡萝卜素化合物例如虾青素、角黄素、侧金盏花黄质、β-胡萝卜素、海胆酮、玉米黄质、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮和侧金盏花玉红素的总量。
产虾青素微生物如菌株E-396同时产生许多种类胡萝卜素化合物，例如虾青素、角黄素、侧金盏花黄质、β-胡萝卜素、海胆酮、玉米黄质、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮和侧金盏花玉红素。因此在类胡萝卜素总量中玉米黄质含量比例低，通常为约0-10％质量。根据本发明，对产虾青素微生物进行诱变并随后筛选出类胡萝卜素总量中具有高产物比例玉米黄质的突变株。选择标准至少要求突变后的玉米黄质产物比例高于亲代菌株；选出的突变株中类胡萝卜素总量中玉米黄质的比例优选为20％质量或更高，更优选为40％质量或更高，甚至更优选为60％质量或更高。
估计虾青素的生物合成使用了上游β-胡萝卜素，通过用酮基化酶和羟化酶分别在其两端对六元环进行修饰而发生(见图1)。预计酮基化酶的完全缺失导致仅产生β-胡萝卜素、β-隐黄质和玉米黄质，而不产生需要酮基化酶的海胆酮、角黄素、3-羟基海胆酮、海星酮、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素。预计酮基化酶的不完全缺失在类胡萝卜素总量中产生较低比例的海胆酮、角黄素、3-羟基海胆酮、海星酮、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素。因此作为另一种从突变株中选择产玉米黄质微生物的方法，可使用其中根据类胡萝卜素总量中海胆酮、角黄素、3-羟基海胆酮、海星酮、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素比例的下降来进行选择的方法。这种选择可根据上述每种化合物在类胡萝卜素总量中的比例低于10％质量来进行，优选低于5％质量，更优选低于1％质量。
产类胡萝卜素微生物的突变处理和产β-胡萝卜素微生物突变株的选择
本发明所用的突变用亲代菌株定义为类胡萝卜生产微生物，其中相应于16S核糖体RNA的DNA碱基序列与SEQ ID NO：1所述碱基序列有98％或更高的同源性，并且产生至少一种以下类胡萝卜素化合物：海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素；优选使用角黄素和海胆酮合计量在类胡萝卜素总量中的比例为50％质量或更高的产类胡萝卜素微生物，或者使用玉米黄质和β-隐黄质合计量在类胡萝卜素总量中的比例为50％质量或更高的产类胡萝卜素微生物。更优选，使用角黄素和海胆酮合计量在类胡萝卜素总量中的比例为70％质量或更高的产类胡萝卜素微生物，或者使用玉米黄质和β-隐黄质合计量在类胡萝卜素总量中的比例为70％质量或更高的产类胡萝卜素微生物。本文所用的“类胡萝卜素总量”指类胡萝卜素化合物例如β-胡萝卜素、海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素的总量。
在类胡萝卜素的生物合成中，估计在番茄红素的两端形成了环状结构以生成β-胡萝卜素，而β-胡萝卜素两端的六元环进一步被酮基化酶和羟化酶修饰，分别产生角黄素、玉米黄质、虾青素等(见图1)。
本发明的发明人发现，通过使用以高比例产生角黄素和海胆酮的微生物，或者使用以高比例产生玉米黄质和β-隐黄质的微生物作为突变用亲代菌株，相比使用以高比例产生虾青素的微生物作为突变用亲代菌株，能够显著提高得到产β-胡萝卜素微生物的可能性。这些现象可解释如下。因为以高比例产生虾青素的微生物同时有羟化和酮基化β-胡萝卜素的酶，需要缺失这两种酶以积累β-胡萝卜素，以高比例产生角黄素和海胆酮的微生物由于已经缺失了羟化酶，所以只需要通过突变缺失酮基化酶，或者以高比例产生玉米黄质和β-隐黄质的微生物由于已经缺失了酮基化酶，所以只需要通过突变缺失羟化酶。以高比例产生角黄素和海胆酮的微生物，或者以高比例产生玉米黄质和β-隐黄质的微生物可以是天然具有这种特性的野生型菌株，也可以是通过突变(例如从产虾青素微生物)得到。
根据本发明，产类胡萝卜素微生物的诱变方法没有具体限定，只要能引起突变即可。例如可使用采用诱变剂的化学方法，如使用N-甲基-N′硝基-N-亚硝基胍(NTG)和甲磺酸乙酯(EMS)；物理方法如紫外辐射和X射线辐射；生物学方法，如基因重组、转座子等。突变处理可进行一次或两次或更多次，例如进行诱变处理以提供产类胡萝卜素微生物突变体，其再次经历诱变。
然后从上述所得的产类胡萝卜素微生物突变体中，选择相比亲代菌株类胡萝卜素总量中有更高产物比例(质量百分比)β-胡萝卜素的突变株，以获得胡萝卜素生产微生物。对于这种目的，突变处理后可在固体培养基上形成细菌菌落，再随机选择菌落，但挑选黄色到橙色菌落，以有效得到产β-胡萝卜素微生物(突变体)，因为产β-胡萝卜素微生物菌落通常表现为这些颜色。包含这个步骤显著提高了得到所需突变株的可能性，其中类胡萝卜素总量中有高产物比例的β-胡萝卜素。
用常规方法培养上述选出的每个突变株的菌落，并分析每个突变株培养液中含有的类胡萝卜素化合物，以选出具有高产物比例β-胡萝卜素的突变株。
突变株的培养可在如含有产生类胡萝卜素化合物成分的生产微生物生长必需培养基中进行。培养方法可是任何方法，包括使用试管、烧瓶等的振摇培养、通气搅动培养等。分析类胡萝卜素化合物的方法可是任何方法，只要它能够分离并检测类胡萝卜素化合物；例如可用高效液相色谱、薄层层析或者纸层析。
根据本发明，产β-胡萝卜素微生物通过筛选出类胡萝卜素总量中有高产物比例β-胡萝卜素的突变株得到。产类胡萝卜素微生物如菌株E-396同时产生多种类胡萝卜素化合物，例如虾青素、角黄素、侧金盏花黄质、β-胡萝卜素、海胆酮、玉米黄质、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮和侧金盏花玉红素。因此在类胡萝卜素总量中β-胡萝卜素的产物比例低，通常为约0-20％质量。
根据本发明，对产类胡萝卜素微生物进行诱变并随后筛选出类胡萝卜素总量中具有高产物比例β-胡萝卜素的突变株。选择标准至少要求突变后的β-胡萝卜素产物比例高于亲代菌株；选出的突变株中类胡萝卜素总量中β-胡萝卜素的产物比例优选为50％质量或更高，更优选为70％质量或更高，甚至更优选为90％质量或更高。
如上所述，估计类胡萝卜素的生物合成通过在它们两端对六元环进行修饰而发生，分别使用酮基化酶和羟化酶，分别生成角黄素、玉米黄质、虾青素等(见图1)。估计酮基化酶和羟化酶的完全缺失导致仅产生β-胡萝卜素，并且不产生β-胡萝卜素后的海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素。估计酮基化酶和羟化酶的不完全缺失会增加类胡萝卜素总量中β-胡萝卜素的产物比例和降低海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素的产物比例。因此作为另一种用于从突变株中选择产β-胡萝卜素微生物的方法，可使用其中根据类胡萝卜素总量中海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素比例下降来进行选择的方法。这种选择可基于上述每种化合物在总类胡萝卜素中的比例低于20％质量来进行，优选低于10％质量，更优选低于5％质量。
产类胡萝卜素微生物的突变和番茄红素生产突变株的选择
本发明所用的突变用亲代菌株定义为产类胡萝卜微生物，其中相应于16S核糖体RNA的DNA碱基序列与SEQ ID NO：1所述碱基序列有98％或更高的同源性，并且产生至少一种选自β-胡萝卜素、海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素的类胡萝卜素化合物。至少产生上述一种类胡萝卜素的野生型菌株可用作突变用亲代菌株，也可使用通过人工诱变处理改进了虾青素、角黄素、玉米黄质、β-类胡萝卜素及类似物质生产力的突变株作为亲代。
根据本发明，对产类胡萝卜素微生物的诱变方法没有具体限定，只要能引起突变即可。例如可使用使用诱变剂的化学方法，如N-甲基-N′硝基-N-亚硝基胍(NTG)和甲磺酸乙酯(EMS)；物理方法如紫外辐射和X射线辐射；生物学方法，如基因重组、转座子等。突变处理可进行一次或两次或更多次，例如进行诱变处理以提供产类胡萝卜素微生物的突变体，其再次经历诱变。
从上述所得的产类胡萝卜素微生物突变体中，选择相比亲代菌株类胡萝卜素总量中有更高产物比例(质量％)番茄红素的突变株，以获得产番茄红素微生物。对于这种目的，突变处理后在固体培养基上形成细菌菌落，然后随机选择菌落，但相比亲代菌株的红色到棕(tango)色菌落，选择粉红色到微红紫色的菌落，以有效得到产番茄红素微生物(突变体)，因为产β-胡萝卜素微生物菌落通常表现为粉红色到微红紫色。包含这个步骤显著提高了得到所需突变株的可能性，其类胡萝卜素总量中有高产物比例的番茄红素。
用常规方法培养上述选出的每个突变株的菌落，并分析每个突变株培养液中含有的类胡萝卜素化合物，以选出具有高产物比例的番茄红素的突变株。
突变株的培养可在如含有产生类胡萝卜素化合物成分的生产微生物生长必需培养基中进行。培养方法可是任何方法，包括使用试管、烧瓶等的振摇培养、通气搅动培养等。分析类胡萝卜素化合物的方法可是任何方法，只要它能够分离并检测类胡萝卜素化合物，例如可用高效液相色谱、薄层层析或者纸层析。
根据本发明，产β-胡萝卜素微生物通过筛选出类胡萝卜素总量中有高产物比例番茄红素的突变株得到。本文所用的“类胡萝卜素总量”指类胡萝卜素例如番茄红素、β-胡萝卜素、海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素的总量。
产番茄红素微生物如菌株E-396同时产生多种类胡萝卜素化合物，例如虾青素、角黄素、侧金盏花黄质、β-胡萝卜素、海胆酮、玉米黄质、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮和侧金盏花玉红素。因此在类胡萝卜素总量中番茄红素产物比例低，通常为约0-5％质量。
根据本发明，对产类胡萝卜素微生物进行诱变，随后筛选出类胡萝卜素总量中具有高产物比例番茄红素的突变株。选择标准至少要求突变后的番茄红素产物比例高于亲代菌株；选出的突变株类胡萝卜素总量中番茄红素的产物比例优选为40％质量或更高，更优选为65％或更高，甚至更优选为90％或更高。
估计类胡萝卜素的生物合成通过在番茄红素的两端形成环以生成β-胡萝卜素，而β-胡萝卜素的六元环在两端进一步被酮基化酶和羟化酶修饰，分别产生角黄素、玉米黄质、虾青素等(见图1)。估计环化酶的完全缺失导致仅产生番茄红素并且不产生番茄红素后的β-胡萝卜素、海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素。估计环化酶的不完全缺失增加类胡萝卜素总量中番茄红素的产物比例，降低β-胡萝卜素、海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素的比例。因此作为另一种从突变株中选择产番茄红素微生物的方法，可使用其中基于类胡萝卜素总量中β-胡萝卜素、海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素产物比例下降来进行选择的方法。这种选择可根据上述每种化合物在总类胡萝卜素中的比例低于20％质量来进行，优选低于10％质量，更优选低于5％质量。
选出的突变株的培养和类胡萝卜素化合物的收获
随后，上述选出的产玉米黄质突变株、产β-胡萝卜素微生物突变株或者生产番茄红素突变株按下文所述进行培养，并收获所需类胡萝卜素化合物。
根据本发明，培养上述每种突变微生物以收获玉米黄质、β-胡萝卜素、番茄红素或是含有这些物质的类胡萝卜素混合物。培养这种突变微生物的方法可为任何方法，只要产生所需类胡萝卜素化合物，不过可采用以下方法。也就是使用含有碳源、氮源、无机盐和(如果必要)生产微生物生长所需具体物质(例如维生素、氨基酸、核酸等)的培养基。碳源的实例包括糖类例如葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和麦芽糖；有机酸例如醋酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸；醇类例如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇和异丁醇等等。添加比例根据所用碳源种类而不同，典型的为每升培养基1到100g，优选为每升2到50g。所用的氮源实例包括选自以下的一种或多种：硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素、谷氨酸单钠等。添加比例根据所用氮源种类而不同，典型的为每升培养基0.1到20g，优选为每升1到10g。所用的无机盐实例包括选自以下的一种或多种：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、氯化铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化锌、硫酸铜、氯化钙、碳酸钙和碳酸钠。添加比例根据所用无机盐种类而不同，典型为每升培养基0.1mg到10g。具体需要物质的实例包括选自以下的一种或多种：维生素、核酸、酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、干酵母、大豆渣、大豆油、橄榄油、玉米油和亚麻籽油。添加比例根据具体所需物质种类而不同，典型为每升培养基0.01mg到100g。培养基pH值调节到2-12，优选为6-9。培养条件包括10到70摄氏度的温度，优选为20到35摄氏度；振摇培养或通气搅动培养典型进行1到20天，优选为2到9天。
然后，进行操作以从上述所得培养液中除去水。根据培养液情况例如有色物含量决定应从培养液中除去水的程度，以得到玉米黄质、β-胡萝卜素、番茄红素或是含有这些物质的类胡萝卜素混合物，但典型首先进行过滤操作，如果需要进一步除去水则干燥沉淀。可用常规过滤或离心方法等进行过滤。如果需要进一步除去水，可采用干燥沉淀的方法。干燥方法的实例包括如常规的喷雾干燥、转鼓式干燥和冷冻干燥。
可通过提取法任选提高所需类胡萝卜素化合物的含量。提取法所用的原料可使用培养液本身，或者使用其过滤后的沉淀或其干燥物。提取方法的实例包括如溶剂提取和超临界二氧化碳提取。用于提取的有机溶剂没有具体限制，可以是水溶性有机溶剂或者水不溶性有机溶剂。水溶性有机溶剂包括四氢呋喃、吡啶、二烷、环己烷、环己醇、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、甲乙酮、二甲基甲酰胺和二甲亚砜。提取溶剂可用两种或多种的混合物，或是与水的混合物。所得提取物可进行真空浓缩等以除去溶剂制得产品。任选可进行除臭处理或用植物油悬浮。
如果所需类胡萝卜素化合物含量需要进一步提高，推荐使用常规纯化方法，包括使用两种或更多种溶剂组合的液-液提取和柱层析，随后浓缩或冷却含有类胡萝卜素化合物的提取物或洗出液等，或者添加不良溶剂以沉淀类胡萝卜素化合物。
通过这些方法得到的含有玉米黄质、β-胡萝卜素或番茄红素的培养液沉淀、干燥沉淀、提取物、纯化提取物等，可用作如饲料组分、食品材料、化妆品材料和药物材料。
本说明书包括日本专利申请No.2003-325104、2003-325130、2003-325144的说明书内容，本申请的优先权基于这些申请。
附图简述
图1为显示类胡萝卜素化合物的生物合成途径的图。
实施本发明的最佳方法
实施例
下文基于实施例进一步详细描述本发明。但是本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
用200mg/L NTG(N-甲基-N′硝基-N-亚硝基胍)在28摄氏度下静置突变处理菌株E-396(FERM BP-4283)30分钟。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表1成分的培养基，并在121摄氏度下蒸汽灭菌15分钟，制得试管培养基。共选出了200个黄色到橙色的突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养4天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株其中类胡萝卜素总量中玉米黄质的产物比例达到60％质量或更高。表2显示了该菌株所含的类胡萝卜素化合物分析结果。为了对比，在同样条件下培养菌株E-396，其培养液中类胡萝卜素化合物分析结果列于表3。
[表1]
| 成分 | 添加量(g/L) |
| 酵母提取物蛋白胨蔗糖 | 20550 |
| KH2PO4Na2HPO4·12H2OMgSO4·7H2OFeSO4·7H2OCaCl2·2H2ONa2CO3 | 1.53.80.50.010.01调培养基至pH7的量 |
[表2]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 4.0----2.4---10.6 | 23.514.162.4 |
“-”表示低于检测限(0.1mg/L)。
[表3]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素 | 1.61.80.41.6 | 6.67.41.66.6 |
| 侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 1.0-6.41.58.61.4 | 4.126.36.235.45.8 |
“-”表示低于检测限(0.1mg/L)。
实施例2
用200mg/L NTG(N-甲基-N′硝基-N-亚硝基胍)在28摄氏度下静置突变处理菌株E-396(FERM BP-4283)30分钟。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表1成分的培养基，并在121摄氏度下蒸汽灭菌15分钟，制得试管培养基。随机选出1,500个黄色到橙色的突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养4天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株产生的海胆酮、角黄素、3-羟基海胆酮、海星酮、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素各自产物比例均低于类胡萝卜素总产量10％质量。表4显示了该菌株的类胡萝卜素化合物分析结果。
[表4]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质 | 4.4---0.23.1 | 31.91.422.5 |
| 虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 0.5-1.14.5 | 3.68.032.6 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
实施例3
用NTG诱变处理菌株E-396(FERM BP-4283)，随后选出了呈深红色的菌落得到突变株Y-559，该菌株有提高的虾青素生产能力。用150mg/L NTG进一步诱变株Y-559。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表1成分的培养基，并在121摄氏度下蒸汽灭菌15分钟，制得试管培养基。选出了350个黄色到橙色的突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养5天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株其中类胡萝卜素总量中海胆酮、角黄素、3-羟基海胆酮、海星酮、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素各自产物比例均低于1％。表5显示了该菌株的类胡萝卜素化合物分析结果。为了对比，在同样条件下培养菌株Y-559，其培养液中类胡萝卜素化合物分析结果列于表6。
[表5]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质 | 34.0----3.4 | 59.15.9 |
| 虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | --0.419.7 | 0.734.3 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
[表6]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 26.27.90.912.020.3-67.7-56.40.6 | 13.64.10.56.310.635.329.40.3 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
实施例4
使用UV灯紫外辐射诱变株A-581-1(FERM BP-4671)。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表1成分的培养基，并在121摄氏度下蒸汽灭菌15分钟，制得试管培养基。选出了280个黄色到橙色的突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养4天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株其中类胡萝卜素总量中玉米黄质的产物比例达到20％质量或更高。表7显示了该菌株的类胡萝卜素化合物分析结果。为了对比，在同样条件下培养菌株A-581-1，其培养液中类胡萝卜素化合物分析结果列于表8。
[表7]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 3.9----2.2---2.0 | 48.127.224.7 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
[表8]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质 | 0.60.6-0.70.4- | 7.87.89.15.2 |
| 虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 1.80.42.70.5 | 23.45.235.16.5 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
实施例5
用100mg/L NTG(N-甲基-N′硝基-N-亚硝基胍)在28摄氏度下静置突变处理菌株E-396(FERM BP-4283)30分钟。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表9成分的培养基，并在121摄氏度下蒸汽灭菌15名，制得试管培养基。选出了4,000个黄色到橙色的突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养4天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株其中类胡萝卜素总量中β-胡萝卜素的产物比例达到50％质量或更高。表10显示了该菌株的类胡萝卜素化合物分析结果。为了对比，在同样条件下培养菌株E-396，其培养液中类胡萝卜素化合物分析结果列于表11。
表9
| 成分 | 添加量(g/L) |
| 酵母提取物蛋白胨蔗糖KH2PO4Na2HPO4·12H2OMgSO4·7H2OFeSO4·7H2OCaCl2·2H2O | 205501.53.80.50.010.01 |
| Na2CO3 | 调培养基至pH7的量 |
[表10]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 11.90.2-0.30.4-0.7-0.5- | 85.01.42.12.95.03.6 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
[表11]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮 | 1.61.80.41.61.0-6.41.5 | 6.67.41.66.64.126.36.2 |
| 侧金盏花黄质玉米黄质 | 8.61.4 | 35.45.8 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
实施例6
用NTG突变处理菌株E-396(FERM BP-4283)，随后选出了呈橙色的菌落得到突变株CA-22，该菌株有提高的角黄素生产能力。用200mg/L NTG进一步诱变株CA-22。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表9成分的培养基并在121摄氏度下蒸汽灭菌15分钟，制得试管培养基。选出了80个黄色到橙色的突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养5天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株其中类胡萝卜素总量中β-胡萝卜素产物比例达到50％质量或更高。表12显示了该菌株的类胡萝卜素化合物分析结果。为了对比，在同样条件下培养菌株CA-22，其培养液中类胡萝卜素化合物分析结果列于表13。
[表12]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质 | 17.40.4-0.3----- | 96.12.21.7 |
| 玉米黄质 | - |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
[表13]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 1.22.5-16.10.9-0.3--- | 5.711.976.74.31.4 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
实施例7
用NTG处理菌株E-396(FERM BP-4283)，随后选出了呈黄色的菌落得到突变株ZE-7，该菌株有提高的产玉米黄质能力。用150mg/L NTG进一步诱变株ZE-7。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表9成分的培养基，并在121摄氏度下蒸汽灭菌15分钟，制得试管培养基。选出了60个黄色到橙色的突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养5天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株其中类胡萝卜素总量中β-胡萝卜素产物比例达到50％质量或更高。表14显示了该菌株的类胡萝卜素化合物分析结果。为了对比，在同样条件下培养菌株ZE-7，其培养液中类胡萝卜素化合物分析结果列于表15。
[表14]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 16.0--------- | 100 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
表15
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮 | 4.0----2.4-- | 23.514.1 |
| 侧金盏花黄质玉米黄质 | -10.6 | 62.4 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
实施例8
使用UV灯用紫外辐射诱变株A-581-1(FERM BP-4671)。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表9成分的培养基，并在121摄氏度下蒸汽灭菌15分钟，制得试管培养基。选出了3,000个黄色的突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养4天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株其中类胡萝卜素总量中海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素各自产物比例均低于20％质量。表16显示了该菌株的类胡萝卜素化合物分析结果。为了对比，在同样条件下培养菌株A-581-1，其培养液中类胡萝卜素化合物分析结果列于表17。
[表16]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质 | 2.90.5-0.20.20.30.2-0.2 | 64.411.14.44.46.74.44.4 |
| 玉米黄质 | - |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
[表17]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 0.60.6-0.70.4-1.80.42.70.5 | 7.87.89.15.223.45.235.16.5 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
实施例9
用100mg/L NTG(N-甲基-N′硝基-N-亚硝基胍)在28摄氏度下处理菌株E-396(FERM BP-4283)30分钟。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表18成分的培养基，并在121摄氏度下蒸汽灭菌15分钟，制得试管培养基。选出了60个粉红色到微红紫色的突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养4天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株其中类胡萝卜素总量中番茄红素的产物比例达到40％质量或更高。表19显示了该菌株的类胡萝卜素化合物分析结果。为了对比，在同样条件下培养菌株E-396，其培养液中类胡萝卜素化合物分析结果列于表20。
[表18]
| 成分 | 添加量(g/L) |
| 酵母提取物蛋白胨蔗糖KH2PO4Na2HPO4·12H2OMgSO4·7H2OFeSO4·7H2OCaCl2·2H2ONa2CO3 | 205501.53.80.50.010.01调培养基至pH7的量 |
[表19]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| 番茄红素β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 15.5------0.3-0.3- | 96.31.91.9 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
[表20]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| 番茄红素β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | -1.61.80.41.61.0-6.41.58.61.4 | 6.67.41.66.64.126.36.235.45.8 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
实施例10
用100mg/L NTG(N-甲基-N′硝基-N-亚硝基胍)在28摄氏度下静置突变处理菌株E-396(FERM BP-4283)30分钟。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表18成分的培养基，并在121摄氏度下蒸汽灭菌15分钟，制得试管培养基。随机选出了800个突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养4天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株其中类胡萝卜素总量中番茄红素的产物比例达到40％质量或更高。表21显示了该菌株的类胡萝卜素化合物分析结果。为了对比，在同样条件下培养菌株E-396，其培养液中类胡萝卜素化合物分析结果列于表20。
[表21]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| 番茄红素β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 10.10.20.5-0.30.4-1.2-0.9- | 74.31.53.72.22.98.86.6 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
实施例11
用NTG突变处理菌株E-396(FERM BP-4283)，随后选出了呈深红色的菌落得到突变株Y-559，该菌株有提高的虾青素生产能力。用150mg/L NTG进一步诱变株Y-559。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表18成分的培养基，并在121摄氏度下蒸汽灭菌15分钟，制得试管培养基。选出了80个粉红色到微红紫色的突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养5天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株其中类胡萝卜素总量中番茄红素的产物比例达到40％质量或更高。表22显示了该菌株的类胡萝卜素化合物分析结果。为了对比，在同样条件下培养菌株Y-559，其培养液中类胡萝卜素化合物分析结果列于表23。
[表22]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| 番茄红素β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 163.9------0.7--- | 99.60.4 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
[表23]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| 番茄红素β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质 | -26.27.90.912.020.3- | 13.64.10.56.310.6 |
| 虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 67.7-56.40.6 | 35.329.40.3 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
实施例12
用NTG突变处理菌株E-396(FERM BP-4283)，随后选出了呈橙色的菌落得到突变株CA-22，该菌株有提高的角黄素生产能力。用200mg/L NTG进一步诱变株CA-22。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表18成分的培养基，并在121摄氏度下蒸汽灭菌15分钟，制得试管培养基。共选出了60个粉红色到微红紫色的突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养5天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株其中类胡萝卜素总量中番茄红素产物比例达到40％质量或更高。表24显示了该菌株的类胡萝卜素化合物分析结果。为了对比，在同样条件下培养菌株CA-22，其培养液中类胡萝卜素化合物分析结果列于表25。
[表24]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| 番茄红素β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素 | 19.3---0.4- | 98.02.0 |
| β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | ----- |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
[表25]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| 番茄红素β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | -1.22.5-16.10.9-0.3--- | 5.711.976.74.31.4 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
实施例13
用NTG处理菌株E-396(FERM BP-4283)，随后选出了呈黄色的菌落得到突变株ZE-7，该菌株有提高的产玉米黄质能力。用150mg/L NTG进一步诱变株ZE-7。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表18成分的培养基，并在121摄氏度下蒸汽灭菌15分钟，制得试管培养基。选出了80个粉红色到微红紫色的突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养5天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株其中类胡萝卜素总量中番茄红素产物比例达到40％质量或更高。表26显示了该菌株的类胡萝卜素化合物分析结果。为了对比，在同样条件下培养菌株ZE-7，其培养液中类胡萝卜素化合物分析结果列于表27。
[表26]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| 番茄红素β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 17.1-----0.2---0.5 | 96.11.12.8 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
[表27]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| 番茄红素β-胡萝卜素 | -4.0 | 23.5 |
| 海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | ----2.4---10.6 | 14.162.4 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
实施例14
使用UV灯用紫外辐射诱变株A-581-1(FERM BP-4671)。在内径为18mm的试管中加入6ml含有表18成分的培养基，并在121摄氏度下蒸汽灭菌15分钟，制得试管培养基。选出了100个粉红色的突变菌落，将一铂环量的每个菌落接种到试管培养基中，然后在28摄氏度下330rpm振摇培养4天。这些培养液进行离心分离，然后用高效液相色谱分析所得细胞体内的类胡萝卜素化合物，结果有一个菌株其中类胡萝卜素总量中β-胡萝卜素、海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素各自产物比例均低于20％质量。表28显示了该菌株的类胡萝卜素化合物分析结果。为了对比，在同样条件下培养菌株A-581-1，其培养液中类胡萝卜素化合物分析结果列于表29。
[表28]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| 番茄红素β-胡萝卜素 | 3.3- | 54.1 |
| 海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | 0.4-0.30.3-1.1-0.7- | 6.64.94.918.011.5 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
[表29]
| 类胡萝卜素化合物 | 每单位体积培养液的产物浓度(mg/L) | 产物比例(质量％) |
| 番茄红素β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素侧金盏花玉红素β-隐黄质虾青素海星酮侧金盏花黄质玉米黄质 | -0.60.6-0.70.4-1.80.42.70.5 | 7.87.89.15.223.45.235.16.5 |
“-”表示含量低于检测限(0.1mg/L)
所有本文引用的出版物均通过引用整体结合到本文中。
工业适用性
本发明的方法用于生产玉米黄质、β-胡萝卜素和番茄红素以及含有这些物质作为主要成分的类胡萝卜素混合物，它们可用作着色剂、抗氧化剂等。
本发明提供了低成本、高安全性的玉米黄质、β-胡萝卜素和番茄红素生产方法，通过该方法它们可稳定供应。
本发明的一些生产玉米黄质、β-胡萝卜素或番茄红素的突变株在产生作为主产品的玉米黄质、β-胡萝卜素或番茄红素的同时，也可产生作为副产品的其它类胡萝卜素化合物，例如β-隐黄质和/或β-胡萝卜素，本发明的方法也可用作有效生产这些类胡萝卜素混合物的方法。
序列表
<110>新日本石油株式会社(Nippon Oil Corporation)
<120>生产类胡萝卜素化合物的方法
<130>PH-2223PCT-US
<150>JP2003/325104
<151>2003-9-17
<150>Jp2003/325130
<151>2003-9-17
<150>JP2003/325144
<151>2003-9-17
<160>2
<210>1
<211>1452
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物体：E-396的说明
<400>1
agtttgatcc tggctcagaa cgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcga 60
gaccttcggg tctagcggcg gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtgccc ttctctacgg 120
aatagccccg ggaaactggg agtaataccg tatacgccct ttgggggaaa gatttatcgg 180
agaaggatcg gcccgcgttg gattaggtag ttggtggggt aatggcccac caagccgacg 240
atccatagct ggtttgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatcttaga caatgggggc aaccctgatc tagccatgcc 360
gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa agctctttca gctgggaaga taatgacggt 420
accagcagaa gaagccccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggggct 480
agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggactggaaa gtcagaggtg 540
aaatcccagg gctcaacctt ggaactgcct ttgaaactat cagtctggag ttcgagagag 600
gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc 660
gaaggcggct cactggctcg atactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 720
attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgc cagacgtcgg caagcatgct 780
tgtcggtgtc acacctaacg gattaagcat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa 840
aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900
aacgcgcaga accttaccaa cccttgacat ggcaggaccg ctggagagat tcagctttct 960
cgtaagagac ctgcacacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttc 1020
ggttaagtcc ggcaacgagc gcaacccacg tccctagttg ccagcaattc agttgggaac 1080
tctatggaaa ctgccgatga taagtcggag gaaggtgtgg atgacgtcaa gtcctcatgg 1140
gccttacggg ttgggctaca cacgtgctac aatggtggtg acagtgggtt aatccccaaa 1200
agccatctca gttcggattg tcctctgcaa ctcgagggca tgaagttgga atcgctagta 1260
atcgcggaac agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1320
accatgggag ttggttctac ccgacgacgn tgcgctaacc ttcggggggc aggcggccac 1380
ggtaggatca gcgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggggaa cctgcggctg 1440
gatcacctcc tt 1452
<210>2
<211>1426
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>未知生物体：A-581-1的说明
<400>2
tagagtttga tcctggctca gaacgaacgc tggcggcagg cttaacacat gcaagtcgag 60
cgagaccttc gggtctagcg gcggacgggt gagtaacgcg tgggaacgtg cccttctcta 120
cggaatagcc ccgggaaact gggagtaata ccgtatacgc cctttggggg aaagatttat 180
cggagaagga tcggcccgcg ttggattagg tagttggtga ggtaacggct caccaagccg 240
acgatccata gctggtttga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga 300
ctcctacggg aggcagcagt ggggaatctt agacaatggg ggcaaccctg atctagccat 360
gccgcgtgag tgatgaaggc cttagggttg taaagctctt tcagctggga agataatgac 420
ggtaccagca gaagaagccc cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggg 480
gctagcgttg ttcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgta ggcggactgg aaagtcagag 540
gtgaaatccc agggctcaac cttggaactg cctttgaaac tatcagtctg gagttcgaga 600
gaggtgagtg gaattccgag tgtagaggtg aaattcgtag atattcggag gaacaccagt 660
ggcgaaggcg gctcactggc tcgatactga cgctgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac 720
aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tgccagacgt cggcaagcat 780
gcttgtcggt gtcacaccta acggattaag cattccgcct ggggagtacg gtcgcaagat 840
taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 900
agcaacgcgc agaaccttac caacccttga catggcagga ccgctggaga gattcagctt 960
tctcgtaaga gacctgcaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020
ttcggttaag tccggcaacg agcgcaaccc acgtccctag ttgccagcat tcagttgggc 1080
actctatgga aactgccggt gataagccgg aggaaggtgt ggatgacgtc aagtcctcat 1140
ggcccttacg ggttgggcta cacacgtgct acaatggtgg tgacagtggg ttaatcccca 1200
aaagccatct cagttcggat tgtcctctgc aactcgaggg catgaagttg gaatcgctag 1260
taatcgcgga acagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1320
acaccatggg agttggttct acccgacgac gctgcgctaa cccttcgggg aggcaggcgg 1380
ccacggtagg atcagcgact ggggtgaagt cgtaacaagg tagcca 1426
Claims (18)
1.一种生产玉米黄质或含玉米黄质的类胡萝卜素混合物的方法，所述方法包括：诱导产虾青素微生物突变，其中相应于16S核糖体RNA的DNA碱基序列与SEQ ID NO：1所述碱基序列基本同源；筛选玉米黄质占类胡萝卜素总产量的产物质量百分比高于亲代菌株的突变株，以得到产玉米黄质微生物；培养所述产玉米黄质微生物；并从所得培养物中收获玉米黄质或所述含玉米黄质的类萝卜素混合物。
2.权利要求1的方法，其中所述筛选玉米黄质占类胡萝卜素总产量的产物质量百分比高于亲代菌株的突变株的步骤包括，在固体培养基上选择黄色到橙色的菌落。
3.权利要求1的方法，其中产玉米黄质微生物产生的玉米黄质占类胡萝卜素总量的质量百分比为20％或更高。
4.权利要求1的方法，其中所述产玉米黄质微生物产生的海胆酮、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素各自的比例均低于类胡萝卜素总量的10％质量。
5.权利要求1的方法，其中所述含有玉米黄质的类胡萝卜素混合物包含β-隐黄质和/或β-胡萝卜素。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述产虾青素微生物选自菌株E-396(FERM BP-4283)及其突变株和菌株A-581-1(FERM BP-4671)及其突变株。
7.一种生产β-胡萝卜素或含有β-胡萝卜素的类胡萝卜素混合物的方法，所述方法包括：将产类胡萝卜素微生物作为突变用亲代菌株诱导突变，其中相应于16S核糖体RNA的DNA碱基序列与SEQ IDNO：1所述碱基序列基本同源，并且其产生至少一种选自海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素的类胡萝卜素化合物；筛选β-胡萝卜素占类胡萝卜素总产量的产物质量百分比高于亲代菌株的突变株，以得到产β-胡萝卜素微生物；培养所述产β-胡萝卜素微生物；并从所得培养物中收获β-胡萝卜素或所述含β-胡萝卜素的胡萝卜素混合物。
8.权利要求7的方法，其中所述方法包括使用产类胡萝卜素微生物作为突变用亲代菌株，所述亲代菌株的角黄素和海胆酮合计量占类胡萝卜素总量的质量比为50％或更高。
9.权利要求7的方法，其中所述方法包括使用产类胡萝卜素微生物作为突变用亲代菌株，所述亲代菌株的玉米黄质和β-隐黄质合计量占类胡萝卜素总产量的质量比为50％或更高。
10.权利要求7的方法，其中所述筛选β-胡萝卜素占类胡萝卜素总产量的产物质量百分比高于亲代菌株的突变株的步骤包括，在固体培养基上选择黄色到橙色的菌落。
11.权利要求7的方法，其中所述产β-胡萝卜素微生物产生的β-胡萝卜素占类胡萝卜素总量的质量比为50％或更高。
12.权利要求7的方法，其中所述产β-胡萝卜素微生物产生的海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素各自的比例均低于类胡萝卜素总量的20％质量。
13.权利要求7-12中任一项的方法，其中所述产类胡萝卜素微生物选自菌株E-396(FERM BP-4283)及其突变株和菌株A-581-1(FERM BP-4671)及其突变株。
14.一种生产番茄红素或者含有番茄红素的类胡萝卜素混合物的方法，所述方法包括：将产类胡萝卜素微生物作为突变用亲代菌株诱导突变，其中相应于16S核糖体RNA的DNA碱基序列与SEQ IDNO：1所述碱基序列基本同源，并且其产生至少一种选自β-胡萝卜素、海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素的类胡萝卜素化合物；筛选番茄红素占类胡萝卜素总产量的产物质量百分比高于亲代菌株的突变株，以得到产番茄红素微生物；培养所述产番茄红素微生物；并从所得培养物中收获番茄红素或所述含番茄红素的类胡萝卜素混合物。
15.权利要求14的方法，其中所述筛选番茄红素占类胡萝卜素总产量的产物质量百分比高于亲代菌株的突变株的步骤包括，在固体培养基上选择粉红色到微红紫色的菌落。
16.权利要求14的方法，其中所述产番茄红素微生物产生的番茄红素占类胡萝卜素总量的质量比为40％或更高。
17.权利要求14的方法，其中所述产番茄红素微生物产生的β-胡萝卜素、海胆酮、β-隐黄质、3-羟基海胆酮、海星酮、角黄素、玉米黄质、侧金盏花玉红素、侧金盏花黄质和虾青素各自的比例均低于类胡萝卜素总量的20％质量。
18.权利要求14-17中任一项的方法，其中所述产类胡萝卜素微生物选自菌株E-396(FERM BP-4283)及其突变株和菌株A-581-1(FERM BP-4671)及其突变株。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20061206 |