CN1872271A - 一种防治更年期综合症的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用中草药熟地黄、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉的提取物来制备防治更年期综合症的药物组合物。

Description

一种防治更年期综合症的药物组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及中草药药物组合物，具体而言是关于一种防治更年期综合症的中草药药物组合物及其制备方法。
背景技术
更年期综合症指妇女在更年期(一般为45-55岁之间)出现的以植物神经功能紊乱为主的症候群。更年期的主要症状为忧虑、抑郁、易激动、失眠、健忘、头晕、头痛、喜怒无常、骨质疏松等。医学界认为本病的主要起因是卵巢功能衰退，雌激素水平显着下降。因此常用补充雌激素(Estrogen)的雌激素替代疗法(Estrogen ReplacementTherapy)治疗。随着雌激素的广泛使用，有关其副作用如卵巢癌、子宫内膜癌、冠心病、卒中和器官发炎等的报导越来越多。日本Morishta Jintan公司以千里光、红花、马鞭草、悬钩子等植物药加钙剂用于治疗更年期骨质疏松，已获得专利(JP 2000053576 A2，2000年)；美国Wakunaga of America公司用黄芪、益母草、马鞭草、鼠尾草等中药制成针对更年期症状的各种制剂，已获得美国专利(US6346267，2002年)。国内用中成药治疗更年期综合症也有报导，常用的古方有左归丸、左归饮、消遥丸、六味地黄丸等。现代方剂有更年安、更年康、更年乐、妇康宁、妇宁康等。这些中成药中，有的含动物药，有的添加了合成药的成分，有的仍采用传统丸剂，外形粗大，数量多，口味差，服用不便，价格不菲。因此在详尽研究、分析中医药妇女病的典籍的基础上，我们以明代张景岳于1624年出版的《景岳全书》中的左归丸为基础，组成一种防治更年期综合症的中药制剂。
发明内容
因此，本发明的其中一个方面就是提供新的、更有效的防治更年期综合症的药方。
根据本发明的一个方面，提供一种防治更年期综合症的药物组合物，其特征在于所述药物组合包含熟地黄、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、和淡豆豉等成分的提取物。在一个优选的实施例中，所述药物组合基本上由熟地、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉等成分的提取物组成。在一个较优选的实施例中，所述组合由熟地、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉等成分的提取物组成。在一个更优选的实施例中，所述提取物是由下述重量配比的原料提取而得：
熟地黄4.5-35.5％      淫羊藿5.5-24.5％    山茱萸1.0-25.2％
山药0.5-26.0％        枸杞子3.0-24.0％    淡豆豉3.5-22.5％
在一个更优选的实施例中，所述提取物是由下述重量配比的原料提取而得：
熟地黄15-25份    淫羊藿8-17份     山茱萸5-20份
山药10-24份      枸杞子10-25份    淡豆豉9-22份
在一个更优选的实施例中，所述提取物是由下述重量配比的原料提取而得：
熟地黄18-22份    淫羊藿10-13份    山茱萸8-12份
山药12-17份      枸杞子13-17份    淡豆豉14-18份
在最优选的实施例中，所述提取物是由下述重量配比的原料提取而得：
熟地黄19.6份    淫羊藿11.2份    山茱萸10.4份
山药14.0份      枸杞子14.4份    淡豆豉15.4份
根据本发明的另一个方面，提供一种制备防治更年期综合症之药物组合物的方法，包括提供熟地、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉的提取物。在一个具体的实施例中，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄15-25份    淫羊藿8-17份     山茱萸5-20份
山药10-24份      枸杞子10-25份    淡豆豉9-22份
在一个优选的实施例中，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄18-22份    淫羊藿10-13份    山茱萸8-12份
山药12-17份      枸杞子13-17份    淡豆豉14-18份
在一个较优选的实施例中所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄19.6份    淫羊藿11.2份    山茱萸10.4份
山药14.0份      枸杞子14.4份    淡豆豉15.4份
在另一个优选的实施例中，所述方法，进一步包括以下步骤：
(a)提供包含熟地、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉的混合物；
(b)以水提取所述混合物，过滤，取得第一提取液；
(c)浓缩第一提取液，取得浓缩提取液；
(d)以乙醇提取所述浓缩提取液，取得第二提取液及沉淀；
(e)浓缩第二提取液
优选的，所述步骤(b)的提取是在90-100℃下以水提取所述混合物2～3次，每次0.5～2小时。
优选的，所述步骤(c)的浓缩包含在80℃将第一提取液，减压浓缩至相对密度为1.1-1.3。
优选的，所述乙醇的浓度为70-100％(v/v)。
优选的，所述步骤(e)的浓缩包括将第二提取液浓缩至相对密度为1.0-1.5。
根据本发明的另一个方面，提供一种营养补充品，包含熟地、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉的提取物。优选的，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄15-25份    淫羊藿8-17份     山茱萸5-20份
山药10-24份      枸杞子10-25份    淡豆豉9-22份
较优选的，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄18-22份    淫羊藿10-13份    山茱萸8-12份
山药12-17份    枸杞子13-17份    淡豆豉14-18份
更优选的，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄19.6份    淫羊藿11.2份    山茱萸10.4份
山药14.0份      枸杞子14.4份    淡豆豉15.4份
根据本发明的另一个方面，提供以熟地、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉的提取物作为制备治抑郁症药的应用。优选的，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄15-25份    淫羊藿8-17份     山茱萸5-20份
山药10-24份      枸杞子10-25份    淡豆豉9-22份
更优选的，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄18-22份    淫羊藿10-13份    山茱萸8-12份
山药12-17份      枸杞子13-17份    淡豆豉14-18份
最优选的，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄19.6份    淫羊藿11.2份    山茱萸10.4份
山药14.0份      枸杞子14.4份    淡豆豉15.4份
具体实施方案
实施例1：组合物I的制备
材料：
●熟地：购自上海华宇药业有限公司
●淫羊藿：购自上海华宇药业有限公司
●山茱萸：购自上海华宇药业有限公司
●山药：购自上海华宇药业有限公司
●枸杞子：购自上海华宇药业有限公司
●淡豆豉：购自上海华宇药业有限公司
●95％乙醇：购自上海莱盈化工有限公司；产品编号：030801
秤取熟地黄19.6公斤，淫羊藿11.2公斤(切成5毫米宽的丝)，山茱萸10.4公斤，山药14.0公斤(切成3毫米厚的薄片)，枸杞子14.4公斤，淡豆豉15.4公斤，共85公斤。用水提取二次，提取温度90-100℃，每次加水680升，每次1.5小时，将两次提取所得的提取液合并，过滤，并在80℃的温度下浓缩至相对密度为1.2(60℃)。用2倍体积量的95％乙醇沉淀杂质，取上清液在50～80℃的温度下浓缩成相对密度为1.3的提取物，70℃真空干燥，粉碎得到组合物I(10.5克)。每克组合物I相当于生药8.10克。
实施例2：急性毒性试验
本发明中药制剂的急性毒性试验测得该药的半数致死量(LD50)大于5g/kg。本实验参照《化学品单次给药的毒性研究指导原则》(试行本)以及《药理实验方法学》(1991)进行。动物：昆明种清洁级小鼠共20只，上海实验动物中心，体重：18-22克，雌雄各半。
药品：试验样品：实施例1制得的组合物I。
试验方法：
按照最大给药剂量法，动物于试验前禁食5小时，试验当日配制药物，配制方法为将组合物I溶解于20ml的生理盐水中。剂量为5g/kg，并以一次灌胃给药(0.4ml/20g体重)。给药后观察动物毒性反应及死亡情况，连续观察10天。十天后，解剖并观察小鼠主要器官。
结果：
试验小鼠无一死亡，也未见明显中毒症状。其行为活动，精神状态、饮食、粪便、皮毛、呼吸均正常，口、眼、鼻无异常分泌物，解剖后主要脏器未见明显异常病变。实验证明，组合物I的半数致死量(LD50)对雌性小鼠为497g生药/kg，对雄性小鼠为528g生药/kg。
实施例3：睡眠试验
有镇静催眠作用的药物一般能延长的睡眠时间。睡眠时间的延长可由注射戊巴比妥钠小鼠的翻正反射消失时间来表示。本实验参照《药理实验方法学》(1991)、《中药药理研究方法学》(1996)、《现代药理实验方法》(1998)，以及朱晓东、唐希灿《中国药理学报》(1998)进行。
动物：昆明种小白鼠，雌性，18-20克，来自中科院上海实验动物中心。
药品：
●试验组：实施例1制得的组合物I；剂量为56g生药/体重kg/日。给药配方是将0.56g的组合物I溶解于0.2ml的水中而得。
●阳性对照组：安定(Diazepam)；购自安徽邦宁制药有限公司；剂量为0.5mg/体重kg/日。给药配方是由1mg的安定溶于40ml的水中而得。
●阴性对照组：0.9％生理盐水。
试验方法：
随机将30只小鼠分为三组：试验组、阳性对照组和阴性对照组。阴性对照组和试验组的小鼠分别口服如上所述的药物及剂量，1次1日，连续给药14天。阳性对照组的动物于最后一天口服给予安定一次。最后一次给药后1小时，所有小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠35mg/kg，观察并记录小鼠翻正反射消失持续的时间。根据《现代药理实验方法》(1998)，翻正反射消失的时间等同于睡眠持续的时间。试验结果见表1。
表1.组合物I对戊巴比妥钠所致睡眠时间的延长作用(n＝10，mean±SD)
  组别   剂量   睡眠持续时间(秒)
  阴性对照组   生理盐水   1510.7±898.2
  阳性对照组   0.5mg/kg安定   2927.8±1061.2**
  试验组   相当于56g生药/kg   2679.7±1045.6*
*p＜0.05与阴性对照组相比；**p＜0.01与阴性对照组相比
试验结果显示(见表1)：试验组明显延长小鼠的睡眠时间，与阴性对照组相比有显着性差异(P＜0.05)。
实施例4：旷场实验(Open Field Test)
有中枢抑制或镇静作用的药物可减少动物的自主活动。本实验参照《药理实验方法学》(1991)，《中药药理研究方法学》(1996)进行。动物：昆明种小白鼠，雌性，体重18-20克，来自中科院上海实
验动物中心。
仪器：多功能小鼠自主活动记录仪，型号：YLS-1B，山东省医学科学院设备站。
药品：
●试验组：实施例1制得的组合物I；剂量为14g生药/体重kg/日。给药配方是将0.14g的组合物I溶解于0.2ml的水中而得。
●阳性对照组：安定(Diazepam)；购自安徽邦宁制药有限公司；剂量为1mg/体重kg/日。给药配方是由1mg的安定溶于20ml的水中而得。
●阴性对照组：0.9％生理盐水。
试验方法：
随机将30只小鼠分为试验组、阳性对照组、阴性对照组三组。阴性对照组和试验组的小鼠分别口服如上所述的药物及剂量，每日1次，连续给药14天。阳性对照组动物于最后一天口服给予安定一次。最后一次给药后1小时，将小鼠放入红外探测的自主活动仪内，测定小鼠3分钟内的活动次数。试验结果见表2。
表2.组合物I对正常小鼠自主活动的影响(n＝10，mean±SD)
  组别   剂量   给药后1小时   给药后3小时
  阴性对照组   生理盐水   74.3±8.5   56.0±10
  阳性对照组   1.0mg/kg安定   61.0±11.6*   46.2±11.3*
  试验组   相当于14g生药/kg体重   65.6±8.5*   37.9±8.43**
*p＜0.05与阴性对照组相比；**p＜0.01与阴性对照组相比
试验结果显示(见表2)：给药后1小时，试验组降低了小鼠的活动性，与阴性对照组相比有显着性差异(p＜0.05)，其程度与安定组相当。给药后3小时，试验组仍显示明显药效。
上述试验证实，本发明的组合物I具有中枢抑制或镇静作用，显示该组合物也可应用于作为镇静的药物。
实施例5：正常小鼠明暗穿箱试验
在本试验中，小鼠被置于Shimada明暗箱内。小鼠在两个箱子之间穿梭的次数及停留在暗箱/明箱内的时间被纪录。抗焦虑作用的药物可明显增加小鼠的穿箱次数及减少在暗箱的滞留时间。本实验参照《药理实验方法学》(1991)、《中药药理研究方法学》(1996)、以及《现代药理实验方法》(1998)进行。
仪器：
Shimada明暗箱〔上海医药工业研究院〕：规格：40cm×40cm×12cm的有机玻璃箱，中间有一个20cm×20cm×12cm的方箱，两个对角分别有两个10cm×10cm×12cm的暗箱，暗箱的两侧各连有两个L型的跑道，暗箱与L型的跑道有一个3.5cm×3.5cm的洞口相通。
动物：昆明种小白鼠，雌性，18-20克，来自中科院上海实验动物中心。
药品：
●试验组：实施例1制得的组合物I；剂量为56g生药/体重kg/日。
●阳性对照组：安定(Diazepam)；购自安徽邦宁制药有限公司；剂量为1mg/体重kg。
●阴性对照组：0.9％生理盐水；剂量为0.2ml/10g体重/日。
试验方法：
随机将30只小鼠分为试验组、阳性对照组、阴性对照组三组。阴性对照组和试验组的小鼠分别口服如上所述的药物及剂量，1次1日，连续给药14天。阳性对照组动物于最后一天给药一次。最后一次给药后1小时，将小鼠放入Shimada明暗箱中，使小鼠背对暗箱的洞口。记录10min内小鼠的穿箱次数及分别在明暗箱的滞留时间。试验结果见表3。
表3.组合物I对正常小鼠明暗穿箱作用的影响(n＝10，mean±SD)
          组别   剂量   穿箱次数   暗箱停留时间(秒)
  阴性对照组   生理盐水   60.8±8.46   247.9±58.75
  阳性对照组   1.0mg/kg安定   76.1±8.9**   166.6±45.05**
  试验组   相当于56g生药/kg体重   72.8±7.91**   169.8±61.22**
**p＜0.01与阴性对照组相比
试验结果显示(见表3)：接受组合物I的小鼠的穿箱次数明显多于阴性对照组(p＜0.01)，在暗箱内的停留时间短于阴性对照组(p＜0.01)。
实施例6去势小鼠明暗穿箱试验
本实验与实施例5相同惟试验动物为切除卵巢(去势)小鼠。抗焦虑作用的药物应可明显增加去势小鼠的穿箱次数及减少在暗箱的滞留时间。本实验参照《药理实验方法学》(1991)、《中药药理研究方法学》(1996)、《现代药理实验方法》(1998)。
仪器：与实施例5同
动物：昆明种小白鼠，雌性，18-20克，来自中科院上海实验动物中心。
药品：
●试验组：实施例1制得的组合物I；剂量为14g生药/体重kg/日。
●阳性对照组：安定(Diazepam)；购自安徽邦宁制药有限公司；剂量为1mg/体重kg。
●阴性对照组：0.9％生理盐水。
试验方法：
随机将30只小鼠分为试验组、阳性对照组、及阴性对照组三组。所有小鼠以35mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，无菌条件下分别切开背部双侧距脊柱1cm处皮肤及皮下组织，分离双侧卵巢并予以切除，缝合切口。一周后口服给予药物如实例5。最后一次给药后1小时，将小鼠放入Shimada明暗箱中，使小鼠背对暗箱的洞口。记录10min内小鼠的穿箱次数及分别在明暗箱的滞留时间试验结果见表4。
表4.组合物I对去势小鼠明暗穿箱作用的影响(n＝10，mean±SD)
  组别   剂量   穿箱次数   暗箱停留时间(秒)
  阴性对照组   生理盐水   21.2±8.6   92.2±39.3
  阳性对照组   1.0mg/kg安定   20.5±10.7(p＝0.874)   47.4±31.9*
  试验组   相当于14g生药/kg体重   8.04±6.4**   48.1±39.7*
*P＜0.05与阴性对照组相比；**P＜0.01与阴性对照组相比
试验结果：
试验组小鼠的穿箱次数明显少于阴性对照组和阳性对照组(p＜0.01)，在暗箱内的停留时间也明显缩短，与阴性对照组相比有显着性差异(p＜0.05)，显示组合物具有显着抑制中枢神经的效果(见《药理实验方法学》(1991))。
实施例7：去势大鼠高架十字迷宫试验
高架十字迷宫是用来研究大鼠焦虑情形的一个常用的方法。所用的仪器包括两个开臂及两个闭臂。四臂相交形成一个加号的形状。整个仪器从地面架高。一般认为高度与敞开的空间会引起与焦虑有关的行为，动物会避免进入开臂。抗焦虑作用的药物应能增加大鼠进入开臂次数和在开臂滞留时间。本实验参照《药理实验方法学》(1991)、《中药药理研究方法学》(1996)、《现代药理实验方法》(1998)。
动物：SD大白鼠，雌性，体重230-250克，来自中科院上海实验动物中心。
药品：
●试验组：实施例1制得的组合物I；剂量为14g生药/体重kg/日。
●阳性对照组：安定(Diazepam)；购自安徽邦宁制药有限公司；剂量为0.5mg/体重kg。
●阴性对照组：0.9％生理盐水。
试验方法：
随机将30只大鼠分为试验组、阳性对照组、阴性对照组三组。所有大鼠以60mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，无菌条件下分别切开背部双侧距脊柱1.5cm处皮肤及皮下组织，分离双侧卵巢并予以切除，缝合切口。一周后口服给予药物治疗。阴性对照组和试验组的大鼠分别口服如上所述的药物及剂量，1次1日，连续给药14天。阳性对照组的大鼠于最后一天给药一次。最后一次给药后1小时，将小鼠放入迷宫中。大鼠进入开臂的次数及停留在开臂的时间被记录并列于表5。
表5
  组别   迷宫内的迁移时间
  进入开臂次数×100％进入两臂次数之和  停留于开臂时间×100％停留于两臂时间之和
  阴性对照   2±4％  0.5±1％
  组
  阳性对照组   12±11％*  6±7％*
  试验组   11±17％(p＝0.3)  4±5％(p＝0.48)
*p＜0.05与阴性对照组相比
试验结果：
试验组进入开臂次数的百分比明显增加，同样，在开臂滞留时间的百分比也呈增加趋势。试验证实，本发明组合物I具有抗焦虑作用，显示该组合物也可应用于作为抗焦虑的药物。
实施例8：正常小鼠跳台试验
本实验利用一个包括一个平台及铜闸的跳台纪录仪器。将小鼠置于铜栅上。当铜栅通电时，小鼠正常的反应是跳至平台上躲避电击。过了一段时间后，小鼠会忘记电击而跳回铜栅。跳回铜栅是一个“错误反应”。小鼠跳回铜栅会因再次受到电击而再跳回平台。从第一次跳至平台与第一次跳回铜栅之间相隔的时间叫做“潜伏期”。在一段时间内跳回铜栅(错误反应)的次数可作为小鼠记忆力的指标。根据此一原理，有改善学习记忆的药物可减少东莨菪碱造成的记忆获得障碍小鼠24小时后受电击的动物数，3分钟内的错误数降低，以及延长首次跳下平台的潜伏期。本实验参照《药理实验方法学》(1991)、《中药药理研究方法学》(1996)、《现代药理实验方法》(1998)，以及杨军，王静等(2000)。
动物：昆明种小白鼠，雌性，18-20克，来自中科院上海实验动物中心。
药品：
●试验组：实施例1制得的组合物I；剂量为14g生药/体重kg/日。
●阳性对照组：石杉碱甲(Huperzine A)，购自上海复旦复华药业有限公司；剂量为1.5ug/体重kg/日(等于0.2ml/10g体重)。
●阴性对照组：0.9％生理盐水。
●其它试剂：氢溴酸东莨菪碱(Scopolamine)，购自上海禾丰制药有限公司，剂量：2mg/体重kg。
仪器：小鼠跳台记录仪，型号：YLS-2T型，山东省医学科学院设备站。
试验方法：
随机将30只小鼠分为三组：试验组、阳性对照组、和阴性对照组。阴性对照组和试验组的动物分别口服如上所述的药物及剂量，阳性对照组口服石杉碱甲1.5ug/kg，0.2ml/10g体重，1次1日，连续给药14天。最后一次给药后1小时，腹腔注射东莨菪碱2mg/kg，30min后将小鼠放入跳台仪内适应5min。然后通电，动物受到电击后的正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激，多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台，如此训练5min，记录每鼠受电击的次数。24小时后重测，记录受电击的动物数，第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误总数。试验结果见表6。
表6(n＝10，mean±SD)
  组别   5分钟训练期间   24小时后
  受电击次数(每鼠)   受电击总次数   受电击小鼠数目   3min内错误数   第一次跳下平台的潜伏期(秒)
  阴性对照组   4.1±1.9   41   9   14   77.1±94.9
  阳性对照组   5.7±2.7   51   5   8   200.6±137.2*
  试验组   3.1±1.9   28   4   5   181.3±141.7(p＝0.074)
*p＜0.05与阴性对照组相比
试验结果(见表6)：
第一天是小鼠服药14天后首次接受电击，在此之前小鼠从未接受过该种训练，因而不会对该训练存在记忆，也就是说在第一天每一组小鼠的反应都是自发的条件反射，而不存在药物的辅助作用。第一天每鼠受电击的次数在试验组有下降趋势，但无统计学差异，且受电击的总次数也明显减少，所以理论上第一天不应该有明显差异。24小时后，试验组受电击的小鼠数目及3min内的错误次数均明显减少，第一次跳下平台的潜伏期明显延长。本实验显示组合物I能够延长受电击小鼠跳下平台的潜伏期，但差异未达到显著水平。
实施例9：正常小鼠避暗法试验(Step Through Test)
本试验利用一个具有一明室与一暗室的小鼠避暗仪。将小鼠放入明室，背向门。当小鼠从明室走出进入暗室即会遭受电击，该行为为一个错误反应。小鼠被放入避暗仪后到产生的第一个错误反应的间隔时间为潜伏期。小鼠的记忆力越强，潜伏期越长，在一段时间内发生的错误反应次数就越少。有改善学习记忆的药物可延长乙醇所致记忆再现障碍小鼠24小时后由明室到暗室的潜伏期及减少错误次数。本实验参照《药理实验方法学》(1991)、《中药药理研究方法学》(1996)、《现代药理实验方法》(1998)以及朱晓东、唐希灿《中国药理学报》(1998)。
动物：昆明种小白鼠，雌性，18-20克，来自中科院上海实验动物中心。
药品：
●45％乙醇：购自上海化学试剂公司
●试验组：实施例1制得的组合物I；剂量为14g生药/体重kg/日
●阳性对照组：石杉碱甲，购自上海复旦复华药业有限公司；剂量为1.5ug/体重kg/日(等于0.2ml/10g体重)。
●阴性对照组：0.9％生理盐水。
●其它试剂：氢溴酸东莨菪碱，购自上海禾丰制药有限公司，剂量：2mg/体重kg。
仪器：小鼠避暗仪，型号：YLS-1A型，山东省医学科学院设备站。
试验方法：
随机将30只小鼠分为三组：阴性对照组，阳性对照组和试验组。三组的小鼠分别口服如上所述的药物及剂量，1次1日，连续给药14天。末次给药后1小时(第14天)，口服给予45％的乙醇溶液(0.1ml/10g)。30min后将小鼠放入避暗箱内，背朝洞口放入明室，同时启动定时器。动物穿过洞口进入暗室受到电击，计时自动停止。取出小鼠，记录每鼠从放入明室致进入暗室遇到电击所需的时间，此即潜伏期。24小时后重测，记录进入暗室的动物数、潜伏期和5min内的电击次数。试验结果见表7。
表7(n＝10，mean±SD)
  组别   第一次测试   第二次测试(24h后)
  第一个潜伏期   错误次数   第二个潜伏期
  阴性对照组   16.8±10.21   4.7±3.8   82.4±75.3
  阳性对照组   19.3±16.16   1.4±2.0*   196.2±121.9*
  试验组   24.8±22.43(p＝0.75)   2.7±2.6(p＝0.17)   143.9±110.4(p＝0.196)
*p＜0.05与阴性对照组相比
试验结果：
测试第一天，试验组小鼠第一个潜伏期均有延长趋势(理论上第一天不应该有明显差异)，此现象并未发生在阳性对照组。24小时后，试验组小鼠的第二个潜伏期也呈延长趋势。上述试验证实，本发明组合物I具有改善学习记忆的作用，显示该组合物也可应用于作为改善记忆的药物。
与前一个实施例相同，第一天为训练动物，动物从明室进入暗室的第一个潜伏期在各个试验组间不应该有差异。
实施例10：调节血清雌激素、孕激素水平作用的试验
原理：雌激素能使去卵巢的小鼠出现动情期，阴道涂片出现大量角化上皮细胞雌激素亦具有同化作用，促进蛋白质合成使子宫增重，使子宫重量与每100g体重比值上升。本实验参照《中药新药研究指南》(1996)、《药理实验方法学》(2003)、《生殖药理学》(1990)以及W.G.沃格(2001)。
动物：SD大鼠，上海西普尔-必凯公司提供，体重：给药前体重为220.0-250.0克，雌性，共30只分成5组。
药品：
●试验组：
1.实施例1制得的组合物I；7g生药/体重kg/日
2.由如下重量比例的原料，按照实施例1的步骤所提取的组合物II：
熟地黄18-22份    淫羊藿10-13份    山茱萸8-12份
山药12-17份      枸杞子13-17份    淡豆豉14-18份
剂量：7g生药/体重kg/日
3.由如下重量比例的原料，按照实施例1的步骤所提取的组合物III：
熟地黄19.6份    淫羊藿11.2份    山茱萸10.4份
山药14.0份      枸杞子14.4份    淡豆豉15.4份
剂量：5g生药/体重kg/日
●阳性对照组：
1.苯甲酸雌二醇组(Estradiol Benzoate)，购自上海第九制药厂；剂量：0.01mg/体重kg/日；注射配方：溶解于花生油(0.01mg/ml)中。
2.左归丸组，购自上海雷允上封浜制药有限公司；剂量：7g生药/体重kg/日；注射配方：溶解于0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。
3.更年安组，购自天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂；剂量：6g生药/体重kg/日；注射配方：溶解于0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。
●阴性对照组：0.9％生理盐水。
●0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)：购自中国医药集团上海化学试剂公司
试验方法：
将SD大鼠随机分为阴性对照组、苯甲酸雌二醇组(阳性对照组1)、左归丸组(阳性对照组2)，更年安组(阳性对照组3)和试验组。按照上述剂量及注射配方灌胃给药，除了阳性对照组1(苯甲酸雌二醇组)以皮下注射给药。连续给药28天，每天一次。每日先阴道涂片，后给药，观察SD大鼠身体情况，记录给药量和涂片结果。末次给药24小时后，将SD大鼠称重，麻醉，取血后处死。摘取子宫，称全子宫湿重。再取一侧子宫称湿重，然后将组织块放置60烘箱中烘8小时称重，测得干重。血清用RIA法测雌、孕激素水平。试验结果见表8和表9。
表8(n＝6)
  组别   雌二醇(ng/ml)   孕酮(ng/ml)
  阴性对照组   15.67±5.01   25.75±4.71
  阳性对照组   苯甲酸雌二醇组 33.00±21.76**   25.85±6.15(p＝0.974)
  左归丸组   23.40±12.58(p＝0.198)   20.59±2.94(p＝0.063)
  更年安组   24.17±5.35*   20.21±3.50*
  试验组   组合物I   26.00±12.52(p＝0.09) 14.35±4.06*
  组合物II   20.83±8.89   18.80±5.44*
  组合物III   13.50±6.54   20.71±9.22
mean±SD，*p＜0.05；**p＜0.01与阴性对照组比
试验结果：
试验组能使SD去势大鼠血清雌二醇水平明显提高，与阴性对照组相比有差异，同时能使SD去势大鼠血清孕酮水平降低，与阴性对照组相比有显着性差异(*p＜0.05)，效果优于左归丸组和更年安组.表中所示的试验组为低剂量组，低剂量能使SD去势大鼠血清孕酮水平降低，与阴性对照组相比有显着性差异(*P＜0.05)，而高剂量组能使SD去势大鼠血清雌二醇水平明显提高，与阴性对照组相比有显着差异(*p＜0.05)，但表中未示。
表9对SD去势大鼠子宫重量、脏器指数的影响(n＝6)
  组别   子宫重量(g)   脏器指数(g/100g体重)
  阴性对照组   0.090±0.017   0.034±0.007
  阳性对照组   苯甲酸雌二醇组   0.597±0.064**   0.246±0.030**
  左归丸组   0.122±0.050**   0.045±0.019*
  更年安组   0.124±0.028(p＝0.077)   0.046±0.010(p＝0.056)
  试验组   组合物I   0.121±0.010*   0.073±0.007*
  组合物II   0.137±0.036*   0.050±0.013*
  组合物III   0.149±0.070   0.060±0.037
mean±SD，*p＜0.05，**p＜0.01与阴性对照组比
试验结果(见表9)：
试验组能使SD去势大鼠子宫重量和脏器指数增加，与阴性对照组相比有显着性差异(p＜0.05)，效果优于左归丸组和更年安组。
上述试验证实，组合物I，II，III能使SD去势大鼠子宫重量和脏器指数增加，血清雌二醇水平明显提高，血清孕酮水平降低，与阴性对照组相比有显着差异(p＜0.05)，作用明显优于左归丸和更年安，显示具有雌激素样活性。因此，本发明组合物I，II，III具有调节血清中雌激素、孕激素水平的作用，显示这些组合物也可应用于作为调节血清雌激素、孕激素的药物。
实施例11：抗氧化作用实验〔铜离子诱导的低密度脂蛋白抗氧化实验〕
原理：物质的抗氧化能力越强，低密度脂蛋白(LDL)越不容易被氧化。本实验参考Puhl H.，Waege G及Esterbauer H.(1994)、Buege JA.及AustSD.(1978)的记载。
药品：
●试验组：实施例1制得的组合物I；溶解于水中，浓度如表10A所列。
●阳性对照组：苯甲酸雌二醇，购自Innovative Research of America，Florida。
●阴性对照组：0.9％生理盐水。
表10A
  组合物浓度(mg/ml)
  0.01
  0.05
  0.10
●50μM CuSO4：购自Riedel-deHaen；产品编号：31294；目录编号：2811；制备方法：将16mg CuSO4加入100ml的水，形成水溶液。将5ml的所述水溶液加入95ml的水中，形成100ml 50μM的CuSO4水溶液
●低密度脂蛋白(LDL)：实验室制备。为防止脂蛋白修饰，将EDTA及NaN3加入从香港威尔斯亲王医院健康对象取得的血清。EDTA与NaN3的最终浓度分别为0.1％及0.05％。根据Havel et al.，1995所述的方法将LDL从血清中分离出来。为了防止LDL氧化，血清以氮气冲洗，再以1,500g速度离心15分钟移去细胞及细胞残骸。再加入NaCl-KBr溶液(将153g NaCl，354g KBr以及100mgEDTA溶于1L的水中制备而得，密度为1.33g/mL)，使密度增加至1.019g/ml。在4℃下将血清以160,000g再离心20个钟头。将最上层含有乳糜微粒及非常低密度的脂蛋白(very low-densitylipoprotein,VLDL)移去后，留下的血清层的密度增加至1.064g/mL，并在4℃下以160,000g_速度再离心24h。收取最上层的LDL层，用氮气冲洗后，存放于-70℃备用。
●EDTA，购自Sigma。
●TBA-TCA-HCL溶液：将0.6g的硫巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)、0.0268g TCA以及0.1mole的HCl混合。
●硫巴比妥酸：购自Sigma。
●丙二醛(Malonaldehyde)：购自Sigma。
●四甲氧基丙烷(Tetramethoxypropane，TMP)：购自Sigma。
试验方法：
将50微升50微摩尔浓度的铜离子加入0.4毫升低密度脂蛋白中，试验组加入50微升不同浓度的组合物I，对照组加入50微升水。随将浓度混合物在37℃温浴，在不同时间间隔取出样品，降温到4℃，并加入乙二胺四乙酸停止反应。加入2毫升的反应试剂〔0.6克丁基苯甲醇和0.0268克硫代巴比妥酸和0.1摩尔盐酸〕，在532nm下用紫外可见分光光度计测定氧化低密度脂蛋白的含量。
对照组实验中，铜离子诱导的低密度脂蛋白迅速氧化。组合物I可以抑制铜离子诱导的低密度脂蛋白的氧化，从而保护低密度脂蛋白，延缓被氧化的时间。0.01毫克每毫升浓度的组合物I可以抑制低密度脂蛋白的氧化达2个小时，0.05毫克每毫升浓度的组合物I可以抑制低密度脂蛋白的氧化达6个小时，0.10毫克每毫升的组合物I可以抑制低密度脂蛋白的氧化达18个小时(见表10)。
表10(n＝3，mean±SD)
  抑制时间(分钟)   浓度(毫克组合物I/毫升)
  0   0.01   0.05   0.10
  0   11.29±0.99   10.76±0.31   11.59±0.89   12.95±0.84
  120   31.38±0.99   8.39±0.72   14.43±0.84   12.36±0.36
  240   89.35±1.13   34.34±1.26   19.41±1.87   15.73±2.86
  360   88.04±4.07   90.36±1.68   23.30±3.28   19.64±1.52
  480   87.33±1.17   88.94±1.68   69.60±4.54   26.64±
  2.24
  600   85.72±2.43   88.72±1.68   93.78±2.62   30.35±5.36
  720   83.72±2.43   87.72±1.68   93.78±2.62   30.16±0.81
  840   83.72±2.43   86.72±1.68   93.78±2.62   32.74±0.57
  960   83.72±2.43   85.72±2.68   98.78±2.62   33.27±0.54
  1080   82.72±3.43   87.72±1.68   98.78±2.62   34.87±3.75
  1200   83.72±2.43   85.72±1.98   98.78±2.62   69.30±3.26
  1320   81.72±2.93   86.72±1.68   98.78±2.62   92.89±1.92
以上实验表明，组合物I具有明显的抗氧化作用。
实施例12：组合物I的抗氧化作用〔铁离子还原实验〕
原理：物质的抗氧化能力越强，越多三价铁离子会还原二价成铁离子。
参考：Benzie IF and Szeto YT.(1999)，J.Agric.Food Chem.47：633-636
动物：仓鼠，香港中文大学实验动物中心，体重：100公克，雌性，共47只分成6组。
药品：
●试验组：实施例1制得的组合物I依不同剂量再分组：16.6mg/100g/日(第一组)；33.2mg/100g/日(第二组)；66.4mg/100g/日(第三组)。
●阳性对照组(第四组)：苯甲酸雌二醇，购自Innovative Research ofAmerica，Florida；剂量：0.5mg/每片；目录编号：E121。
●阴性对照组(第五组)：水。
●伪手术组(第六组)：对仓鼠实施手术，但没有真正切除卵巢。
●血清铁离子还原能力(Ferric Reducing Ability of Plasma，FRAP)
试剂：由混合25ul 10mM TPTZ，25ul 20mM FeCl3·6H2O以及250ul，300mM的乙酸缓冲液。
试验方法：
仓鼠去势手术之后，经过一个月时间的身体恢复之后开始给药。不同剂量组灌胃给药四个星期，从眼眶抽取血液样本，经10000rpm离心10分钟后取得血清。10微升不同试验组动物的血清样品，加入300微升新配制的铁还原试剂中(由2.5毫升10mM三吡啶三吖嗪以及2.5毫升20mM升的三氯化铁溶液加入25毫升的300mM乙酸缓冲液中配制而成)，用紫外可见分光光度计在593nm的波长下全程监测反应体系。反应10分钟内吸光度的增高值(ΔA10-0mins)用来计算样品抗氧化能力的大小。FRAP的计算方式如下：
FRAP值(nmol/L)＝[样本溶液×ΔA10-0mins]*标准浓度/ΔA10-0mins的标准样本]
给药四星期后剩余的FRAP百分比＝[给药四个星期后的FRAP值]/[给药前的FRAP值]×100％
试验结果：
阴性对照组动物血清的抗氧化能力明显减弱，而试验组(第一组-第三组)动物血清的抗氧化能力明显高于对照组，说明组合物I可以明显减缓血清抗氧化能力的下降幅度。(见表11)
表11(n＝7-9，mean±SD)
组别   给药四星期后剩余的FRAP百分比   数量
  第一组(16.6mg/100g/日)   92.85±28.68(p＝0.16)   7
  第二组(33.2mg/100g/日)   96.43±20.27*(p＝0.03)   8
  第三组(66.4mg/100g/日)   90.17±30.75(p＝0.25)   8
  第四组(阳性对照组)   88.32±21.06(p＝0.17)   9
  第五组(阴性对照组)   75.72±13.04   8
  第六组(伪手术组)   123.23±67.23**(p＝0.001)   7
*p＜0.05与阴性对照组相比；**p＜0.01与阴性对照组相比
实施例13：心血管疾病的预防作用
原理：血清中[非高密度脂蛋白]/[高密度脂蛋白]比率与患心血管疾病的几率呈正相关；体内各器官的总胆固醇含量与患心血管疾病的几率呈正相关。
参考：Chan PT.，Fong WP.Cheung YL.，Huang Y，Ho KKW.and ChenZY.(1999)，Journal of Nutrition.129：1094-1101
药品：
●试验组：实施例1制得的组合物I浸膏依不同剂量再分组：
16.6mg/100g/日(低剂量组)；33.2mg/100g/日(中剂量组)；66.4mg/100g/日(高剂量组)。
●阳性对照组(第四组)：苯甲酸雌二醇，购自Innovative Research ofAmerica，Florida；剂量：0.5mg/每片；目录编号：E121。
●阴性对照组(第五组)：0.9生理盐水。
●伪手术组(第六组)：对仓鼠实施手术，但没有真正切除卵巢。
试验方法：
仓鼠去势手术之后，经过一个月时间的身体恢复之后开始给药。不同剂量组灌胃给药四个星期，从眼眶抽取血液样本，经10,000rpm离心10分钟后取得血清。试验组动物血清的高密度脂蛋白含量升高，非高密度脂蛋白与高密度脂蛋白的比率下降。由于低密度脂蛋白含量的升高与冠心病的发生和发展有着密切的关系，而高密度脂蛋白可以有效转运胆固醇，减少胆固醇在冠状动脉的沉积，升高高密度脂蛋白有可能成为冠心病防治的有效措施。实验动物灌胃给药八个星期以后，氮气麻醉杀死，利用气相色谱对各器官的胆固醇含量进行分析，结果表明：中剂量组以及高剂量组动物肾脏中，胆固醇含量显着低于对照组，说明组合物I给药达到特定剂量以后可以有效降低胆固醇的含量(见表12)。
表12(n＝7～9，mean±SD)
  组别   数量   血清[非高密度脂蛋白]/[高密度脂蛋白]比率   肾胆固醇含量
  阴性对照组   8   0.58±0.12   3.7±0.4
  低剂量组(16.6mg/100g·天)   7   0.57±0.25   3.4±0.4
  中剂量组(33.2mg/100g·天)   8   0.50±0.20   3.2±0.1*
  高剂量组(66.4mg/100g·天)   8   0.41±0.11*   3.3±0.3*
  阳性对照组   9   0.62±0.16   3.5±0.4
  伪手术组   7   0.60±0.12   3.5±0.3
*P＜0.05与阴性对照组相比
实验结果：
组合物I可以有效抑制低密度脂蛋白的氧化，保持血清的抗氧化能力，与对照组相比有显着性差异(p＜0.05)，说明组合物I具有显着的抗氧化作用。动物实验结果表明，组合物I能够有效提升高密度脂蛋白的含量，降低非高密度脂蛋白与高密度脂蛋白的比率，同时降低肾脏胆固醇的含量，与对照组相比有显着差异，说明组合物I具有预防心血管疾病的作用。因此，该组合物I显示也可应用于作为预防心血管疾病的药物。
实施例14：组合物I对雌激素受体α转活化的影响
雌二醇可引发带有雌激素应答组件的基因之表达，故本实验研究组合物I对雌激素应答组件的荧光素酶的表达之影响，也即组合物I对雌激素受体α转活化的影响。
参考：Po LS，Chan ZY，Tsang DSC & Leung LK(2002).Cancer Letter 187：33-40
药品：
●试验组：将实施例1制得的组合物I溶解于生理盐水中，制备成如下浓度的样品：10-9M，10-8M，10-7M，10-6M，10-5M。
●对照组样品：17β-雌二醇，购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO，USA)。
●雌激素受体α(ERα)表达载体：包含限制性位点的引物被用来扩增来自MCF-7的完整ERo cDNAPCR产物经限制性内切酶消化后分别插入pcDNA3.1+以及pCl-Neo，之后转化E.coli DH5α。克隆由DNA测序证实(Marcogen Ltd.，Korea)。ERα的表达载体被命名为pcDNA-erl。
●C3-1uc：来自美国Duke大学的D.McDonnell博士。
●pRL(Ranilla荧光素酶控制质粒)：购自普洛麦格公司(PromegaCorporation)
●HepG2细胞：购自普洛麦格公司；产品编号：HB8065。
●荧光素酶检测系统：购自普洛麦格公司；产品编号：E1980。
仪器：
●24孔培养版：购自Iwaki；产品编号：IW3820-024N。
试验方法：
铺HepG2细胞于24孔培养板。二十四小时之后，将雌激素受体α表达质粒、雌激素应答组件荧光素酶报导质粒及荧光素酶对照质粒转染细胞。再经二十四小时，将不同浓度的组合物I加进入细胞培养液之中。接触组合物I二十四小时之后将细胞裂解。裂解液用作双荧光素酶活性的检测。
试验结果：组合物I可引起雌激素受体α之转活化，且与组合物浓度成正比。见表13
表13(n＝3)
 组合物I浓度   Log10(荧光素酶活性)
  10-9M   0.108±0.0023
  10-8M   -0.065±0.0227
  10-7M   0.244±0.0080
  10-6M   0.444±0.0193
  10-5M   0.971±0.0443
Mean±SD
实施例15：组合物I对雌激素受体β转活化的影响
原理：雌二醇可引发带有雌激素应答组件的基因之表达。故本实验研究组合物I对携有雌激素应答组件的荧光素酶之表达的影响，也即组合物I对雌激素受体β转活化的影响。
参考：Po LS，Chan ZY，Tsang DSC & Leung LK(2002).Cancer Letter 187：33-40
药品：
●17β-雌二醇，购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO，USA)。
●雌激素受体β(ERβ)表达载体〔pcl-Neo-er2〕：来自香港中文大学陈良教授。
●其余同实施例14。
试验方法：铺HepG2细胞于二十四孔板。二十四小时之后，将雌激素受体β表达质粒、雌激素应答组件荧光素酶报导质粒及荧光素酶对照质粒转染细胞。再经二十四小时，将不同浓度的组合物I加进入细胞培养液之中。接触组合物I二十四小时之后将细胞裂解。裂解液用作双荧光素酶活性的检测。
试验结果：组合物I能引起雌激素受体β之转活化，且与组合物浓度成正比(见表14)。图2显示出组合物I对雌激素受体β转活化的影响(n＝3)
表14组合物I对雌激素受体β转活化的影响(n＝3)
  组合物I浓度   Log10(荧光素酶活性)
  10-8M   -0.030±0.0823
  10-7M   -0.006±0.1530
  10-6M   0.207±0.0357
  10-5M   0.278±0.1197
  10-4M   0.446±0.0536
Mean±SD
实施例16：组合物I对雌二醇雌转活化激素受体的影响
由于雌二醇能够引发带有雌激素应答组件的基因之表达，故研究组合物I对雌二醇引发的携有雌激素应答组件的荧光素酶表达之影响，以确定它是雌二醇的激动剂抑或拮抗剂。
参考：Po LS，Chan ZY，Tsang DSC & Leung LK.(2002).Cancer Letter187：33-40。
药品：
●试验样品：实例1制得的组合物I；
●对照样品：17β-雌二醇，Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO，USA)。
试验方法：
铺HepG2细胞于二十四孔板。二十四小时后，将雌激素受体α或β表达质粒、雌激素应答组件荧光素酶报导质粒及荧光素酶对照质粒转染细胞。再经过二十四小时，将0ng/ml，100ng/ml或10ug/ml的组合物I和10-12M至10-6M雌激素加入细胞培养液之中。细胞接触组合物I二十四小时之后裂解，其裂解液作双荧光素酶活性检测。
试验结果：组分物I对雌二醇引发的雌激素受体无拮抗作用(见表15)。
表15组合物I对雌二醇引发的雌激素受体α转活化的影响(n＝3)
  组合物I浓度   Log10(荧光素酶活性)
  0ng/ml组合物I   100ng/ml组合物I   10ug/ml组合物I
  10-12M   0.264±0.0413   0.353±0.0528   1.208±0.0598
  10-11M   0.648±0.0490   0.901±0.1169   1.298±0.1426
  10-10M   4.475±0.3530   4.593±0.0924   4.712±0.4222
  10-9M   6.370±0.3600   5.141±0.4072   5.605±0.3876
  10-8M   6.212±0.8330   5.998±0.1138   5.582±0.2159
  10-7M   6.665±0.4690   7.039±0.4109   7.835±1.0874
  10-6M   8.230±0.8784   7.451±1.5420   7.574±1.1859
Mean±SD
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Claims (24)

1.一种防治更年期综合症的药物组合物，其特征在于所述药物组合物包含熟地、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉等成分的提取物。
2.如权利要求1的药物组合物，其特征在于所述组合物基本上由熟地、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉等成分的提取物组成。
3.如权利要求1的药物组合物，其特征在于所述组合物由熟地、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉等成分的提取物组成。
4.权利要求1，2，或3的药物组合物，其中，所述提取物是由下述重量配比的原料提取而得：
熟地黄4.5-35.5％    淫羊藿5.5-24.5％    山茱萸1.0-25.2％
山药0.5-26.0％      枸杞子3.0-24.0％    淡豆豉3.5-22.5％
5.权利要求1，2，或3的药物组合物，其中，所述提取物是由下述重量配比的原料提取而得：
熟地黄15-25份      淫羊藿8-17份         山茱萸5-20份
山药10-24份        枸杞子10-25份        淡豆豉9-22份
6.权利要求1，2，或3的药物组合物，其中，所述提取物是由下述重量配比的原料提取而得：
熟地黄18-22份      淫羊藿10-13份        山茱萸8-12份
山药12-17份        枸杞子13-17份        淡豆豉14-18份
7.权利要求1的组合物，其中，所述提取物是由下述重量配比的原料提取而得：
熟地黄19.6份      淫羊藿11.2份        山茱萸10.4份
山药14.0份        枸杞子14.4份        淡豆豉15.4份
8.一种制备防治更年期综合症之药物组合物的方法，包括提供熟地黄、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉的提取物。
9.权利要求8的方法，其中，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄15-25份      淫羊藿8-17份        山茱萸5-20份
山药10-24份        枸杞子10-25份       淡豆豉9-22份
10.权利要求8的方法，其中，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄18-22份      淫羊藿10-13份        山茱萸8-12份
山药12-17份        枸杞子13-17份        淡豆豉14-18份
11.权利要求8的方法，其中，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄19.6份      淫羊藿11.2份        山茱萸10.4份
山药14.0份        枸杞子14.4份        淡豆豉15.4份
12.权利要求8，9，10，或11的方法，进一步包括以下步骤：
(a)提供包含熟地黄、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉的混合物；
(b)以水提取所述混合物，过滤，形成第一提取液；
(c)浓缩第一提取液，形成浓缩提取液；
(d)以乙醇提取所述浓缩提取液，形成第二提取液及沉淀；
(e)浓缩第二提取液
13.权利要求12的方法，其中，所述步骤(b)的提取是在90-100℃下以水提取所述混合物2～3次，每次0.5～2小时。
14.权利要求12的方法，其中，所述步骤(c)的浓缩包含在80℃将第一提取物，减压浓缩至相对密度变为1.1-1.3。
15.权利要求12的方法，其中，所述乙醇的浓度为50-100％(v/v)。
16.权利要求12的方法，其中，所述步骤(e)的浓缩包括将第二提取液浓缩至相对密度为1.1-1.5。
17.一种营养补充品，包含熟地黄、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉的提取物。
18.权利要求17的营养补充品，其中，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄15-25份      淫羊藿8-17份         山茱萸5-20份
山药10-24份        枸杞子10-25份        淡豆豉9-22份
19.权利要求17的营养补充品，其中，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄18-22份      淫羊藿10-13份        山茱萸8-12份
山药12-17份        枸杞子13-17份        淡豆豉14-18份
20.权利要求17的营养补充品，其中，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄19.6份      淫羊藿11.2份          山茱萸10.4份
山药14.0份        枸杞子14.4份          淡豆豉15.4份
21.熟地黄、淫羊藿、山茱萸、山药、枸杞子、以及淡豆豉的提取物作为制备治抑郁症药的应用。
22.权利要求21的应用，其中所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄15-25份      淫羊藿8-17份         山茱萸5-20份
山药10-24份        枸杞子10-25份        淡豆豉9-22份
23.权利要求21的应用，其中，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄18-22份      淫羊藿10-13份        山茱萸8-12份
山药12-17份        枸杞子13-17份        淡豆豉14-18份
24.权利要求21的应用，其中，所述提取物提取自如下重量比例的原料：
熟地黄19.6份      淫羊藿11.2份        山茱萸10.4份
山药14.0份        枸杞子14.4份        淡豆豉15.4份
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