CN1863788B

CN1863788B - 抗菌和防辐射化合物

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Publication number: CN1863788B
Application number: CN028121716A
Authority: CN
Inventors: 彼得·普罗科菲耶夫·杰尼先科; 尼古拉·谢尔盖耶维奇·萨普罗诺夫; 亚历山大·亚历山德罗维奇·塔拉先科
Original assignee: Biodiem Ltd
Current assignee: Biodiem Ltd
Priority date: 2001-06-18
Filing date: 2002-06-14
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2022-06-14
Also published as: CN101804047B; US20150258059A1; EP2471531B1; CA2450121C; CN101804047A; CA2450121A1; EP2468276A1; JP5281960B2; HK1061856A1; BR0210506A; JP2009263372A; US20140080876A1; US9045452B2; AU2002311088B2; US8158664B2; ZA200309750B; WO2002102789A1; JP2005511487A; RU2259825C9; US20100292317A1

Abstract

本发明提供了一种治疗和或预防微生物感染的方法，所述方法包括施用有效量的式I的化合物及其药用盐或衍生物、前药、互变异构体和/或异构体的步骤，其中，X和Y是相同或不同的杂原子；是由X和Y决定的单键或双键；R1到R5是相同或不同的选自氢或无害的取代基；和R6和R7是相同或不同的选自氢或无害的取代基，或者当存在双键时R6和R7之一不存在。本发明还提供了式I的化合物在制备治疗和/或预防微生物感染的药物中的应用。本发明还提供了保护受试者不受放射性损伤的方法，所述方法包括给需要用药的受试者施用有效量的式I的化合物的步骤。

Description

抗菌和防辐射化合物

技术领域

本发明涉及具有抗菌和防辐射活性的化合物。具体而言，本发明涉及取代的硝基苯乙烯化合物，该化合物对于包括细菌、真菌和原生动物在内的多种微生物具有杀灭活性。本发明的化合物还能够防止辐射损伤。

背景技术

本文特此并入了本说明书所引述的包括专利或专利申请在内的所有参考文献。本申请人并不认为所述参考文献构成了现有技术。对于这些文献的评述仅表明了其作者的观点，但本申请人保留对所引文献的确切性和适当性质疑的权利。应当清楚地理解，尽管本文提到了相当数量的现有出版物，但本申请人并不认为，在澳大利亚或其他任何国家，其中的任何参考文献可构成本领域的公知常识的一部分。

细菌、真菌和原生动物可造成很多种感染，包括从轻微的呼吸道疾病到严重的系统性感染和慢性病。由例如沙门氏菌(Salmonella)或弯曲杆菌(Campylobacter)等造成的食物中毒很常见，在采用动物的集中饲养技术饲养牲畜或家禽时，在牲畜或家禽中发生的地域性感染通常会导致这种食物中毒。

尽管已经有了多种抗生素，但是控制传染仍然很难，而且许多微生物能够产生抵抗力。许多微生物导致了迄今证明是非常棘手的问题，例如医院中发生的多抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染、抗性肠球菌(Enterococcus)感染、在爱滋病患者中的细菌、真菌和原生动物感染和在不发达国家的肺结核、疟疾和其他地域性疾病等。

目前仅有极少数的药物对于细菌、真菌和原生动物的病原体具有广谱活性。最普遍的是采用抗生素作为对付微生物病原体的药物。然而，大多数抗生素具有窄的特异性。甚至广谱抗菌抗生素对于真菌和原生动物也不很有效。大多数抗生素属于特定种类范围内的化合物，尽管已经开发出了改良的这些化合物的半合成衍生物，但是，近二十年来仅出现了少数新的抗生素化合物种类。

对于保护活有机体不受放射性照射的药物的可选择性也非常有限。在放射防护剂中，最有效的是含硫化合物(Kuna，1989)。例如胱胺是许用的放射防护剂(Vladimirov et al，1989)。该制剂的防护指数没有超过1.45，而且其缺点是能导致痢疾。另一种已知的放射防护制剂是巯胺(β-巯乙胺)(Mashkovskiy，1986)

这种制剂的治疗指数低，作用时间短(0.5-1小时)，而且其放射防护活性寿命短。

已知β-硝基苯乙烯及其某些衍生物具有生物活性及部分杀菌活性(Foyer，1973)。俄罗斯专利2145215显示，芳基硝基烯烃的某些衍生物具有抗菌、抗真菌和抗原生动物活性，而且它们能够保护不受放射危害。这些化合物具有如下结构式：

其中，R1是H或CH3；

R2’和R3’是相同或不同的选自H、OCH3、OH、NO2和(CH3)2N的基团。

这些化合物的活性令人满意，但仍需要具有广谱活性的低成本、低毒性药物。

我们现已发现，某些取代的硝基苯乙烯化合物对于包括细菌、真菌和原生动物在内的多种生物体具有强的活性，而且，它们还对放射性损伤具有防护性。

发明内容

本发明提供了一种治疗和或预防微生物感染的方法，所述方法包括施用有效量的式I的化合物及其药用盐或衍生物、前药、互变异构体和/或异构体的步骤，

其中，X和Y是相同或不同的杂原子；

是由X和Y决定的单键或双键；

R1到R5是相同或不同的选自氢或无害的取代基；和

R6和R7是相同或不同的选自氢或无害的取代基，或者当存在双键时R6和R7之一不存在。

本发明还提供了式I的化合物在制备治疗和/或预防微生物感染的药物中的应用。

本发明还提供了保护受试者不受放射性损伤的方法，所述方法包括给需要用药的受试者施用有效量的式I的化合物的步骤。

另一方面，本发明提供了癌的放射线疗法，所述疗法包括以下步骤：给需要采用该疗法的受试者施用有效量的式I的化合物，使该受试者的肿瘤部位接受放射源的照射。

另一方面，本发明提供了式I的化合物作为抗菌和辐射防护剂的应用。

优选X和Y是相同或不同的O和N，更优选X和Y同时为氧。

优选R1和R2是相同或不同的选自氢、羟基、卤素或选择性取代的C1-6烷基。

R3到R5优选相同或不同的选自氢、羟基、卤素、硝基、C1-6烷氧基或选择性取代的C1-6烷基。

优选卤素为氯或溴。

优选式I的化合物的顺式(E)异构体。

特别优选如下的式I的化合物：其中，X、Y、

R6和R7如上述定义；R1和R2是相同或不同的选自氢、羟基、Cl、Br和C1-4烷基的基团；以及R3到R5是相同或不同的选自氢、羟基、Cl、Br、硝基C1-4烷氧基或C1-4烷基的基团。

本发明的化合物的具体例子如下：

(1)X和Y是O，R1是甲基，R2和R3是氢(3，4-亚甲基二氧-(3-甲基-对硝基苯乙烯)

(2)X和Y是O，R1到R3是氢(3，4-亚甲基二氧-β-硝基苯乙烯)

(3)X是N，Y是NH，R1是甲基，R2和R3是氢(苯并咪唑-5-β-硝基丙烯)

(4)X是N，Y是NH，R1是氢，R2是甲基，R3不存在(2-甲基苯并咪唑-5-β-硝基乙烯)

(5)X是O，Y是N，R1和R2是氢，R3不存在(苯并噁唑-5-β-硝基乙烯)

(6)X是N，Y是O，R1和R2是甲基，R3不存在(2-甲基苯并噁唑-5-β-硝基丙烯)

式I的某些化合物本身是新的。

因此，本发明提供了式Ia的化合物：

其中，X、Y、

和R2到R7如上述式I所定义，附带条件是，当X和Y均为O且R2到R7均为氢时，则R1不为氢、R1-4烷基或CO2Et，或者当X和Y均为O时，则R2到R7不为氢。

本发明还提供了上述定义的式Ia的化合物的制备方法，所述方法包括使式II的化合物与式III的化合物缩合的步骤，

在所述式II的化合物中，X、Y、

和R3到R7如上述式Ia所定义，在所述式III的化合物中，R1和R2如上述式Ia所定义。

本发明还提供了上述定义的式Ia的化合物的制备方法，所述方法包括使式IV的化合物与C(NO3)4反应的步骤，

在所述式IV的化合物中，X、Y、

和R1到R7如上述式Ia所定义。

上述方法优选在催化剂存在的条件下进行，所述催化剂有例如胺或例如NaOH或KOH等碱金属氢氧化物。

另一方面，本发明提供了药物或兽药组合物，所述药物或兽药组合物含有上述定义的式Ia的化合物及药用的或兽药用的载体。

优选所述药物或兽药组合物是局部的、口服的或不经肠的组合物。

所述药用的或兽药用的载体优选有机溶剂，例如丙酮、苯、乙腈、DMSO或醇，所述醇例如甲醇或乙醇。尽管本发明的化合物水溶性较差，但当水与有机溶剂混合时，可以形成稳定的混合物。

具体实施方式

为了清楚地理解本说明书，“含有(包含)”一词的意思是“包括但不局限于”。

术语“杂原子”指O、N或S。

术语“无毒的取代基”在本文中采用其最广的含义，它指对本发明的化合物的抗菌或辐射防护性能没有有害的影响。其例子包括烷基、链烯基、炔基、芳基、卤原子取代基、卤烷基、卤代链烯基、卤代炔基、卤代芳基、羟基、烷氧基、链烯氧基、芳氧基、苄氧基、卤代烷氧基、卤代链烯氧基、卤代芳氧基、硝基、硝基烷基、硝基链烯基、硝基炔基、硝基芳基、硝基杂环基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯基氨基、炔基氨基、芳氨基、二芳基氨基、苄胺基、二苄基氨基、酰基、链烯基酰基、炔基酰基、芳基酰基、酰胺基、二酰基氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、芳基亚氧硫基、杂环基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环基、烷基亚氧硫基、芳基亚氧硫基、烷氧羰基、芳氧羰基巯基、烷硫基、芳硫基、酰硫基和含磷化合物。

特别适合的无毒取代基是烷基、链烯基、炔基、卤原子取代基、卤代烷基、卤代链烯基、卤代炔基、羟基、烷氧基、链烯氧基、卤代烷氧基、卤代链烯氧基、硝基、硝基烷基、硝基链烯基和硝基炔基。

在一个优选实施方式中，无毒的取代基是C1-6烷基、卤原子取代基、羟基C1-6烷氧基和硝基。

术语“选择性取代”指某基团可以或可以不被进一步取代，所用的取代基是，例如上述一定的无毒的取代基。

术语“卤素”指氟、氯、溴和碘，优选氯和溴。

术语“烷氧基”在本文中采用其最广的含义，它指直链、支链或环状的含氧基团，所述的每个基团均具有烷基部分，优选C1-6烷基，更优选C1-4烷基。这类烷氧基的例子有甲氧基、乙氧基、丙氧基、正丁氧基和叔丁氧基。

单独使用的或在例如“选择性取代的C1-4烷基或C1-6烷基”等化合物名词中使用的术语“C1-4烷基”或“C1-6烷基”指具有1-6个碳原子的直链、支链或环状烃基。这类烷基的例子有甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、己基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基。

式I或Ia的化合物的盐优选是药用的，但应当理解，非药用盐也落在本发明的范围之内，由于它们可用作制备本发明的药用盐的中间体.药用盐的例子包括药用阳离子，例如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵；药用无机酸的酸加成盐，所述药用无机酸有例如盐酸、正磷酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸；或药用有机酸的盐，所述药用有机酸有例如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲烷磺酸、三卤代甲烷磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、sulphanilic、天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、单宁酸、抗坏血酸和戊酸.

此外，本发明的某些化合物可与水或普通的有机溶剂形成溶剂化物。这些溶剂化物包括在本发明的范围之内。

“药用衍生物”指指任何药用盐、水合物或任何其他化合物，在给受试者施用所述的任何其它化合物之后，能够(直接或间接地)形成式I或式Ia的化合物，或形成具有抗菌或辐射防护性的、式I或式Ia的化合物的活性代谢物或残余物。

术语“前药”在本文中采用其最广的含义，它包括在体内转变为式I或式Ia的化合物的那些化合物。

术语“互变异构体”在本文中采用其最广的含义，它包括能够以两种异构体的形式平衡存在的式I或式Ia的化合物。这类化合物的原子或基团之间的键可以不同，而且这些原子或基团在该化合物中的位置也可以不同。

术语“异构体”在本文中采用其最广的含义，它包括构象异构体、几何异构体和立体异构体。由于式I或式Ia的化合物可具有一个或多个手性中心，因此这些化合物可以对映异构体的形式存在。

术语“微生物感染”在本文中采用其最广的含义，它指由微生物和引起的任何感染，包括细菌感染、真菌感染、酵母感染和原生动物感染。

术语“微生物”包括任何显微可见的生物体或在分类学上相关的肉眼可见的生物体，所述肉眼可见的生物体均属于藻类、细菌、真菌、酵母和原生动物等类别。

细菌感染包括但不局限于，由蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、白喉棒杆菌(Corynebacteria Diphtheriae)、肠球菌属(Enterococcus(链球菌属D(Streptococcus D))、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)引起的感染、肺炎球菌属(Pneumoccoccal)(肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)感染、葡萄球菌属(Strphylococcal)感染和链球菌属(Streptococcal)感染；革兰氏阴性菌包括拟杆菌属(Bacteroides)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Ampylobacter)感染，肠出血大肠埃希氏菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli(EHEC/E.coli 0157：H7)、肠袭大肠埃希氏菌(enteroinvasive Escherichia coli(EIEC))、肠毒大肠埃希氏菌(enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC))、流感嗜血菌(Haemophilus Influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、沙氏军团菌属菌种(Legionella spp.)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonnorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、败血变形菌属菌种(Proteus spp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌属菌种(Salmonella spp.)、希瓦氏菌属菌种(Shigella spp.)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)和椰尔森氏菌属(Yersinia)；抗酸细菌，其包括结合分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、鸟分枝杆菌——细胞内的(Mycobacteriumavium-intracellulare)、约氏分枝杆菌(Myobacterium johnei)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium Leprae)、非典型细菌(atypical bacteria)、衣原体属(Chlamydia)、枝原体属(Mycoplasma)、立克次氏体属(Rickettsia)、螺体属(Spirochetes)、彻白密螺旋体(Treponemapallidum)、回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorfii)和出血黄疸钩端螺旋体(LeptospiraIcterohemorrhagiae)，以及其他各种细菌，包括放线菌属(Actinomyces)和诺卡菌属(Nocardia)。

真菌感染包括但不局限于由链格孢(Alternaria alternata)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、尼日尔曲霉(Aspergillus niger)、杂色曲霉(Aspergillus Versicolor)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatiditis)、白色念珠菌(Candida albicans)、Candida dubliensis、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candidaparapsi losis)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、絮状表皮癣菌(Epidermophytonfloccosum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、糠秕鳞斑菌(malassezia furfur)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、spp.毛菌霉(Mucor spp.)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioide brasiliensis)、马尔尼非青霉(Penicillium marneffei)、卵圆形糠秕孢子菌(Pityrosporum ovale)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、指间毛癣菌(Trichophyton interdigitale)、白色毛孢子菌(Trichosporon beigelii)和红酵母属菌种(Rhodotorula spp.)引起的感染。

酵母感染包括但不局限于由克劳氏酒香酵母(Brettanomycesclausenii)、卡斯酒香酵母(Brettanomyces custerii)、异酒香酵母(Brettanomyces anomalous)、naardenensis酒香酵母(Brettanomycesnaardenensis)、himilis假丝酵母(Candida himilis)、中间型假丝酵母(Candida intermedia)、清酒假丝酵母(Candida saki)、马铃薯假丝酵母(Candida solanl)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、Candidaversatilis、比奇氏假丝酵母(Candida bechii)、Candida famata、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、星型假丝酵母(Candida stellata)、酒性假丝酵母Candida vini)、汉逊氏德巴利氏酵母(Debaromyceshansenii)、中间型德克氏酵母(Dekkera intermedia)、布鲁塞尔德克氏酵母(Dekkera bruxellensis)、念珠地丝菌(Geotrichium sandidum)、费比氏汉逊氏酵母(Hansenula fabiani)、葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、季氏有孢汉逊酵母(Hanseniaspora guillermondii)、vinae有孢汉逊酵母(Hanseniaspora vinae)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、柠檬形克勒克酵母(Kloekera apiculata)、马克斯克鲁维氏酵母(Kluveromyces marxianus)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromycesfragilis)、美极梅奇酵母(Metschikowia pulcherrima)，季氏毕赤氏酵母(Pichia guilliermodii)、orientalis毕赤氏酵母(Pichiaorientalis)、发酵性毕赤氏酵母(Pichia fermentants)、膜醭毕赤氏酵母(Pichia memranefaciens)、巴杨氏红糖酵母(RhodotorulaSaccharomyces bayanus)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大连糖酵母(Saccharomyces dairiensis)、微小糖酵母(Saccharomycesexigus)、单胞糖酵母(Saccharomyces uinsporus)、葡萄汁糖酵母(Saccharomyces uvarum)、oleaginosus糖酵母(Saccharomycesoleaginosus)、boulardii糖酵母(Saccharomyces boulardii)、路为氏糖酵母(Saccharomycodies ludwigii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulasporadelbruekii)、星型球拟酵母(Torulopsis stellata)、拜列氏接合糖酵母(Zygoaccharomyces bailli)和rouxii接合糖酵母(Zygosaccharomyces rouxii)引起的感染。

原生动物感染包括但不局限于利什曼虫属(Leishmania)、弓形体属(Toxoplasma)、疟原虫(Plasmodia)、泰勒虫属(Theileria)、无形体(Anaplasma)、鞭毛虫属(Giardia)、毛滴虫属(Trichomonas)、锥虫属(Trypanosoma)、球虫类(Coccidia)和巴贝虫属(Babesia)引起的感染。具体例子包括克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)或卵形疟原虫(Plasmodium ovale)。

优选所述微生物感染是由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的感染，例如所述革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus fecalis)、肺炎克雷白菌(Klebsiella pneumonia)、鼠伤害沙门菌(Salmonellatyphimurium)或假结核病菌(pseudotuberculosis)、不动杆菌属(Acinetobacter)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)或脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)；真菌或酵母感染，例如指间毛癣菌(Trichophyton interdigitale)；烟曲霉(Aspergillus fumigatus)或白色念珠菌(Candida albicans)；或原生动物感染，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)或阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)。

微生物感染的例子包括特别是在兽医活动中的细菌或真菌伤口感染、粘膜感染、肠感染、腐烂状态、肺炎、沙眼、鸟疫、膣炎症、真菌感染和沙门菌感染。本发明的化合物还可用于处理抵抗性微生物种类，或者在需要对物质进行杀菌或消毒的各种领域用于进行例如表面消毒。

术语“受试者”在本文中指任何有疾病的或处于需要采用药物活性剂治疗状况的动物。所述受试者可以是哺乳动物，优选人，也可以是家畜或宠物。虽然本发明化合物尤其预期可以适用于人的药物治疗，但本发明化合物也适用于动物治疗，包括治疗宠物如狗和猫、家畜如马、矮种马、驴、骡、骆驼、羊驼、猪、牛和羊，或动物园动物如灵长类、猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄动物。

适合的哺乳动物包括以下科目的成员：灵长目、啮齿目、兔类、鲸类、食肉类、奇蹄类和偶蹄类动物。优选奇蹄类和偶蹄类动物，因为他们在生物学和经济上的重要性相类似。

例如，偶蹄目包括分布于9个科的约150种生物：猪(猪科)、野猪类(Tayassuidae)、河马(Hippopotamidae)、骆驼(Camelidae)、麝香鹿(Tragulidae)、长颈鹿和霍加皮(Giraffidae)、鹿(Cervidae)、叉角羚(Antilocapridae)、牛、羊、山羊、羚羊(牛科)。上述许多动物在各个国家作为饲养动物。更重要的是，许多重要的经济动物如山羊、绵羊、牛和猪具有非常相似的生物性和大量共同的基因。

奇蹄类动物包括马和驴，它们在经济上都很重要，而且其关系密切。实际上，人所都知道马和驴是可以杂交的。

这里使用的术语“有效量”指本发明化合物产生所需的抗菌和防辐射活性的有效用量。

具体的“有效量”显然会随着以下因素的不同而变化，如被治疗的特定状况、受试者的身体状况、被治疗受试者的类型、治疗时间、协同疗法(若有的话)的类型、所用的具体制剂及化合物或其衍生物的结构。

术语“辐射损伤”在本文中采用其最广的含义，指由于暴露于辐射源如电离辐射而引起的危害。术语“电离辐射”在本文中指有足够能量可以离解键的光子，如来源于放射性核子的α、β和γ射线和X射线。

术语“癌的放射线疗法”在本文中采用其最广的含义，包括良性或恶性肿瘤的放射线疗法。

本发明防辐射药物主要用于癌的放射线疗法。许多应用放射线疗法存在困难的普通器官都可以使用本发明的防辐射药物来保护，如皮肤、口腔粘膜、食管粘膜、直肠粘膜、阴道粘膜以及膀胱上皮细胞等。

除用于癌的放射线疗法之外，还可以在高危辐射场合预防性地使用本发明的防辐射药物。

本发明化合物可与其他药物一起使用，以达到可行的结合。这种可行的结合可以包括药物活性剂的任何化学相容性的结合，只要这种结合不消弱I或I a的化合物的活性即可。应当理解，本发明化合物与其他药物可以单独施用、先后施用或同时施用。

治疗微生物感染时可以使用的其他药物包括其他抗感染剂，如抗生素。

当所述化合物被用作防辐射剂时，所述的其他药物可包括化学疗法药剂，例如类辐射药剂，它是一种损伤DNA的细胞毒素药剂，它对DNA造成的损伤与电离辐射导致的损伤类似。使DNA链断裂的类辐射药剂的例子包括博来酶素、阿霉素、亚德里亚霉素、5UF、新制癌菌素、烷化剂以及其他产生DNA加合物的药剂。可以预期，本发明的防辐射剂可以与防护电离辐射同样的方法来保护DNA不受这些药剂的损伤。在临床使用中，防辐射剂不可能与化学疗法药剂一起施用，因为这样会削弱该药剂对肿瘤的作用。但是，有时对病变组织局部使用是有利的。例如，口腔粘膜炎是细胞毒素药剂如阿霉素导致的病变性副作用，在施用化学疗法药剂之前用本发明的防辐射剂漱口，可以减小这种副作用，而不会消弱该药剂对口腔外肿瘤的作用。类似地，通过口服可以保护胃肠道，而通过吸入雾剂可以保护肺，通过例如防辐射药剂导管在膀胱内释放可以保护膀胱。因此，本发明优选的方法将式I和Ia的化合物与其他药物如类辐射药剂结合使用。

本发明化合物可以通过例如具有相互作用力的基团与其它药剂相结合，这些药剂可将该化合物送到目标肿瘤位置。合适的这类药剂包括抗体或蛋白质、生长因子例如造血生长素，造血生长素可以在全身辐射和骨髓移植过程中使造血干细胞得到优先防辐射保护。

在骨髓移植过程中，也可在体外使用本发明化合物的结合体.骨髓移植一般包括从受试者获得并储存状况未恶化的骨髓样本.随后采用非常猛烈的化学疗法(即大剂量).这种化学疗法由于破坏了正常干细胞而通常是致命的，但受试者由于使用了他们自身的造血干细胞而得救.该方法的问题是干细胞的最初样本很容易被肿瘤细胞污染，因此使用各种方法来净化肿瘤细胞的骨髓制剂.此时可以采用通过将其加入骨髓细胞悬浮液中来使用结合在造血生长因子上的防辐射药剂.然后可以辐射该悬浮液，期望优先保护正常骨髓细胞而不是肿瘤细胞免受对细胞具有杀伤作用的辐射的伤害.

本文中“药用载体”指用于将式I或Ia的化合物输送给受试者的药用溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体，可以根据预计的施用方式进行选择。从与组合物中的其他成分的相容性以及对受试者无害的意义上讲，任何载体必须是药物“可接受的”。

式I或Ia的化合物可以根据剂量单位制剂的形式口服、局部使用或不经肠使用，所述制剂中含传统无毒药用载体、佐剂和赋形剂。本文使用的术语“不经肠”包括皮下注射、施用于肺和鼻腔的雾剂以及通过静脉、肌肉、内膜、颅骨的注射或输液技术。

本发明还提供适于局部施用、口服和不经肠施用的药物制剂，以用于本发明的新疗法。本发明的化合物可以采用以下形式口服：片剂、雾剂或油状悬浮液剂、锭剂、片剂、粉剂、颗粒剂、乳状液、胶囊、糖浆或酊剂。为了制备外观和口感良好的药物制剂，用于口服的组合物可含有一种或多种以下物质：甜味剂、香味剂、着色剂和防腐剂。适当的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、天冬酰苯丙氨酸甲酯或糖精。适当的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、斑脱土、藻酸或琼脂。适当的香味剂包括欧薄荷油、鹿蹄草油、樱桃、柑桔或覆盆子香味剂。适当的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α维生素E、维生素C、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。适当的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。适当的缓释剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。所述片剂包括与适合生产片剂的、无毒的药用赋形剂混合在一起的活性成分。

这些赋形剂可以是，例如，(1)惰性稀释剂，如碳酸钙、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；(2)造粒或崩解剂，如玉米淀粉或藻酸；(3)粘合剂，如淀粉、白明胶或阿拉伯胶；以及(4)润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。这些片剂可以不包衣，也可以用常用技术包衣，以延长药物在胃肠道的分解和吸收，并由此使药物较长时间内的发挥药效。例如，可以使用如单硬脂酸甘油酯和二硬脂酸甘油酯等缓释物质。也可以采用美国专利4,256,108、4,160,452和4,265,874中所述的技术进行包衣，从而得到可控释放的渗透治疗片剂。

本发明方法中使用的式I或Ia的化合物以及药物活性剂的施用方法可以是，分别或同时采用内用、不经肠注射或长时间逐步输液。可以在静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内、透皮或通过如渗透泵来输液给药。进行体内研究时，可以将药剂直接加入或溶解在一种合适的生物用溶剂或缓冲液中，然后再加入到细胞或组织中。

不经肠给药的制剂包括消毒水或无水溶剂、悬浮液和乳液。无水溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、乙醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。不经肠的载体包括氯化钠溶液、复方氯化钠葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠、乳酸盐的复方氯化钠静脉注射载体包括流体和营养补充物、电解质补充物(如基于复方氯化钠葡萄糖注射液的电解质补充物)等。还可具有防腐剂以及其它添加剂，如抗菌剂、抗氧剂、螯合剂、生长因子和惰性气体等。

一般来说，本文中使用的“处理”“治疗”等术语是指影响受试者、组织或细胞，以得到预想的药理和/或生理效果.这些效果可以是预防性的，即完全或部分地阻止疾病或其征兆，和/或治疗性的，即部分或完全使疾病痊愈.本文使用的“治疗”涵盖治疗或预防脊椎动物、哺乳动物，特别是人的疾病，包括(a)对于对某种疾病的易感的、但尚未被诊断为患有该疾病的群体，预防该疾病的发生；(b)控制疾病，即抑制其发展；或(c)缓解或改善病情，即，使该疾病的病情减轻.

本发明包括对改善病情有用的各种药物组合物。根据本发明的一种实施方式，药物组合物的制备方法是，利用载体、赋形剂、添加剂或辅助剂，将式I或Ia的化合物、其相似物、衍生物或其盐，或者是式I或Ia的化合物与一种或几种药物活性剂的结合物制成适合受试者施用的形式。常用的载体或辅助剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇或其他糖、滑石、牛奶蛋白质、白明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动植物油、聚乙二醇和溶剂如消毒水、醇、甘油和多元醇。静脉载体包括流质或营养补充物。防腐剂包括抗菌剂、抗氧剂、螯合剂和惰性气体。其他药用载体包括水溶液、无毒的赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等，见Remington的《制药学(Pharmaceutical Sciences)》(第20版，Williams&Williams(2000))、《英国国家处方(British National Formulary)》(第43版，British Medical Association and Royal PharmaceuticalSociety of Great Britain，2000)，本文引用其内容作为参考。药物组合物中各种组分的pH值和具体浓度根据现有技术中的常规方法确定。参见Goodman and Gilman的《疗法的药理学基(The Pharmacological Basisfor Therapeutics)》础(第7版，1985)。

药物组合物优选以剂量单元制备和施用。固体药剂单元可以是片、胶囊和栓剂。对受试者治疗时，根据化合物的活性、施用方式、疾病的性质及严重程度、受试者的年龄和体重，受试者每天使用的剂量有所不同。但在特定情况下，可以增大或减小使用剂量。日剂量的施用方法可以是，以单剂量单元或几个小剂量单元施用一次，也可以一定间隔多次施用细分的剂量。

本发明的药物组合物可以治疗有效剂量在局部或全身施用。对于该用途有效的量当然与受试者的病情、体重以及总体状态有关。一般来说，体外试验所用的剂量可以为在该部位施用药物组合物的有效剂量提供有益的启示，所以可以利用动物模型来确定治疗微生物感染的有效剂量。例如，在Langer，Science，249：1527，(1990)中描述了各种影响因素。口服制剂可以是硬的凝胶胶囊，其中的活性成分与惰性固体稀释剂相混合，所述惰性固体稀释剂有例如碳酸钙、磷酸钙、或高岭土。它们也可以是软的凝胶胶囊，其中的活性成分与水或油介质相混合所述油介质有例如花生油、液体石蜡或橄榄油等。

水性悬浮液通常含有与适于制成水性悬浮液的赋形剂混合在一起的活性物质.这些赋形剂可以是(1)悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；(2)分散剂或润湿剂，可以是(a)天然磷脂，如卵磷脂；(b)环氧烷烃与脂肪酸的缩聚产物，如聚氧乙基硬脂酸酯；(c)环氧烷烃与长链脂肪醇的缩聚产物，如十七氧亚乙基十六烷醇；(d)环氧烷烃与由脂肪酸和己糖醇得到的偏酯的缩聚产物，如聚氧乙基山梨糖醇单油酸酯，或(e)环氧烷烃与由脂肪酸和己糖醇酐得到的偏酯的缩聚产物，如聚氧乙基山梨聚糖单油酸酯.药物组合物可以是无菌的、可注射的水性或油性悬浮液的形式.该悬浮液可以用上文提到的适合的分散剂、润湿剂或悬浮剂根据已知的方法进行配制.无菌的注射制剂也可以是，在无毒的、可不经肠施用的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，如在1，3-丁二醇中的溶液.在可用的载体和溶剂中，可以采用的是水、复方氯化钠溶液和等渗的氯化钠溶液.另外，无菌的不挥发性油常用作溶剂或悬浮介质.为了达到此目的，任何无刺激性的不挥发性油都可以使用，包括合成的甘油单酯或甘油二酯.另外，在注射制剂中也可使用如油酸等脂肪酸.

式I或Ia的化合物可以以脂质体释放系统的形式施用，如小的单层载体、大的单层载体以及多层载体。脂质体可以由各种磷脂如胆固醇、十八烷胺或卵磷脂等形成。

式I或Ia的化合物也可以用作兽药组合物的形式，这种兽药组合物可以按照例如现有技术中的常规方法准备。这种兽医药物的例子包括适合以下用途的兽药组合物：

(a)口服，外用，如汤药(如水或无水溶液或悬浮液)；片剂或丸药；与饲料混在一起的粉末、颗粒或小丸；用于舌头使用的糊。

(b)不经肠施用，例如以无菌的溶液或悬浮液的形式通过例如皮下、肌肉或静脉注射；或者(在适当情况下)通过乳腺内注射，其中，将悬浮液或溶液通过乳头注入乳房。

(c)局部施用，例如以霜、膏或雾剂在皮肤上施用；或

(d)阴道内施用，例如以阴道栓、膏或泡沫的形式。

式I或Ia的化合物的剂量水平可以达到每1公斤体重1克。可与载体物质结合在一起形成一个单剂量的活性成分的量可根据被治疗的对象及具体的给药方式而变化。例如，设计用于人口服的制剂中可含有高达1克的活性化合物及适量载体物质，所述载体物质的含量可以占总组合物的约5％-约95％。剂量单元一般含有约5mg到500mg的活性成分。

本发明的化合物可以选择性地以分剂量的方式施用，因此在这种施用方式中总共至少要施用两次。优选从至少每两小时到每四小时或更长时间施用一次；例如可以每小时或每半小时施用一次该化合物。在一个优选的实施方式中，分剂量施用过程包括，在第一次施用后足够长的时间之后，血液中活性化合物的水平从最初施用后达到的血浆水平最大值降低到约5-30％后，第二次施用本发明化合物，以维持活性成分在血液中的有效量。在从每次在前施用起相应的时间间隔后，可以选择性地继而施用一次或多次，优选在血浆水平降低到中间在前最大水平的约10-50％时施用。

但是应当理解，对于特定的患者，具体剂量与多种因素有关，包括所用的特定化合物的活性、年龄、体重、整体健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度、药物的结合情况以及所治疗疾病的严重程度。

附图说明

图1是实施例9中的白色念珠菌的存活数目的对数值(Log存活数)与时间(小时)的关系图；

图2是实施例26中被寄生感染的血细胞的百分数与培养时间的关系，其中T＝营养体，R＝Rings，T/S＝营养体或裂殖体。

具体实施方式

实施例

下面仅参照以下非限定性的实施例和附图来详细描述本发明。

实施例1

一般合成方法

有文献(Perekalkin，1982a)描述了苯二乙双酮(Benzdioxol)类物质。苯并咪唑和苯并噁唑的合成也可以用以下的标准缩合方法1和方法2(Perekalkin，1966，1982b)进行。

方法1

方法2

其中，X、Y、和R1到R7与上式I中的定义相同。

方法2中，将等克分子数的苯甲醛和硝基烷在锥形烧瓶中混合，然后溶解在等体积的乙醇中。将新蒸馏出的乙二胺以催化剂量(通常相对于醛和硝基烷基为1比10)加入到上述溶液中，然后室温下避光放置数日(3到10天)。在此过程中化合物结晶。冷却到0℃后，将晶体过滤，用冷乙醇洗涤，然后干燥。若产率较低，可以将母液一起加入，然后用旋转蒸发器蒸馏。冷却后又得到一些不纯的产物。将该产物溶解在少量沸腾的乙醇中进行提纯。然后用活性炭处理，趁热过滤，在冷却过程中得到了细小的黄色针状晶体。产率约为80-85％，色谱分析表明该化合物是均质的。

所得化合物的红外光谱与文献(Hamlin and Weston，1949；Knoevenagel and Walter，1904；Burton and Duffield，1949)一致。

该化合物可以溶于有机溶剂如乙醇、丙酮、苯、甲醇、乙腈、氯仿和二甲基亚砜(DMSO)中，但在水中溶解性不好(0.1％)。若将乙醇溶液加入到水中，则形成稳定的胶状混合液。

实施例2

化合物(1)(3，4-亚甲二氧基-β-甲基-β-硝基苯乙烯)的制备方法

采用上述实施例1所述的方法制备化合物(1)。反应式如下。

将9.8g四硝基甲烷(1摩尔)与10cm3丙酮的混合物用冰冷却，然后将该混合物滴加到溶有8.1g蒸馏异黄樟油精(1摩尔)和4.8g吡啶(1.2摩尔)的20cm3丙酮溶液中。滴入第一滴就使反应混合物颜色变深，当四硝基甲烷全部滴加完后，液体变为暗红色不透明状。四硝基甲烷的气味很快消失，大约两小时以后，将已变得透明的暗红色液体倒入装有100cm3水的带塞的瓶中。将混合物充分振荡，用乙醚层覆盖，然后分小批加入由6.7cm333％的苛性钾溶液(1.03摩尔)和50cm3水组成的混合物。每次加料后均要摇动，碱液全部加完后，继续摇动，直到暗红色油状的吡啶和三硝基甲烷的盐完全消失。分离水层后，再用乙醚萃取。结合了乙醚的萃取物先用水冲洗，接着用硫酸酸化后的水冲洗，最后再用纯水冲洗。真空蒸馏除去醚后得到黄色针状β-硝化异黄樟油精沉淀，该沉淀是从约65cm3乙醇中重结晶得到的。得到的化合物(1)的熔点为98℃，产量为7g。若溶剂全部蒸发完，可以再得到0.5g化合物(1)。总产量为理论产量的72.5％。

实施例3

制备化合物(1)(3，4-亚甲二氧基-β-甲基-β-硝基)的替代方法

采用上述实施例1中的方法2制备化合物(1)。反应式如下。

使900gm胡椒醛在持续振荡状态下溶解到1000cc乙醇中，然后缓慢加入450ml硝基乙烷，再加入10ml乙二胺。搅拌17小时后，将混合物在室温下避光放置5-7天。用布氏漏斗过滤生成的黄色晶体，直到无溶剂，然后用150ml乙醇洗两次。得到1200gm熔点为95℃的化合物(1)。从乙醇中进一步结晶出来后，得到1000g熔点为98℃的淡黄色晶体(产率约80％)。

分子式C10H9NO4，分子量-207.05

物理和化学性质

形态黄色晶体

溶解性＜溶于乙醇、丙酮、苯、甲醇、乙腈、氯仿和二甲基亚砜中-几乎不溶于水

熔点94-98℃(从50％乙醇中结晶的产物约为96-98℃)

pH值(在50％v/v乙醇中)接近中性

比旋光光惰性，但有两个立体异构体

稳定性高于200℃时变黑

纯度质谱分析(MS)表明，分子量为303.4和331.4的杂质为主要杂质

红外光谱

1.芳环-大于3000波数及缔合芳烃的1470-1630区域

2.β-甲基苯乙烯-苯乙烯上加成基团1442，脂族碳C-+900-1000峰

3.硝基在较低波数，如747，673，β-硝基苯乙烯的波数为1520

4.芳香醚基团-1312(1258)、1138、1030，然而，红外还给出了该化合物的指纹区(供参考)。为了消除杂质峰的影响，测定了重结晶物质的指纹区。

红外光谱

分子量为303.4和331.4的杂质

确认主要物质分子量为207.05

NMR谱图

-氢NMR谱(200MHz)显示：芳香环有3个保留的H，3H属于CH3部分，另外一个接在侧链上，2H是另一芳环一部分。

-碳NMR谱(50MHz)显示：-CH3、CH-、-CH2(亚甲二氧基)

-化学位移值支持给出的结构式，采用这种合成方法更容易得到E-异构体，而不是Z-异构体。显示有强的消去基团(NO2)。

紫外/可见光谱

重结晶物质在250-270nm和360-370nm处有吸收峰(宽峰)，在210nm以下有强吸收峰。

实施例4 化合物(2)的制备方法

可以采用上述实施例1中的方法2制备化合物(2)。反应式如下。

用刚蒸出的乙二胺NH2-CH2-CH2-NH2作催化剂，使3，4-亚甲二氧基苯甲醛与硝基甲烷缩合。该反应在乙醇中进行，反应在室温下避光进行5天。过滤分离得到的晶体，用冷乙醇冲洗。在空气中干燥后，产率为80％，熔点为158-159℃，经过重结晶后，熔点为162-163℃。化合物(2)不溶于水，溶于丙酮、乙醇、乙酸及大部分有机溶剂。

实施例5 抗菌活性

本文所述试验中，采用馆藏的病原体菌株(用“M”指代)和选自病理材料的菌株(用“B”指代)，所述馆藏的病原体菌株来自Microbiologychair of the Military Medical Academy博物馆，所述选自病理材料的菌株来自患者，并且不超过三次实验室传代。对于每种病原体的类型采用相应的最佳的营养介质。至于注入方法，是将化合物(1)和(2)以0.03％-2.0％的剂量加入到固体营养介质中。采用与检测抗生素敏感性的标准方法相类似的琼脂扩散评估法。

琼脂扩散评估法的进行如下所述。

制备肉胨琼脂，然后注入浓度为0.01-2.0％的试验化合物。将介质倒入培养皿中，静置。当琼脂与待检微生物嫁接后，立即截取直径为10mm的琼脂棒，放在含有同样介质的培养皿上(每个培养物至少截取6个棒)。在37℃下孵育一天后，检测琼脂棒周围培养物的生长受到抑制的区域的直径。根据对抗生素的试验敏感性的官方标准对结果进行评价。直径小于等于20mm对应于稳定的培养物，直径为21-28mm对应于中等稳定的培养物，直径大于等于29mm对应于敏感培养物。

与此类似，根据俄罗斯进口新药和医疗方法检验机构(RussianSupervisory Authority for the Introduction of New MedicinalSubstances and Medical Technology)的官方规程，检验病原体对15种抗生素的敏感性(圆盘法(disc method))。

为了评价其可能的总体性能范围，采用了数个病原体的属和菌株，以便能够揭示这些菌株和属对试验物质的敏感性的极限.

下面的表1为浓度为1.0％的化合物(1)的实验结果，化合物(1)在该浓度下抑制了5×105-5×107个生物体/ml的繁殖，表1还显示了采用以下15种抗生素的敏感性试验结果作为对比。

1青霉素，

2氨比西林

3庆大霉素

4羧苄青霉素

5卡那徽素

6林肯霉素

7氯霉素(levomicethin)

8苯唑青霉素

9多粘菌素

10利福平

11瑞斯托霉素

12链霉素

13四环素

14红霉素

15头孢菌素。

表1

注：

#敏感性菌株

+中度敏感菌株

-稳定菌株

下表2采用上述琼脂扩散法得到的某些微生物对化合物(1)的敏感性的结果。

表2

注：

#敏感的

+中度敏感的

-稳定的

表3为病原真菌对化合物(1)的敏感性实验结果。

表3

实施例6 抗菌实验

采用琼脂扩散法检验化合物(1)的抗菌活性。

由于该化合物的溶解性很小，因此不能在液相中进行研究。为此，在肉胨琼脂上制备含0.5％的试验化合物的初始母饱和体。将该母饱和体在水浴中再生为液态，通过加入琼脂基，从该母饱和体得到连续两次稀释液。由此得到了化合物浓度分别为0.5％、0.25％、0.12％、0.06％、0.03％和0.015％的稀释液，将该稀释液倒入培养皿中，在该培养皿上使6种细菌和两种真菌的试验培养物接种。

使用了以下的试验培养物：

1)金黄色葡萄球菌株674，从患者分离得到，对庆大霉素、苯唑青霉素、四环素、红霉素、头孢菌素敏感，对链霉素轻微敏感。

2)粪肠球菌馆藏菌株，对氨比西林、利福平和链霉素敏感。

3)肺炎克雷白菌株312，从患者分离得到，对庆大霉素、多粘菌素敏感。

4)鼠伤寒沙门馆藏菌株727，对氨比西林、庆大霉素、羧苄青霉素、canamicillin、多粘菌素和头孢菌素敏感。

5)不动杆菌菌株681，从患者分离得到，对多粘菌素轻微敏感。

6)铜绿假单胞菌株328，从患者分离得到，对多粘菌素轻微敏感。

7)指间毛癣菌。

8)白色念珠菌。

将上述8种试验培养物分别种植在培养皿中的无菌肉胨琼脂上，然后将被浓度为0.5％的9种化合物之一饱和的标准琼脂棒放在琼脂表面。在37℃下生长24小时和48小时后，测量琼脂棒周围的延缓区域。对于真菌培养物，在30℃下孵育7-10天后检测结果。

化合物对饱和琼脂的影响总结在表4中。

表4

下面的表5为琼脂扩散试验结果。

表5化合物在琼脂中扩散试验中生长延缓的结果

试验培养物	化合物(1)导致的生长延缓的区域大小
试验培养物	化合物(1)导致的生长延缓的区域大小	金黄色葡萄球菌	6.5
粪肠球菌	6	金黄色葡萄球菌	6.5
粪肠球菌	6	肺炎克雷白菌	5
鼠伤寒沙门菌	7	肺炎克雷白菌	5
鼠伤寒沙门菌	7	不动杆菌属	6.5
假单胞菌属	0	不动杆菌属	6.5
假单胞菌属	0	延缓的平均区域	5.17

在同样的浓度下，化合物(1)可以抑制抗氨比西林的葡萄球菌和对该抗生素敏感的肠球菌的生长。对于其他病原体和制剂可以观察到类似的差别。

化合物(1)抗结核杆菌(TB)的效果

用10％的正常马血清，通过在合成液体介质(SOTON)中连续两次稀释的标准方法检验抗TB效果。在Tween 80中制备该溶液。

试验培养物为对抗TB药物敏感的结核分枝杆菌(Mycobact tub.)H.37RV。

将分枝杆菌悬浮液(密度5×107个细胞/ml)洒在特殊的液体介质(Vischnevsky，B.I.).

在37℃下孵育10-14天后计算结果。MIC(完全抑制了结核分枝杆菌)

结果见下表6。

表6

	最小抑菌浓度(μg/ml)
	最小抑菌浓度(μg/ml)	化合物(1)	6.25
异烟肼	0.02-0.1	化合物(1)	6.25
异烟肼	0.02-0.1	利福平	0.01-0.02
乙胺丁醇	1.0-2.5	利福平	0.01-0.02
乙胺丁醇	1.0-2.5	链霉素	0.5

只有化合物(1)与乙胺丁醇/异烟肼的MIC接近。

实施例7 抗原生动物活性

还研究了化合物(1)和(2)对毛滴虫的作用。采用从患者分离出的阴道毛滴虫。将这些毛滴虫在37℃、pH为5.8-6.5的介质199中，所述介质199含5.0％的天然胎牛血清、碳水化合物和用来抑制伴生菌群的抗生素。在培养试管中的介质表面涂上凡士林。实验样本中所含的试验化合物的浓度为0.3％。

研究了7样本，样本中含有寄生虫游动的形式，数量为1.0cm3中有5-8个细胞。在对照试验中，培养的寄生虫可以成功地经过3-4次传代(每次传代5-6天)。相比之下，在含有试验化合物的介质中的游动形式的培养物在任何情况下都是不成功的。在试验化合物存在的情况下，仅仅经一次传代，游动形式就不能繁殖。

实施例8 体内抗菌活性

通过对腹膜或鼻腔内感染了副结核棒杆菌(Corynebacteriumparatuberculosis)的小鼠进行实验，确定该化合物的治疗和预防效果。

通过腹膜内、肌肉或口服施用化合物(1)和(2)，从感染之日起在不同时间内施用＜20％LD50/0.2的剂量，即感染前2天和1天(记为2，1)、感染当日(记为0)以及感染后的1、2、3天等(记为+1、+2、+3等)。

检查每天的死亡率，计算出累计变量，在此基础上根据下式得到制剂的性能结果

AI＝[[(B-A)]:B]x[100]

其中AI＝制剂的活性指数(％)，

A＝实验组的累计死亡率，

B＝对照组的累计死亡率

试验结果见下表7，结果表明，所试验的化合物(1)和(2)对感染了副结核棒杆菌的小鼠表现出治疗和预防活性。

至于通过肌肉给药，表现为降低动物的死亡率的临床预防效果的性能为52.53％.对沙门氏菌病的临床效果在50.0-20.0％的范围内变化.对假结核病的预防效果为50.0％.

表7 以AI评估化合物活性的排序

实施例9 辐射防护活性

用体重为18-20g的雄性白鼠检测试验化合物(1)和(2)的防辐射效果。

剂量：2、4、6、8、10、15、20Gr(1hR＝100伦琴)。

观察时间：25天。

报告方法：动态死亡率，累计死亡率和实际剂量变化(FCD)的计算值。

给药时间安排：以50mg/kg的剂量给白鼠施用0.2mL。

第一组：对照组，

第二组一辐射2天和1天。

表8为试验化合物的防辐射性能的试验结果。

表8

注：*1hR＝100伦琴

结果表明，与对照组相比，在任何辐射量下，预防性地施用试验化合物后都可以显著降低受辐射动物的死亡率。FCD(LD50对照)＝1.39-1.43，这表明试验化合物具有强的防辐射作用，该结果不逊于文献报导的药物。

实施例10 感染伤口的治疗

志愿者人的皮肤伤口被链球菌和葡萄球菌感染后，用含有0.1％的化合物(1)和(2)的药膏处理伤口，所述药膏基于凡士林、绵羊油和亚砜。施用0.1％的药膏3天后，彻底清理掉伤口的脓，随后伤口愈合。

治疗3例被真菌大面积感染的皮肤，真菌的类型不清楚。每天用0.1％的药膏擦拭伤口两次。一周内皮肤上不再生长真菌。

实施例11 药代动力学

尽管还没有对本发明的化合物的药代动力学进行详细研究，但对经腹膜和胃肠道施用了化合物(1)和(2)的小鼠的试验已经证实，该化合物在血液中的生物活性浓度可以维持24小时以上。

实施例12 毒性试验

经胃肠道给小鼠用药的平均致死剂量为1500mg/kg体重；而经腹膜给药时，平均致死剂量为575mg/kg体重。因此，本发明的化合物的毒性较小。

实施例13 化合物(1)的抗菌活性和溶解性

化合物(1)基本上不溶于水，但在10％的DMSO中的溶解度为1mg/mL(0.1％)，在10％的乙醇中的溶解度为2mg/ml，在10％的丙酮中的溶解度为2mg/mL。

在5％的溶剂中可检测到的最高浓度是512μg/ml，或者在2.5％的溶剂中可检测到的最高浓度是256μg/ml。在细菌试验中不需要专门的进行化学中和，稀释就可使残留活性充分中和。

试验中选择DMSO作溶剂，因为它对检验菌株的毒性最小。

当化合物(1)与乙醇配合时，其对大肠埃希氏菌的活性至少提高8倍。化合物(1)在2.5％的DMSO中的MIC为＞512μg/ml，而其在0.06％的乙醇中的MIC为128μg/ml。乙醇浓度大于2.5％时对大肠埃希氏菌有毒性。

实施例14 化合物(1)的抗菌活性

NCCLS-USA标准方法-肉汤微量稀释法(或大量稀释法)(Mueller-Hinton)。

接种体1-4×104cfu(菌落形成单元)(或-4×105cfu)。环丙沙星试验对照。加入氯己定值以便对比消毒和杀菌活性。

除非另有说明，将最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)作为在35℃、24小时有氧条件下的3log降低值(杀死99.9％)。经过48小时滴定没有显著差异。

结果如表9所示。

结果小结

对于选自有代表性的革兰氏阳性或阴性菌，在可接受的体内浓度下，化合物(1)具有杀菌活性，是较为广谱的抗菌药。化合物(1)对抵抗喜氧的革兰氏阳性或阴性球菌和喜氧的革兰阳性杆菌上广泛有效，在临床上具有重要意义。

抗革兰氏阳性球菌的感染

临床分离的(抗多种抗生素)金黄色葡萄球菌和粪肠球菌与标准菌株一样易受感染。虽然目前的治疗药物在低浓度下没有活性，但有可能采用化合物(1)作为治疗手段，来同时对抗对目前选用的药物没有响应的葡萄球菌和肠球菌。

厌氧感染

化合物(1)对临床上重要的产气荚膜梭菌、艰难梭菌和脆弱拟杆菌具有活性。艰难梭菌可以引起就医患者的小肠结肠炎，目前选用药物万古霉素进行治疗。万古霉素存在的问题是会产生抗性。因此治疗艰难梭菌引起的小肠结肠炎的内服药将替代万古霉素，这种内服药具有市场前景。

厌氧感染通常是一种或多种厌氧菌与兼性细菌引起的混合感染，所述兼性细菌通常是肠革兰氏阴性肠杆菌。最常见的厌氧病原体是艰难梭菌和脆弱拟杆菌。目前使用甲硝唑与其他抗菌药结合的治疗方法通常是有效的。由于化合物(1)对喜氧和厌氧菌具有广谱活性，所以可用该化合物来治疗此类感染。

肠道感染

化合物(1)对空肠弯曲杆菌具有非常高的对抗活性。空肠弯曲菌属目前在全世界是肠道感染的最主要的原因，由于肠道感染在某些患者身上体现的非常强烈，而且有可能被感染而发展成为格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)，格-巴二氏综合征是一种中枢神经系统(CNS)疾病，因此需要进行治疗。

化合物(1)对肠道革兰氏阴性菌的对抗性可能源于其溶解性及渗透细胞的能力。已经有成功治疗动物的顽固的肠道感染以及沙门氏菌感染的例证。

外阴阴道炎

化合物(1)对淋病奈瑟球菌具有较强的抵抗活性。外阴阴道炎由白色念珠菌、淋病奈瑟球菌、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和阴道毛滴虫引起(是分别引起，不是共同感染引起)。化合物(1)对其中的两种因子具有对抗活性。

配制化合物(1)使之达到较大的溶解度(因此可能会有较大的吸收)可以提高其在体内的活性并改善其分布。

表9

化合物(1)、环丙沙星和氯己定对抗多种临床上重要的细菌的MIC/MBC(μg/ml)

实施例15 化合物(1)的抗真菌活性

NCCLS(美国国家临床实验室标准化委员会)-USA肉汤大量稀释法(RPMI介质)。

接种物：约5×104菌丝碎片/ml(血球计数法)。咪康唑对照。

在30℃、有氧条件下，对酵母菌2、7和10天，对丝状真菌4、7、和14天的最小抑菌浓度(MIC)和最小抗真菌浓度(MBC)(2log减少率-杀死99％)。

结果列在表10中。

结果小结

化合物(1)在相对低的浓度下是大部分临床重要的酵母菌和丝状真菌的抗真菌剂。(表10)

皮肤真菌感染

化合物(1)对引起人体和动物的皮肤、毛发以及指甲感染的3种主要真菌具有良好的活性。外部真菌感染是全世界最普遍的真菌感染。其治疗时间很长，需数个月(指甲感染需要几年)。使用抗真菌洗液或药膏进行表面治疗的疗效很有限。目前的治疗虽然成本低，但疗效不好，而且复发率高。优选采取口服的全身性药物(特比奈芬和伊曲康唑)治疗缺乏抵抗力的患者的外部感染和指甲感染。

全身感染

全世界越来越多缺乏抵抗力的患者受到了严重的真菌感染，而且感染越来越严重。真菌感染通常时间长，治愈率低，复发率高，而且真菌会产生抗性。念珠菌病(白色念珠菌)和曲霉病(烟曲霉)是主要的真菌感染。严重的、入侵性的感染具有较高的死亡率。有效的(抗菌)药非常少。长期治疗必须考虑安全性和不能产生抵抗力的问题。两性霉素B是治疗许多严重的霉菌病的主要药物。它是一种溶解性差和生物利用度低的杀菌剂，而且由于其毒性和输送的问题以及较高的治疗失败率，其应用受到了限制。吡咯和三唑是低毒、药物动力特性良好的制真菌剂(如氟康唑和伊曲康唑)，但常常由于在长期治疗中产生抗性而失效。

化合物(1)具有广谱性，是对白色念珠菌和烟曲霉的抗菌剂不产生抗性的抗真菌剂。(见下表)

表10

化合物(1)和咪康唑对抗临床上重要的真菌的MIC/MBC(μg/ml)

实施例16 化合物(1)的杀孢子的活性

枯草芽孢杆菌内生孢子

烟曲霉无性外生孢子

检验在水和吐温20中达24小时的化合物(1)的杀孢子活性。

512μg/ml的化合物(1)在24小时内不能杀死枯草芽孢杆菌内生孢子。

512μg/ml的化合物(1)在24小时内可以杀死烟曲霉无性外生孢子，但在6小时内不能。

吸入曲霉属孢子是主要的传播方式。抗孢子活性对于防止缺乏抵抗力的个体患病非常重要。由于孢子必须通过发芽而传染，但最终是由对真菌的植物形式的活性来确定疗效。

实施例17 化合物(1)的抗性的产生

细菌和真菌在低于抑制浓度的化合物(1)中连续暴露12个星期，检测发现MIC升高了，这表明产生了抗药机制。每周的传代培养中使用大量不同的接种物，因此抑制浓度每周均有变化。在暴露开始和结束时测定标准MIC。若标准MIC的变化大于4倍，则表明抗性增强，或每周MIC有增大趋势。已知所选用的菌种很容易对许多抗菌素产生抗性，这是临床上的一个主要问题。

已知许多菌种和白色念珠菌对当前的很多药物会产生抗性，但当它们在化合物(1)中连续暴露12周后没有产生抗性(表11).仔细观察菌种微观和宏观的异常变化.普通变形菌丧失了群游能力，表明对鞭毛有影响.其他菌种正常.红酵母另外3种霉菌的试验没有完成.这些菌株没有产生抗性主要是化合物(1)的作用.

表11

在MHB中低于抑制浓度的化合物(1)中连续暴露12个星期，细菌和真菌的MIC(μg/ml)升高情况。

实施例17化合物(1)在血液条件下的抗菌活性

在血浆和全血(马)存在的条件下，用大量稀释法测定化合物(1)和环丙沙星在Mueller Hinton肉汤中达48小时的活性。

化合物(1)的活性在10％的血浆存在下似乎相对不受影响，而在5％全血存在活性较高。这些药物在血液存在下的抑制活性有时会稍微提高，这可能是由于血液中天然存在的抗菌因子造成的。进一步提高血浆和全血浓度后，化合物(1)对金黄色葡萄球菌的抗菌活性降低了(见表13)。在10％血浆和全血存在下，环丙沙星对金黄色葡萄球菌的抗菌活性分别下降4倍和2倍。

表12

化合物(1)在人的全血和血浆存在下的活性

实施例19 结合在血浆蛋白质上的化合物(1)

增加血浆浓度测定化合物(1)的MIC。发现化合物(1)结合在了人血清蛋白和琼脂糖上，血清结合过程对药物的输送和生物利用度具有重要意义。

提高血浆浓度后化合物(1)的MIC显著提高。杀菌活性比抑制活性受到的影响显著。

在血浆蛋白质存在情况下，化合物(1)的生物利用度显著降低(表13)。化合物(1)可以可反转结合在蛋白质上。

表13

MHB中化合物(1)在高浓度血浆存在下的MIC/MMC(μg/ml)

MHB中血浆的百分数金黄色葡萄球菌酿脓链球菌

MIC MIC

0 4 4

1 4 4

2.5 8 8

5 8 8

10 16 16

20 32 32

50 128 64

100 128 256

实施例20 杀死率

将菌种嫁接在溶解在水中的化合物(1)上，经过1、2、4、6和9小时后立即制样。由MHA(35℃，48小时)上的存活数量来估计存活量。

杀死量：用log减少因子来表示存活量(log)的降低。

(例如，1 log减少率＝90％被杀死，2 log＝99％被杀死，3 log＝99.9％被杀死等)

化合物(1)杀死白色念珠菌的速度非常快，512μg/ml时在2小时内的减少率高于99.999％，而256μg/ml时在4小时内可以达到高于99.999％的减少率。

对细菌的杀死速度较慢。512μg/ml时在2小时内对枯草芽孢杆菌的杀死率为99.99％，而256μg/ml时在9小时内对金黄色葡萄球菌的杀死率可以达到99.99％。

没有对环丙沙星进行试验。

表14

化合物(1)在6或9小时内的log减少率因子

实施例21 化合物(1)在大鼠中的剂量范围试验

该实施例的目的是确定大鼠口服一个剂量后，化合物(1)的吸收和血液水平。

试验条件

使Sprague-Dawley大鼠(6w/o，2001年1月30日出生)在标准环境条件(22℃±3℃，相对湿度30-70％，人工光源，光照12小时/黑暗12小时)下在动物笼中适应6天。使大鼠随意进食一般的实验食物和水，每个笼里关5只鼠。

试验物质

将化合物(1)在无菌LPW中配制成水悬浮液。在高浓度下将悬浮液超声波分散以减小颗粒尺寸，使其能通过管饲法的针管。

试验化合物(1)的浓度为1250、1000、500和100mg/kg。

试验方法

将大鼠随机分为多个治疗组，在尾巴上标上数字。从最小剂量开始顺序检测剂量。

组别A 100mg/kg 5/2/01

B 500 8/2/01(未禁食)

C 500 12/2/02(禁食)

D 1000 14/2/01

E 1250 21/2/01

施用单剂量的约100mg/kg体重的化合物(1)的悬浮液和水对照。每次即将给药前称量一只对照大鼠和五只治疗大鼠的体重，计算出剂量体积，药物用强饲管(刻度为22的不锈钢量据，光滑的圆头部位贴在注射器上)喂食。

在第4小时和第8小时从尾巴上抽取约100-200μl血液(小离心管)。尾巴用加热灯预热，然后用一把大手术刀将尾巴尖切开，将血液挤压进小离心机管里。没有尝试取24小时后的血液样，因为弄碎尾巴上结痂的伤疤很困难，大鼠也难以承受疼痛。

血液凝固后，在小离心机里离心分离3分钟(14速)，分离出的血清在-20℃下储存。

观察动物7天，每天两次，对每只大鼠都作单独记录。第一次称重后不需要再称重。在第7天杀死大鼠并作解剖。

给大鼠施行二氧化碳安乐死。

记录所有病理状态，切除(10％福尔马林)心脏、肺、肝、肾、胃、脾、十二指肠以及结肠样本，作组织学检验。

实施例22 化合物(1)的血液水平

生物鉴定

由于化合物(1)与血液蛋白和琼脂之间具有强的结合力，所以在这种结合力的干扰下无法对化合物(1)在血液中的水平进行生物鉴定。

琼脂扩散

不可能进行化合物(1)的琼脂扩散检验，因为化合物(1)与琼脂之间结合力很强，以致在1-512μg/ml的任一浓度下，都没有形成对易感菌株金黄色葡萄球菌或酿脓链球菌的抑制区域。进行了孔板扩散和圆盘扩散检验。

肉汤稀释液

在MHB中的稀释血清，不可能用少量酿脓链球菌接种物(被1μg/ml在MHB中的化合物(1)抑制)进行试验，因为在高浓度下与血浆强结合会产生显著的前带(prozone)。

紫外光谱检测

对于单个大鼠试样的检测，血清量不足。

因此取治疗组和对照组的试样，得到化合物(1)对每一治疗组的平均水平。

试验方法

将化合物(1)用甲苯从血清中萃取(2次)出来，检测到在370nm处有吸收(日立U2000)。还检验了采用在50％甲醇/水(v/v)中的100μg/ml的化合物(1)的穿刺(spiked)对照和未处理对照。

血液水平

从胃肠道吸收的化合物(1)非常少，大约是口服剂量到达血液后的2％。血液水平随着剂量增大而增加。8小时的水平一般高于4小时的水平。4小时和8小时的水平之间的微小差别说明吸收很慢。

表15

实施例23化合物(1)的抗菌活性谱

抗真菌活性

丝状真菌

NCCLS-USA肉汤大量稀释法(RPMI介质)一试行。接种物1-4×105cfu。咪康唑对照。该检验用于评价初始活性谱。

采用新提出的M38-P NCCLS-USA标准大量稀释法，重复检验先前采用NCCLS-USA肉汤稀释法检验过的丝状真菌的MIC和MFC。

在不同的日子重复2或3次得到结果。

对于所有先前检验过的真菌，检验结果与先前使用旧方法得到的检验结果没有明显区别。一些检验中用两性霉素B代替咪康唑作为对照。

酵母

采用官方标准NCCLS-M27-A肉汤大量稀释法检验酵母的抗真菌易感性。

还采用了用于丝状真菌的M38-P微量稀释法。

在35℃下，48小时后测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀真菌浓度(MFC)，结果表示为2log减少率，即99％的杀死率。用每种方法在不同日子重复测两次或三次作为结果。两种方法得到的结果没有显著区别。据报导，M38-P仅用于酵母和丝状真菌。

表16

化合物(1)和两性霉素B对临床上重要的真菌的MIC/MFC(μg/ml)一M38-P法

化合物(1) 两性霉素B 咪康唑

MIC MMC MIC MMC MIC MMC

酵母(24小时，35℃)

白色念珠菌 8 8 0.25₁ 0.25

C.guillermondii RMIT 176 2 2 0.03 0.06 1 1

克鲁斯念珠菌RMIT 177 4 4 0.5₂ 0.5 2 2

近平滑念珠菌RMIT 178 2 2 0.25₃ 0.25 0.5 0.5

热带念珠菌RMIT 181 4 4 0.25 0.5 1 2

光滑念珠菌RMIT 157 2 2 0.5 1 0.25 0.5

新生隐球菌(Cryptococcus 1 0.5 4

neoformans)

丝状真菌(48小时，35℃)

烟曲霉 8 32 1 8

黑曲霉 8 16 2 2

黄曲霉 16 32 8 8

禾谷镰刀菌 4 8 4 8

F.chlamydosporum 8 8 2 2

匍枝根霉 4 16 ＞16

R.oryzae 64 64 4 4

微小根毛霉(Rhizomucor pusillus) 4 8 1 1

多变拟青霉(Paecilomyces variotii) 1 2 1 1

暗色真菌

裴氏着色霉(Fonsecaea pedrosoi) 2 2 8 16

疣状瓶霉(Phialophora verrucosa) 16 32 2 4

波氏假阿利什菌(Pseudoallescheria 2 4 4 16

boydii)

皮肤真菌

红色毛癣菌 1 256

絮状表皮癣菌(Epidermophyton 0.5 16

floccosum)

石膏样小孢子菌(Microsporum 1 8

gypseum)

两性霉素B对照的允许范围

0.25-1μg/ml

0.5-2.0μg/ml

0.25-1μg/ml

细函

方法

NCCLS-M7-A5标准方法——肉汤微量稀释法(Mueller-Hinton)。接种物1-4×104cfu。环丙沙星作为实验对照。用氯己定和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为消毒剂和防腐活性对照。

还采用了NCCLS-M7-A5标准方法——微量稀释法(Mueller Hinton±指定的强化物)。在35℃、有氧条件下，24小时最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)表示为3log减少率(99.9％被杀灭)。48小时的滴定后无明显差异，因而未作记录。

采用微量稀释法和大量稀释法的MIC/MMC没有显著差异。

表17

弯曲杆菌属(Campylobacter)

用化合物(1)对从人体分离的多种弯曲杆菌属菌种进行试验。

表18

化合物(1)的MIC/MMC(μg/mL)，采用NCCLS-M7A5大量稀释法，42℃，48小时，微需氧链球菌培养

MIC MMC

空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)54/1-2 2 2

空肠弯曲杆菌541-3 2 2

结肠弯曲杆菌(C.coli)54/2 4 4

胚胎弯曲杆菌(C.fetus)54/3 2 2

豚肠弯曲杆菌(C.Hyointestinalis) 2 2

唾液弯曲杆菌唾液生物变种(C.Sputorium)54/5 2 2

Laniolis弯曲杆菌(C.laniolis)54/6 2 2

在世界范围内，弯曲杆菌属细菌是引起肠胃炎(血性腹泻、腹痛、呕吐、头痛、发热、持续约1周)的最常见的原因。后遗症是关节炎和格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)(0.1％)。这类病主要由食用家禽所致。在美国每年约有250万个病例。99％的病例由空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)所引发。患者的表现从亚临床到急性各不相同。患有这些病时通常仅采用液体置换法而不作治疗，如果病情严重或危及生命，则采用抗生素(红霉素、四环素或氟喹诺酮)治疗。

表19

化合物(1)的MIC/MMC(μg/mL)(24小时，35℃-大量稀释法)

细菌 MIC MMC

淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae) 2 2

流感嗜血菌(Haemophilus influenzae) 0.125 0.125

肺炎链球菌(Streptococcus 2 2

pneumoniae)

以上是人的重要致病病菌，采用抗生素可以成功地对付这些病菌。淋病奈瑟球菌是引发妇女阴道炎的主要原因。所以低浓度的化合物(1)对于白色念珠菌和淋病奈瑟球菌这两种细菌具有对抗活性。

阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)

方法

根据Garcia，L的描述，在经过Llass改良的Diamond完全培养基(改良的TYM)中，采用肉汤大量稀释法测定阴道毛滴虫的临床分离体的MIC。培养物被放置在5mL的带螺纹盖的玻璃瓶中，其中没有气体空间。

将体积为5mL的log 2稀释液与体积为0.5mL的在log相生长物中的细胞进行接种，得到最终接种物密度为1×104到3×104个细胞/mL；在改良的TYM中，所述稀释液为从在5％的DMSO中的512μg/mL的化合物(1)到在0.002％的DMSO中的0.25μg/mL的化合物(1)。在37℃、有氧条件下，将上述玻璃瓶孵育24小时，然后镜检其活动性。被确定为最低浓度的MIC显示没有活动性。将来自显示没有活动性的所有试管中的0.5mL的部分在5mL的改良的TYM中进一步作传代培养，在37℃、有氧条件下培养达5天，以便确定其无活动性。

分别用在TYM中的生长物对照、在2.5％的DMSO改性的TYM中的生长物对照和在5％的DMSO改性的TYM中的生长物对照验证上述试验。

在不同的日子进行3次重复试验。

结果

	MIC	MMC
	MIC	MMC	阴道毛滴虫	4μg/mL	4μg/mL

实施例24 对化合物(1)的抵抗的产生

从经过12周抵抗试验的菌株中选择具有抵抗性的菌株，采用微量稀释法与母菌株同时进行重复试验。

表20

在化合物(1)在MHB中的亚抑制浓度下，真菌菌株在其中连续暴露12周后的MIC的变化(μg/mL)

经过重复试验，真菌的MIC表现出高达4倍的差异。MIC的显著增加为大于等于8倍。

丝状霉菌株没有产生显著的抵抗性。

实施例25 乙醇制剂对活性的影响

对于白色念珠菌(Candida albicans)、鼠伤寒沙门菌(SalmonellaTyphimurium)和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，采用大量稀释法和微量稀释法比较了化合物(1)的DMSO和乙醇制剂对化合物(1)的MIC的影响。

使用前将在乙醇中的贮存液静置48小时以便提高其稳定性。化合物(1)在乙醇中的溶解性不如在DMSO中的溶解性。将乙醇和DMSO的浓度保持恒定在2％，并与原液正常稀释时溶剂浓度的下降相比较。两种方法没有明显差别。在DMSO的恒定和下降水平之间MIC没有差异。在恒定的2％的乙醇存在下，仅有大肠埃希氏菌对乙醇的易感性增强了。

表21

大量稀释法中溶剂对化合物(1)的MIC(μg/ml)的影响

原本在试图选择乙醇作为药物的适当溶剂时，已经注意到了乙醇对大肠埃希氏菌的协同效应。乙醇对葡萄球菌、沙门氏菌或念珠菌没有增强作用。DMSO是体外试验中药物的较好的溶剂。乙醇将被用于动物研究。

实施例26 贮存时化合物(1)溶液的稳定性

在室温(RT约18-21℃)、4-20℃下将在水和5％的DMSO中的浓度为512μg/ml的化合物(1)的原液贮存达12周，每隔2周测定对于枯草芽孢杆菌的MIC，从而试验其杀菌能力。

表22

每隔2周测定512μg/ml的化合物(1)的原液对枯草芽孢杆菌(24小时，35℃)的MIC/MBC，从而试验其稳定性

1 8周后溶液从淡黄色变为深黄色。

2 2周后溶液从淡黄色变为深黄色。

化合物(1)很稳定，4-20℃下贮存12周后稀释液仍保持杀菌能力。与实践中的抗生素溶液相比，室温下贮存6周杀菌能力下降2倍是很低的。它也在对细菌的MIC的允许变化量度范围(2倍)内。没有试验对照真菌。

实施例27 化合物(1)对人类的体外血红细胞中的人类疟疾寄生虫恶性疟原虫的影响

本实施例的目的是定量研究化合物(1)对人类体外血红细胞中的人类疟疾寄生虫恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的生长的影响。

方法

疟疾寄生虫

3D7特别适用于本实验所用的恶性疟原虫的体外培养物品系。这种寄生虫在人的血红细胞内经过了多个生长和复制的循环。每一个完整的循环周期为48小时，循环从幼虫的环状体期寄生虫开始到分节的裂殖体，环状体期的寄生虫在循环的最初24小时内通过色素营养子而成熟，分节的裂殖体破裂会释放出有感染性的裂殖子，裂殖子迅速侵入血红细胞。新入侵的裂殖子变为环状，于是继续进行下一轮循环。

寄生虫培养物和生长抑制分析

采用成熟的技术，在新采集的人的血红细胞中的体外培养物中同步保留恶性疟原虫。为了进行入侵分析，将含有阶段同步的培养物和色素营养子血红细胞提纯，然后在新鲜的人的血红细胞中再悬浮，从而在每100个血红细胞中约有2个被寄生(2％的寄生虫血症)。将新鲜的培养介质加入，得到最终的血红细胞浓度为2×108个红细胞/ml。

在37℃及降低的氧张力下，孵育多份含有试验化合物、唯一载体(此时为乙醇)或PBS(对照)的血红细胞悬浮液。立即(时间＝0)涂上薄的血，然后经过24、48和72小时的培养。每次涂血时，用吉姆萨染液在pH为7.2下染色后，通过镜检来定量分析寄生虫血症和寄生虫成熟的阶段。这样可以定量分析侵入、寄生虫的成长和随后的再侵入。在每个取样时间点上，用新鲜的介质完全置换所有样品中的培养介质(±化合物/载体)。

测试均含有10％的乙醇的、浓度分别为100、400和1000μg/ml的化合物(1)的水溶液。使用前将原液在4℃下保存。分析时，将每种溶液进一步在完全寄生虫培养物介质(pH＝7.2)中稀释为1∶40，从而得到所需的工作浓度(5、10和25μg/ml)，然后无菌过滤(0.22μm)，然后加入到被寄生的血红细胞悬浮液中。在整个分析过程中将原液在4℃下保存，使用时在寄生虫培养介质中适当稀释。应当指出，浓度为1000μg/ml时，该化合物甚至在加热到37℃和剧烈搅拌下也完全不溶。于是，在25μg/ml的假定浓度下进行的试验事实上是在更低的有效浓度下进行的。

结果

在最终浓度为5、10和25μg/ml下测试了化合物(1)对寄生虫生长的影响。结果如图2所示。检测发现，所有试验的药物浓度都对抑制寄生虫的生长和复制有影响，经过72小时的培养后，试验的最大浓度(25μg/ml)下的抑制作用最大。单独使用乙醇时，在0.25％的最终浓度下对于寄生虫的生长没有明显影响。试验化合物在所有浓度下均没有检测到对血红细胞的形态有负面影响。

在25μg/ml下没有观察到寄生虫，在10μg/ml下仅观察到了很少数寄生虫，这表明该化合物实际上杀死了寄生虫。

很明显，为了清楚和便于理解，本发明在一定程度上进行了详细描述，但是在不背离本说明书所描述的发明理念的条件下，本领域的技术人员可以对实施方式作各种变化和改变。

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Claims

1.式I的化合物及其药用盐、几何异构体和/或立体异构体在制备治疗和/或预防微生物感染的药物中的应用，所述式I化合物为：

其中，X和Y相同或不同，并且选自O、N、NH或S；

是由X和Y决定的单键或双键；

R₁是氢或C_1-4烷基；

R₂是氢或C_1-6烷基；

R₃至R₅是选自氢或C_1-4烷基的相同或不同的基团；和

R₆和R₇是选自氢或C_1-6烷基的相同或不同的基团，或者当存在双键时，R₆和R₇中的一个基团不存在，

其中所述微生物感染是由金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷白菌、鼠伤寒沙门菌或假结核病、不动杆菌属、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌、空肠弯曲杆菌或脆弱拟杆菌引起的感染；或者是由指间毛癣、烟曲霉或白色念珠菌引起的真菌感染或酵母菌感染；或者是由恶性疟原虫或阴道毛滴虫引起的所述原生动物感染。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述的微生物感染是细菌伤口感染、粘膜感染、肠感染、溃烂、沙眼或毛滴虫。

3.如权利要求1或2所述的应用，其中X和Y是选自O和N的相同或不同的原子。

4.如权利要求3所述的应用，其中X和Y同时为O。

5.如权利要求1或2所述的应用，其中R₁和R₂是选自氢或C_1-4烷基的相同或不同的基团。

6.如权利要求1或2所述的应用，其中所述式I化合物是E同分异构体形式。

7.如权利要求1或2所述的应用，其中X和Y为O，R₁为甲基并且R₂和R₇是氢，所述式I化合物为3，4-亚甲基二氧-β-甲基-β-硝基苯乙烯，

或其中X和Y为O并且R₁至R₇是氢，所述式I化合物为3，4-亚甲基二氧-β-硝基苯乙烯，

或其中X是N，Y是NH，R₁是甲基，R₂至R₆是氢且R₇不存在，所述式I化合物为苯并咪唑-5-β-硝基丙烯，

或其中X是N，Y是NH，R₁至R₅是氢，R₆是甲基并且R₇不存在，所述式I化合物为2-甲基苯并咪唑-5-β-硝基乙烯，

或其中X是O，Y是N，R₁至R₆是氢并且R₇不存在，所述式I化合物为苯并噁唑-5-β-硝基乙烯，

或其中X是N，Y是O，R₁和R₆是甲基，R₂至R₅是氢并且R₇不存在，所述式I化合物为2-甲基苯并噁唑-5-β-硝基丙烯，