CN1853720A - 糜－胰蛋白酶口腔溃疡膜 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种口腔溃疡制剂，它含有：0.1－40重量份的糜－胰蛋白酶、50－99.8重量份的壳聚糖和0.01－10重量份的有机酸，所述的口腔溃疡制剂是固态剂型。还提供了所述制剂的制备方法。本发明口腔溃疡制剂使用简便、疗效好、作用时间长。

Description

糜-胰蛋白酶口腔溃疡膜

技术领域

本发明涉及药物领域，更具体地涉及糜-胰蛋白酶的口腔溃疡制剂。

背景技术

口腔溃疡是口腔科常见病、多发病，轻者产生疼痛不适，重者影响进食甚至讲话，并可引起感染等并发症。

目前，治疗口腔溃疡的方法有多种，但效果多不理想。治疗药物中，中药有西瓜霜、锡类散等散剂，但这种剂型使用不方便，于患处涂布不均匀，且很快随唾液而流失，限制了药物作用的发挥。西药有草珊瑚口腔喷雾剂、滇虹口溃液、蜂胶口腔膜等多种剂型，但喷雾剂、含漱剂的作用时间很短，膜剂可贴于溃疡面，但通常在几分钟之内便会溶解消失，疗效不佳。

赵菊琴(维斯克溶液雾化吸入治疗放射性口腔炎的观察.华夏医学2001；14(1)：38-39)报道了将维斯克溶液25ml、庆大霉素8万u、糜蛋白酶5mg和地塞米松5mg混合后，用超声雾化吸入的方法治疗急性放射性口腔炎，但其缺点是需有超声雾化吸入仪器才能实施，治疗过程较复杂；治疗前需配制药液，治疗过程费时；糜蛋白酶在水溶液中不稳定，易自身水解。

美国专利“蛋白水解的干燥生物聚合组合物及其治疗创伤的用途”(Proteolytic，dry biopolymeric composition for treatment of wounds，and methodof using same.专利号：4,613,502)公开了一种含有化学键和固定化蛋白酶的壳聚糖颗粒粉剂，用于治疗溃疡性、坏疽性溃疡，但其缺点是壳聚糖颗粒和蛋白酶固定化的工艺较复杂，壳聚糖颗粒暴露于空气中易受潮，影响固定化蛋白酶的活性，进而影响储存时间和疗效。

欧洲专利“治疗活性药物的给药系统”(Delivery system for pharmaceutical oftherapeutic actives.公开号：0368253 A2)公开了一种作用于身体局部或粘膜表面的给药系统，由至少一种氨基多糖衍生物和药物组成，此给药系统可在作用局部形成一层具有生物相容性、牢固性和渗透性的膜，使药物活性物质可特定地作用于局部，并保护局部组织，便于控制剂量和药物释放速率。其中氨基多糖衍生物可选自多种chitosonium聚合物和壳聚糖衍生物，药物可选自对机体具有活性的物质。

中国专利“生物敷料及其制备方法”(申请号：02110599.5)公开了一种包括壳聚糖、醋酸和FE复合酶杀菌剂的生物敷料，用于治疗人体创伤，以快速杀灭伤口的病菌。

中国专利“用于向伤口释放胶原酶的给药剂型及其制备方法”(申请号：96191620.6)公开了由水溶性或水不溶性聚合物制成的胶原酶释放给药膜，作用于体表伤口后可定量释放胶原酶。

本发明需要解决的技术问题是提供一种适用于治疗口腔溃疡的药物制剂，以克服现有技术的不足，在充分保证制剂中蛋白酶活性的前提下，同时又达到作用使用方便、安全有效、作用长久、促进伤口愈合并保护创面的作用。

发明内容

本发明的目的就是提供一种使用简便、疗效好、作用时间长的口腔溃疡药物制剂。

在本发明的第一方面，提供了一种口腔溃疡制剂，它含有：

0.1-40重量份(更佳地0.2-5重量份)的糜-胰蛋白酶，所述的糜-胰蛋白酶选自下组：糜蛋白酶、胰蛋白酶、或其组合；和

50-99.8重量份(更佳地80-99.7重量份)的壳聚糖，所述的壳聚糖选自下组：酸溶性壳聚糖、水溶性壳聚糖或其组合；和

0.01-10重量份的有机酸，所述的有机酸选自下组：甲酸、乙酸或其组合；

并且所述的口腔溃疡制剂是固态或半固态剂型。

在另一优选例中，所述的糜-胰蛋白酶是糜蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，并且糜蛋白酶：胰蛋白酶的单位比为1∶100至200∶1，较佳地为1∶10至20∶1(单位：U)，更佳地为1∶5至10∶1，最佳地为1∶2至2∶1。

在另一优选例中，所述的壳聚糖为酸溶性壳聚糖。

在另一优选例中，所述的有机酸为甲酸。

在另一优选例中，所述制剂中的糜-胰蛋白酶的总单位为5000-15000U/mg。

在另一优选例中，所述的糜-胰蛋白酶的含量为1.5-2.5重量份。

在本发明的第二方面，提供了一种本发明口腔溃疡制剂的制备方法，包括步骤：

(a)将壳聚糖用0.5％甲酸溶解，形成壳聚糖胶；和

(b)将糜-胰蛋白酶加入(a)步骤制得的胶中，搅拌均匀，过滤，制得含糜-胰蛋白酶的壳聚糖胶；和

(c)将(b)步骤制得的含糜-胰蛋白酶的壳聚糖胶铺于平板上，干燥成膜。

附图说明

图1不同酶含量的口腔溃疡膜样品的酶活力

图2糜-胰蛋白酶口腔溃疡膜的稳定性

图3不同酶含量的糜-胰蛋白酶口腔溃疡膜治疗实验性豚鼠口腔溃疡，用药3天的溃疡面积变化

图4酶含量为2％的糜蛋白酶与胰蛋白酶比例不同的口腔溃疡膜治疗实验性豚鼠口腔溃疡，用药3天的溃疡面积变化

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现将糜-胰蛋白酶和合适的生物材料成膜后所形成的固态膜口腔溃疡制剂，具有极其优异的综合性能，即使用简便、疗效好、作用时间长。在此基础上完成了本发明。

糜-胰蛋白酶

如本文所用，术语“糜-胰蛋白酶”指糜蛋白酶、或胰蛋白酶、或其组合。可用于本发明的糜-胰蛋白酶没有特别限制，可以是各种来源的糜-胰蛋白酶，包括天然的、重组的、提取的或市售的。

一种优选的糜-胰蛋白酶是糜-胰蛋白酶结晶，例如从猪胰中提取获得而获得(同样可从牛胰、羊胰等中提取)。

当使用糜蛋白酶和胰蛋白酶的混合物时，糜-胰蛋白酶中糜蛋白酶∶胰蛋白酶之比通常为1∶100至200∶1(单位：U)，较佳地为1∶10至20∶1(单位：U)，更佳地为1∶5至10∶1，最佳地为1∶2至2∶1，如1.5∶1(单位：U)。

就纯的糜蛋白酶或胰蛋白酶而言，糜蛋白酶的活性范围通常为5250-7500U/mg，胰蛋白酶的活性范围通常为3500-5000U/mg，此优选范围的糜-胰蛋白酶结晶是猪胰的初级提取产物。

糜-胰蛋白酶的制备方法是本领域中已知的。一种优选的结晶制备方法如下所述：

取新鲜猪胰，剥去脂肪和结缔组织后绞肉机绞碎，每5公斤加十升冷的0.2N硫酸溶液，搅拌1-2小时后放置过夜。次日按所加硫酸溶液的体积计算，加固体工业用硫酸铵至0.2饱和度，放置3-5小时后过滤，滤液再加固体工业硫酸铵至0.5饱和度，放置过夜。次日吸去上清液，下层含沉淀部分用抽气漏斗过滤得粗制滤品。将此滤品溶于5倍体积的蒸馏水中，用化学纯硫酸铵重复上述步骤取0.2-0.5饱和度沉淀部分，得精制滤品。将精制滤品溶于三倍体积的蒸馏水中，并调PH6.0，然后缓慢加入饱和硫酸铵溶液至似混非混程度，在25℃下放置，二日后结晶完全。结晶用少量0.25饱和度硫酸铵溶液洗涤，得结晶滤品。结晶母液(连用重结晶母液一起)装入透析袋，对0.005N盐酸透析去盐后过滤，滤液用2N NH₄OH调PH6.5左右，将此滤液冷冻干燥，即得到了糜-胰蛋白酶。

使用糜蛋白酶与胰蛋白酶混合的初级提取产物的原因在于：(a)用猪胰制备的产物即糜-胰蛋白酶结晶，生产方便，成本较低。分离出纯的糜蛋白酶和胰蛋白酶比较困难，并会大大增加成本；(b)糜蛋白酶的作用范围主要针对芳香族氨基酸，作用于含苯环的氨基酸的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键，胰蛋白酶的作用范围主要针对碱性氨基酸，作用于精氨酸、赖氨酸的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键，二者联合使用可以更加彻底地清除坏死组织。

此外，可用于本发明的酶还可选自(但并不限于)：糜蛋白酶(胰凝乳蛋白酶)、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、无花果蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原和外肽酶的一种或其中两种及两种以上的任意比例的组合。

在本发明的组合物中，糜-胰蛋白酶的含量通常为0.1-10重量份。当含量小于0.1重量份时(如小于0.1％)时，难以充分发挥糜-胰蛋白酶的作用。当含量大于10重量份(如超过10％)时，对口腔溃疡的愈合程度，反而较使用低剂量的酶有所下降。

原因可能在于：(a)蛋白酶用量过大导致酶切作用后释放过多的舒缓激肽(9肽，Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg)，舒缓激肽的作用是产生痛觉(痛觉是主观感觉)、促进炎症反应、舒张血管；(b)坏死组织较正常组织容易被蛋白酶清除。使用蛋白酶可去除坏死组织，但如使用剂量过大、时间过长则会造成正常新生组织的损伤；(c)胰蛋白酶对正常组织损伤较小，且在其作用一定时间后，正常组织可产生抗胰蛋白酶(α-anti-trypsin)，防止胰蛋白酶对正常组织的破坏。但抗胰蛋白酶对糜蛋白酶的抑制作用较弱，大量糜蛋白酶对正常组织将造成破坏。

更佳地，糜-胰蛋白酶的含量为0.2-5重量份(或0.2-5wt％)。

壳聚糖

本发明口腔溃疡制剂的另一关键成分是壳聚糖。壳聚糖(chitosan，CTS)是一种由天然高分子甲壳素(chitin)经脱乙酰基后得到的氨基多糖。壳聚糖对人体细胞具有良好的亲和性，抗原性低，安全性高。适用于本发明的壳聚糖选自下组：酸溶性壳聚糖和水溶性壳聚糖或其组合。

酸溶性壳聚糖是一种由天然高分子甲壳素(chitin)经脱乙酰基后得到的氨基多糖，为白色、无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体，可溶于酸性溶液(稀盐酸、硝酸和大多数有机酸)。

水溶性壳聚糖为酸溶性壳聚糖经化学修饰(降解、羟基化、羧基化、烷基化或季铵化)后的产物，可溶于水，包括低聚壳聚糖(壳寡糖)、低分子水溶性甲壳胺、羟乙基甲壳素、羟丙基甲壳素、羧甲基甲壳素、N-羧甲基壳聚糖(MCC)、N-羧丁基壳聚糖等。

优选的壳聚糖是酸溶性壳聚糖(简称壳聚糖)。

在本发明的制剂中，壳聚糖的含量通常为，50-99.8重量份，更佳地为80-99.7重量份。

其他添加剂

除了上述物质之外，本发明的口腔溃疡制剂，还可任选地含有其它药用辅料，例如增稠剂、成膜剂、抗氧化剂、稳定剂、香味剂、掩味剂、色素或稀释剂等。这些药用辅料都是本领域中熟知的。

例如，糜-胰蛋白酶口腔溃疡膜中还可添加增稠剂和成膜剂。

糜-胰蛋白酶口腔溃疡膜中的增稠剂选自聚羧乙烯(或称卡伯波)、羟丙基甲基纤维素或其钠盐、羟丙基纤维素或其钠盐、阿拉伯胶、西黄蓍胶、海藻酸钠。

糜-胰蛋白酶口腔溃疡膜中的成膜剂选自聚羧乙烯(或称卡伯波)、羟丙基甲基纤维素或其钠盐、羟丙基纤维素或其钠盐、羧甲基纤维素或其钠盐。

这些额外添加剂的用量通常为0.01-40重量份，更佳地为0.1-10重量份。

有机酸

本发明的口腔溃疡制剂中，用于溶解壳聚糖的酸可选自稀盐酸、稀硝酸和有机酸或其组合，优选挥发性的有机酸，例如甲酸、乙酸或其组合。

口腔溃疡制剂

将所述的糜-胰蛋白酶融于壳聚糖的甲酸溶液，干燥成膜后即可制得本发明的固态剂型(包括半固态剂型)的口腔溃疡制剂。优选的剂型是口腔溃疡膜。

本发明的糜-胰蛋白酶口腔溃疡制剂在口腔溃疡创面上形成保护膜，可缓解食物等对创面的刺激，对创面持久保护，减轻患者疼痛，并通过壳聚糖遇口腔唾液形成亲水凝胶所产生的阻滞作用，缓慢地维持酶成分释放，通过酶解清除创面坏死组织，充分作用于创面，达到长效的酶治疗作用。

本发明口腔溃疡制剂的制备，可用本领域技术人员熟知的常规设备和方法。

一种优选的方法如下：用0.5％甲酸溶解壳聚糖，加入糜-胰蛋白酶，搅拌均匀，过滤，制得含糜-胰蛋白酶的壳聚糖溶液，将制得的溶液倒至平板上，干燥成膜。

糜-胰蛋白酶口腔溃疡膜中，每平方毫米膜中含有约0.001-0.1mg糜-胰蛋白酶。实施例中制备的酶含量为2重量份的壳聚糖膜中，每平方毫米膜中含有约0.0089mg的糜-胰蛋白酶。可根据口腔溃疡的面积施用不同大小的壳聚糖膜，以将溃疡面全部覆盖为准。

含酶的壳聚糖膜中，酶活性的保持率达66％-100％，酶含量为2重量份的壳聚糖膜中，酶活性保持率达93％。

本发明的优点在于，

(a)对人体安全无毒，无致敏、刺激作用；

(b)采用固态膜剂型，且放置于空气中不易受潮，使糜-胰蛋白酶能够稳定地存在于制剂中，酶活性得以保持，从而保证了疗效。

(c)采用固态壳聚糖膜剂型，由于膜在接触溃疡面后，遇唾液膨胀，在溃疡面上形成了一层均匀、柔软而湿润的保护膜，具有良好的生物相容性，避免了食物等对创面的刺激，减轻了患者疼痛，对创面提供长时间的保护。

(d)糜-胰蛋白酶均匀分布于固态膜制剂体系中，用药后，药物不易虽唾液而流失，同时，随着保护膜因进食、说话等口腔活动及唾液等逐渐溶解，缓慢地释放出酶成分，由于唾液的湿润作用，糜-胰蛋白酶遇水后开始发挥酶活性，缓慢持久地作用于溃疡面，有效地去除溃疡面的坏死组织，保证了酶疗效的充分发挥。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

不同酶含量的糜-胰蛋白酶口腔溃疡膜的制备

各成分用量及配方见表1.

                      表1

编号	壳聚糖膜酶含量	糜-胰蛋白酶(mg)	壳聚糖(mg)
				12345	0.1％1.5％2％2.5％10％	0.57.6101355	500500500500500

糜-胰蛋白酶来源于中科院生化所，糜蛋白酶∶胰蛋白酶＝1.5∶1(单位：U)，每mg混合物含6950U糜蛋白酶和4500U胰蛋白酶。

壳聚糖购自恒台县金湖甲壳制品有限公司，脱乙酰度＞90％。

制备步骤：按编号1-5的配方分别制得不同糜-胰蛋白酶含量(0.1％，1.5％，2％，2.5％，10％)的口腔溃疡膜。

(1)将壳聚糖溶解于25ml 0.5％甲酸，加入糜-胰蛋白酶，搅拌均匀，过滤，制得含蛋白酶的壳聚糖溶液；

(2)将上述溶液倒至平板上，干燥成膜。

实施例2

不同糜蛋白酶、胰蛋白酶比例的口腔溃疡膜的制备

各成分用量及配方见表2.

                                       表2

编号	酶含量	糜-胰蛋白酶(mg)
								糜∶胰＝200∶1(U)	糜∶胰＝5∶1(U)	糜∶胰＝1.5∶1(U)	糜∶胰＝0.1∶1(U)	糜∶胰＝1∶100(U)	壳聚糖(mg)
		67389	2％2％2％2％2％	100000	010000	001000	000100							000010	500500500500500

糜-胰蛋白酶来源于中科院生化所(同实施例1)。

编号3为2％酶含量的糜蛋白酶∶胰蛋白酶＝1.5∶1(U)的壳聚糖膜；

编号6为2％酶含量的糜蛋白酶∶胰蛋白酶＝200∶1(U)的壳聚糖膜；

编号7为2％酶含量的糜蛋白酶∶胰蛋白酶＝5∶1(U)的壳聚糖膜；

编号8为2％酶含量的糜蛋白酶∶胰蛋白酶＝0.1∶1(U)的壳聚糖膜；

编号9为2％酶含量的糜蛋白酶∶胰蛋白酶＝1∶100(U)的壳聚糖膜；

制备步骤：

(1)将壳聚糖溶解于25ml 0.5％甲酸，加入蛋白酶，搅拌均匀，过滤，制得含蛋白酶的壳聚糖溶液；

(2)将上述溶液倒至平板上，干燥成膜。

实施例3

酶含量2％的糜-胰蛋白酶水溶液和缓冲液溶液的制备

1.配制PH4.0缓冲液(40ml)：1mmol Ca²⁺，PH4.0

蒸馏水	40ml
		CaCl2	44.4mg

用盐酸调PH值至4.0。

2.配制PH8.0缓冲液(40ml)：1mmol Ca²⁺，PH8.0

蒸馏水	40ml
		CaCl2	44.4mg

用盐酸调PH值至8.0。

3.酶含量2％的糜-胰蛋白酶水溶液和缓冲液溶液的制备

各成分用量及配方见表3.

                               表3

	样品：酶溶液		糜-胰蛋白酶(mg)		溶剂
							编号	总量(ml)	酶含量	PH值	蒸馏水(ml)	缓冲液(ml)
101112	555	2％2％2％		100100100	6.54.08.0	500							055

编号10为酶含量2％，PH6.5的水溶液；

编号11为酶含量2％，PH4.0，1mmol Ca²⁺的缓冲液溶液。

编号12为酶含量2％，PH8.0，1mmol Ca²⁺的缓冲液溶液。

按表3.将糜-胰蛋白酶溶于蒸馏水或缓冲液中，充分振摇，完全溶解。

实施例4

不同酶含量的口腔溃疡膜的酶活性测定：BAEE法

1.测定方法

以BAEE(苯甲酰精氨酸乙酯)为底物，使用U-2001分光光度计(HITACHI)在253nm波长处检测不同样品中的胰蛋白酶活性。计算依照SIGMA标准，取60s吸光度值，吸光度值每上升0.001ABS表示酶活力上升1U。(BAEE溶于DMSO中，BAEE在3ml检测体系中的浓度为0.5mmol/L)

2.测定结果：见表4.和图1.

                           表4

编号	酶含量	每mg酶的酶活力(U/mg)	酶活性保持率
				1234513	0.1％1.5％2％2.5％10％100％	295037004190432045004500	66％82％93％96％100％100％

编号13为糜-胰蛋白酶[糜∶胰＝1.5∶1(单位U)](购自中科院生化所，同

实施例1)。

对比编号1-5样品的酶活性，随着酶含量的增加，酶活性测定值亦增加，各样品的酶活性与糜-胰蛋白酶样品13相比，其酶活性的保持率达66％-100％。酶含量2％的样品与糜-胰蛋白酶样品13相比，保持了约93％的酶活性。

实施例5

不同糜蛋白酶、胰蛋白酶比例的口腔溃疡膜的酶活性测定：BAEE法和BTEE法

1.测定方法

(1)以BAEE(苯甲酰精氨酸乙酯)为底物，使用U-2001分光光度计(HITACHI)在253nm波长处检测不同样品中的胰蛋白酶活性。计算依照SIGMA标准(同实施例4)。

(2)以BTEE(苯甲酰酪氨酸乙酯)为底物，使用U-2001分光光度计(HITACHI)在256nm波长处检测不同样品中的糜蛋白酶活性。计算依照SIGMA标准(同实施例4)。

2.测定结果：见表5.

表5

编号	口腔溃疡膜样品		每mg酶的酶活力(U/mg)
					糜蛋白酶∶胰蛋白酶(U)	酶含量	糜蛋白酶活力	胰蛋白酶活力
	614715313816917	200∶1200∶15∶15∶11.5∶11.5∶10.1∶10.1∶11∶1001∶100	2％100％2％100％2％100％2％100％2％100％	1250013000850087506200675010001050105110					5560170018004000435010150110001205012850

编号14为糜-胰蛋白酶[糜∶胰＝200∶1(单位U)]。

编号15为糜-胰蛋白酶[糜∶胰＝5∶1(单位U)]。

编号13为糜-胰蛋白酶[糜∶胰＝1.5∶1(单位U)]。

编号16为糜-胰蛋白酶[糜∶胰＝0.1∶1(单位U)]。

编号17为糜-胰蛋白酶[糜∶胰＝1∶100(单位U)]。

实施例6

酶含量2％的口腔溃疡膜、酶含量2％的糜-胰蛋白酶水溶液和缓冲液溶液的稳定性试验

1.测定方法

以BAEE(苯甲酰精氨酸乙酯)为底物，使用U-2001分光光度计(HITACHI)在253nm波长处检测不同样品中的胰蛋白酶活性。计算依照SIGMA标准(同实施例4)。(BAEE溶于DMSO中，BAEE在3ml检测体系中的浓度为0.5mmol/L)

各样品存放于室温，稳定性试验持续1个月，第一周每天测定1次，之后每周测定1次。

糜-胰蛋白酶水溶液和缓冲液溶液于第1次测定前制备。

2.测定结果：见表6.和图2.

                                                            表6

样品	酶活性保持率
												1d	2d	3d	4d	5d	6d	7d	10d	17d	24d	31d
	3号：2％酶，壳聚糖膜10号：2％酶，蒸馏水PH6.511号：2％酶，缓冲液PH4.012号：2％酶，缓冲液PH8.0	100％100％100％100％	99.8％78.6％70.6％44.3％	100％77.8％62.7％38.6％	99.3％50.6％52.4％25.7％	98.6％38.9％47.6％20.9％	97.4％31.9％46.0％20.5％	96.9％29.6％42.9％17.7％	96.2％7.0％30.2％10.5％	95.0％6.2％27.8％8.0％	92.6％3.1％26.2％8.0％												91.9％0.8％25.4％7.2％

(1)采用固态膜剂型的含酶的口腔溃疡壳聚糖膜，酶活性得以很好的保持，稳定性好。

(2)糜-胰蛋白酶的水溶液和缓冲液样品中，酶活性很快降低，酶溶解于PH6.5的普通蒸馏水后1个月，酶活性降低至第一次测定值的0.8％。

实施例7

不同酶含量，不同糜蛋白酶与胰蛋白酶比例的口腔溃疡壳聚糖膜对实验性豚鼠口腔溃疡治疗后的观察

1.实验方法

(1)豚鼠口腔溃疡模型造模：用一根下端内径3mm的玻璃滴管，内置小棉球，棉球底部与玻璃下口齐平，将管口浸入90％石炭酸溶液至刚浸透小棉球为止，将滴管下端平置于豚鼠右侧口角约4mm处60秒，即见该区直径约3mm的白色损害，次日可见豚鼠口唇边潮湿，流口水，颊粘膜处红肿。

(2)给药与观察：于造模后第1、2、3天溃疡局部给药，每日2次，每日观察并记录溃疡面大小和溃疡愈合情况，并记录每日进食量和体重。第4、5、6、7天停药，继续观察并记录。

2.实验分组：实验动物共分13组，分别为阳性对照组(2组)、阴性对照组(1组)、空白对照组(1组)及实验组(9组)，每组实验动物数6只。

(1)阳性对照组：共2组，分别使用锡类散(南通精华制药有限公司，批号030808)和桂林西瓜霜(桂林三金药业集团公司，批号031033)。

(2)阴性对照组：1组，使用不含酶的壳聚糖膜。

(3)空白对照组：1组，不使用任何药物。

(4)实验组：共9组，分别使用实施例1和2中制备的口腔溃疡膜样品。

(a)实施例1中制备的编号1-5，糜-胰蛋白酶含量分别为0.1％、1.5％、2％、2.5％、10％的口腔溃疡膜样品，其中糜蛋白酶与胰蛋白酶(单位：U)的比例为1.5∶1。

(b)实施例2中制备的编号6-9，糜-胰蛋白酶含量为2％的口腔溃疡膜样品，其中糜蛋白酶与胰蛋白酶(单位：U)的比例分别为200∶1、5∶1、0.1∶1、1∶100。

3.给药剂量：口腔溃疡膜25mm²/次，2次/日。

4.实验结果

(1)采用不同酶含量的口腔溃疡膜进行治疗后豚鼠口腔溃疡面积的变化每日观察后计算溃疡面积占初始溃疡造模面积的百分比，并作图，见图3.

(a)d0即溃疡造模当日的溃疡面积记为100％，次日(d1)用药前可观察到粘膜损伤面积较初始造模面积增大，之后(d2以后)开始逐渐缩小愈合。

(b)0.1％-10％不同酶含量的口腔溃疡膜对溃疡愈合有不同程度的促进作用，溃疡愈合情况明显优于空白对照组及阴性对照组，其中酶含量1.5％、2％、2.5％的实验组的溃疡愈合情况甚至优于锡类散和桂林西瓜霜两个阳性对照组，酶含量2％的壳聚糖膜的促进溃疡愈合作用尤为显著，用药后4天溃疡面积已缩小至初始造模面积的30％以下。

(2)采用酶含量为2％但糜蛋白酶与胰蛋白酶比例不同的口腔溃疡膜进行治疗后豚鼠口腔溃疡面积的变化

每日观察后计算溃疡面积占初始溃疡造模面积的百分比，并作图，见图4.

在酶含量相同的情况下，不同糜蛋白酶与胰蛋白酶比例的口腔溃疡膜中，糜蛋白酶∶胰蛋白酶＝1.5∶1的样品对于促进溃疡面积缩小的作用最显著。

结果总结

上述实验结果表明，含糜-胰蛋白酶的口腔溃疡膜具有优异的治疗口腔溃疡的效果。

含有糜-胰蛋白酶的口腔溃疡膜保持良好的酶活性和稳定性。在动物实验中，可观察到，与阳性对照组相比，含有糜-胰蛋白酶的口腔溃疡壳聚糖膜具有显著的疗效，且明显优于不含有糜-胰蛋白酶的壳聚糖膜。含有糜-胰蛋白酶的口腔溃疡膜施用于创面后，在唾液的作用下粘附于口腔粘膜表面，可有效释放酶成分，充分发挥酶活性，更有效地去除溃疡面的坏死组织。

实施例8

重组表达胰蛋白酶口腔溃疡膜

重组猪胰蛋白酶(货号：03708969001，一种购自Roche公司的用Pichiapastoris菌株重组表达的胰蛋白酶)中不含有其它蛋白酶。使用U-2001分光光度计(HITACHI)，用BAEE法在253nm波长处检测胰蛋白酶活性为11500U。

取上述重组猪胰蛋白酶，按实施例1制备样品，并重复实施例4、6和7的步骤进行了酶活性测定、稳定性试验和动物实验。结果显示用重组猪胰蛋白酶制备的口腔溃疡膜具有良好的酶活性保持率(大于90％)和稳定性，具有明显的疗效，优于阳性对照组。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本中请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种口腔溃疡制剂，其特征在于，它含有：

0.1-40重量份的糜-胰蛋白酶，所述的糜-胰蛋白酶选自下组：糜蛋白酶、胰蛋白酶、或其组合；和

50-99.8重量份的壳聚糖，所述的壳聚糖选自下组：酸溶性壳聚糖、水溶性壳聚糖或其组合；和

0.01-10重量份的有机酸，所述的有机酸选自下组：甲酸、乙酸或其组合；

并且所述的口腔溃疡制剂是固态或半固态剂型。

2.如权利要求1所述的口腔溃疡制剂，其特征在于，所述的糜-胰蛋白酶是糜蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，并且糜蛋白酶：胰蛋白酶的单位比为1∶100至200∶1。

3.如权利要求1所述的口腔溃疡制剂，其特征在于，所述的壳聚糖为酸溶性壳聚糖。

4.如权利要求1所述的口腔溃疡制剂，其特征在于，所述的有机酸为甲酸。

5.如权利要求1-4所述的口腔溃疡制剂，其特征在于，所述的糜-胰蛋白酶的总单位为5000-15000U/mg。

6.如权利要求1-4所述的口腔溃疡制剂，其特征在于，所述的糜-胰蛋白酶的含量为1.5-2.5重量份。

7.一种权利要求1所述的口腔溃疡制剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将壳聚糖用0.5％甲酸溶解，形成壳聚糖胶；和

(b)将糜-胰蛋白酶加入(a)步骤制得的胶中，搅拌均匀，过滤，制得含糜-胰蛋白酶的壳聚糖胶；和

(c)将(b)步骤制得的含糜-胰蛋白酶的壳聚糖胶铺于平板上，干燥成膜。

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