CN1772900A

CN1772900A - 野生稻的一个抗冻基因及其编码蛋白与应用

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Publication number: CN1772900A
Application number: CN 200510068050
Authority: CN
Inventors: 种康; 戴晓燕; 徐云远; 陈大洲; 肖叶青; 许智宏
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2005-05-09
Publication date: 2006-05-17
Anticipated expiration: 2025-05-09
Also published as: CN100400662C

Abstract

本发明公开了野生稻的一个抗冻基因及其编码蛋白与应用。该基因可具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。该基因的编码蛋白可具有下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的SEQ ID №：2；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物抗冻性的蛋白质。本发明的抗冻基因将在培育抗冻性增强的植物(特别是水稻)中发挥重要的作用。

Description

野生稻的一个抗冻基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物中与抗胁迫相关的基因及其编码蛋白与应用，特别涉及野生稻中的一个与抗冻相关的基因及其编码蛋白与其在培育抗冻性提高的植物中的应用。

背景技术

植物的生长受到环境中多种非生物因素的影响，其中冻害及冷胁迫是影响农作物产量的主要因素之一。研究表明大量逆境应答基因的表达是植物获得抗逆性所必需的(Gong et al.，PNAS，99：11507-11512)。目前研究比较清楚的与抗冻相关的途径是DREB1/CBF这条途径，该途径中的转录因子DREB1/CBF(Dehydration-responsiveelement binding protein/C-repeat binding factor)家族通过和顺式作用元件结合，从而激活下游基因的表达(Liu et al.，Plant Cell，10：1391-1406)。但迄今为止，有关DREB1/CBF途径信号转导的研究还未见报道，异源三聚体G-蛋白偶联受体(GProtein-Coupled Receptor)在动物中是一个比较大的家族，参与生命活动中的很多过程，家族的不同成员在蛋白水平上的同源性很低，目前按功能主要分成六类(Kolakowski，Receptors Channels，2：1-7)，但蛋白在空间结构上有一个共同的特点，即都含有7个跨膜区(Anthony，Genome Biology，2：3013.1-3013.10)，异源三聚体G-蛋白偶联受体的研究大多集中在动物中，而有关于植物中GPCR作用的报道很少，仅仅从芯片杂交结果，人们推测异源三聚体G-蛋白偶联受体在抗逆过程中可能具有重要的信号转导作用。

我国江西省东乡普通野生稻(O.rufipogon)是分布在世界上最北端的野生稻品种，蕴含丰富的抗病虫基因和耐冷基因，具有优良的耐冷性、耐旱性、耐瘠性和抗病性等，而且蛋白质含量较高，可利用价值巨大。因此充分利用东乡野生稻的一系列有益基因，在植物育种研究中具有重大价值。此外，拟南芥和水稻基因组测序工作的完成，为利用这些模式植物进行基因功能的研究提供了便利条件。

发明内容

本发明的目的是提供野生稻中的一个抗冻基因及其编码蛋白。

本发明所提供的抗冻基因，名称为OrGPCR,来源于普通野生稻(O.rufipogon)，它可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：1由1407个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1407位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

本发明抗冻基因所编码的蛋白(OrGPCR)，具有下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物抗冻性的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：2由468个氨基酸残基组成。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增OrGPCR中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

利用植物表达载体，将本发明的抗冻基因导入植物细胞，可获得对低温耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用OrGPCR构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明OrGPCR的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也可以是拟南芥、烟草等双子叶植物。

本发明借助芯片技术从东乡野生稻中筛选到的抗冻基因OrGPCR为研究东乡野生稻的抗冻机理和水稻的育种工作提供了理论基础，将在培育抗冻性增强的植物(特别是水稻)中发挥重要的作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为从水稻幼苗总RNA中用RT-PCR法扩增到的OrGPCR cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为OrGPCR植物表达载体pSN：：OrGPCR的物理图谱

图3为转OrGPCR拟南芥阳性苗的PCR鉴定结果

图4为转OrGPCR拟南芥的RT-PCR鉴定结果

图5为转OrGPCR拟南芥经低温胁迫处理后的表型

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、OrGPCR的克隆

对水稻cDNA芯片进行杂交，从抗冻候选基因中挑选到一个经低温诱导后蛋白表达量提高3.7倍的基因(OrGPCR)进行功能验证，根据已知的EST序列从NCBI的(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)和(http：//www.tigr.org)两个网站得到该基因完整的开放阅读框(ORF)序列并根据该序列设计引物：5’端引物为CGC GGATCCATGGGTTGGGGCGCGGTGGTG(带下划线部分碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)；3’端引物为CGG GGTACCTCAATCAATTGGGTGCTTGTC(带下划线部分碱基为限制性内切酶Kpn I识别位点)。以东乡野生稻(O.rufipogon)幼苗经2-3℃处理72小时的总RNA为模板，在上述引物对的引导下，RT-PCR扩增OrGPCR的cDNA序列，具体方法包括以下步骤：

1、总RNA的提取：把在不含激素的1/2MS培养基上生长两周的东乡野生稻幼苗放在低温培养箱中2-3℃处理72小时，用Trizol法(所用试剂购自Invitrogen公司)提取幼苗总RNA，具体方法为：收集上述经低温处理的水稻材料100mg，立即置于液氮中研磨，加入1mL Trizol试剂，充分混匀后，室温放置5分钟；加入0.2mL氯仿，剧烈振摇15秒，室温温育3分钟；4℃，12000g离心15分钟；将上清液转移到一个新的1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇沉淀RNA；最后将RNA沉淀用1mL 75％乙醇洗涤后溶于适量经DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。

2、第一链cDNA的合成：用Superscript^TMII RT试剂盒(Invitrogen)并按试剂盒说明书进行操作：取1-5μg步骤1获得的水稻总RNA放入灭活了RNase的PCR管中，加入Oligo(dT)_12-18(500mg/mL)1μL和dNTP Mix(10mM each)1μL，用DEPC处理后的双蒸水补充至12μL，混匀后在65℃下加热5分钟，然后迅速置于冰上，1分钟。短暂离心后再加入5×第一链反转录缓冲液4μL、0.1M DTT 2μL和RNaseOut^TM(40unit/μL)1μL，轻轻混匀后，42℃温育2分钟，然后加入Superscript^TMII反转录酶(200unit/μL)1μL，混匀，42℃温育50分钟，70℃加热15分钟使酶失活，得到第一链cDNA。

3、OrGPCR cDNA的合成：取1μL步骤2获得的反转录产物为模板，在5’端引物和3’端引物的引导下，用PCR的方法合成OrGPCR的cDNA，PCR反应体系为：LA Taq(TaKaRa公司)0.5μL、2×GC缓冲液I(TaKaRa公司)25μL、dNTP 1μL、5’端引物(10μM/L)1μL、3’端引物(10μM/L)1μL、模板1μL、加双蒸水补充反应体系至50μL。PCR反应条件为：先94℃ 4分钟；再94℃ 45秒，62℃ 45秒，72℃ 2分钟，共35个循环；最后72℃ 10分钟。

反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道1为DL15000DNA Marker，泳道2为OrGPCR的RT-PCR产物，泳道3为阴性对照)，经RT-PCR扩增得到分子量约为L 4kb的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天为时代公司)回收该片段，然后将该回收片段与载体pGEM-T Easy(Promega)进行连接，连接体系为：T₄ DNA连接酶(3u/μL)、2×连接酶缓冲液5μL、pGEM-T Easy(50ng/μL)0.5μL和回收PCR产物3.5μL，4℃反应12-24小时。参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pTOrGPCR。以该质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明OrGPCR具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列，由1407个碱基组成，其开放阅读框(ORF)为自5’端第1-1407位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质，在蛋白水平上的同源性比较结果表明，OrGPCR与动物中研究较多的异源三聚体G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptor)在蛋白水平上的同源性为37％，同时与最近在拟南芥中发现的一个蛋白序列(AAL49849)的同源性可达到70％以上，因而推测OrGPCR可能是一个G蛋白偶联受体。

实施例2、OrGPCR超表达载体pSN：：OrGPCR的构建

1、玉米泛素启动子(UbiPro)的获得

1)玉米基因组DNA的提取：剪取约0.2g玉米幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800μL新配制的提取缓冲液(含0.1M Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1％SDS和1％β-巯基乙醇)，剧烈振荡使其全部悬浮；65℃水浴30分钟，每5分钟颠倒混匀一次；然后加入250μL预冷的5M乙酸钾，立即颠倒混匀，冰浴5分钟；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm离心5分钟；收集上清，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置40分钟；4℃12000rpm离心15分钟，弃上清；沉淀用70％、100％乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μL含100μg/mL RNase的ddH₂O中，得到玉米基因组DNA。

2)PCR扩增玉米泛素启动子(UbiPro)：取2μL步骤1)获得的玉米基因组DNA溶液作为模板，在带有HindIII识别位点的5′引物(GG AAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG)和带有BamHI识别位点的3′引物(CG GGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG)的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃ 3分钟；再94℃ 45秒，62℃ 45秒，72℃ 2分钟，共35个循环，最后72℃ 10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到长度约为2kb的扩增片段，与预期结果相符，回收该目的片段，用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切后回收，得到带有粘性末端的玉米泛素启动子(UbiPro)，备用。

2、用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列从质粒载体pBI 221(Clontech公司)上切下，连接到载体pUC19(TaKaRa公司)的相应位点中，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19-Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化的载体大片段，并将该回收片段与步骤1获得的带有粘性末端的玉米泛素启动子(UbiPro)相连，得到重组载体，命名为pUN19。

3、用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切从步骤2购建的重组载体pUN19切下包含UbiPro和Noster的长度约为2.3kb的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriclture，www.cambia.org)多克隆位点的EcoR I和HindIII位点处，得到重组载体，命名为pUN1301。

4、用限制性内切酶HindIII和BamHI对质粒载体pBI221进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测后回收长度约为0.8kb的35S启动子片段，将其与经相同酶双酶切的质粒载体pUN1301进行连接，得到含有35S启动子片段的重组载体，命名为pSN1301。

5、对重组质粒载体pTOrGPCR和pSN1301分别用限制性内切酶KpnI和BamHI进行双酶切，酶切体系为：质粒10μL、10×酶切缓冲液5.0μL、KpnI 1μL、BamHI 0.8μL，加ddH₂O补充反应体系至50μL，37℃酶切12-24小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收1407bp的OrGPCR片段和12376bp的载体pSN1301大片段，分别溶解于20uL ddH₂O中。再按以下反应体系将两者进行连接：T₄ DNA连接酶2μL、10×连接酶缓冲液2μL、回收的OrGPCR 10μL、回收的pSN1301 6μL，16℃连接16小时。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性菌株，将该重组质粒命名为pSN：：OrGPCR，其物理图谱如图2所示。在该质粒中采用CaMV 35S强启动子启动目的基因OrGPCR在植物中超表达，转基因的获得方法见下述实施例。

实施例3、OrGPCR超表达拟南芥的获得及其鉴定

含有表达载体的农杆菌浸泡转化的植株所结种子以及由该种子长成的植株用T₀代表，T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株。

一、转化有OrGPCR超表达质粒pSN：：OrGPCR的拟南芥的获得

1、OrICLa超表达质粒pSN：：OrGPCR转化拟南芥

用EasyJecT Plus电激仪(英国EquiBio公司)并参照说明书进行操作，将质粒pSN：：OrGPCR用电激法转化农杆菌C58，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到农杆菌的阳性克隆；再参照Clough等的方法(Clough SJ and Bent AF，1998Plant J 16：735-43)，在上述阳性克隆农杆菌的介导下，将pSN：：OrGPCR转化拟南芥。

2、转基因拟南芥阳性苗的抗菌素筛选

将收获的步骤1获得的转基因拟南芥的种子用0.2％ TritonX-100浸泡10分钟；再用10％的次氯酸钠表面消毒，12分钟；灭菌水洗涤五次，每2分钟一次；用水将种子铺在含25mg/L潮霉素的MS平板上，用锡箔纸包裹，在4℃、黑暗条件下放置2天，取出后于22℃的培养室中暗培养3-4天；3-4天后，长势最高的为初筛到的阳性转化苗，在避光条件下取出，光下再培养3天，然后将转基因阳性苗移至花盆中培养，得到T1代转基因材料。

二、转基因拟南芥的鉴定

GUS染色液：100mmol/L磷酸盐pH 7.0，0.1％Triton X-100，10mmol/L EDTA，0.5mmol/L铁氰化钾，X-Gluc 1mg/mL。

Edwards提取缓冲液：200mM Tris-C1pH7.5，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS。

1、拟南芥阳性苗的GUS染色鉴定

取生长3周的步骤1筛选的拟南芥阳性幼苗叶片尖部2-3mm材料进行GUS染色。37℃温育12-24小时，再用75％酒精脱色，叶片呈蓝色的为阳性植株。

2、转基因植株的PCR鉴定

1)基因组DNA的提取

取一片用步骤1的方法鉴定的拟南芥阳性植株的叶片放入1.5mL Eppendorf管中，加入液氮，用组织研磨杵研磨10秒钟，磨碎；加入400μL Edwards提取缓冲液，轻轻研磨(洗去杵上组织)；振荡5秒钟，离心1分钟，转移300μL的上清液到新管中，加入300μL异丙醇，混合，于室温放置2分钟；离心、弃上清，风干沉淀，溶于100μL水中，得到转基因材料的基因组DNA。

2)转基因植株的PCR鉴定

以步骤1)获得的基因组DNA为模板，在引物1(5’引物：ATGGGTTGGGGC GCGGTGGTG)和引物2(3’引物：TCAATCAATTGGGTGCTTGTC)的引导下，用PCR的方法对转基因植株进行鉴定，PCR反应体系为：基因组DNA溶液1μL、LA taq 0.5μL、2×GC缓冲液25μL、dNTP 1μL、引物1(10μM/L)和引物2(10μM/L)各1μL、加双蒸水补充反应体系至50μL。PCR反应条件为：先94℃ 4分钟；再94℃ 45秒，62℃ 45秒，72℃ 2分钟，共30个循环；最后72℃ 10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示(泳道1-4为不同转基因株系，泳道WT为野生型植株)，所有转基因株系都扩出了约1.4kb的阳性条带，与预期大小相符，而野生型则没有，表明目的基因已成功转入拟南芥中。

3、转基因植株的RT-PCR鉴定

分别提取WT和用上述方法检测到的两个转基因株系开花期的总RNA，各取2μg总RNA进行反转录，合成其cDNA，RNA提取和反转录方法参照实施例1中的步骤进行。以此反转录产物为模板，在OrGPCR特异引物(5’引物：CGCGGATCCATGGGTTGGGGCGCGGTGGTG，3’引物：CGGGGTACCTCAATCAATTGGGTGCTTGTC)的引导下，进行RT-PCR检测(以Actin为参照，5’引物：CCCTCTTTGAATTGCCTC，3’引物：CAGGAGCAATACGGAGCT)，PCR反应体系与实施例1同，PCR反应条件为：先94℃ 5分钟；再94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟，共28个循环；最后72℃ 10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示(泳道L6、和L19为两个不同的转基因株系，泳道WT为野生型植株)，所有转基因株系都扩出了清晰的OrGPCR的片段，而野生型则没有，表明OrGPCR已成功转入拟南芥中。

实施例4、低温胁迫处理后的OrGPCR转基因拟南芥的表型

对OrGPCR转基因拟南芥幼苗进行低温胁迫处理，观察它的抗冻性。具体方法为：将生长3周的盆栽OrGPCR转基因拟南芥幼苗先在4℃下冷训化一周，然后分为两组分别在-8℃下低温处理5.5小时和6小时，再将苗置于22℃恢复培养3天观察其表型特征，结果如图5所示(A：在-8℃下低温处理5.5小时的野生型植株；B：在-8℃下低温处理5.5小时的转基因植株；C：在-8℃下低温处理6小时的野生型植株；D：在-8℃下低温处理6小时的转基因植株)，表明OrGPCR转基因拟南芥具有明显的低温胁迫抗性。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1407

<212>DNA

<213>普通野生稻(O.rufipogon)

<400>1

atgggttggg gcgcggtggt gtacgggggc ggcgtggtgg gggcgtcgct ggtggggctc 60

ggctgggcgg ggctgtggtt cctcaaccgg cggctgtaca aggagtacga ggagcggcgg 120

gcgctggtgc agatcctctt cggcctcgtc ttcgccttct cctgcaacct cttccagctc 180

gtcctcttcg agatcctccc cgtcctctcc aagcacgccc gcttcctcaa ctggcacctc 240

gacctcttct gcctcatcct cctcctcgtc ttcgtcctcc cctactacca ctgctacctg 300

ctgctgcgca actcaggggt gcggagggag cgggctctgc tcgtcgcggc gctgttcctg 360

ctggtcttcc tctatggctt ctggcgcatg gggattcatt tccccatgcc ttctccggaa 420

aaagggtttt tcacgatgcc ccagttggtt agtaggattg gcgtgattgg agtaagtgtc 480

atggctgttc tttctggttt tggtgccgtc aatctgcctt acagctatct gtcactgttt 540

atcagggaaa ttgatgaaaa ggacatcaaa acattggaaa ggcagctcat gcaatccatg 600

gagacatgca tcgctaagaa aaagaaaatt gttctgtcca aaatggagat ggagaggatt 660

caaggatcag aagagaagct aaaagccaga tcatttctaa agcgtatcgt tgggacagtt 720

gttcgatctg tgcaagaaga tcaaactgag caggatatca aaagcttgga tgcagaggtc 780

caggcactag aagaactttc caaacaacta tttcttgaga tatatgaact ccgtcaagca 840

aagatagctg ctgcgttttc tcgaacttgg agaggccatg ctcagaatct actaggatat 900

gctttgtcag tgtattgtgt ttataagatg ctcaagtcct tgcagaatgt tgtctttaaa 960

gaggcaggtt ctgttgatcc agtaaccatg acaattacca tcttcttgag gcattttgac 1020

attggtattg atgtcactct tttatcacag tatatatctc tcatatttat cgggatgttg 1080

gttgtcatat ctgttcgagg tttcttggca aatgttatga agttcttctt tgctgtttct 1140

agagttggga gtggttcaac aaccaatgtt gtcctttttc tatctgagat catgggaatg 1200

tacttcatat catctattct tctcataagg aaaagcctgg caaatgagta tagggtgatc 1260

attacagatg ttttgggtgg cgatatccag ttcgactttt accaccgctg gtttgatgct 1320

atatttgtgg ctagtgcatt tctgtccttg cttctgattt ctgcccaata cacctcccgg 1380

caaacagaca agcacccaat tgattga 1407

<210>2

<211>468

<212>PRT

<213>普通野生稻(O.rufipogon)

<400>2

Met Gly Trp Gly Ala Val Val Tyr Gly Gly Gly Val Val Gly Ala Ser

1 5 10 15

Leu Val Gly Leu Gly Trp Ala Gly Leu Trp Phe Leu Asn Arg Arg Leu

20 25 30

Tyr Lys Glu Tyr Glu Glu Arg Arg Ala Leu Val Gln Ile Leu Phe Gly

35 40 45

Leu Val Phe Ala Phe Ser Cys Asn Leu Phe Gln Leu Val Leu Phe Glu

50 55 60

Ile Leu Pro Val Leu Ser Lys His Ala Arg Phe Leu Asn Trp His Leu

65 70 75 80

Asp Leu Phe Cys Leu Ile Leu Leu Leu Val Phe Val Leu Pro Tyr Tyr

85 90 95

His Cys Tyr Leu Leu Leu Arg Asn Ser Gly Val Arg Arg Glu Arg Ala

100 105 110

Leu Leu Val Ala Ala Leu Phe Leu Leu Val Phe Leu Tyr Gly Phe Trp

115 120 125

Arg Met Gly Ile His Phe Pro Met Pro Ser Pro Glu Lys Gly Phe Phe

130 135 140

Thr Met Pro Gln Leu Val Ser Arg Ile Gly Val Ile Gly Val Ser Val

145 150 155 160

Met Ala Val Leu Ser Gly Phe Gly Ala Val Asn Leu Pro Tyr Ser Tyr

165 170 175

Leu Ser Leu Phe Ile Arg Glu Ile Asp Glu Lys Asp Ile Lys Thr Leu

180 185 190

Glu Arg Gln Leu Met Gln Ser Met Glu Thr Cys Ile Ala Lys Lys Lys

195 200 205

Lys Ile Val Leu Ser Lys Met Glu Met Glu Arg Ile Gln Gly Ser Glu

210 215 220

Glu Lys Leu Lys Ala Arg Ser Phe Leu Lys Arg Ile Val Gly Thr Val

225 230 235 240

Val Arg Ser Val Gln Glu Asp Gln Thr Glu Gln Asp Ile Lys Ser Leu

245 250 255

Asp Ala Glu Val Gln Ala Leu Glu Glu Leu Ser Lys Gln Leu Phe Leu

260 265 270

Glu Ile Tyr Glu Leu Arg Gln Ala Lys Ile Ala Ala Ala Phe Ser Arg

275 280 285

Thr Trp Arg Gly His Ala Gln Ash Leu Leu Gly Tyr Ala Leu Ser Val

290 295 300

Tyr Cys Val Tyr Lys Met Leu Lys Ser Leu Gln Asn Val Val Phe Lys

305 310 315 320

Glu Ala Gly Ser Val Asp Pro Val Thr Met Thr Ile Thr Ile Phe Leu

325 330 335

Arg His Phe Asp Ile Gly Ile Asp Val Thr Leu Leu Ser Gln Tyr Ile

340 345 350

Ser Leu Ile Phe Ile Gly Met Leu Val Val Ile Ser Val Arg Gly Phe

355 360 365

Leu Ala Asn Val Met Lys Phe Phe Phe Ala Val Ser Arg Val Gly Ser

370 375 380

Gly Ser Thr Thr Asn Val Val Leu Phe Leu Ser Glu Ile Met Gly Met

385 390 395 400

Tyr Phe Ile Ser Ser Ile Leu Leu Ile Arg Lys Ser Leu Ala Asn Glu

405 410 415

Tyr Arg Val Ile Ile Thr Asp Val Leu Gly Gly Asp Ile Gln Phe Asp

420 425 430

Phe Tyr His Arg Trp Phe Asp Ala Ile Phe Val Ala Ser Ala Phe Leu

435 440 445

Ser Leu Leu Leu Ile Ser Ala Gln Tyr Thr Ser Arg Gln Thr Asp Lys

450 455 460

His Pro Ile Asp

465

Claims

1、野生稻的一个抗冻基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2、根据权利要求1所述的抗冻基因，其特征在于：所述抗冻基因具有序列表中SEQ ID №：1的DNA序列。

3、权利要求1所述抗冻基因编码的蛋白，其特征在于：是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

4、根据权利要求3所述的蛋白，其特征在于：所述蛋白具有序列表中的SEQ ID №：2氨基酸残基序列。

5、含有权利要求1所述抗冻基因的表达载体。

6、含有权利要求1所述抗冻基因的转基因细胞系。

7、含有权利要求1所述抗冻基因的宿主菌。

8、一种培育抗冻植物的方法，是利用植物表达载体将权利要求1所述的抗冻基因导入植物细胞，获得对低温耐受力增强的的转基因细胞系及转基因植株。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述被转化的植物宿主为水稻。