CN1771044B

CN1771044B - 施用铁治疗不安腿综合征的组合物

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Publication number: CN1771044B
Application number: CN038260972A
Authority: CN
Inventors: M·J·赫勒内克; R·A·朗格; F·B·奥尔德哈姆; M·L·托卡斯
Original assignee: Vifor International AG
Current assignee: Vifor International AG
Priority date: 2003-03-14
Filing date: 2003-05-13
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2023-05-13
Also published as: JP2010180252A; IL170386A; KR20060082032A; CY1110407T1; AU2003249635A1; PL206810B1; KR100978377B1; CN1771044A; US20040180849A1; PT1603580E; DE60322121D1; JP2006520322A; AU2003249635B2; RS20050695A; MXPA05009786A; RU2319490C2; ZA200508308B; ES2309403T3; RS51823B; EP1603580B1

Abstract

一种治疗不安腿综合征的方法，包括施用受治疗者释放率高于IDI的铁复合物。铁释放率在至少2,000μg/dl的浓度下测定。

Description

施用铁治疗不安腿综合征的组合物

背景

不安腿综合征

受不安腿综合征(RLS；也称作Ekbom′s综合征)严重折磨的受害者，实际上不能保持坐着或者甚至不能静止地站立。需要保持运动静止和受限制的认知刺激的活动，如乘坐运输工具(汽车、飞机、火车等)或者参加较长时间的会议、演讲、电影或其它演出，变得很困难，如果可能的话。由于这些在夜里变得更严重的感觉的折磨，RLS患者发现睡眠实际上是不可能的，继而降低了他们的生活质量。运动的迫切要求，其随着休息时间的增加而增强，可能会通过运动完全消失，如步行。然而，一旦运动停止，症状又重新出现，强度增强。如果强迫RLS患者躺着静止不动，症状将继续发展象一个负重的弹簧，最后腿将不随意的运动，症状立即就缓解。如果患者试图保持躺着，那么将观察到腿有节奏的或半有节奏的运动(Pollmacher和Schulz1993)。这些运动被称作清醒状态的运动障碍(DWA)(Hening等，1986)或者更普通地，清醒状态的周期性肢体运动(PLMW)。

临床上，当符合4个诊断标准时提示是RLS：(1)迫切要求运动肢体(通常是腿)的感觉；(2)运动不安以降低感觉；(3)当在休息时，症状重新出现或者恶化；和(4)在发生RLS症状或症状严重时昼夜节律显著改变；也就是说，症状在晚上和夜间恶化(Allen和Earley 2001a)。由Willis在1685年首先认识，RLS一直被误解并与睡眠中周期性肢体动作(PLMS；其可能是RLS的一部分，但是不能定义RLS)、周期性肢体运动障碍(PLMD；睡眠障碍)和夜间(或睡眠)肌痉挛相混淆(Allen和Earley 2001a)。

在RLS中铁和多巴胺浓度是紧密相关的因素

在RLS中脑内铁缺乏和多巴胺合成降低是重要因素(Ekbom1960，Nordlander 1953)。多巴胺是在脑内合成的神经递质，其对于正确的中枢神经系统(CNS)功能是必需的。在多巴胺的合成中，铁是酪氨酸羟化酶的辅因子，其是多巴胺代谢中的限速步骤(Cooper等，1991)。多巴胺能系统中的铁似乎在RLS病理生理学中是一个重要的成分(Chesson AL等，1999，Ekbom 1960，Hening等，1999，Montplaisir等，1991)。

因为铁是多巴胺合成中酪氨酸羟化酶的辅因子，因此多巴胺减少。当向脑中有过量铁的大鼠施用鳌合物(结合金属如铁的物质，使它们成为生理上不能利用的)时，它们有效减少多巴胺和多巴胺周转(Ward等，1995)。铁缺乏的动物中的研究也已经证明多巴胺受体(Ben-Shachar等，1985，Ward等，1995)，多巴胺转运蛋白功能和受体密度降低而细胞外多巴胺升高(Erikson等，2000，Nelson等，1997)。大鼠中所观察到的这些情况也在RLS患者中观察到。例如，在基底神经节中观察到多巴胺受体减少(Staedt等，1995，Turjanski等，1999)。RLS患者脑脊液(CSF)铁蛋白(一种重要的铁贮藏蛋白)低于正常的65％并且CSF转铁蛋白(血液和体液中的铁转运蛋白)高于正常三倍，尽管在RLS和对照中铁蛋白和转铁蛋白的血清水平正常(Earley等，2000)。铁浓度在整个脑内有不同；RLS患者在黑质和脑的壳部分中铁较少，两者都是多巴胺合成的位置。(Allen等，2001)。总之，铁蛋白水平降低表明RLS严重(O′Keeffe等，1994，Sun等，1998)。这些观察资料表明脑转运或贮藏铁的能力在特发性RLS(没有明显原因的RLS)中异常。

治疗RLS

当前对RLS的治疗是不同的并且受不良副作用(见表1)烦扰。治疗包括施用多巴胺激动剂(促进产生多巴胺的物质)、其它多巴胺能试剂、苯二氮卓类、阿片制剂和抗惊厥剂。在由继发情况导致的RLS病例中，如妊娠、肾疾病的终末阶段、红细胞生成素(EPO)治疗和铁缺乏，除去这种情况，如分娩或者常规补充铁的治疗，至少在一些疾病中可减少或消除症状(Allen和Earley 2001a)。然而，由非继发情况导致的RLS(“特发性”RLS)，提出了更大的治疗挑战。

多巴胺能剂如左旋多巴通常提供有效的最初治疗，但是随着继续使用，在约80％的RLS患者中发生耐受和症状增加(Allen和Earley1996)；这种并发症对于多巴胺激动剂也常见(Earley和Allen 1996，Silber等，1997)。其它供选择的药物，苯二氮卓类、阿片制剂和抗惊厥剂不是与多巴胺剂一样有效(Chesson AL等，1999，Hening等，1999)。尽管它们的治疗方案有变化，但是由于副作用和有限的疗效，15-20％的患者发现所有的药物治疗都是不充分的(Earley和Allen1996)。

由于铁和多巴胺合成之间的联系，施用铁似乎对提高体内铁贮存量将是一种简单并安全的治疗。显而易见的选择是口服施用铁，因为这种施用方式是简单和便宜的。实际上，铁缺乏的RLS患者对口服补充铁剂反应显著(Ekbom1960，O′Keeffe等，1994)。然而，在血清铁蛋白水平正常的RLS患者中，口服铁治疗的好处不利地降低到基线血清铁蛋白水平：在开始治疗时铁蛋白水平越高，这种好处就越不显著(O′Keeffe等，1994)。这种提高铁贮存量的方法是无效的，因为肠上皮控制铁吸收，不对多巴胺合成反应，但对血清铁水平反应(Conrad等，1999)。因此，铁的口服剂量是无效的，并且不耐受。当血清铁蛋白水平正常时为了增加体内铁的贮存量，需要使用绕过肠上皮控制的方法。例如，在慢性疾病引起的贫血中，铁吸收和转运受到显著损害，被提高的血清铁蛋白水平不再准确地反映体内所贮存的铁的水平。同样地在慢性疾病所导致的贫血中，向丧失的系统递送适当的铁用于红细胞生成的唯一有效的方法是通过静脉内施用。

静脉内施用铁对于血清铁蛋白水平正常的那些RLS患者来说绕过了通过口服施用铁的问题和无效，实际上，静脉内施用右旋糖酐铁溶液，如INFeD0

(Watson Pharma，Inc.；Corona，CA(具有平均表观分子量165,000g/摩尔，大约±10％的范围)，和Dexferrum

(American Regent Inc.，Shirley，NY)(共同称作“IDI”)成功地治疗RLS。然而，剂量很高(1000mg/施用)；或者高于通常用于治疗其它情况时所用剂量的大约2到10倍。尽管IDI给一些RLS患者带来了希望，但是其也带来明显的缺点：不仅剂量很高，而且在约1.7％的人群中右旋糖酐引起过敏反应(Fishbane等，1996)，一种威胁生命的情况；患过敏反应的那些人中有大约50％以下的人死亡。

概述

在第一个方面，本发明是一种治疗不安腿的方法，包括施用受治疗者铁释放率比IDI高的铁复合物。在至少2,000μg/dl的浓度测定铁释放率。

在第二个方面，本发明是一种治疗不安腿的方法，包括施用受治疗者通过氧化铝柱试验，在3438μg/dl的浓度时铁释放率至少115g/dl的铁复合物。

在第三个方面，本发明是一种治疗不安腿的方法，包括施用IDI，改良包括用释放率比IDI更高的铁复合物代替IDI。

在第四个方面，本发明是一种试剂盒，包括释放率高于IDI的铁复合物组合物、注射器，以及用于注射器的针头。在至少2,000μg/dl的浓度测定铁释放率。

附图描述

图1显示使用葡萄糖酸铁(也称作溶于蔗糖中的葡萄酸铁钠复合物或Ferrlecit；Watson Pharma，Inc.；Corona，CA)、蔗糖铁(Venofer

(蔗糖铁注射剂USP)American Regent Inc.；Shirley，NY)、右旋糖酐铁(INFeD；Watson Pharma，Inc.)，和其它右旋糖酐铁(Dexferrum；American Regent Inc.)的静脉注射制剂，血清中转铁蛋白结合的铁相对于所添加铁量的变化(Δ铁)。X轴，所添加的元素铁(μg/dl)；Y轴，Δ铁(μg/dl)。

详述

本发明利用铁释放率高于IDI的铁复合物在较低剂量时对于RLS的治疗具有与IDI同样效果的发现。当静脉施用时这些铁复合物避免与IDI相关的过敏反应的危险，这种过敏反应是由于存在抗其它铁复合物中不存在的右旋糖酐部分的抗体，而且由于较高的释放率，可降低治疗剂量。

这种铁复合物的一个实例是Venofer

(蔗糖铁注射剂USP)，一种过敏性样反应的发生率为0.0046％的蔗糖铁复合物(即，20,000人中有一个人发生；IDI的过敏反应的发生率为1.7％，或者几乎100个人中有两个人发生)。然而，释放率高于IDI的任何铁复合物都是有效的RLS治疗剂。

用于治疗RLS的铁组合物

铁复合物是含有(II)或(III)氧化状态的铁的化合物，其与有机化合物复合。这些包括铁聚合物复合物、铁碳水化合物复合物，以及铁aminoglycosan复合物。这些复合物可买到，或者具有公知的合成法(见，例如，(Andreasen和Christensen 2001，Andreasen和Christensen 2001，Geisser等，1992，Groman和Josephson 1990，Groman等，1989))。

铁碳水化合物复合物的实例包括铁单简糖复合物、铁寡糖复合物，以及铁多糖复合物，如：蔗糖铁、多聚异麦芽糖铁(右旋糖酐铁)、多聚麦芽糖铁(糊精铁)、葡萄糖酸亚铁、山梨糖醇铁、氢化右旋糖酐铁，其可进一步与其它化合物复合，如山梨糖醇、柠檬酸和葡糖酸(例如糊精-山梨糖醇-柠檬酸铁复合物和蔗糖-葡糖酸铁复合物)，以及它们的混合物。

铁aminoglycosan复合物的实例包括硫酸软骨素铁、硫酸皮肤素铁、硫酸角质素铁，其可进一步与其它化合物复合以及它们的混合物。

铁聚合物复合物的实例包括透明质酸铁复合物、铁蛋白复合物，以及它们的混合物。铁蛋白复合物包括铁蛋白、转铁蛋白，以及具有氨基酸取代的铁蛋白或转铁蛋白，以及它们的混合物。优选的，铁复合物具有至少30,000的分子量，更优选地通过HPLC/CPG测定的30,000到100,000(如在Geisser等1992中所描述的)。优选地，铁复合物的大小最大为0.1微米，更优选地0.035到0.1微米，通过过滤测定。

最优选的铁复合物是蔗糖铁(蔗糖铁注射剂USP，Venofer

)。这种组合物也避免与较小糖分子，尤其是葡萄糖酸相关的毒性问题，其具有很高的铁释放率。蔗糖铁组合物用最佳铁释放率平衡这些毒性问题。

测定铁复合物铁释放率

本发明利用可在较低剂量有效施用铁释放率比IDI高的铁复合物的发现。IDI的铁释放率是69.5-113.5μg/dl。在本发明中，铁复合物在至少2000μg/dl，包括2000、3000、3500、5000、和10,000μg/dl的浓度时必须具有至少115μg/dl的释放率。优选地，至少120μg/dl，更优选地，至少140μg/dl。可实施两个试验测定铁释放率，如Esposito等(2000)和由Jacobs等(1990)所述。

“鳌合剂试验”(Esposito等，2000)

候选铁复合物的释放率是候选复合物将铁捐赠给脱铁运铁蛋白或铁鳌合剂，如去铁胺的能力。为了检测这种转移，可使用探针荧光素-转铁蛋白(Fl-Tf)和荧光素-去铁胺(Fl-DFO)，一旦结合到铁上其遭受淬灭(Breuer和Cabantchik 2001)。简而言之，该方法包括用10mM草酸盐将铁从血清中动员出来并且将其转移到金属传感器(metallosensor)荧光素化脱铁运铁蛋白(Fl-aTf)。在试验中存在镓以避免不稳定的血浆铁结合样品中未标记的脱铁运铁蛋白。不稳定的血浆铁的值来自荧光素化脱铁运铁蛋白的荧光信号淬灭的值。可使用例如，96孔板和平板阅读器，在485/538nm激发/发射滤波器对(增益＝25)测量荧光。

“氧化铝柱试验”(Jacobs等，1990)

在这个试验中，将样品(血清和候选的铁组合物)通过氧化铝柱以吸收有机的和药物结合的铁，然后收集洗脱液并重构到预先选择的体积(例如，1.5ml)，最终的铁浓度使用化学分析器，如Hitachi 717化学分析器进行测定。使用Ferrozine试剂，其包括去污剂、柠檬酸和硫脲的缓冲液、抗坏血酸盐，以及ferrozine。这个试验是一种非蛋白化(proteinizing)的方法，其中去污剂使脂血样品澄清，缓冲液将pH降低到＜2.0以便从转铁蛋白中以Fe³⁺的形式释放铁，抗坏血酸盐将Fe³⁺还原成Fe²⁺，ferrozine与Fe²⁺反应形成有色复合物，在560nm处通过分光光度法进行测量。这个结果来自从实验样品读数中减去对照(空白)样品的值，结果记做ΔTf-结合的铁(μg/dl)。

药学组合物

在许多情况中，铁复合物可作为包括铁复合物和溶解该复合物的缓冲液的简单组合物施用。然而，可添加其它产品，如果期望的话，使铁输送、保藏最大化，或者优化特定的输送方法。

“药学可接受的载体”包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂等(Gennaro2000)。优选的这种载体或稀释剂的实例包括，但不限于，水、盐、Ringer′s乳酸溶液和葡萄糖溶液。也可将补充的活性化合物掺入到组合物中。对于静脉内施用，优选将Venofer

在生理盐水中稀释到大约2-5mg/ml。药物溶液的体积是基于每个患者的安全体积，由医学专业人员决定。

全面考虑

将用于施用的本发明的铁复合物组合物制成与打算的施用途径，如静脉内注射相容的形式。用于肠胃外、真皮内或皮下应用的溶液和悬液可包括无菌稀释剂，如注射用水、盐溶液、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及调整张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。pH可用酸或碱调整，如盐酸或氢氧化钠。制剂可装入安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的多倍剂量小瓶中。

适于注射的药物组合物包括用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌水溶液或分散体。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CREMOPHOR ELTM(BASF；Parsippany，N.J.)或磷酸缓冲盐(PBS)。组合物必需是无菌的，并且应当是流体以便可使用注射器施用。这种组合物在生产和贮藏期间应当是稳定的并且一定抗微生物，如细菌和真菌污染保藏。载体可以是分散介质，含有例如，水、多元醇(如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇)，以及其它相容的，合适的混合物。各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，苯甲醇、对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、酚、抗坏血酸，和硫柳汞，可能含有微生物污染。组合物中可包括等张剂如糖、多元醇、如甘露醇、山梨醇，和氯化钠。可延迟吸收的组合物包括如单硬脂酸铝和明胶的试剂。

可通过将溶于适当溶剂中的所需量的铁复合物与如所需的单一或组合成分混合，随后通过灭菌制备无菌可注射的溶液。制备用于制备无菌可注射溶液的无菌固体的方法包括真空干燥和冷冻干燥以产生含有铁复合物和任何其它所期望成分的固体。

全身施用

全身施用可以是经粘膜或经皮。对于经粘膜或经皮施用，可选择能渗透靶屏障的渗透剂。经粘膜的渗透剂包括，去污剂、胆盐、以及梭链孢酸衍生物。鼻喷雾剂或栓剂可用于经粘膜施用。对于经皮施用，将活性化合物制成软膏、油膏、凝胶，或乳膏。

载体

活性化合物可与保护化合物避免被从体内迅速清除的载体一起制备，如控制释放的制剂，包括植入物和微囊化的施用系统。可使用生物可降解的或生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙二醇酸(polyglycolic acid)、胶原、聚原酸酯，和聚乳酸。这样的材料可从ALZA公司(Mountain View，CA)和NOVA Pharmaceuticals，Inc.(Lake Elsinore，CA)买到，或者通过本领域技术人员制备。

药物组合物的试剂盒

铁复合物组合物可被包括在试剂盒、容器、包或分液器中，与施用说明一起。当本发明是以试剂盒提供时，组合物的不同组分可被包装在独立的容器中，如安瓿或小瓶，使用前直接混合。组分的这种独立包装可允许长期贮藏而不损失组分的活性。

试剂盒也可包括独立容器中的便于完成特殊试验的试剂，如诊断试验。

容器

可在任何种类的容器中提供试剂盒中所包括的试剂，以便保持不同组分的寿命并且不被容器的材料吸附或改变。例如，密封的玻璃安瓿或小瓶可包含在中性非反应性气体，如氮气下包装的冷冻干燥的铁复合物或缓冲液。安瓿可由任何合适的材料构成，如玻璃，有机聚合物，如聚碳酸酯、聚苯乙烯等，陶瓷，金属或者典型地用于容纳试剂的任何其它材料。合适容器的其它实例包括由相似物质制造的瓶，如安瓿，和由用箔作衬里的内部构成的包袋，如铝或合金。其它容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶、注射器等。容器可具有无菌入口部分，如一种具有可被皮下注射器针头刺穿的塞子的瓶。其它的容器可具有被很容易地移去的膜分隔的两个隔室，一旦去除，允许组分混合。可移去的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。

指导性材料

试剂盒也可与指导性材料一起提供。使用说明可被印在纸或其它物质上，和/或在可读的电子介质上提供，如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、微型盘、SACD、Zip盘、录象带、录音带等。详细的使用说明可能不与试剂盒物理结合；相反，使用者可在由试剂盒的生产商或经销商指定的国际互联网站上获得指导，或者以电子邮件方式提供使用说明。

用铁释放率比IDI高的组合物治疗RLS的方法

用铁释放率高于IDI的铁复合物组合物治疗RLS的方法包括施用该复合物，在预先确定的时间间隔施用剂量或者对RLS症状的出现和再现作出剂量调整。总的来说，剂量取决于施用的途径。优选的施用途径是静脉内输入；然而，某些铁化合物可肌肉内施用如右旋糖酐铁。然而，任何途径都是可接受的，只要铁能从铁复合物中迅速释放(比静脉内施用的IDI更迅速)，这样可治疗RLS症状。

适当的剂量水平通常将是每剂量约10mg到1000mg元素铁，其可以单剂量或多剂量施用，特别地每次施用至少1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0、1000.0、和2000.0毫克元素铁，而且直到每次给药最大耐受剂量(MTD)。优选地，剂量水平将是每剂量约0.1到1000mg；最优选地每剂量约100mg到约500mg。化合物可以各种方案施用(见实施例3)。

例如，以单剂量(以1.5-5mg铁/ml生理盐水)施用RLS患者含有1000mg元素铁的可静脉内注射的蔗糖铁复合物(Venofer)。单次静脉内治疗将延长症状缓解的时间，大约2到12个月(Nordlander1953)，尽管认为缓解的时间可能较短或较长。如果期望的话，可通过使用MRI测量CSF铁蛋白(和其它铁相关的蛋白)和脑内铁贮藏量监控输入后CNS中铁状态的改变。使用标准的主观的(例如，患者日记、等级表)和客观的(例如，P50、SIT、腿活动计)方法测量临床状态，评价RLS患者的输入后变化。如果期望的话，为了更好地评价RLS症状改善的程度，在治疗前，大约治疗后两周，以及12个月后或者当症状重新出现时，获取CSF和血清铁的值，脑内铁的MRI测量值以及睡眠和固定试验的全部临床评价。治疗后每月获取临床等级，腿活动计记录和血清铁蛋白。CSF铁蛋白变化也可用于评价症状消失的程度。在实施例2和其中所引用的参考资料中提供更多的细节。

施用的频率取决于每个患者的反应和所给元素铁的量。合适的施用方案将是每周一次到每18个月一次，更优选地每两个月到12个月一次，或者任何时间间隔之间，如每两个月一次和一天，3、4、5、6、7、8、9、10和11个月一次。可选择地，可特定施用铁复合物，也就是说，由于症状再次出现，只要实施的医学专业人员注意安全预防。

然而，应当被理解的是，对于任何特定患者来说具体的剂量和施用频率可变化，取决于各种因素，包括所使用的铁复合物的活性、该复合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、总的健康状况、性别、饮食、施用的方式和时间、排泄率、药物组合、特定疾病的严重性，以及宿主正在接受的治疗。

实施例

提供下列实施例用于举例说明本发明。本领域技术人员可很容易地对本发明的组合物和方法进行无关紧要的改动。实施例不意味着以任何方式限制本发明。

实施例1铁释放率

静脉内铁剂先经过细胞内摄入，加工以及可控制的释放，间接地将铁捐赠给转铁蛋白。然而，静脉内铁剂的许多不利的反应是剂量相关的，剂量限制的并且随试剂的种类而变化的证据支持可能也发生直接捐赠的假说。静脉内施用足够剂量的铁可使铁结合能力短暂地过饱和，这些试剂它们直接捐赠铁的潜力可变化。

体外测定候选铁复合物(葡萄糖酸铁(也称作溶于蔗糖中的葡萄酸铁钠复合物，Ferrlecit))的静脉注射制剂、蔗糖铁(蔗糖铁注射剂USP，Venofer)以及右旋糖酐铁(INFeD

和Dexferrum)的两种可获得的制剂将铁捐赠给血清中转铁蛋白的能力。将铁剂的系列稀释液加到新鲜血清中，通过氧化铝柱除去铁-糖复合物，测定得到的洗脱液中转铁蛋白结合的铁。

这种测定用比色分析血清中转铁蛋白结合的铁，可靠地排除了铁剂和无机铁的干扰(Jacobs和Alexander 1990)。

肠胃外铁制剂

使用5ml安瓿中12.5mg/ml的溶于蔗糖的葡萄糖酸铁复合物，Ferrlecit(Watson Pharmaceuticals，Inc，Corona，CA)、蔗糖铁(5ml小瓶中20mg/ml，蔗糖铁注射剂USP，Venofer；AmericanRegent Inc.，Shirley，NY)以及右旋糖酐铁的两种制剂(INFeD

；Watson Pharmaceuticals，Inc，Corona，CA；和Dexferrum；AmericanRegent Inc.，Shirley，NY；两者都是在2ml小瓶中，100mg/ml)。

对于每个实验，在同一天检查在所有实验浓度的所有试剂。对于铁剂的每个浓度，在使用的那一天配制等摩尔贮存液，在0.9％ NaCl中连续稀释(≤1∶10)。

实验的铁浓度

静脉内推注125mg葡萄糖酸铁(1900μg/dl；(无名的2001))、100mg蔗糖铁(3,000μg/dl(Danielson等，1996))或者100mg右旋糖酐铁(3,080到3,396μg/dl，文献上的数据，American Regent Inc.，Shirley，NY)后，我们在预计包括试剂的最大血浆浓度(C_max)的范围中检查铁制剂的浓度。

测定转铁蛋白结合的铁

使用Jacobs等的方法测定血清转铁蛋白所结合的铁的量(Jacobs和Alexander 1990)。将0.1ml贮存的铁制剂溶液加到1.5ml新鲜汇集的血清中并孵育5分钟。将样品通过2.0g氧化铝柱以吸收有机的和药物结合的铁，收集洗脱液并重构到1.5ml的总体积，使用Hitachi 717化学分析器(Boehringer Mannheim Corporation；Indianapolis，IN)测定最终的铁浓度。使用Hitachi指定的ferrozine试剂(Boehringer)，其包括去污剂、柠檬酸和硫脲的缓冲液、抗坏血酸盐，以及ferrozine。简要地，这是一种非蛋白化(non-proteinizing)的方法，其中去污剂使脂血样品澄清，缓冲液将pH降低到＜2.0以便从转铁蛋白中以Fe³⁺的形式释放铁，抗坏血酸盐将Fe³⁺还原成Fe²⁺，ferrozine与Fe²⁺反应形成有色复合物，在560nm处通过分光光度法进行测量。这个结果来自从实验样品读数中减去对照(空白)样品(0.1ml 0.9％NaCl加上1.5ml血清，不添加铁剂)的值，结果记做ΔTf-结合的铁(μg/dl)。

观察到下列结果，并且在下面的表2中和以图示在图1中(X轴，所添加的元素铁(μg/dl)；Y轴，Δ铁(μg/dl)；G，葡萄糖酸盐；S，蔗糖；D，dexferrum；I，INFeD)表示：

(1)柱提取除去所有静脉内铁剂的无血清样品中＞99％的可检测到的铁；

(2)Δ铁随着每种所添加的试剂的量而增加；和

(3)在四种试剂中，Δ铁反应以剂量相关的方式不同。

表2

实施例2诊断和评价RLS症状和监控治疗的试验

提供下列试验以帮助评价RLS的诊断和治疗。医疗从业者将选择适于每个特定患者的那些试验。在许多情况中，监控RLS的诊断标准将足以评价治疗功效。

诊断因素当符合四个诊断标准时提示是RLS：(1)迫切要求运动肢体(通常是腿)的感觉；(2)运动不安以降低感觉；(3)当在休息时，症状重新出现或者恶化；和(4)在发生RLS症状或症状严重时昼夜节律显著改变；也就是说，症状在晚上和夜间恶化(Allen和Earley 2001a)。

Johns Hopkins RLS严重程度表(JHRLSS)(Allen and Earley2001b)这种四点表(0-3对应于无症状到症状严重)基于通常发生RLS症状那天的时间。基于这个表的严重程度可来自有组织的诊断性的临床面谈(见下面)；这个表最常用于描述特性，不作为治疗结果的衡量标准。

有组织的诊断性的临床面谈和诊断性调查表

这些是由经过训练的人员或患者(自我管理的)用于描绘RLS症状学的标准的，生效的工具。可向潜在的RLS患者询问的类型和问题参考表3。

表3：有组织的诊断性的临床面谈和诊断性调查表

RLS生活工具(RLS-QLI，RLS Foundation May1，2002)的质量
	IRLSSG不安腿综合征等级表
SF-12健康调查
	疲劳严重程度表
Epworth睡眠表

睡眠-RLS日志(Earley等，1998)这个日志由RLS患者保存并在临床医生要求的时间期间当发生RLS症状和睡眠时进行记录。

CNS和血液铁状态取样(腰椎穿刺和血液样本方法)

腰椎穿刺是使用无菌技术在L4/L5或L5/S1腰椎间隙之间进行。以1ml等分试样收集10ml CSF。使用标准技术从这些样品中测定铁、铁蛋白ceruloplasm和转铁蛋白浓度。

在腰椎穿刺的时候，也采集10ml血液。然后将血清用于测定铁、铁蛋白、总铁结合力(TIBC)、铁饱和度百分率(％Sat)以及转铁蛋白受体浓度。这些变量是测定体内总铁贮存量的最准确的血液指标。

对于许多患者，如果考虑到腰椎穿刺中所包括的危险，血液取样可能足以监控治疗成功并且是期望的。

多导睡眠图(PSG)夜晚的PSGs提供直接测量睡眠效率和NREM睡眠中每小时PLMS的数目。这两种测量可用作严重程度的主要依赖的测量方法。也可根据Rechtschaffen和Kales标准(Rechtschaffen和Kales 1968)凭视觉对睡眠进行评分，可使用公认的标准(Force 1993)对PLMS评分。

根据现有技术中公知的方法(Montplaisir等，1998)获得连续两个晚上的完整标准的临床多导睡眠图。通常监视的时间是23:00到07:00。

建议的固定试验(SIT)(Montplaisir等1986，Pelletier等 1992，Montplaisir等1998)

受治疗者躺下，腿露出来，上身倾斜60°。通过EEG监视受治疗者以防止它们睡着，胫骨前肌上的EMG记录腿部运动。要求受治疗者不要活动1小时。在这个期间，将发生运动，运动的数量与RLS严重程度相关。通常监视的时间是08:00-09:00，16:00-17:00和22:00-23:00。

腿活动计/监视器(LAM)可用LAM获得腿活动的移动记录。LAM测定PLMS/小时，与PSGs相比对于患失眠症或PLMS的患者有±5％的误差(Gorny等1986)。对于临床医师希望评价的每个任意时期，LAMs日常佩带至少3个连续夜晚。

脑内铁的MRI测量(Allen等2001)简要地，根据已知的方法(Gelman等1999)，使用GE 1.5T信号系统(General Electric，Milwaukee，WI)上FID和回声的梯度回声取样(GESFIDE)序列，从一次扫描中获得松弛率R₂ ^*和R₂的多切片测量值。

重建R₂ ^*和R₂图象作为NIH图象1.61中的单一，多切片“堆”，公众区NIH图象程序(由美国国立卫生院开发，可从国立卫生院获得)。显示在R₂ ^*图象上含铁结构的切片。然后由两名受过训练的研究人员通过手工独立地追踪该结构，对于区域显示最好的切片使用标准的解剖学准则。将左右两个半球的松弛率平均。然后从R₂ ^*和R₂的差异中计算R₂′。

实施例3施用Venofer 和其它铁复合物(预测的)

Venofer

的剂量可由医学专业人员根据体重、疾病严重程度、以及每个患者对药物的个体反应进行调整。根据表4静脉内施用Venofer

或其它铁复合物。

例如，1000mg Venofer作为单次静脉内剂量施用RLS患者。单次静脉内治疗将延长RLS症状缓解的时间，大约2-12个月，尽管认为缓解的时间可能更短或更长。如果期望的话，可使用CNS和血液铁试验监控输入后CNS中铁状态的改变(见实施例2)。使用标准的主观的(例如，患者日记、等级表)和客观的(例如，P50、SIT、腿活动计，见实施例2)方法测量临床状态，评价RLS患者的输入后变化。如果期望的话，为了更好地评价RLS症状改善的程度，在治疗前，大约治疗后两周，以及再次在12个月后或者当症状重新出现时，测定CSF和血清铁的值，以及脑内铁的那些值，获取睡眠和固定试验的全部临床评价。

施用前，在生理盐水中将Venofer[以5ml中100mg元素铁(20mg/ml提供]稀释到2-5mg/ml。然后通过自由流动的外周或中心静脉内输入施用该溶液。药物溶液的体积是基于每个患者的安全体积，由医学专业人员确定。

对于直接注射，可在2分钟期间施用100mg以及在5分钟期间施用200mg。一周后，或者根据需要一旦再次出现RLS症状时重复注射。

表4 向RLS患者施用Venofer的实例

Venofer 剂量(元素铁，mg)	静脉内施用的时间	重复	总的剂量(元素铁，mg)
				(1)500(2)250	在4小时期间	(A)症状没有减轻的1周内；或者，(B)一旦再次出现RLS症状	(A)(1)1000(2)500(B)(1)500(2)250
(1)500(2)250	在4小时期间缓慢输入	4到7天内重复	(1)1,000(2)500
				(1)1,000(2)500(3)250(4)100	在4-6小时期间缓慢输入	一旦再次出现RLS症状	(1)1,000(2)500(3)250(4)100

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