ES2931431A1 - Tratamiento de la enfermedad de charcot-marie-tooth - Google Patents

Abstract

Tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. La presente invención divulga una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth que comprende florfenicol, siendo preferentemente la causa de dicha enfermedad alteraciones en GDAP1 y/o MFN2 y los síntomas de la enfermedad deficiencias motoras, pérdida sensorial, deficiencias ópticas, parálisis diafragmática y/o parálisis de las cuerdas vocales.

Description

DESCRIPCI N

TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE CHARCOT-MARIE-TOOTH

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biomedicina, más concretamente al tratamiento de enfermedades mitocondriales.

Antecedentes

La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) es una neuropatía para la que en la actualidad no hay tratamientos efectivos. Los pacientes con CMT presentan una degeneración de los nervios periféricos, lo que lleva a la debilidad muscular y a la pérdida de la propiocepción. Como se ha demostrado estudiando biopsias de piel de pacientes de CMT, la pérdida de proteínas de la fosforilación oxidativa mitocondrial y de enzimas de la respuesta antioxidante acompañan a la degeneración de los nervios en estos pacientes2.

La CMT es una enfermedad rara y la afección hereditaria más común del sistema nervioso periférico, con una prevalencia general estimada en la población de 10 a 28/100.000 habitantes en Europa. La CMT es una enfermedad genética heterogénea1 que suele aparecer en las dos primeras décadas de vida. Los pacientes presentan una degeneración de los nervios periféricos, lo que lleva a la debilidad muscular y a la pérdida de la propiocepción y de la sensación de pinchazo y se caracteriza por la debilidad muscular distal y la atrofia. A pesar de los esfuerzos por caracterizar la enfermedad, en la actualidad la CMT carece de tratamientos eficaces o de terapias.

Se han vinculado más de 90 genes a la enfermedad de CMT y a las neuropatías relacionadas. Uno de ellos codifica la proteína asociada a la diferenciación inducida por gangliósidos (GDAP1). Las mutaciones en el gen GDAP1 causan CMT axonal con herencia tanto recesiva (AR-CMT2K) como dominante (CMT2K), y desmielinización recesiva CMT4A. La GDAP1 es una proteína de la membrana mitocondrial externa (MOM) que también se encuentra tanto en las membranas mitocondriales asociadas (MAM) como en los sitios de contacto de la membrana mitocondrial-lisosoma. Las mutaciones en la GDAP1 se han asociado con cambios anormales en la morfología y la dinámica de las mitocondrias y con una disminución de la entrada de Ca2+ a través de la entrada de calcio operada por almacenamiento (SOCE), lo que lleva a un fallo en la estimulación de la respiración mitocondrial y a la inhibición de la producción de ATP mitocondrial. La falta de GDAP1 también induce una respuesta inflamatoria en la médula espinal y el nervio ciático. Además, la GDAP1 participa en la defensa contra el estrés oxidativo. En este contexto, se ha demostrado que los miembros de la familia de la GDAP1 responden y protegen contra el estrés asociado al aumento de los niveles de glutatión oxidado. Asimismo, las mutaciones de GDAP1 conducen a una actividad defectuosa del complejo mitocondrial I y al estrés oxidativo. En consonancia con estas observaciones, se ha informado de la pérdida de proteínas mitocondriales y antioxidantes en biopsias de piel de pacientes con CMT2 y en los nervios periféricos del ratón Gdapl knock-out (Gdapl-null). La pérdida de proteínas de fosforilación oxidativa mitocondrial y de enzimas de la respuesta antioxidante acompañan a la degeneración de los nervios en las biopsias de piel de los pacientes con CMT, lo que sugiere además que la función mitocondrial y el estrés oxidativo constituyen objetivos potenciales para tratar la enfermedad del CMT.

El florfenicol es un antibiótico sintético con estructura fenilpropanoide. Su mecanismo de acción actúa bloqueando la enzima peptidil transferasa en la subunidad 50S del ribosoma bacteriano. Se emplea como antibiótico veterinario que se utiliza para el tratamiento de la enfermedad respiratoria bovina y la podredumbre del pie; también se utiliza en la acuicultura. Sin embargo, puede presentar algunos efectos secundarios:

El artículo científico Florfenicol-induced Mitochondrial Dysfunction Suppresses Cell Proliferation and Autophagy in Fibroblasts. Hu D. et al, Sci. Rep. 7, 13554. (2017) divulga que el florfenicol inhibe la actividad mitocondrial, así como la síntesis de proteínas, sin embargo, las dosis empleadas en este estudio son entre 70 y 100 veces más elevadas que en la presente invención, además se ha probado en cultivos celulares y no en modelos animales,

El artículo científico Florfenicol induces oxidative stress and hepatocyte apoptosis in broilers via Nrf2 pathway, Han C, et al, Ecotoxicol Environ Saf. 2020 Mar, divulga la toxicidad hepática de esta molécula pollos a los que se ha suministrado florfenicol en la bebida. La fisiología de las aves y los mamíferos es diferente, en la presente invención la administración de florfenicol no muestra efectos secundarios tóxicos.

Recientemente, se ha divulgado el uso de este compuesto para usos terapéuticos alternativos. La solicitud de patente WO2017042196A2 divulga el uso del florfenicol junto con una tetraciclina para la prevención y/o tratamiento de un trastorno asociado a la senescencia de células madre.

Sin embargo, ningún documento divulga el uso de esta molécula para la enfermedad CMT.

La patente EP2624832B1 divulga uso médico de inhibidores específicos de la enzima HDAC6 para el tratamiento de CMT. Estos inhibidores tienen una estructura química diferente al florfenicol y además pueden presentar efectos secundarios.

En la presente invención se divulga una composición farmacéutica para el tratamiento de los síntomas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.

Descripción

En la presente memoria el término “tratamiento” ha de entenderse como uso preventivo, es decir, para el evitar la progresión de los síntomas de la enfermedad, o terapéutico, para revertir los síntomas.

En la presente memoria la expresión “alteraciones genéticas” comprende mutaciones (sustituciones, deleciones, duplicaciones o inversiones) de al menos una base nucleotídica de la secuencia de un gen que dé como resultado un fenotipo característico de la enfermedad Charcot-Marie-Tooth. Las alteraciones genéticas pueden ser somáticas o espontáneas y hereditarias.

En la presente memoria los términos “Gdapl-null’, “Gdap1-/- “, “ratones deficientes en Gdapl”, “Gdapl knockout’ y “Gdapl ko” son sinónimos y se emplean de forma intercambiable.

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende florfenicol para su uso en el tratamiento de los síntomas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth de un paciente.

La fórmula química del florfenicol es 2,2-dicloro-N-[(1R,2S)-3-fluoro-1-hidroxi-1-(4-metilsulfonilfenil)propan-2-il]acetamida. Adicionalmente, florfenicol también engloba a una sal, solvato, y/o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.

Los síntomas de la enfermedad pueden ser la manifestación física de las alteraciones en las proteínas involucradas en el metabolismo energético y proteínas redox (reducción -oxidación) características de la enfermedad CMT.

En una realización particular los síntomas de la enfermedad CMT son uno o más de los siguientes: deficiencias motoras, pérdida sensorial, deficiencias ópticas, parálisis diafragmática y/o parálisis de las cuerdas vocales

En otra realización particular las deficiencias motoras comprenden alteraciones motoras, deficiencias motoras de las extremidades inferiores, pérdida de masa corporal en las piernas y los pies, arcos de los pies elevados, dedos de los pies doblados (dedos del pie en martillo) y/o dificultad para flexionar el talón (pie caído).

En otra realización particular la pérdida sensorial comprende una menor sensibilidad o pérdida de la sensibilidad en las piernas y los pies. Estos síntomas están ligados a las deficiencias motoras de las extremidades inferiores.

En otra realización particular las deficiencias ópticas pueden ser atrofia óptica, dando lugar a un deterioro visual.

El tratamiento de los síntomas también comprende la prevención del agravamiento de los síntomas en el caso de que el comienzo del tratamiento con la composición farmacéutica de la invención tenga lugar una vez que los síntomas hayan aparecido.

Sin embargo, en el caso de las deficiencias motoras, la composición de la invención sólo es efectiva en su prevención si se administra antes de que se desarrollen.

En otra realización particular el tratamiento de las deficiencias motoras comprende la prevención de la aparición de las alteraciones motoras.

El efecto beneficioso del florfenicol se debe a su naturaleza lipofílica y a su actividad desacopladora que, por un lado, aumenta la respiración mitocondrial y disminuye la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondrial. De hecho, el tratamiento a largo plazo con florfenicol evita la desregulación de las proteínas metabólicas y redox mitocondriales en los nervios periféricos.

En cualquier caso, el tratamiento con florfenicol no mejora la coordinación motora de los de los ratones Gdapl knockout una vez que los síntomas son visibles mediante la reducción de los mismos.

En una realización particular, la causa de la enfermedad se debe a alteraciones genéticas en GDAP1 y/o MFN2.

La secuencia que codifica para GDAP1 y MFN2 humana, así como sus respectivos tránscritos se pueden encontrar en la base de datos de Ensembl (Human GRCh38.p13) GDAP1: ENSG00000104381 y MFN2: ENSG00000116688. Esta es la secuencia de un individuo particular en la población de seres humanos. Los seres humanos varían entre sí en sus secuencias génicas. Estas variaciones son muy mínimas, produciéndose algunas veces a una frecuencia de aproximadamente 1 a 10 nucleótidos por gen. Existen formas diferentes de cualquier gen particular dentro de la población humana. Estas formas diferentes se denominan variantes alélicas. Las variantes alélicas a menudo no cambian la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada; tales variantes se denominan sinónimas. Incluso si cambian el aminoácido codificado (no sinónimas), la función de la proteína no se ve afectada normalmente. Tales cambios son evolutiva o funcionalmente neutros. Cuando se hace referencia a GDAP1 humana o MFN2 humana en la presente solicitud, se pretende que todas las variantes alélicas se abarquen por el término.

Para los fines de determinar una alteración genética en cualquiera de estos genes, pueden compararse las secuencias de GDAP1 y/o MFN2 determinadas en una muestra de prueba de un primer ser humano con una secuencia determinada obtenida de una muestra de un segundo humano que sirva como control, este segundo ser humano puede ser un familiar. Una diferencia en la secuencia en los dos tejidos indica una mutación. Alternativamente, puede compararse la secuencia determinada en un gen de GDAP1 y/o MFN2 en una muestra de prueba con la secuencia indicada en el párrafo anterior en Ensembl. Puede identificarse una diferencia entre la secuencia de muestra de prueba y la secuencia en Ensembl como una mutación. Un experto en la materia sabría diferenciar aquellas alteraciones genéticas responsables de la enfermedad CMT de otras alteraciones silenciosas o inocuas. Las muestras corporales adecuadas para las pruebas incluyen sangre, suero, plasma, esputo, orina, heces, saliva y líquido cefalorraquídeo.

En una realización preferida la neuropatía de Charcot-Marie-Tooth (CMT) está causada por mutaciones en la secuencia del gen GDAP1.

En otra realización preferida adicional, los subtipos de la enfermedad CMT causadas por mutaciones en GDAP1 son: formas recesivas axonales (AR-CMT2K), dominantes axonales (CMT2K) y recesivas desmielinizantes (CMT4A).

En otra realización preferida la neuropatía de Charcot-Marie-Tooth (CMT) está causada por mutaciones en la secuencia del gen MFN2 es la forma recesiva axonal AR-CMT2A2

En otra realización preferida adicional, el subtipo de la enfermedad CMT causada por mutaciones en MFN2 son:

En una realización preferida la neuropatía de Charcot-Marie-Tooth 2 (CMT 2) está causada por mutaciones en el gen MFN2. Las mutaciones en MFN2 causan la forma AR-CMT2A2.

Otros subtipos de CMT causados por alteraciones genéticas en la secuencia de GDAP1 y/o MFN2 también se encuentran comprendidos en el ámbito de la presente invención.

En una realización particular la CMT puede ser al menos uno de los subtipos, AR-CMT2K, CMT2K y CMT4A y el modelo preclínico el ratón GDAPI-null y/o células derivadas del mismo.

La cantidad de florfenicol variará en función de la forma específica de administración. Por ejemplo, una composición farmacéutica para la administración vía oral en seres humanos puede contener aproximadamente de 0,001 a 500 mg/ml de florfenicol, preferentemente, de 0,01 a 300 mg/ml, más preferentemente de 0,1 a 300 mg/ml, aún más preferentemente de 0,2 a 200 mg/ml, aún más preferentemente de 0,3 a 100 mg/ml, siendo el solvente del florfenicol cualquier líquido potable para los seres humanos, preferentemente agua.

La cantidad de florfenicol administrada a un individuo puede ser una dosis de 1 mg/kg a 1000 mg/kg, preferentemente una dosis de 10 mg/kg a 500 mg/kg, más preferentemente una dosis de 50 mg/kg a 400 mg/kg, o aún más preferentemente una dosis de 100 mg/kg a 300 mg/kg.

La composición farmacéutica se puede administrar con un intervalo de administración variable, a modo de ejemplo de 1 a 7 veces por semana, preferentemente, de 2 a 6 veces por semana, más preferentemente de 3 a 5 veces por semana.

La composición farmacéutica se puede administrar a individuos de edad a partir del nacimiento, 1 año o más, preferentemente 5 años o más, más preferentemente 10 años o más.

En una realización particular la composición farmacéutica se puede administrar tras el diagnóstico de la enfermedad CMT por un especialista, por ejemplo, mediante consejo genético en diagnóstico perinatal. Por ejemplo, mediante la detección de mutaciones en los genes asociados con esta enfermedad como GDAP1 y MFN2

Es importante que la composición farmacéutica se administre antes del desarrollo de los síntomas para evitar que estos aparezcan. Sin embargo, la administración puede comenzar antes del diagnóstico en el caso de individuos con una alta probabilidad de padecer la enfermedad de CMT.

La composición farmacéutica de la invención puede comprender adicionalmente, al menos uno o más de los siguientes:

- al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, y

- al menos un aditivo farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica de la invención se puede emplear como tratamiento subsiguiente o simultáneo con otras terapias.

La composición farmacéutica de la invención se puede administrar a un individuo por vía intraperitoneal, oral, subcutánea o intramuscular, preferentemente por vía oral.

La composición farmacéutica indicados para la administración por vía oral puede presentarse en unidades separadas, como cápsulas, píldoras o comprimidos, cada uno de ellos con una cantidad predeterminada de florfenicol; en granulados o en gránulos; en disolución, como una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite o en polvo; El florfenicol puede también administrarse vía intravenosa, como un preparado o un puré.

La composición farmacéutica puede tener cualquier formulación seleccionada del grupo que consiste en un comprimido, una pastilla, un polvo, un granulado, una cápsula, una suspensión, una solución, una emulsión, un jarabe, una solución acuosa, una solución no acuosa, una suspensión, una emulsión, un secante por congelación, un supositorio y una inyección.

Cuando se emplean de forma oral, se pueden elaborar, por ejemplo, comprimidos, pastillas, píldoras, suspensiones oleosas o acuosas, gránulos en polvo dispersos, emulsiones, pastillas duras o blandas, siropes o elixires.

Las composiciones farmacéuticas se pueden fabrican por un procedimiento conocido, por ejemplo, un procedimiento general de mezclado, granulación, disolución o liofilización. Por ejemplo, la composición farmacéutica para su administración oral se puede preparar mezclando el fármaco con un vehículo sólido, granulando la mezcla, añadiendo un aditivo apropiado si fuera necesario, y, a continuación, formulando la mezcla o el granulado en forma de un comprimido o una gragea.

Un comprimido se puede elaborar por compresión o por moldeado, o de forma opcional, con uno o más excipientes y/o aditivos adicionales. Los comprimidos compactos pueden elaborarse por compresión, en un dispositivo adecuado del florefnicol en libre flotación como los sobres o gránulos, opcionalmente mezclados con un ligante, un lubricante, un diluyente inerte, un profiláctico, una superficie activa o un agente dispersante. Los comprimidos que han sido transformados, moldeándolos en un dispositivo adecuado, en una mezcla de florfenicol en polvo humedecidos con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden ir opcionalmente revestidos, marcados o elaborados a fin de proporcionar una liberación lenta o controlada del florfenicol.

Las composiciones farmacéuticas administradas por vía oral se pueden elaborar por cualquiera de las técnicas conocidas en cuanto a la preparación de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más excipientes y/o aditivos que contienen agentes edulcorantes, de condimentación, colorantes y conservantes, a fin de conseguir un preparado agradable al paladar. Serán aptos los comprimidos que contienen el florfenicol en mezclas con excipientes farmacéuticos permitidos no tóxicos y que son admitidos en la elaboración de comprimidos.

El excipiente farmacéuticamente aceptable puede incluir, en particular, un relleno, por ejemplo, azúcar, tal como lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol, un agente de celulosa y/o fosfato de calcio, tal como fosfato tricálcico o hidrogenofosfato de calcio, y un agente de acoplamiento, por ejemplo, pastas de almidón que usan almidones de maíz, trigo, arroz o patata, gelatina, tragacanto, metilcelulosa y/o polivinilpirrolidona, y si fuera necesario, un agente disgregante, por ejemplo, los almidones mencionados anteriormente, carboximetilalmidón, polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, por ejemplo, alginato de sodio.

Los aditivos farmacéuticamente aceptables incluyen, en particular, un agente de control de flujo y un lubricante, por ejemplo, ácido silícico, talco, ácido esteárico o su sal, por ejemplo, estearato de magnesio, o calcio y/o polietilenglicol. Se proporciona un recubrimiento gastrorresistente apropiado a un núcleo de gragea, y, en particular, una solución de azúcar concentrada que incluye goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio en un disolvente orgánico apropiado o una mezcla de disolventes, o se usa una solución agitada, o, para formar el recubrimiento gastrorresistente, se puede usar una solución con agente de celulosa apropiado, tal como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa.

Otros excipientes farmacéuticamente aceptables para administración por vía oral incluyen agentes encapsulantes y cápsulas rellenadas en seco fabricadas de gelatina, y cápsulas selladas blandas fabricadas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. La cápsula rellenada en seco puede incluir un ingrediente activo en forma particulada, por ejemplo, un relleno, tal como lactosa, un agente de acoplamiento, tal como almidones, y/o un modificador, como talco o estearato de magnesio, y una mezcla con un estabilizante si fuera apropiado. En la cápsula blanda, el florfenicol se disuelve o suspende en un líquido apropiado, por ejemplo, aceite fijo, aceite de vaselina o polietilenglicol líquido, y se puede añadir un estabilizante en el mismo. Los comprimidos pueden estar con o sin revestir mediante técnicas conocidas que incluyen la microencapsulación para retrasar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal y de ese modo proporcionar una acción prolongada durante un período de tiempo mayor. Por ejemplo, se pueden emplear materiales retardantes como el monoestereato de glicerol o el diestearato de glicerol por si solos o con una cera.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden presentarse como suspensiones acuosas que contienen florfenicol en mezclas con excipientes y/o aditivos apropiados para la elaboración de las suspensiones acuosas. Por ejemplo, incorporan un agente en suspensión, como la carboximetilcelulosa de sodio, la metilcelulosa, metilcelulosa de hidroxipropilo, alginato sódico, el polivinilpirrolidona, la goma tragacanto, la goma arábiga y agentes dispersantes o humidificantes como la fosfatida natural (por ejemplo la lecitina), un producto de condensación de óxido de alquileno con un ácido graso (por ejemplo, el estearato de polioxietileno), un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga, (por ejemplo, el heptadecaetileneoxicetanol), un producto de condensación del óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anhídrido de hexitol (por ejemplo, el monooleato sorbitán polioxietileno). La suspensión acuosa puede contener también uno o más conservantes como el etil o el n-propil p-hidroxi-benzoato, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes edulcorantes, como la sacarosa o la sacarina.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden presentarse como polvos o gránulos dispersables permitidos en la preparación de una suspensión acuosa mediante la adicción de agua, proporcionan el florfenicol en una mezcla con un excipiente y/o aditivo dispersante o humidificante, un agente de suspensión o uno o más conservantes.

Los excipientes y/o aditivos dispersantes o humidificantes permitidos así como los agentes en suspensión son por ejemplo los expuestos anteriormente. También pueden encontrarse excipientes adicionales, por ejemplo, edulcorantes, saborizantes o colorantes.

La cantidad de florfenicol que puede mezclarse con los excipientes y/o aditivos para generar una forma de dosificación sencilla variará en función del agente empleado y la forma específica de administración. Por ejemplo, una composición farmacéutica con un tiempo de liberación concebido para la administración vía oral en seres humanos puede contener aproximadamente de 0,001 a 500 mg/ml de florfenicol, preferentemente, de 0,01 a 300 mg/ml , más preferentemente de 0,1 a 300 mg/ml, aún más preferentemente de 0,2 a 200 mg/ml, aún más preferentemente de 0,3 a 100 mg/ml intensificada con una correcta y adecuada cantidad de sustancia portadora que puede oscilar entre un 1 y 95% de las composiciones totales (peso/peso). Se puede preparar la composición farmacéutica para proporcionar fácilmente cantidades medibles para su administración. Por ejemplo, una solución acuosa concebida para la infusión (inyección) intravenosa puede contener desde aproximadamente 3 hasta 500 pg (picogramos) de florfenicol por mililitro de solución a fin de que la inyección de un volumen adecuado a una velocidad de 30 mL/hr pueda producirse.

Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar en envases de dosis unitarias o múltiples, por ejemplo, ampollas precintadas y los viales, y pueden ser almacenarse en condiciones de liofilización que precisen únicamente la adición de un portador líquido estéril, por ejemplo, el agua para la inyección, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones por inyección improvisadas, son elaboradas a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos de la misma clase que los que se citaron anteriormente. Los preparados preferentes de dosis unitarias son aquellos que contienen una dosis diaria o una subdosis diaria unitaria, o una fracción adecuada de este tipo, de florfenicol.

La composición farmacéutica que se administre por vía subcutánea, intramuscular y/o intraperitoneal puede llevar cualquiera de los excipientes y aditivos mencionados en la solicitud de patente CN102920655A.

El término “paciente” se refiere a cualquier mamífero que es el receptor del diagnóstico, preferiblemente un ser humano. El paciente puede ser una persona que se presenta para una evaluación de rutina de la enfermedad o puede presentar síntomas sugestivos de CMT. El paciente también puede ser un individuo considerado de alto riesgo de esta enfermedad, debido a los antecedentes familiares con esta enfermedad hereditaria.

El diagnóstico se puede realizar por cualquier método conocido del estado de la técnica que se emplee de forma corriente en la práctica médica por un facultativo o un especialista en esta enfermedad.

La composición farmacéutica puede administrarse al paciente antes de la aparición de los síntomas de la CMT, lográndose así la prevención o el retraso en la aparición de los síntomas característicos de esta neuropatía.

En una realización la composición farmacéutica se puede administrar durante toda la vida del paciente contando desde la primera administración lográndose así la prevención o el retraso en la aparición de los síntomas característicos de esta neuropatía.

En otra realización particular, la composición farmacéutica se puede administrar con un intervalo de administración variable, a modo de ejemplo de 1 a 7 veces por semana, preferentemente, de 2 a 6 veces por semana, más preferentemente de 3 a 5 veces por semana.

La dosis eficaz del florfenicol y de la composición farmacéutica que lo comprenda depende de la naturaleza de las condiciones la forma de ejecución y la formulación farmacéutica, y estará definida por la experiencia de un médico mediante la aplicación de las investigaciones habituales para un aumento de la dosis. Se puede considerar que la dosis eficaz se encuentra desde 0,0001 hasta aproximadamente 1000 mg/kg peso corporal por día, o desde 0,01 hasta aproximadamente 500 mg/kg peso corporal por día, o desde 0,01 hasta 100 mg/kg peso corporal por día, o desde 0,05 hasta aproximadamente 10 mg/ kg de peso corporal por día. Por ejemplo, la dosis diaria que se postula para una persona adulta de aproximadamente 70 kg de peso corporal estará en el rango de 1 mg a 1000 mg, o entre 5 mg y 500 mg, y puede hacerse mediante dosis individuales o múltiples, diarias o no.

En una realización particular, se puede usar la composición farmacéutica para la indicación reivindicada administrando a un individuo una dosis de 0,1 mg/kg/día a 1000 mg/kg/día, específicamente una dosis de 1 mg/kg/día a 500 mg/kg/día, o una dosis de 3 mg/kg/día a 400 mg/kg/día, o una dosis de 10 mg/kg/día a 300 mg/kg/día.

En la dosis y el intervalo de administración de la composición farmacéutica pueden variar dependiendo de diversos factores, por ejemplo, condiciones individuales, tales como disponibilidad y duración del fármaco un procedimiento de administración, sexo, edad y peso de los individuos, gravedad de las enfermedades y similares. La vía de administración específica y la dosis se pueden seleccionar por un experto en la materia según condiciones tales como la edad, el peso, el grado de actividad de la enfermedad y el estado físico. Las condiciones particulares de la dosis e intervalo de administración pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la materia.

Por lo tanto, la administración de florfenicol a partir de una etapa temprana del diagnóstico a los pacientes con CMT podría contribuir a prevenir la pérdida de las proteínas mitocondriales y antioxidantes observadas en los nervios periféricos de los pacientes con CMT levemente afectados, resultando en un menor deterioro de las funciones motoras.

Cabe destacar que el tratamiento con florfenicol previene el deterioro molecular y el daño oxidativo observado en los nervios ciáticos de los ratones Gdapl-null así como el desarrollo de síntomas de CMT en dichos ratones, lo que apoya firmemente el daño oxidativo como un factor importante que contribuye a la etiología de la enfermedad.

Se ha descubierto que el tratamiento con florfenicol durante 24 horas a una concentración final de 1 pM promueve el aumento significativo de la respiración mitocondrial en cultivos primarios de neuronas aisladas de ratones Gdap1-/-.

El tratamiento diario con florfenicol en agua de bebida de ratones Gdap1-/- a una concentración de 200 mg/kg a partir de un mes desde el nacimiento previene la aparición de las deficiencias motoras de los ratones Gdap1-/-. Esta concentración es equivalente a 0.84 mg/ml.

En una realización particular la concentración de florfenicol es al menos 200 mg/kg o 0.84 mg/ml.

Debido a que los ratones podían beber el agua que contenía el florfenicol libremente es posible que en algunos casos la cantidad ingerida fuera diferente a la calculada inicialmente.

En otra realización particular la concentración de florfenicol es al menos 150 mg/kg o 0.63 mg/ml.

La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos que describen de forma detallada los objetos de la invención. Estos ejemplos no deben ser considerados como limitativos del alcance de la invención sino como ilustrativos de la misma.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. El florfenicol activa la respiración mitocondrial de las células de neuroblastoma SH-SY5Y.

Las células se incubaron durante 24 horas con una solución de 1 pM de florfenicol.

A. Estructura química del florfenicol.

B. Las células SH-SY5Y se trataron con florfenicol (líneas y barras grises) o se dejaron sin tratar (líneas y barras negras) y se registraron los perfiles respiratorios en un analizador Seahorse. Los histogramas (izquierda) muestran las tasas de consumo de oxígeno (OCR) basal, OSR (respiración sensible a oligomicina) y máxima. OL, oligomicina; DNP, 2,4-dinitrofenol; ROT, rotenona; ANT, antimicina A. Las barras (derecha) indican la media ± SEM de tres réplicas biológicas. *P < 0,05 en comparación con el LCR mediante la prueba t de Student.

Figura 2. El florfenicol activa la respiración mitocondrial de las células SH-SY5Y inhabilitadas por GDAP1 y de las neuronas DRG inhabilitadas por Gdapl.

A. Las células GDAPI-knockdown G4 se trataron con florfenicol (líneas y barras grises) o se dejaron sin tratar (líneas y barras negras) y los perfiles respiratorios se registraron en un analizador Seahorse. Los histogramas (izquierda) muestran las tasas de consumo de oxígeno (OCR) basal, OSR y máxima. OL, oligomicina; DNP, 2,4-dinitrofenol; ROT, rotenona; ANT, antimicina A. Las barras (derecha) indican la media ± SEM de tres réplicas biológicas.

B. Perfiles y parámetros respiratorios de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) de los ratones Gdapl-/- (líneas y barras grises) sobre las neuronas del DRG de los ratones de tipo salvaje (líneas y barras negras), ambos tratados 24 h con 1 pM de florfenicol. Las barras (derecha) indican la media ± SEM de tres réplicas biológicas.

Las barras indican la media ± SEM de tres réplicas biológicas. *p < 0,05 en comparación con el LCR respectivo mediante la prueba t de Student.

Figura 3. El florfenicol previene el desarrollo del fenotipo asociado a la enfermedad CMT en los ratones Gdapl-/-.

A. Esquema gráfico que muestra el curso del tratamiento de los ratones. Después del destete (1 mes) se administró florfenicol (0,84 mg/ml) en el agua de bebida de los ratones. Se realizaron pruebas de función motora a los 7 y 10 meses de edad.

(B-C) Ratones de tipo silvestre (WT, n=9, barra de línea negra y puntos), ratones Gdap1 -/- no tratados (KO, n=10, barra de línea roja y cuadrados) y ratones Gdap1-/- tratados con florfenicol (FLORF, n=9, barra de línea gris y triángulos).

B. Izquierda: Imágenes representativas de ratones a los 10 meses de edad. Los histogramas de la derecha muestran la cuantificación del cambio de peso de los ratones durante los tratamientos a los 7 y 10 meses de edad.

C. Imágenes representativas de ratones de 10 meses de edad suspendidos por la cola. Los ratones de tipo silvestre (WT) y los ratones Gdap1-/- tratados con florfenicol muestran la respuesta característica de intentar escapar extendiendo las extremidades posteriores del tronco de su cuerpo. Por el contrario, las extremidades posteriores de los ratones Gdap1-/- no tratados se mantienen pegadas al tronco en una postura distónica anormal. Los histogramas muestran la cuantificación del ángulo entre la extremidad trasera derecha y el eje del cuerpo.

Las barras indican la media ± SEM de la n indicada en la parte superior. **p < 0.01 cuando se compara con ratones WT y ##p < 0.01 cuando se comparan con los ratones Gdap1-/- por la prueba t de Student. La n son los ratones indicados en cada caso particular

Figura 4 El florfenicol previenen las deficiencias motoras en los ratones Gdapl-/-

A-D Ratones de tipo salvaje (WT, n=9, barra de línea negra y puntos), ratones Gdap1-/-sin tratar (KO, n=10, barra de línea negra y cuadrados), y ratones Gdap1-/- tratados con florfenicol (FLORF, n=9, barra de línea gris y triángulos).

A. Arriba, imagen representativa de la prueba de colgado de dos extremidades. Debajo, los histogramas muestran la cuantificación del máximo tiempo durante el cual los ratones mostraron tensión sostenida en las extremidades, (panel superior) y el impulso de sujeción mínimo en la prueba de colgado de dos extremidades a los 10 meses de edad (panel inferior).

B. Imagen representativa de la prueba de fuerza de agarre. El panel inferior muestra la cuantificación de la fuerza de los ratones (g) sobre el peso corporal (g).

C. Arriba, imagen representativa de la prueba de colgado de cuatro extremidades. Debajo, los histogramas muestran la cuantificación del máximo tiempo durante el cual los ratones mostraron tensión sostenida en las extremidades. (panel superior) y el impulso de sujeción mínimo en la prueba de colgado de cuatro extremidades a los 10 meses de edad (panel inferior).

D. Imagen representativa de la prueba del rotarod. El gráfico muestra la cuantificación de la latencia de los ratones al caer (en segundos) a una velocidad de 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 y 32 r.p.m.

Las barras indican la media ± SEM de la n indicada en la parte superior. **p < 0.01 cuando se compara con ratones WT y ##p < 0.01 cuando se comparan con los ratones Gdap1-/- por la prueba t de Student.

Figura 5. El florfenicol previene las deficiencias metabólicas y redox observadas en los nervios ciáticos de los ratones GDAP1--.

Los extractos del nervio ciático obtenidos a partir de ratones salvajes (WT, caja negra, izquierda) (n=9), ratones Gdap1~A no tratados (KO, caja negra, centro) (n=10) y tratados con florfenicol (FLORF, caja gris, derecha) (n=9) se depositaron en forma de gotas sobre las láminas y procesados. Los arrays se desarrollaron con los anticuerpos primarios indicados y la cantidad de proteína de los extractos se expresa en unidades arbitrarias/ng de proteína utilizando como estándar el diagrama lineal de la línea celular C2C12. Los gráficos de cajas representan los percentiles 25 a 75 con el valor mediano en la línea media, y con todos los datos representados desde los valores mínimos hasta los máximos del nivel de expresión de las proteínas, los niveles de expresión se muestran como unidades arbitrarias, (u.a.). Se muestran las enzimas del metabolismo de la glucosa (ENO1, LDHA, PDH), el ciclo del TCA (IDH1, MDH2), oxidación de los ácidos grasos (HADHA), OXPHOS (Fosforilación Oxidativa) (CORE2, p-F1-ATPase), dinámica mitocondrial (MFN2, OPA1), homeostasis redox (G6PDH, GR, SOD1, Catalasa, SOD2) y estrés oxidativo (MDA, 4HNE). * y **, indica una p < 0,05 y p < 0,001 cuando comparados con los ratones WT, respectivamente; # y ##, p < 0,05 y p < 0,001 cuando se comparan con ratones Gdap1-/-, respectivamente.

Figura 6. El florfenicol no causa deficiencias metabólicas y redox en el hígado de los ratones.

Los extractos de tejido hepático obtenido a partir ratones de tipo salvaje (WT, caja negra, izquierda) (n=9), de ratones Gdapl-/- no tratados (KO, caja negra, centro) (n=10) y de ratones Gdapl-/- tratados con florfenicol (FLORF, caja gris, derecha) (n=9) se depositaron en forma de gotas sobre las láminas y procesados. Los arrays se desarrollaron con los anticuerpos primarios indicados y la cantidad de proteína de los extractos expresada en unidades arbitrarias/ng de proteína utilizando como estándar el diagrama lineal de la línea celular C2C12. Los gráficos de cajas representan los percentiles 25 a 75 con el valor mediano en la línea media, y con todos los datos representados desde los valores mínimos hasta los máximos del nivel de expresión de las proteínas, los niveles de expresión se muestran como unidades arbitrarias, (u.a.). Se muestran las enzimas del metabolismo de la glucosa (ENO1, LDHA, PDH), el ciclo del TCA (IDH1, MDH2), oxidación de los ácidos grasos (HADHA), OXPHOS (Fosforilación Oxidativa) (CORE2, p-F1-ATPase), dinámica mitocondrial (MFN2, OPA1), homeostasis redox (G6PDH, GR, SOD1, Catalasa, SOD2) y estrés oxidativo (MDA, 4HNE). * y **, indica una p < 0,05 y p < 0,001 cuando comparados con los ratones WT, respectivamente; # y ##, p < 0,05 y p < 0,001 cuando se comparan con ratones Gdapl-/-, respectivamente.

Figura 7. El florfenicol no causa deficiencias metabólicas y redox en el cerebelo de los ratones.

Los extractos de tejido del cerebelo obtenido a partir ratones de tipo salvaje (WT, caja negra, izquierda) (n=9), de ratones Gdapl-/- no tratados (KO, caja negra, centro) (n=10) y de ratones Gdapl-/- tratados con florfenicol (FLORF, caja gris, derecha) (n=9) se depositaron en forma de gotas sobre las láminas y procesados. Los arrays se desarrollaron con los anticuerpos primarios indicados y la cantidad de proteína de los extractos expresada en unidades arbitrarias/ng de proteína utilizando como estándar el diagrama lineal de la línea celular C2C12. Los gráficos de cajas representan los percentiles 25 a 75 con el valor mediano en la línea media, y con todos los datos representados desde los valores mínimos hasta los máximos del nivel de expresión de las proteínas, los niveles de expresión se muestran como unidades arbitrarias, (u.a.). Se muestran las enzimas del metabolismo de la glucosa (ENO1, LDHA, PDH), el ciclo del TCA (IDH1, MDH2), oxidación de los ácidos grasos (HADHA), OXPHOS (Fosforilación Oxidativa) (CORE2, p-F1-ATPase), dinámica mitocondrial (MFN2, OPA1), homeostasis redox (G6PDH, GR, SOD1, Catalasa, SOD2) y estrés oxidativo (MDA, 4HNE). * y **, indica una p < 0,05 y p < 0,001 cuando comparados con los ratones WT, respectivamente; # y ##, p < 0,05 y p < 0,001 cuando se comparan con ratones Gdapl-/-, respectivamente.

Figura 8. E El florfenicol no causa deficiencias metabólicas y redox en el músculo de los ratones.

Los extractos de tejido muscular obtenido a partir ratones de tipo salvaje (WT, caja negra, izquierda) (n=9), de ratones Gdapl-/- no tratados (KO, caja negra, centro) (n=10) y de ratones Gdapl-/- tratados con florfenicol (FLORF, caja gris, derecha) (n=9) se depositaron en forma de gotas sobre las láminas y procesados. Los arrays se desarrollaron con los anticuerpos primarios indicados y la cantidad de proteína de los extractos expresada en unidades arbitrarias/ng de proteína utilizando como estándar el diagrama lineal de la línea celular C2C12. Los gráficos de cajas representan los percentiles 25 a 75 con el valor mediano en la línea media, y con todos los datos representados desde los valores mínimos hasta los máximos del nivel de expresión de las proteínas, los niveles de expresión se muestran como unidades arbitrarias, (u.a.). Se muestran las enzimas del metabolismo de la glucosa (ENO1, LDHA, PDH), el ciclo del TCA (IDH1, MDH2), oxidación de los ácidos grasos (HADHA), OXPHOS (Fosforilación Oxidativa) (CORE2, p-F1-ATPase), dinámica mitocondrial (MFN2, OPA1), homeostasis redox (G6PDH, GR, SOD1, Catalasa, SOD2) y estrés oxidativo (MDA, 4HNE). * y **, indica una p < 0,05 y p < 0,001 cuando comparados con los ratones WT, respectivamente; # y ##, p < 0,05 y p < 0,001 cuando se comparan con ratones Gdapl-/-, respectivamente.

Ejemplos de realización.

A continuación, se explican los materiales, métodos y protocolos concretos empleados en los ejemplos de la invención. Salvo que se indique lo contrario, las condiciones y materiales empleadas en los ejemplos de realización serán las que figuren en la siguiente sección.

A. Materiales y Métodos

Líneas celulares. Las células se cultivaron en un incubador a 37°C con una atmósfera controlada con un 10% de CO². Las células de carcinoma colorrectal humano HCT116 y C2C12 se cultivaron en el medio McCoy’s 5A y DMEM, respectivamente, complementado con un 10 % de suero bovino fetal (FBS). Las células SH-SY5Y de neuroblastoma humano WT y GDAP1 knockdown (G4)3 se cultivaron en medio DMEM-F12 suplementado con un 10% de FBS. Para el control estable de las células G4 SH-SY5Y, se añadió 2pg/ml de puromicina al medio, para mantener la selección. Para preservar las líneas celulares, se congelaron gradualmente alícuotas de 5 millones de células en un 1 ml del medio de cultivo con 10% de DMSO, dimetil sulfóxido (14 h a -20°C, 24 h a -70°C y luego se mantuvieron en nitrógeno líquido). El descongelamiento se realizó a 37°C diluyéndolos inmediatamente en el medio de cultivo.

Evaluación de la respiración mitocondrial. El efecto del florfenicol sobre los parámetros respiratorios mitocondriales se determinaron en el analizador de flujo XFe96 Seahorse (Agilent Technologies) como se describe en4. Se evaluó el efecto en 35.000 células de las líneas celulares SH-SY5Y WT y G4. Para determinar el efecto en los DRGs WT y Gdap1-/- se empleó el analizador de flujo XF24 Seahorse y se sembraron a una densidad de 1 x 105 células/pocillo. El efecto del florfenicol se evaluó en ensayos por triplicado tras la incubación de 1 pM de dicho fármaco durante 24 h utilizando 10 mM de glucosa, 1mM de piruvato y 2mM de glutamina y se determinó mediante la adición secuencial de 6 pM de oligomicina, 0,25 mM de 2,4-dinitrofenol (DNP) y 1 pM de antimicina A/1 pM de rotenona.

Animales. Los ratones se alojaron en el Animalario con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y temperaturas de 18-23 °C con 40-60% de humedad. Los ratones deficientes en Gdapl o Gdapl knockout (Gdapl--) fueron previamente generados y caracterizados y se emplean como modelos de estudio de la enfermedad CMT5. El florfenicol (0,84 mg/ml) se administró a los ratones en el agua potable.

Evaluación de la función motora del ratón

Prueba de Rotarod . El rendimiento motor y el equilibrio se midieron usando un rotarod acelerante. Cada ratón fue sometido al mismo procedimiento durante 2 días. El primer día se utilizó para entrenar a los ratones en una sesión de 2 min, caminando a 4 revoluciones por minuto (r.p.m). Los ratones que se cayeron después de completar 2 min caminando en un plazo de 10 min se descartaron del experimento. Las sesiones de prueba se realizaron el segundo día. Durante la prueba, la velocidad del rotarod fue acelerándose de 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 a 32 r.p.m. Los ratones pasaron 1 min corriendo a cada velocidad. Se midió su latencia. Los ratones que se cayeron 6 veces en 60 segundos se descartaron del experimento.

Prueba de fuerza de agarre/resistencia . La prueba de fuerza de agarre se utilizó para medir la máxima fuerza que podría realizar un ratón con sus patas delanteras aprovechando la tendencia del animal a agarrarse a las superficies. Empleando cada vez un ratón, se dejó que se agarrara a las barras metálicas y luego se le retiró suavemente hasta que el agarre se rompiera. El tirón se hacía a una velocidad constante y lo suficientemente lento para permitir que el ratón ejercer una resistencia contra él. La prueba se repitió 5 veces por ratón, con un mínimo de 1 minuto entre cada una de las 5 determinaciones por animal.

Prueba de colgado o suspensión: dos extremidades . La fuerza muscular de las extremidades delanteras se midió controlando la capacidad de los ratones de ejercer una tensión sostenida en las extremidades para oponerse a su peso. Los ratones se colocaron en una barra de metal de 2 mm de espesor a 35 cm de una superficie acolchada y se registró el tiempo hasta la caída. La prueba terminó después de que se lograra un tiempo de suspensión de 2 min o de otra manera después de tres sesiones. Se calculó el máximo tiempo de suspensión y el impulso de sujeción mínimo (masa corporal, gramos x tiempo de suspensión, suspensión)6.

Prueba de colgado o suspensión: cuatro extremidades . La fuerza muscular de las cuatro extremidades se midió controlando la capacidad de los ratones de ejercer una tensión sostenida en las extremidades para oponerse a su peso. Se colocaron ratones en una rejilla de alambre a 35 cm de una superficie acolchada y se registró el tiempo hasta la caída. La prueba terminó después de que se lograra un tiempo de suspensión de 2 minutos o, de lo contrario, después de tres sesiones. Se calculó el tiempo máximo de suspensión y el impulso de sujeción mínimo (masa corporal x tiempo de suspensión)6.

Determinación del reflejo de agarre de las extremidades posteriores . Para cuantificar el reflejo de agarre de las extremidades posteriores, se suspendió a los ratones de la punta de la cola y se registró la posición natural que adoptaba cada ratón tomando una fotografía del animal. A continuación, en un análisis a ciegas, se determinó la forma del ángulo entre la extremidad posterior derecha y el eje longitudinal del cuerpo del ratón utilizando un transportador.

Extracción de proteína de los tejidos de los ratones. Para la extracción de proteínas, se homogeneizaron secciones de tejido mediante un homogeneizador de molino de perlas OMNI Bead Ruptor 24 (Fisher Scientific, 15515799), previamente suspendido la sección de tejido en el reactivo de extracción de proteínas de tejido T-PER (Cat. No.

78510, Thermo Scientific, Ins. Madrid, España,) en una proporción de 1:8 (peso/volumen), y se congelaron tres veces más en nitrógeno líquido. La concentración de proteínas se determinó con el reactivo Bradford (Cat. No. 5000001, Bio-Rad, Inc. Madrid, España) usando Albúmina de Suero Bovino (BSA) como estándar.

Cultivos neuronales del ganglio de la raíz dorsal. Los ganglios de la raíz dorsal (DRG) se obtuvieron a partir de ratones recién nacidos (día postnatal 0-2) de tipo salvaje (WT) y Gdapl knockout (Gdapl-/-) según7. Los ganglios se digirieron en colagenasa (Worthington, EE.UU.) y tripsina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.), se disociaron por trituración y se aplicaron en DMEM-F12 que contenía 50 ng/mL de NGF (Tebu-Bio, Le-Perray-en-Yvelines, Francia), 10% de suero bovino fetal y 5 ng/mL de afidicolina (A.G. Scientific, San Diego, CA, EE.UU.). Las neuronas DRG fueron sembradas en polilisina y recubiertas de laminina (1 pg/mL) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) y usado para la experimentación entre 2-4 DIV, (Días in vitro).

Impresión y procesamiento de los reverse phase protein arrays (RPPAs). Los extractos de proteínas de las biopsias de tejidos se diluyeron con T-PER (Tissue Protein Extraction Reagent) hasta una concentración final de proteínas de 2 pg/pl (p/v). Antes de la impresión, las muestras se diluyeron con PBS (Tampón fosfato salino) hasta una concentración final de proteínas de 0,5 pg/pl (p/v). También se prepararon extractos de proteínas diluidas en serie (0-1,5 pg/pl (p/v)) derivadas del mioblasto de ratón C2C12 y de las células de carcinoma colorrectal humano HCT116 para evaluar la calidad de la impresión y la respuesta lineal del reconocimiento de proteínas por los anticuerpos utilizados8. También se prepararon curvas estándar de BSA (0-2 pg/pl) e IgG (inmunoglobulina G) de ratón (1-30 ng/pl) como controles internos negativos y positivos, respectivamente.

Se añadió una gota de 1,5 nl aproximadamente de cada muestra en láminas de vidrio revestidas de nitrocelulosa (almohadilla ONCYTE® SuperNOVA 8 - Grace Bio-Labs, 705118). Cada muestra se analizó por triplicado o quintuplicado. Las gotas se añadieron utilizando una impresora de sistema pico ÍTWO-300P (M2-Automation, Inc.) equipada con un microdispensador impulsado por un piezoeléctrico (PDMD) de 30-150 pL a una humedad constante de la cámara (HR 52%) y temperatura (16 °C), y una temperatura de la placa (10 °C).

Después de la impresión, las láminas se dejaron secar y posteriormente se bloquearon con el tampón de bloqueo Super G (Cat. No. 10501, Grace Biolabs, Madrid, España). Después, las láminas se incubaron durante la noche a 4 °C con las diluciones indicadas de los anticuerpos primarios listados en la Tabla 1.

Tabla 1: Listado de anticuerpos primarios empleados

Tras la incubación, las láminas se lavaron con la solución de tampón fosfato salinotween, PBS-T y se incubaron más tarde con anticuerpos de cabra anti-ratón o cabra anti-conejo altamente cruzados conjugados con CF™ 647 (Sigma Aldrich, SAB4600183 - SAB4600185; 1:500, Madrid, España). Se utilizaron láminas incubadas directamente con anticuerpos secundarios y con 0,0001% Fast Green FCF (Cat. No. F7252, Sigma Aldrich, Madrid, España) para evaluar posibles uniones inespecíficas a los IgG de ratón no enmascarados y la cantidad total de proteína presente en las gotas de las muestras, respectivamente.

Los microarrays fueron escaneados usando el escáner Typhoon 9410 (GE Healthcare, Inc. Madrid, España). La intensidad media de fluorescencia de las manchas se midió utilizando GenePix® Pro 7 (EE.UU.) y se normalizó en relación con la cantidad de proteína contenida en la muestra obtenida de la almohadilla de tinción FCF. Después de la cuantificación, la intensidad fluorescente relativa se convirtió en unidades arbitrarias de proteína expresada/ng de proteína en el extracto utilizando como estándar el gráfico lineal de la línea celular C2C129,10.

Análisis estadístico. Los resultados que se muestran en las figuras son medias ± SEM (error estándar de la media). El análisis estadístico fue realizado por la prueba t de Student. Las pruebas estadísticas fueron de dos colas en el nivel del 5% de significación. Los análisis estadísticos se realizaron usando Excel Microsoft 365 y GraphPad Prism 7.

B. Ejemplos de realización

Ejemplo 1: El florfenicol activa la respiración mitocondrial de las células de neuroblastoma SH-SY5Y

El florfenicol (Figura 1A), un análogo sintético fluorado del tiamfenicol con actividad bacteriostática tuvo un gran efecto estimulante sobre la respiración mitocondrial en la línea celular SH-SY5Y (Figura 1B). De hecho, el tratamiento de las células SH-SY5Y con este compuesto aumentó significativamente la respiración basal, OSR y máxima de las células. Estos resultados demuestran que el florfenicol tiene una acción directa en la actividad mitocondrial.

A continuación, se probó el efecto del tratamiento con florfenicol en 2 modelos de estudio de CMT, el primero células SH-SY5Y (G4) GDAPI-knockdown (Figura 2A) y el segundo, neuronas postnatales de los ganglios de la raíz dorsal (DRG) de los ratones de tipo silvestre y Gdapl-null, (Figura 2B) un modelo de ratón de la enfermedad CMT5, concretamente de la forma recesiva axonal del relacionado con GDAP1. En ambos casos se incubaron durante 24 horas con florfenicol, este tratamiento estimuló significativamente la basal, la OSR y la respiración máxima de las células deficientes en GDAP1 (Figura 2). Estos resultados demuestran que el florfenicol es un potencial fármaco para el tratamiento de la enfermedad CMT.

Ejemplo 1: Efectividad del florfenicol en la prevención de la aparición y desarrollo de los síntomas de la CMT en ratones deficientes en Gdapl

Se administró florfenicol a ratones Gdapl-null desde el momento del destete y hasta los 10 meses de edad (Figura 3A). También se incluyó un grupo de ratones salvajes y Gdapl-null no tratados.

A los siete meses de edad, observamos que los ratones Gdapl-null mostraban un aumento significativo de peso corporal en comparación con los de tipo salvaje. Por el contrario, el florfenicol evitó el aumento de peso corporal de los ratones Gdapl-null (Figura 3B, panel superior). El aumento de peso es un problema serio en los pacientes con CMT porque los músculos debilitados les dificultan mantenerse activos. De acuerdo con esto, el aumento progresivo de peso observado en los ratones Gdapl-null debido a la acumulación de grasa visceral se evitó al tratar dichos ratones con florfenicol presumiblemente porque al evitar la debilidad muscular permitieron a los ratones tener la misma actividad que los ratones control, o WT.

Sin embargo, la coordinación motora de los grupos de ratones estudiados, evaluada con el rotarod en ratones de las 3 condiciones a 7 meses de edad, no reveló diferencias significativas entre ellos.

A los 10 meses de edad, los ratones Gdapl-null no tratados seguían mostrando un aumento relevante del peso corporal en comparación con los ratones de tipo salvaje (Figura 3B, fotografías). El tratamiento con florfenicol disminuyó significativamente el aumento de peso corporal de los ratones Gdapl-null (Figura 3B panel inferior).

La CMT relacionada con alteraciones genéticas en GDAP1 promueve la debilidad y el desgaste de pies y manos, dando lugar a deficiencias motoras y pérdidas de sensibilidad, lo que lleva a una pronunciada discapacidad de los pacientes. De forma similar a lo descrito para los pacientes, a los 10 meses de edad observamos un reflejo anormal de cierre de la extremidad posterior en ratones Gdapl-null no tratados con florfenicol, evaluado por la forma del ángulo entre la extremidad posterior derecha y el eje del cuerpo, cuando se comparan con los ratones de tipo silvestre (Figura 3C, fotografías). Notablemente, el tratamiento de los ratones con florfenicol mejoró significativamente el reflejo de cierre de las extremidades traseras de los animales (Figura 1C, panel inferior), por lo tanto, el tratamiento de la presente invención mejoró la prevención de la aparición de los síntomas de la CMT.

La determinación de la fuerza muscular de las extremidades delanteras y la fuerza máxima realizada por dichas extremidades se evaluaron mediante las pruebas de colgado de dos y cuatro extremidades (Figuras 4A y 4C imágenes) y fuerza de agarre (Figura 4B). Tanto el máximo tiempo de suspensión (Figura 4A, panel superior) como el impulso de sujeción mínimo (Figura 4A, panel inferior) se redujeron significativamente

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en los ratones Gdapl-null no tratados cuando se compararon con los ratones salvajes o WT en la prueba de colgado con 2 extremidades. El tratamiento de los ratones con florfenicol mejoró significativamente la fuerza muscular de las extremidades delanteras (Figura 4A). Se obtuvieron resultados similares en la prueba de fuerza de agarre (Figura 4B) lo que apoya la conclusión de que el tratamiento con florfenicol previene el desgaste de los músculos de las extremidades delanteras de los ratones Gdapl-null.

La fuerza muscular de las cuatro extremidades se determinó por la habilidad de los ratones para oponerse a su peso haciendo uso de las mismas, mediante una prueba similar a la de colgado de dos extremidades (Figura 4C). Tanto el máximo tiempo de suspensión (Figura 4C, panel superior) como el impulso de sujeción mínimo (Figura 4C, panel inferior) se redujeron significativamente en los ratones Gdapl-null no tratados cuando se compararon con los ratones salvajes. El tratamiento de los ratones con florfenicol mejoró significativamente la fuerza muscular de las cuatro extremidades (Figura 4C), lo que demuestra que el tratamiento con este compuesto previene el desgaste muscular de las extremidades en los ratones Gdapl-null.

Finalmente, la coordinación motora se evaluó mediante la prueba del rotarod (Figura 4D). En ratones con 10 meses de edad, se observó que la latencia de caída se redujo significativamente en los ratones Gdapl-null (Figura 4D), reforzando aún más la conclusión de que el florfenicol actúa como “colector” de especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales desde la vida temprana previniendo la aparición del fenotipo de pérdida de músculo deletéreo característico de la enfermedad CMT en el modelo de ratón Gdapl-null.

Sin embargo, en el caso concreto de las alteraciones motoras, si el florfenicol se administra cuando los síntomas ya se han desarrollado (7 meses tras el nacimiento de los ratones Gdap1 KO) los síntomas no desaparecen, por lo menos para el control de estos síntomas es necesario administrar la composición farmacéutica antes de que aparezcan.

Ejemplo 2: Efectividad del florfenicol en la prevención de la degradación del proteoma mitocondrial redox en ratones deficientes de Gdapl

Se ha publicado que pacientes de la enfermedad CMT sufren una reducción de enzimas implicadas en el metabolismo energético y en la manipulación de ROS como resultado de la lesión de terminales nerviosas epidérmicas1. De manera similar, los nervios periféricos del modelo de ratón de la enfermedad CMT, Gdapl-null también muestran una reducción de las enzimas del metabolismo energético y de la respuesta antioxidante5. Por lo tanto, a continuación, exploramos el efecto del florfenicol en la expresión de determinadas proteínas del metabolismo energético y de la respuesta al estrés oxidativo en extractos de tejido derivados de los nervios ciáticos, de ratones Gdapl-null (Figura 5), utilizando una aproximación cuantitativa de alto rendimiento denominada reverse phase protein arrays (RPPAs)8,9. Los nervios periféricos de los ratones Gdapl-null mostraron una pérdida significativa de las enzimas implicadas en la oxidación de la glucosa y la respiración mitocondrial (LDHA, PDH, IDH1 y CORE2) y de la respuesta antioxidante (GR, SOD1, catalasa y SOD2) en comparación con los ratones de tipo salvaje (Figura 5). De acuerdo con esta última observación, la modificación oxidativa de las proteínas celulares por la MDA y la 4HNE aumentó significativamente en los ratones Gdapl-null (Figura 5). Otras proteínas no mostraron cambios significativos (Figura 5), aunque en la mayoría de ellos se observa una tendencia decreciente (ENO1, MDH2, HADHA, |3F1 y OPA1).

Notablemente, el tratamiento con florfenicol previno y/o aumentó significativamente la expresión de un gran número de proteínas del metabolismo energético (ENO1, LDHA, PDH, IDH, CORE2, |3F1), en la respuesta antioxidante (GR, catalasa y SOD2) y la proteína 4HNE, involucrada en estrés oxidativo, en los nervios ciáticos de los ratones Gdapl-null (Figura 5). Otras proteínas no mostraron cambios significativos, aunque en la mayoría de ellos se observa una tendencia a recuperar los niveles similares de los ratones WT, o control (MDH2, CORE2, OPA1 y SOD1) (Figura 5).

De forma análoga a la determinación de los efectos del florfenicol en extractos de nervios ciáticos, también se comprobó el efecto de este compuesto en otros tejidos como el hígado (Figura 6), cerebelo (Figura 7) y músculo (Figura 8). El tratamiento con florfenicol no causó efectos adversos en otros tejidos del cuerpo.

Estos resultados apoyan firmemente a nivel molecular que las alteraciones en el metabolismo energético y redox que se produce en los ratones Gdapl-null durante el desarrollo pueden prevenirse y tratarse mediante el tratamiento con el antioxidante florfenicol, siendo este tratamiento efectivo y seguro, sin efectos secundarios.

Referencias

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2. Soldevilla, Beatriz et al. “Plasma metabolome and skin proteins in Charcot-Marie-Tooth 1A patients.” PloS one vol. 12,6 e0178376. 2 Jun. 2017, doi:10.1371/journal.pone.0178376

3. Pla-Martin, D., Rueda, C.B., Estela, A., Sanchez-Piris, M., Gonzalez-Sanchez, P., Traba, J., de la Fuente, S., Scorrano, L., Renau-Piqueras, J., Alvarez, J., Satrustegui, J., et al. (2013). Silencing of the Charcot-Marie-Tooth disease-associated gene GDAP1 induces abnormal mitochondrial distribution and affects Ca2+ homeostasis by reducing store-operated Ca2+ entry. Neurobiol. Dis. 55, 140-151.

4. Nuevo-Tapioles, C., Santacatterina, F., Stamatakis, K., Nunez de Arenas, C., Gomez de Cedron, M., Formentini, L., and Cuezva, J.M. (2020). Coordinate betaadrenergic inhibition of mitochondrial activity and angiogenesis arrest tumor growth. Nat Commun 11,3606.

5. Barneo-Muñoz, Manuela et al. “Lack of GDAP1 induces neuronal calcium and mitochondrial defects in a knockout mouse model of charcot-marie-tooth neuropathy.” PLoS genetics vol. 11,4 e1005115. 10 Apr. 2015, doi:10.1371/journal.pgen.1005115

6. Aartsma-Rus, Annemieke, and Maaike van Putten. “Assessing functional performance in the mdx mouse model.” Journal of visualized experiments : JoVE ,85 51303. 27 Mar. 2014, doi:10.3791/51303

7. Cabrera, Jorge Rubén et al. “Secreted herpes simplex virus-2 glycoprotein G modifies NGF-TrkA signaling to attract free nerve endings to the site of infection.” PLoS pathogens vol. 11,1 e1004571.22 Jan. 2015, doi:10.1371/journal.ppat.1004571

8. Santacatterina, Fulvio et al. “Different mitochondrial genetic defects exhibit the same protein signature of metabolism in skeletal muscle of PEO and MELAS patients: A role for oxidative stress.” Free radical biology & medicine vol. 126 (2018): 235-248. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2018.08.020

9. Santacatterina, Fulvio et al. “Quantitative analysis of proteins of metabolism by reverse phase protein microarrays identifies potential biomarkers of rare neuromuscular diseases.” Journal of translational medicine vol. 13 65. 18 Feb. 2015, doi:10.1186/s12967-015-0424-1

10. Santacatterina, Fulvio et al. “Pyruvate kinase M2 and the mitochondrial ATPase Inhibitory Factor 1 provide novel biomarkers of dermatomyositis: a metabolic link to oncogenesis.” Journal of translational medicine vol. 15,1 29. 10 Feb. 2017, doi:10.1186/s12967-017-1136-5

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende florfenicol para su uso en el tratamiento de los síntomas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth de un paciente.

2. La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, en la que los síntomas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth son uno o más de los siguientes: deficiencias motoras, pérdida sensorial, deficiencias ópticas, parálisis diafragmática y/o parálisis de las cuerdas vocales.

3. La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, en el que las deficiencias motoras comprenden alteraciones motoras, deficiencias motoras de las extremidades inferiores, pérdida de masa corporal en las piernas y los pies, arcos de los pies elevados, dedos de los pies doblados y/o dificultad para flexionar el talón.

4. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el tratamiento de los síntomas comprende la prevención del agravamiento de los síntomas.

5. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el tratamiento de las deficiencias motoras comprende la prevención de la aparición de las alteraciones motoras.

6. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la causa de la enfermedad se debe a alteraciones genéticas en GDAP1 y/o MFN2.

7. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, en la que la enfermedad Charcot-Marie-Tooth se selecciona entre AR-CMT2K, CMT2K y CMT4A.

8. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 o 6, en la que la enfermedad Charcot-Marie-Tooth es AR-CMT2A2.

9. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende al menos uno o más de los siguientes:

- al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, y

- al menos un aditivo farmacéuticamente aceptable.

10. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 9, que se administra por vía oral

11. La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, en el que la concentración de florfenicol es de 0,001 a 500 mg/ml.

12. La composición farmacéutica según la reivindicación 10, en el que la concentración de florfenicol es de 1 mg/kg a 1000 mg/kg.

13. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el tratamiento de los síntomas se realiza antes de la aparición de los síntomas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.

14. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la dosis administrada es de 0,0001 hasta aproximadamente 1000 mg/kg peso corporal por día.