CN1754871A - 一枝蒿酮酸的制备方法及用途 - Google Patents

一枝蒿酮酸的制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一枝蒿中提取的单体化合物一枝蒿酮酸的制备方法及用途，采用常规层析和液相结合的方法制备一枝蒿酮酸，首先进行原料处理：将一枝蒿全草粉碎后用乙醇回流提取，再将提取液合并，减压浓缩成膏状，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩拌硅胶上100－200目硅胶柱，用石油醚－乙酸乙酯洗脱，洗脱下来的产品浓缩备用；将层析的粗品溶于甲醇溶液，超声，用半制备高效液相色谱法纯化，收集保留的组分，将其减压浓缩后置恒温干燥箱内干燥，得到无色棒状结晶；将一枝蒿酮酸用于在制备乙型肝炎病毒的抑制和保肝作用的药物用途。

Description

一枝蒿酮酸的制备方法及用途
                       技术领域
本发明涉及一枝蒿酮酸的制备方法及制药用途，尤其是在制备乙型肝炎病毒的抑制和保肝作用的药物用途。
                      背景技术
病毒性肝炎、肝损伤是损害人类健康的疾病，其中病毒性肝炎是严重危害人类健康的全球性传染病，病人预后差，大多数病人转为慢性，可能发展成肝硬化等。病毒性肝炎引起的肝损伤主要由机体免疫应答反应所介导，当病毒激活机体免疫系统后，产生致敏淋巴细胞和特异性抗体，特别是病毒特异性细胞毒性T细胞。它们不但能与体内病毒起反应而加以杀灭，而且也因受病毒感染的肝细胞表面带有病毒抗原而引起肝损伤，导致肝细胞变性肿胀和坏死。目前，对于这类病中西医疗效不十分令人满意。例如，西药干扰素对肝炎病毒消除有一定疗效，但经临床效果不理想，不能杀灭病毒，而且用药时间长，药费较高。中成药类在治疗病毒性肝炎和保肝方面各有所不同，有的中药偏重于清热解毒，有的着重于活血化淤，有的滋补肝肾等，这些药物都各有其不足。临床久服苦寒药物，可伤脾肾，减少食欲、消化及吸收。另外，许多药物必须在肝脏内进行氧化、分解、排泄，有的也可直接导致肝脏损害，反而对肝病痊愈不利。
                        发明内容
本发明的目的是提供一枝蒿酮酸的制备方法及制药用途，具体来说，是采用常规层析和液相结合的方法制备一枝蒿酮酸，及在制备乙型肝炎病毒的抑制和保肝作用药物的用途。
本发明所述的一枝蒿酮酸的制备方法及用途，采用常规层析和液相结合的方法制备一枝蒿酮酸，首先进行原料处理：将一枝蒿全草粉碎后用95％乙醇回流提取4次，时间分别为1-5h，30min-4h，15min-2h，30min-5h，再将提取液合并，减压浓缩成膏状，用乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩拌硅胶上100-200目硅胶柱，用石油醚30-60℃-乙酸乙酯3∶1，V/V洗脱，洗脱下来的产品浓缩备用；标准品制备：将层析的粗品溶于甲醇溶液，超声30min，用半制备高效液相色谱法纯化，收集保留时间为18.5min的组分，将其减压浓缩60℃后置恒温干燥箱内干燥24h，40℃，最后得到无色棒状结晶。
一枝蒿酮酸在制备乙型肝炎病毒的抑制和保肝作用的药物用途。
新疆一枝蒿(Artemisia rupestris L.)系菊科植物，产于新疆维吾尔自治区境内的天山及阿尔泰山山脉，是哈萨克族民间传统用药[1]，具有解毒、抗过敏[2]、抗菌、抗病毒及保肝等功效。临床用于肝炎、感冒、咽炎、扁桃体炎、眼炎的治疗。一枝蒿中含有黄酮类、酮酸类、氨基酸类、甙类、多糖类、挥发油、多肽、生物碱等化合物[3]。酮酸是一枝蒿主要有效成分之一，新疆药物研究所已对一枝蒿酮酸进行了分离及结构鉴定，采用的为常压硅胶柱法。但目前尚未见用半制备色谱对一枝蒿酮酸进行分离制备的报道。因此为了对一枝蒿进行药物质量控制，本文采用常规层析和高效液相结合的方法制备一枝蒿酮酸。方法简便易行，产品纯度可达98％以上。
一枝蒿酮酸的结构
Figure A20041008481800041
一枝蒿酮酸在制备乙型肝炎病毒的抑制和保肝作用的药物用途。
一枝蒿酮酸由新疆维吾尔医研究所提供，为研究其对乙型肝炎病毒的抑制和保肝作用，本实验在体外2.2.15细胞培养系中检测一枝蒿酮酸对乙型肝炎病毒HBsAg、HBeAg及HBV-DNA表达的抑制作用。本实验中采用乙型肝炎病毒DNA克隆转染的人肝癌细胞(Hep-G2)的2.2.15系，观察所试药物一枝蒿酮酸在不同浓度下对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的影响。结果显示：在三批实验中一枝蒿酮酸所试的4个剂量对2.2.15细胞分泌HBsAg均有明显的抑制作用。与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，且在250ug/ml、125ug/ml、62ug/ml、31ug/ml剂量范围内呈现良好的量效相关性。阳性对照药拉米呋啶对2.2.15细胞分泌HBsAg无抑制作用。观察一枝蒿酮酸的保肝、免疫调节和抗自由基作用，一枝蒿酮酸动物实验灌胃给药80、160、320mg/kg，qd，5-7d，明显降低CCL4致肝损伤小鼠的血清GPT和GOT的含量；显著降低D-氨基半乳糖氨盐酸盐致急性肝损伤小鼠的血清GPT、GOT及ALP含量；并能降低小鼠免疫性肝损伤小鼠的血清GPT的含量。提示，一枝蒿酮酸具有明显的保肝作用。
                  附图说明
图1为本发明样品半制备高效液相色谱图
图2为本发明酮酸标准品的分析型高效液相色谱图
图3为本发明各给药组HBV-DNA荧光定量PCR检测曲线图
图4为本发明荧光定量PCR标准曲线图
图5为本发明荧光定量PCR标准曲线图
                       具体实施方式
实施例
(一)一枝蒿酮酸的制备方法及用途，采用常规层析和液相结合的方法制备一枝蒿酮酸，首先进行原料处理：将一枝蒿全草粉碎后用95％乙醇回流提取4次，时间分别为1-5h，30min-4h，15min-2h，30min-5h，再将提取液合并，减压浓缩成膏状，用乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩拌硅胶上100-200目硅胶柱，用石油醚30-60℃-乙酸乙酯3∶1，V/V洗脱，洗脱下来的产品浓缩备用；标准品制备：将层析的粗品溶于甲醇溶液，超声30min，用半制备高效液相色谱法纯化，收集保留时间为18.5min的组分，将其减压浓缩60℃后置恒温干燥箱内干燥24h，40℃，最后得到无色棒状结晶。
1实验方法
1.1仪器与试剂：Dionex半制备高效液相色谱仪，DionexUVD170U/340U UV/VIS检测器，Foxy Jr.馏分收集器，10ml定量环。Waters2690分析型高效液相色谱仪，996PDA检测器。RE-52C型旋转蒸发器(巩义市英予华仪器厂)，Yanaco熔点仪，硅胶和硅胶板(青岛海洋化工厂)，色谱纯甲醇，乙腈(Fisher公司)，二次重蒸水，其他试剂均为分析纯。
1.2原料处理：一枝蒿全草10kg粉碎后用95％乙醇回流提取4次，分别为1-5h，30min-4h，15min-2h，30min-5h，。将提取液合并，减压浓缩成膏状，以乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩拌硅胶上100-200目硅胶柱，石油醚(30-60℃)-乙酸乙酯(3∶1，V/V)洗脱，洗脱下来的产品浓缩备用。
1.3色谱条件
1.3.1半制备型HPLC：YMC-Pack ODS-A柱(20mmI.D.×250mm，5μm)；柱温：室温；检测波长：245nm；流动相：甲醇-0.2％甲酸水溶液(65∶35，V/V)；流速：8.0ml/min。
1.3.2分析型HPLC：YMC-Pack ODS-A柱(4.6mmI.D.×250mm，5μm)；柱温：室温；检测波长：210--400nm；流动相：甲醇-0.2％甲酸水溶液(70∶30，V/V)；流速：1.0ml/min。
1.4标准品制备：将层析的粗品溶于甲醇溶液，超声30min，用半制备高效液相色谱法纯化，收集保留时间为18.5min的组分，见图1。将其减压浓缩(60℃以下)后置恒温干燥箱内干燥24h(40℃)，最后得到无色棒状结晶。
结果与讨论
2.1制备样品的纯度检测
熔点(mp)测定：132-133℃薄层色谱检测：采用两种展开体系进行检测，薄层板用硅胶GF254板。展开剂A为石油醚-乙酸乙酯-乙酸(体积比为20∶10∶1)，RfA为0.45；展开剂B为正己烷-乙醚-乙酸(体积比为5∶10∶1)，RfB为0.61。紫外254nm下见红色斑点，无杂质点。
HPLC检测：产物经分析型高效液相色谱检测，见图2，采用归一化法定量，其纯度大于98％。
结构鉴定
IRvkBr max(cm-1)：3200，2900，1704，1658，1616，950。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ0.65(3H，d，J＝7.1Hz，H-15′，15″，15″′)，0.83(1H，q，J＝16.33Hz，H-10)，1.60(3H，s，H-14′，14″，14″′)，1.75(2H，m，J＝32.69Hz，H-9′，9″)，2.10(2H，m，J＝51.43Hz，H-8′，8″)，2.45(2H，q，J＝31.7Hz，H-2′，2″)，2.60(1H，dd，J＝18.80Hz，6.41Hz，H-7)，2.88(2H，q，J＝41.42Hz，H-6′，6″)，5.73(1H，d，J＝40.14Hz，H-13″)，6.36(1H，d，J＝23.77Hz，H-13′)。
13C-NMR(400MHz，CDCl3)：8208.536(C-12)，174.693(C-3)，171.454(C-5)，145.598(C-4)，137.798(C-11)，125.521(C-13)，45.950(C-14)，41.314(C-2)，38.353(C-6)，37.690(C-7)，36.564(C-8)，35.284(C-1)，31.589(C-9)，12.124(C-10)，8.022(C-15)。
2.3流动相的选择
实验中选择了多种流动相条件。选用乙腈-水系统，酮酸保留时间过短，而且拖尾；选用未加酸的甲醇-水系统，除了保留时间过短外，主峰与杂质峰重叠现象严重。最后我们选用甲醇-0.2％甲酸水溶液，甲酸沸点与水相近，易与水一起蒸出，不会引起产品纯度降低[5]。并确定了制备时的最佳配比甲醇-0.2％甲酸水溶液(65∶35，V/V)，分析时的最佳配比甲醇-0.2％甲酸水溶液(70∶30，V/V)，这样使主峰与杂质峰达到了基线分离。
2.4HPLC归一化法测含量的条件选择
因为酮酸为首批标化的定量用标准品，所以选定了245nm，254nm，238nm和230nm四个检测波长。选用了乙腈-水(70∶30，V/V)和甲醇-0.2％甲酸水溶液(67∶33，V/V)两种溶剂系统做归一化含量测定，以几种测定方法结果的平均值作为含量测定结果。
3、结论
本实验建立的制备一枝蒿酮酸的方法，操作方便，重现性好，制备的产品纯度高。
(二)一枝蒿酮酸在制备乙型肝炎病毒的抑制和保肝作用的药物用途。
实验材料：
1.受试药物：一枝蒿酮酸，由新疆维吾尔医研究所提供，黑棕色粉末。实验前用高纯水配制成20mg/ml的母液，过滤除菌，4℃保存备用。实验时用2.2.15细胞培养液配制成所需浓度。
2.2.2.15细胞：乙型肝炎病毒DNA克隆转染的人肝癌细胞(Hep-G2)的2.2.15系，由北京大学第一附属医院病毒室提供。由我室传代保存。
3.试剂：乙型肝炎表面抗原检测试剂盒、乙型肝炎e抗原检测试剂盒，批号；040210，为华美生物工程公司产品；乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR检测试剂盒安达基因诊断中心产品，批号：2004008；G418；Engls培养液，日本产品。酶标仪750，Bayer公司产品；ABI5700荧光定量PCR仪。
4.阳性对照药：拉米呋啶，葛兰史克制药有限公司产品批号：03100055。实验前用高纯水配成20mg/ml的原药液，过滤消毒备用。
方法及结果
1.对2.2.15培养细胞无毒浓度的确定
取生长旺盛的2.2.15细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔100ul，待长成单层后，到掉培养液，加入不同稀释度的药液，每个稀释度同时做4个复孔，置37C 5％CO2培养箱中培养，第四天换一次药液，每天倒置显微镜下观察细胞形态，连续8天，□确定细胞不出现明显退变的最低稀释倍数(最大浓度)，实验时顺延做到最小有效浓度(即最大稀释倍数)。按Reed-Muench法计算50％毒性浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。细胞病变按六级标准判断。
□□□     -：细胞生长正常，无病变出现；
□□□     ±：细胞病变少于整个单层的10％；
□□□     1：细胞病变约占整个单层细胞的25％以下；
□□□     2：细胞病变约占整个单层细胞的50％以下；
□□□     3：细胞病变约占整个单层细胞的75％以下；
□□□     4：细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。
表1   一枝蒿酮酸对2.2.15培养细胞的毒性
药物 指标                            不同浓度药物的细胞病变(CPE mg/ml)
  1   0.5   0.25   0.125   0.062   0.031   0.015
  一枝蒿酮酸   CPE病变％   4444100％   4444100％   ----0％   ----0％   ----0％   ----0％   ----0％
  拉米呋啶   CPE病变％   4444100％   4444100％   4444100％   4444100％   222250％   ----0％   ----0％
表2   一枝蒿酮酸对2.2.15培养细胞的TC0 TC50(mg/ml)
  药液   母液   TC0   TC50
  一枝蒿酮酸拉米呋啶   20mg/ml20mg/ml   0.250.031   0.1870.062
表1、2结果显示：一枝蒿酮酸对2.2.15培养细胞的TC0为0.25mg/ml，TC50为0.187mg/ml因此实验时将其作为最大浓度并顺延4个浓度。
2.对2.2.15细胞培养系分泌HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的影响
取已长成单层细胞的2.215细胞培养板(24孔)，倒掉培养液，加入无毒浓度以下相应稀释度的药液，浓度分别为：0.25、0.125、0.062和0.031mg/ml，1ml/孔，每个稀释度做6个复孔，同时设拉米呋啶对照药及细胞对照。置37℃5％CO2培养箱中培养，第8天收集上清，三批实验所收集的上清同时测定HBsAg、HBeAg和HBV-DNA。HBsAg、HBeAg采用酶联免疫吸附方法测定，HBV-DNA采用荧光定量PCR法，计算抑制率。
Figure A20041008481800101
见表3-表5
  表3    AR胶囊对2.2.15培养细胞分泌HBsAg的影响
  批次   药物   指标                                                  不同浓度药物的细胞病变(CPE)
  250(ug/ml)   125(ug/ml) 62(ug/m1) 31(ug/ml) 16(ug/ml)   7.8(ug/ml) 3.9(ug/ml)
第一批   AR胶囊拉米呋啶细胞对照   OD值抑制率％OD值抑制率％   0.10±0.03**51.390.21±0.05   0.10±0.01**51.47   0.11±0.02**46.89   0.11±0.02**44.720.20±0.05-39.970.14±0.06 0.14±0.010.36 0.13±0.0212.58 0.12±0.0613.81
  第二批   AR胶囊拉米呋啶细胞对照   OD值抑制率％OD值抑制率％   0.09±0.04**56.790.20±10.05   0.09±0.01**55.65   0.11±0.02**45.19   0.15±0.05**28.520.15±0.03-3.890.14±0.06 0.17±0.04-16.89 0.10±0.0228.83 0.08±0.0341.38
第三批   AR胶囊拉米呋啶细胞对照   OD值抑制率％OD值抑制率％   0.09±0.04**55.890.20±0.05   0.09±0.02**55.73   0.11±0.03**44.88   0.09±0.01**58.620.15±0.03-4.000.14±0.06 0.11±0.0221.88 0.10±0.0332.42 0.09±0.0237.23
与细胞对照组比较：**P＜0.01 *P＜0.05
表3结果显示：在三批实验中AR胶囊所试的4个剂量对2.2.15细胞分泌HBsAg均有明显的抑制作用，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01>，且在250ug/ml、125ug/ml、62ug/ml、31ug/ml剂量范围内呈现良好的量效相关性。阳性对照药拉米呋啶对2.2.15细胞分泌HBsAg无抑制作用。
表4  AR胶囊对2.2.15培养细胞分泌HBeAg的影响
  批次   药物   指标                                             不同浓度药物的细胞病变(CPE)
  250(ug/ml)   125(ug/ml) 62(ug/ml) 31(ug/ml) 16(ug/ml)   7.8(ug/ml) 3.9(ug/ml)
第一批   AR胶囊拉米呋啶细胞对照   OD值抑制率％OD值抑制率％   0.26±0.13*57.140.62±0.16   0.45±0.1027.89   0.43±0.2330.96   0.25±0.09**59.330.50±0.1119.830.62±0.16 0.37±0.1139.70 0.36±0.1241.18 0.27±0.0855.34
第二批   AR胶囊拉米呋啶细胞对照   OD值抑制率％OD值抑制率％   0.27±0.1339.000.45±0.18   0.34±0.0425.43   0.35±0.0923.19   0.37±0.1218.100.47±0.12-3.280.45±0.18 0.48±0.15-7.00 0.36±0.0619.14 0.28±0.1537.85
  第三批   AR胶囊细胞对照   OD值抑制率％   0.84±0.46*50.361.71±0.21   0.86±0.48*49.42   0.91±0.50*46.46   0.93±0.49*45.58
与细胞对照组比较：**P＜0.01  *P＜0.05
表4结果显示：在三批实验中AR胶囊所试的4个剂量对2.2.15细胞分泌HBeAg均有明显的抑制作用，第一、第三批实验组与对照组比较有显著性差异(P＜0.05>，第二批实验由于个别对照空细胞生长状态差抑制率较第，统计学无意义。阳性对照药拉米呋啶对2.2.15细胞分泌HBeAg无抑制作用。
 表5   AR胶囊对2.2.15培养细胞系中HBV-DNA合成的影响
  批次   药物   指标                                     不同浓度药物的HBV-DNA含量(copy/ml)
  250(ug/ml)   125(ug/ml)   62(ug/ml)   31(ug/ml)   16(ug/ml)   7.8(ug/ml)
第一批   AR胶囊拉米呋啶细胞对照   copy值抑制率％copy值抑制率％   1.88×10558.80**4.58×105   1.37×10570.01**   1.25×10572.73**   1.23×10573.06**2.32×10494.92** 1.93×10495.79** 1.41×10492.50**
第二批   AR胶囊拉米呋啶细胞对照   copy值抑制率％copy值抑制率％   3.44×105*34.725.27×105   1.75×10566.79**   8.43×10484.75**   2.03×10561.38*82.32×10495.58** 2.56×10495.13** 2.10×10493.88*8
与细胞对照组比较：**P＜0.01 *P＜0.05
表5结果显示：二批实验中AR胶囊对2.2.15细胞系中HBV-DNA的合成有明显的抑制作用，与细胞对照组比较有显著性差异P＜0.01 P＜0.05。阳性对照拉米咐啶对2.2.15细胞系中HBV-DNA的合成也有明显的抑制作用。
(三)一枝蒿酮酸体内抗鸭乙型肝炎病毒试验
采用重庆麻鸭乙型肝炎动物模型，观察一枝蒿酮酸体内抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的作用。试验中一枝蒿酮酸采用三个剂量：15mg.Kg-1.D-1、30mg.Kg-1.D-1、60mg.Kg-1.D-1，口服治疗28天，停药观察7天，检测用药前、用药后不同时间点及停药后血清中DHBV DNA、DHBsAg的改变情况。结果显示：一枝蒿酮酸大、中剂量组分别于用药14天、21天开始出现血清DHBV DNA滴度降低(P＜0.05)，小剂量组于用药28天出现血清DHBV DNA滴度降低(P＜0.01)，停药7天后DHBV DNA均无明显回升现象；用药期间除病毒对照组(淀粉胶囊)外，一枝蒿酮酸大、中剂量组给药7天后血清DHBsAgO.D值明显降低(P＜0.01)、小剂量组给药28天后血清DHBsAgO.D值明显降低(P＜0.01)、至停药7天血清DHBsAgO.D值与用药前比较仍有持续降低(P＜0.01)。试验结果表明一枝蒿酮酸在鸭体内有抑制鸭乙型肝炎病毒的作用，且有良好的量效相关性。
试验目的：
观察一枝蒿酮酸体内抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的作用，为治疗乙型肝炎病人提供临床前研究资料。
实验材料
1.受试药物：一枝蒿酮酸，由新疆维吾尔医研究所提供，黑棕色粉末，批号：YZH031222。用2号胶囊包装3mg～12mg/粒胶囊。
2.阳性对照药物：拉米呋啶，批号：B038238，葛兰素威康英国行动有限公司生产，压碎后自制成5mg/粒的胶囊。
3.动物：采用健康成年的重庆麻鸭产的蛋孵化的1日龄雏鸭，经腹腔接种0.1ml DHBV DNA阳性病毒血清。接种1周后，分别颈外静脉抽血，用地高辛标记的DHBV DNA探针经斑点杂交检测筛选出感染阳性鸭，饲养至2周龄作为实验动物。
方法和结果：
1、方法：
将感染阳性鸭55只随机分为5组：
(1)病毒对照组(11只)：用淀粉胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为500mg/只。。
(2)阳性药物对照组(12只)：用拉米夫定胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为50mg.Kg-1.D-1。
(3)一枝蒿酮酸小剂量组(10只)：每日口腔灌喂1次，剂量为15mg.Kg-1.D-1。
(4)一枝蒿酮酸中剂量组(10只)：每日口腔灌喂1次，剂量为30mg.Kg-1.D-1。
(5)一枝蒿酮酸大剂量组(12只)：每日口腔灌喂1次，剂量为60mg.Kg-1.D-1。
实验用药时间为28天，停药观察7天。观察指标如下：
(1)血清DHBV DNA改变情况：于用药前、用药7天、14天、21天、28天、停药7天分别颈外静脉抽血，分离血清于-20C保存待检。采用斑点杂交法，用罗氏公司的地高辛标记试剂盒制备DHBV DNA探针统一检测，用Vuego Scan(Brisa-620ST)扫描仪进行膜片扫描；用the Discovery Series Quantity One软件对斑点进行定量分析，斑点值为volume(volume＝intensity×mm2)。统计学采用spss软件，配对t检验。
(2)血清DHBsAg改变情况：于用药前、用药7天、14天、21天、28天、停药7天分别颈外静脉抽血，分离血清于-20C保存待检。将用药前后的血清统一对比检测，采用ELISA快速法、酶标阅读仪(Bio-TEK公司)490nm读取O.D值。统计学采用spss软件，配对t检验。
结果：
(1)用药前、中、后血清DHBV DNA滴度改变情况：病毒对照组(淀粉胶囊)用药期间血清DHBV DNA滴度较用药前明显升高(P＜0.01)。拉米夫定组用药7天后开始出现有血清DHBVDNA滴度降低(P＜0.01)，停药后有DHBV DNA有回升趋势，但与用药前比较，仍有明显降低(P＜0.01)。一枝蒿酮酸大、中剂量组分别于用药14天、21天开始出现有血清DHBV DNA滴度降低(P＜0.05)，小剂量组于用药28天出现血清DHBV DNA滴度降低(P＜0.01)，停药7天后DHBV DNA均无明显回升现象。见表6。
表6  用药前后血清DHBV DNA滴度改变情况( x±S)
  组别                                        DHBV DNA(volume)
用药前 用药7天 用药14天 用药21天 用药28天 停药7天
淀粉胶囊组拉米夫定组一枝蒿酮酸小剂量组一枝蒿酮酸中剂量组一枝蒿酮酸大剂量组   2118.87±362.682168.25±460.652610.60±521.082525.92±501.772906.33±267.27   2357.63±411.44**1872.74±377.00**2538.80±699.392266.32±614.762656.14±509.63   2543.40±506.19**1939.27±432.92*2755.97±796.882267.01±721.832641.14±388.94*   2722.19±556.65**1635.60±264.03**2375.61±769.292084.23±561.52*2495.21±485.19**   2651.80±518.38**1549.34±257.01**2033.46±622.31**1991.35±516.50*2312.86±542.91**   2572.17±460.56**1735.17±255.06**1996.23±522.44**1847.35±410.37**2213.52±410.84**
注：上表所列为各组DNA斑点volume值的平均数及标准差，统计学采用配对t检验(″*″：P＜0.05；″**″：P＜0.01)，为不同时间DNA斑点值与同组用药前DNA斑点值的比较。
(2)各组用药前、中、后血清DHBsAgO.D值改变情况：
随着时间的推移，各组DHBsAgO.D值呈现下降趋势，经统计学比较，病毒对照组(淀粉胶囊)用药前后血清DHBsAgO.D值的改变无统计学意义。一枝蒿酮酸大、中剂量组给药7天后血清DHBsAgO.D值明显降低(P＜0.01)、小剂量组给药28天后血清DHBsAgO.D值明显降低(P＜0.01)、至停药7天血清DHBsAgO.D值与用药前比较仍有持续降低(P＜0.01)。见表7。
                                  表7   各组用药前后血清DHBsAgO.D值改变情况( x±S)
  组别   用药前   用药7天   用药14天   用药21天   用药28天   停药7天
  淀粉胶囊组拉米夫定组AR胶囊小剂量组AR胶囊中剂量组AR胶囊大剂量组   0.503±0.4230.479±0.2780.837±0.4921.253±0.4870.905±0.665   0.595±0.5400.392±0.1960.814±0.5081.058±0.500**0.733±0.604*   0.556±0.4720.425±0.1940.856±0.4700.890±0.460**0.587±0.483**   0.438±0.3380.272±0.130**0.679±0.3910.806±0.432**0.473±0.379**   0.331±0.2810.213±0.097**0.456±0.268**0.708±0.417**0.429±0.311**   0.232±0.1370.161±0.072**0.397±0.263**0.393±0.174**0.203±0.119**
注：上表所列为各组DHBsAgO.D值平均数及标准差，统计学采用配对t检验。(″*″：P＜0.05，″*″：P＜0.01)，为不同时间DHBsAgO.D值与同组用药前DHBsAgO.D值的比较。
小结：
用DHBV感染鸭作为乙型肝炎动物模型来研究人类乙型肝炎发病机理、病毒复制过程及筛选有效的治疗药物，已为国内外学者所公认。1-3日龄雏鸭感染DHBV可维持长期病毒血症而无明显的自然转阴现象，因此，我们应用1日龄雏鸭经腹腔感染DHBV的方法来建立鸭乙型肝炎动物模型进行一枝蒿酮酸抗病毒疗效的考核，期望筛选出有抗乙型肝炎病毒作用的药物。并用对乙型肝炎病毒有明显抑制作用的核苷酸类似物拉米夫定作为阳性药物对照。
本次动物试验结果表明：一枝蒿酮酸大、中剂量组分别于用药14天、21天开始出现有血清DHBV DNA滴度降低(P＜0.05)，小剂量组于用药28天出现血清DHBV DNA滴度降低(P＜0.01)，停药7天后DHBV DNA均无明显回升现象，此外，一枝蒿酮酸大、中剂量组给药7天后血清DHBsAgO.D值明显降低(P＜0.01)、小剂量组给药28天后血清DHBsAgO.D值明显降低(P＜0.01)、至停药7天血清DHBsAgO.D值与用药前比较仍有持续降低(P＜0.01)。上述结果说明一枝蒿酮酸在鸭体内有抑制鸭乙型肝炎病毒的作用，且有良好的量效关系。
(四)一枝蒿酮酸的保肝作用研究
试验目的：观察一枝蒿酮酸的保肝，为药的临床研究提供临窗前研究资料。
材料
1、受试药物：一枝蒿酮酸由新疆维吾尔医研究所提供，批号：030502。本品为棕色至棕褐色粉末；气香，味微苦，有吸湿性。
2、阳性对照药：苦参素胶囊，其内容物为白色或类白色粉末和颗粒，五臭，味苦；江苏正大天晴药业股份有限公司生产，批号：030605。
3、实验试剂：四氯化碳，北京市新光化学试剂厂产品；北京科技协作中心精细化学分部产品；
4、实验仪器：全自动生化分析仪，意大利AUTOLAB；DT200型多功能电子天平，上海天平厂；TGL-16G低温离心机，上海科学仪器厂产品。
5、试验动物：昆明种小鼠，体重20±2g，SPF级，雌雄各半，均购上海斯莱克实验动物有限公司/中国科学院上海实验动物中心。
6、实验动物室：新疆维吾尔自治区维吾尔医研究所实验动物室适用范围为屏障环境(啮齿类)，使用动物为SPF级。实验动物使用许可证号：SYXK(新)2003-0002。
1.一枝蒿酮酸对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用
取昆明种小鼠80只，按下表随机分成8组，ig给药，每日1次，共7天。末次给药后2h，除空白对照组外其它各组小鼠ip0.1％四氯化碳花生油溶液10ml/kg。16h后眼球取血，常规分离血清，测定GPT、GOT含量。
表8一枝蒿酮酸对四氯化碳致肝损伤小鼠血清GPT、GOT的影响
                       (x±SD)
  组别   动物数   剂量(mg/kg)   GPT(iμ/L)   GOT(iμ/L)
  空白对照组肝损伤模型组苦参素胶囊组一枝蒿酮酸一枝蒿酮酸一枝蒿酮酸一枝蒿酮酸一枝蒿酮酸   1010101010101010   --50801603206401280   45.70±9.88218.90±104.99ΔΔΔ62.20±21.36***82.40±34.62***55.60±15.97***60.00±17.96***49.30±12.83***56.00±16.12***   145.00±21.96521.10±213.05ΔΔΔ163.70±32.88***172.60±39.48***162.10±37.98***158.90±33.09***135.20±25.42***128.30±20.08***
注：与正常组比较ΔΔΔp＜0.01，与模型组比较*p＞0.05，***p＜0.01。
结果表明：不同剂量的一枝蒿酮酸明显降低CCL4致肝损伤小鼠的血清GPT和GOT的含量。
2.一枝蒿酮酸对D-氨基半乳糖氨盐酸盐致小鼠急性肝损伤的保护作用
取昆明种小鼠60只，按下表随机分成6组，ig给药，每日1次，共7天。末次给药后1h，除空白对照组外其它各组小鼠ip D-氨基半乳糖800mg/kg，24h后眼球取血，常规分离血清，测定GPT、GOT、ALP含量。
表9  一枝蒿酮酸对D-氨基半乳糖氨盐酸盐致急性肝损伤小鼠血清GPT、GOT、
                    ALP的影响(x±SD)
  组别 动物数   剂量   GPT(mg/kg)(iμ/L)   GOT(iμ/L)   ALP(iμ/L)
  空白对照组肝损伤模型组苦参素胶囊组一枝蒿酮酸一枝蒿酮酸一枝蒿酮酸   101010101010   --5080160320   30.16±6.39209.16±87.90ΔΔΔ82.25±35.38***157.25±49.50***133.16±22.90***144.08±21.40***   125.00±17.69816.92±89.28ΔΔΔ173.33±45.27***510.75±155.3***413.92±76.72***356.42±61.24***   273.66±49.82881.92±174.94ΔΔΔ413.75±109.20***493.58±171.22***363.25±95.36***392.66±54.44***
注：与空白对照组比较ΔΔΔp＜0.01，与模型组比较***p＜0.01。
结果表明：三个不同剂量的一枝蒿酮酸明显降低D-氨基半乳糖氨盐酸盐致急性肝损伤小鼠的血清GPT、GOT及ALP含量。
3.一枝蒿酮酸对小鼠免疫性肝炎的预防作用
取昆明种小鼠72只，♀♂各半，按下表随机分成6组，在iv LPS前5天给药，每日1次，共5天。除空白对照组外其它各组小鼠尾静脉iv BCG 5×106个菌/鼠，12d后再iv LPS 7.5μg/鼠，造成免疫性肝炎模型，12h后眼球取血，常规分离血清，测定GPT、GOT含量。
表10   一枝蒿酮酸对小鼠免疫性肝炎的预防作用(x±SD)
  组别   动物数(只)   剂量(mg/kg)   GPT(iu/L)   GOT(iμ/L)
  空白对照组模型组苦参素胶囊组一枝蒿酮酸一枝蒿酮酸一枝蒿酮酸   121212121212   --5080160320   17.08±3.4559.75±18.30ΔΔΔ33.58±15.88***42.83±25.33*45.58±22.37*27.33±11.38***   140.92±27.84192.92±92.45156.67±54.92198.50±46.33181.92±35.92154.75±44.99
注：与空白对照组比较ΔΔΔp＜0.01，与模型组比较*p＞0.05，***p＜0.01。
结果表明：三个不同剂量的一枝蒿酮酸可降低小鼠免疫性肝损伤小鼠的血清GPT的含量。
结论
一枝蒿酮酸动物实验灌胃给药80、160、320mg/kg，qd，5-7d，明显降低CCL4致肝损伤小鼠的血清GPT和GOT的含量；显著降低D-氨基半乳糖氨盐酸盐致急性肝损伤小鼠的血清GPT、GOT及ALP含量；并能降低小鼠免疫性肝损伤小鼠的血清GPT的含量。提示，一枝蒿酮酸具有明显的保肝作用。

Claims (2)

1、一种从一枝蒿中提取的单体化合物一枝蒿酮酸的制备方法及用途，其特征在于采用常规层析和液相结合的方法制备一枝蒿酮酸，首先进行原料处理：将一枝蒿全草粉碎后用95％乙醇回流提取4次，时间分别为1-5h，30min-4h，15min-2h，30min-5h，再将提取液合并，减压浓缩成膏状，用乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩拌硅胶上100-200目硅胶柱，用石油醚30-60℃-乙酸乙酯3∶1，V/V洗脱，洗脱下来的产品浓缩备用；标准品制备：将层析的粗品溶于甲醇溶液，超声30min，用半制备高效液相色谱法纯化，收集保留时间为18.5min的组分，将其减压浓缩60℃后置恒温干燥箱内干燥24h，40℃，最后得到无色棒状结晶。
2、根据权利要求1所述的一枝蒿酮酸在制备乙型肝炎病毒的抑制和保肝作用的药物用途。
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