CN1748031A - 细菌和用所述细菌生产化合物的方法 - Google Patents

细菌和用所述细菌生产化合物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1748031A
CN1748031A CNA2004800035293A CN200480003529A CN1748031A CN 1748031 A CN1748031 A CN 1748031A CN A2004800035293 A CNA2004800035293 A CN A2004800035293A CN 200480003529 A CN200480003529 A CN 200480003529A CN 1748031 A CN1748031 A CN 1748031A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
orf
lysc
allelotrope
coryneform bacterium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2004800035293A
Other languages
English (en)
Inventor
B·巴特
C·赖嫩
B·黑德里希
G·蒂尔巴赫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Degussa GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa GmbH filed Critical Degussa GmbH
Publication of CN1748031A publication Critical patent/CN1748031A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及棒杆菌细菌，所述细菌除在其天然位点(座位)具有至少一个拷贝的编码蛋白质或RNA合成的可读框(ORF)、基因或等位基因外，一定还在第二个、可选地在第三个或第四个位点以整合入染色体的形式具有第二个、可选地第三个或第四个拷贝的该可读框(ORF)、基因或等位基因；本发明还涉及用所述细菌发酵制备化合物的方法。

Description

细菌和用所述细菌生产化合物的方法
现有技术
化合物，特别是指L-氨基酸、维生素、核苷和核苷酸以及D-氨基酸，被用于人类药物、药品工业、化妆品、食品工业和动物营养物中。
诸多的此类化合物是通过发酵棒杆菌菌株，尤其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)来制备的。由于这些物质非常重要，因此不断地努力改进这些制备方法。对此方法的改进可以涉及发酵措施，例如搅拌和氧气的供给，或营养培养基的组成例如发酵过程中的糖浓度，或通过例如离子交换层析逐渐形成产物形式，或者微生物自身的固有输出特性。
利用了诱变、选择和突变体选择方法来改进这些微生物的输出特性。用这种方式获得了能产生特定化合物的，对于抗代谢物有抗性的菌株，或者是对于在调控上重要的代谢物为营养缺陷型的菌株。
多年来还利用了重组DNA技术方法，通过扩增单个生物合成基因和调查生产效果，来改进棒杆菌(Corynebacterium)菌株。
一种常用方法包括通过附加型复制质粒在特定微生物中扩增某些生物合成基因。该方法有一个缺点是，质粒在发酵过程(在工业方法中发酵通常涉及许多代)中自然丢失(分离不稳定性)。
另一种方法包括借助不在特定微生物中复制的质粒来复制特定的生物合成基因。在这一方法中，包括了克隆的生物合成基因的质粒被整合进该微生物的染色体生物合成基因(Reinscheid等人，Appliedand Environmental Microbiology 60(1)，126-132(1994)；Jetten等人，Applied Microbiology and Biotechnology 43(1)：76-82(1995))。该方法的一个缺点是，质粒的核苷酸序列以及选择所必需的抗生素抗性基因的核苷酸序列保留在微生物中。这对于例如生物质的处理和利用是不利的。此外，专家预计，由于在相应世代数(比如工业发酵中常用的)中通过“坎贝尔型交换(Campbell type crossover)”而去整合，这样的菌株是不稳定的。
发明目的
本发明人的目的是，为利用棒杆菌细菌发酵制备化合物提供新的改进措施。
发明概述
本发明提供生产化合物的棒杆菌细菌，它除了在天然位点(座位)含有一个拷贝的一或多个编码合成用于所述化合物合成的蛋白质或RNA的可读框(ORF)、基因或等位基因外，还在一或多个附加的位点处，优选在第二个、以及可选地在第三或第四个位点处以整合入染色体的形式含有一个或多个，尤其是第二个、可选地第三或第四个拷贝的所述可读框(ORF)、基因或等位基因，其中至少一个所述位点选自基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件或者编码所述原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的DNA。
在第二个、可选地在第三个或第四个位点不存在于微生物中能够/使得能够进行附加型复制或转座的核苷酸序列，和不存在赋予其抗生素抗性的核苷酸序列，第二个、可选地第三个或第四个位点不涉及对于细菌的生长和所需化合物的产生必需的可读框(ORF)、基因或等位基因。
本发明还提供制备一种或多种化合物的方法，其中采取以下步骤：
a)发酵棒杆菌细菌，该棒杆菌细菌除了在天然位点(座位)存在一或多个编码用于合成所述化合物的蛋白质或RNA的可读框(ORF)、基因或等位基因外，
b)还在某些位点将一或多个，尤其是第二个、可选地第三或第四个拷贝的所述可读框(ORF)、基因或等位基因整合进染色体，由此
c)至少一个所述位点选自基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件或者编码所述原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的DNA，
d)在所述位点不存在于微生物中能够/使得能够进行附加型复制或转座的核苷酸序列，和不存在赋予其抗生素抗性的核苷酸序列，
e)在所述可读框(ORF)、基因或等位基因能够表达的条件下进行过表达，浓缩发酵液体培养基和/或细菌细胞中的化合物，
f)分离该化合物，可选地
g)连同来自发酵液体培养基和/或生物质中的成分一起，直至＞(大于)0至100wt％。
相应蛋白质的细胞内活性或浓度与起始细菌(亲本细菌或野生型)中的活性或浓度相比得到提高，尤其是编码所述蛋白质的核苷酸序列过表达时。一般这一提高至少为10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最大为1000％或2000％。
本发明还提供这样的棒杆菌细胞，即其含有与存在于天然位点并编码用于合成所述化合物(尤其是氨基酸)的蛋白质或RNA的可读框(ORF)、基因或等位基因优选以串联排列(tandem arrangement)直接相邻的第三或第四个拷贝的所述可读框(ORF)、基因或等位基因，如WO 03/014330中所述。
“串联排列”意为，两或多个ORF、基因或等位基因纵列彼此直接相邻且方向相同的排列方式。两或多个直接相邻的ORF、基因或等位基因的另一种方向类型可以称作反向。
这些棒杆菌细菌另外对于在选自基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的位点处的拷贝包括所述的“串联排列”。
本发明还提供所述的发酵所述棒杆菌细菌的方法。
发明详述
化合物尤其是指氨基酸、维生素、核苷和核苷酸。这些化合物的生物合成途径在现有技术中是已知且可利用的。
氨基酸优选意指L-氨基酸，特别是蛋白质源的L-氨基酸，选自L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷胺酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸及其盐，尤其是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸。L-赖氨酸是极为优选的。
蛋白质源的氨基酸意指出现在天然蛋白质中的氨基酸，也就是说出现在微生物、植物、动物和人的蛋白质中。
维生素意指，尤其是维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇)、维生素B12(氰钴胺素)、烟酸/烟酰胺、维生素M(叶酸)和维生素E(生育酚)及其盐，泛酸为优选的。
核苷和核苷酸意指，除其它之外，S-腺苷-甲硫氨酸、肌苷-5′-单磷酸和鸟苷-5′-单磷酸及其盐。
棒杆菌细菌特别是棒杆菌属(Corynebacterium)的细菌。在棒杆菌属中，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)和Corynebacteriumthermoaminogenes为优选。除其它之外，可以在K_mpfer和Kroppenstedt(Canadian Journal of Microbiology 42，989-1005(1996))以及在US-A-5,250,434中找到该组细菌中菌株的分类学信息。
棒杆菌属的适宜菌株(尤其)是已知的野生型菌株
谷氨酸棒杆菌ATCC13032
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870
百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)ATCC15990
Corynebacterium melassecola ATCC17965
力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)ATCC13868
节杆菌(Arthrobacter sp.)ATCC243
Brevibacterium chang-fua ATCC14017
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067
乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869
扩展短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020
台北短杆菌(Brevibacterium taipei)ATCC13744和
嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC21645和突变体或菌株，比如现有技术已知的、从产生化合物的菌株衍生而来的突变体或菌株。
产氨棒杆菌物种中的适宜菌株(尤其)是已知的野生型菌株
产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)ATCC6871
产氨短杆菌ATCC15137和
棒杆菌ATCC21084
和突变体或菌株，比如现有技术已知的、从产生化合物的菌株衍生而来的突变体或菌株。
Corynebacterium thermoaminogenes物种中的适宜菌株(尤其)是已知的野生型菌株
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1540
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1541和
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1542和突变体或菌株，比如现有技术已知的、从产生化合物的菌株衍生而来的突变体或菌株。
带有“ATCC”标记的菌株可获自美国模式培养物保藏所(AmericanType Culture Collection)(Manassas，VA，USA)。带有“FERM”标记的菌株可获自国家高级工业科技研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(AIST TsukubaCentral 6，1-1-1Higashi，Tsukuba Ibaraki，日本)。所提到的Corynebacterium thermoaminogenes的菌株(FERM BP-1539，FERMBP-1540，FERM BP-1541和FERM BP-1542)描述于US-A 5,250,434中。
可读框(ORF)描述一段编码或能够编码蛋白质或多肽或核糖核酸的核苷酸序列，根据现有技术无法指出这段核苷酸序列的功能。
在为该核苷酸序列片段指出功能后，通常将其称作基因。
等位基因通常理解为意指一个给定基因的替代形式。这些形式的区别在于核苷酸序列。
在本发明上下文中，优选使用内源的(也即物种特异性的)可读框、基因或等位基因。它们意指存在于某一物种群体，例如谷氨酸棒杆菌中的可读框、基因或等位基因或其核苷酸序列。
本发明上下文中的“一个拷贝的位于天然位点(座位)的可读框(ORF)、基因或等位基因”理解为意指，ORF或基因或等位基因相对于比如存在于相应的野生型或相应的亲本生物或起始生物中的相邻的ORF或基因或等位基因的位置。
因此，例如，编码来自谷氨酸棒杆菌的“反馈”抗性天冬氨酸激酶的lysC基因或lysCFBR等位基因的天然位点是指，一侧带有直接相邻的基因或可读框orfX和leuA、另一侧带有直接相邻的asd基因的lysC位点或lysC座位或1ysC基因位点。
“反馈”抗性天冬氨酸激酶理解为意指这样的天冬氨酸激酶：与野生型形式相比，它对于赖氨酸和苏氨酸的混合物或AEC(氨基乙基半胱氨酸)和苏氨酸的混合物或赖氨酸本身或AEC本身的抑制的敏感性降低(至少5至10％、10％至15％或10％至20％)。产生L-赖氨酸的菌株通常包含这样的“反馈”抗性的或脱敏的天冬氨酸激酶。
谷氨酸棒杆菌染色体的核苷酸序列是已知的，并且可以在专利申请EP-A-1108790以及欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，Germany和Cambridge，UK)核苷酸序列数据库的登录号(AccessionNo.)AX114121中找到。OrfX、leuA基因以及asd基因核苷酸序列的登录号为AX120364(orfX)、AX123517(leuA)和AX123519(asd)。
还可以利用其它数据库，例如国家医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的国家生物技术信息中心(National Centerfor BiotechnologyInformation，NCBI)。
也可以使用其它数据库，比如国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的数据库，或瑞士生物信息学研究所(SwissInstitute of Bioinformatics，Swissprot，日内瓦，瑞士)的数据库，或蛋白质信息资源数据库(Protein Information ResourceDatabase，PIR，华盛顿，美国)的数据库。
“一或多个，特别是第二个、可选地第三或第四个位点”理解为意指不同于“天然位点”的位点。它在下文中也称作“靶位点”或“靶序列”。它还可以叫做“整合位点”或“转化位点”。这(些)位点或存在于相应位点的核苷酸序列优选位于染色体中，且通常并非是生长和所需化合物生产所必需的。
优选以谷氨酸棒杆菌染色体的基因间区域，和通常包含在染色体中的原噬菌体及编码缺陷噬菌体或噬菌体组件的DNA区域为靶位点。这样的位点例子示于表12和13中。
为制备本发明的棒杆菌细菌，通过例如PCR或利用限制性内切酶及之后的凝胶抽提，至少分离得到携带目的ORF、基因、等位基因或操纵子的DNA片段，可选地包括表达和/或调控信号(例如启动子、衰减子、调控蛋白结合位点、核糖体结合位点、衰减子和终止子)。DNA片段长度随特定ORF、基因、等位基因或操纵子的自然长度变化。一般，该长度介于0.25至10kb或0.5至10kb之间。之后为这(些)DNA片段在5’-和3’-末端提供靶位点的核苷酸序列。然后，优选借助在棒杆菌中不复制或仅发生有限复制的载体，将这些DNA片段转化进目的棒杆菌细菌；分离出那些在靶位点整合有目的ORF、基因或等位基因的细菌；靶位点处不保留在微生物中能够/使得能够进行附加型复制的核苷酸序列、能够/使得能够转座的核苷酸序列以及赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。当然可以对该方法进行修改，例如，使得首先将靶位点插入(克隆进)一个载体，并随后在所述靶位点处插入目的ORF、基因、等位基因或操纵子。
本发明还相应提供生产一或多种化合物的棒杆菌细菌的制备方法，包括
a)分离至少一种目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，可选地包括表达和/或调控信号，
b)为ORF、基因或等位基因的5′和3′末端提供靶位点的核苷酸序列，其中所述位点选自基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件，
c)优选将带有靶位点核苷酸序列的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列整合进在棒杆菌细菌中不复制或仅进行有限复制的载体中，
d)将b)或c)的核苷酸序列或载体转移进棒杆菌细菌中，和
e)分离在靶位点整合了根据a)的核苷酸序列的棒杆菌细菌，靶位点处未存留在微生物中能够/使得能够进行附加型复制的核苷酸序列、能够/使得能够发生转座的核苷酸序列以及赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。
还优选，靶位点处不保留所用载体序列或物种异源DNA的残基，比如限制性切割位点或者尤其是在转化的细菌中能够或使得能够发生复制或转录的核苷酸序列，以及靶位点处不保留赋予抗生素抗性的核苷酸序列。这样的位于所整合的ORF、基因或等位基因上游或下游的DNA的最多24个，优选最多12个，尤其优选最多6个核苷酸可选地保留在靶位点。
与编码用于生产化合物的蛋白质或RNA的ORF、基因、等位基因的5′-和3′-末端相附着的靶位点核苷酸序列的长度最小为至少100个碱基对。类似地可以使用核苷酸序列长度为至少200、300、400、500、600、800、1000、1200、1400、16000、18000或20000个碱基对的DNA。通常最大长度不超过3000、5000或10000个碱基对。优选长度为至少300且最大为3000。
借助本发明的方法，制备化合物的棒杆菌细菌或发酵方法的生产率在选自浓度(所形成的化合物，基于单位体积)、产量(所形成的化合物，基于所消耗的碳源)以及产物形成速率(所形成的化合物，基于时间)的一个或多个特征方面提高至少0.5-1.0％或至少1.0至1.5％或至少1.5-2.0％。
有关比如染色体DNA、质粒DNA的分离以及限制酶操作等这样的常规遗传工程方法的指导可以在Sambrook等人(Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)中找到。关于棒杆菌的转化及接合的指导除其它之外可以在Thierbach等人(Applied Microbiology and Biotechnology 29，356-362(1988))、Sch_fer等人(Journal of Bacteriology 172，1663-1666(1990)和Gene 145，69-73(1994))以及Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991))中找到。
仅进行有限复制的载体理解为意指，作为培养宿主或携带者的条件的函数而进行复制或者不复制的质粒载体。因此，Nakamura等人(US-A-6,303,383)已经描述了棒杆菌细菌的一种温度敏感型质粒，它在温度等于/低于31℃时只能进行有限复制。
此外，为分离和鉴定本发明的棒杆菌细菌，可以利用常用的微生物学技术比如涂平板、选择和筛选，以及常用的遗传工程技术比如DNA杂交、聚合酶链式反应(PCR)和DNA测序，以及常用的生物化学方法比如酶活力测定。
本发明进一步提供生产L-赖氨酸的棒杆菌细菌，尤其是棒杆菌属的细菌，它除了在天然位点(座位)含有至少一个拷贝的一或多个编码产生赖氨酸的蛋白质的可读框(ORF)、基因或等位基因之外，还在第二个、可选地在第三或第四个整合在染色体内的位点处含有一个或多个，尤其是第二个、可选地第三或第四个拷贝的所述可读框(ORF)、基因或等位基因，其中至少一个所述位点选自基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件或者编码所述原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的DNA。
所述位点不带有在微生物中能够/使得能够进行附加型复制或者能够/使得能够进行转座或者赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明此外还提供制备L-赖氨酸的方法，包括：
a)发酵所述棒杆菌细菌，尤其是谷氨酸棒杆菌，
在能够允许所述可读框(ORF)、基因或等位基因表达的条件下，
b)浓缩发酵液体培养基中的L-赖氨酸，
c)从发酵液体培养基中分离L-赖氨酸，可选地
d)连同来自发酵液体培养基和/或生物质中的成分一起，直至＞(大于)0至100％。
“生产赖氨酸的可读框(ORF)、基因或等位基因的拷贝”理解为意指，所有在增强/过表达后能够具有提高赖氨酸生产这一效应的，优选内源的可读框、基因或等位基因。增强理解为意指，特定基因产物、蛋白质或酶的细胞内浓度或活性相对于起始细菌中的蛋白质或酶的活性或浓度的提高。
这些除其它之外包括以下可读框、基因或等位基因：accBC、accDA、cstA、cysD、cysE、cysH、cysK、cysN、cysQ、dapA、dapB、dapC、dapD、dapE、dapF、ddh、dps、eno、gap、gap2、gdh、gnd、lysC、lysCFBR、lysE、msiK、opcA、oxyR、ppc、ppcFBR、pgk、pknA、pknB、pknD、pknG、ppsA、ptsH、ptsI、ptsM、pyc、pyc P458S、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tal、thyA、tkt、tpi、zwa1、zwf和zwf A213T。它们概述和解释于表1中。
这些包括，尤其是编码“反馈”抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因。各种不同的lysCFBR等位基因在表2中给出了概括和说明。
以下lysCFBR等位基因是优选的：lysC A279T(根据SEQ ID NO：2所编码的天冬氨酸激酶蛋白质第279位的丙氨酸被苏氨酸取代)、lysCA279V(根据SEQ ID NO：2所编码的天冬氨酸激酶蛋白质第279位的丙氨酸被缬氨酸取代)、lysC S301F(根据SEQ ID NO：2所编码的天冬氨酸激酶蛋白质第301位的丝氨酸被苯丙氨酸取代)、lysC T308I(根据SEQ ID NO：2所编码的天冬氨酸激酶蛋白质第308位的苏氨酸被异亮氨酸取代)、lysC S301Y(根据SEQ ID NO：2所编码的天冬氨酸激酶蛋白质第308位的苏氨酸被酪氨酸取代)、lysC G345D(根据SEQ ID NO：2所编码的天冬氨酸激酶蛋白质第345位的甘氨酸被天冬氨酸取代)、lysC R320G(根据SEQ ID NO：2所编码的天冬氨酸激酶蛋白质第320位的精氨酸被甘氨酸取代)、lysC T311I(根据SEQ IDNO：2所编码的天冬氨酸激酶蛋白质第311位的苏氨酸被异亮氨酸取代)、lysC S381F(根据SEQ ID NO：2所编码的天冬氨酸激酶蛋白质第381位的丝氨酸被苯丙氨酸取代)。
LysCFBR等位基因lysC T311I(根据SEQ ID NO：2所编码的天冬氨酸激酶蛋白质第311位的苏氨酸被异亮氨酸取代)是特别优选的，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所编码的天冬氨酸激酶蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在第三或第四个位点，可以整合所述生产赖氨酸的可读框(ORF)、基因或等位基因的第三或第四个拷贝。除其它之外，以下可读框、基因或核苷酸序列可用于此：aecD、ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、fda、gluA、gluB、gluC、gluD、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、menE、mqo、pck、pgi、poxB和zwa2，尤其是基因aecD，gluA，gluB，gluC，gluD和pck。这些在表3中给出了概括和说明。
所提到的位点当然不仅包括所提到的可读框或基因的编码区域，还包括位于上游负责表达和调控的区域或核苷酸序列，比如核糖体结合位点、启动子、调控蛋白结合位点、调控核糖核酸的结合位点和衰减子。这些区域通常位于编码区域上游1-800、1-600、1-400、1-200、1-100或1-50个核苷酸范围内。同样，位于下游的区域，比如转录终止子也包括在内。这些区域通常位于编码区域下游1-400、1-200、1-100、1-50或1-25个核苷酸范围内。
可以使用染色体内的基因间区域，也就是不具有编码功能的核苷酸序列。最后，通常包含在染色体中的原噬菌体或缺陷噬菌体或噬菌体组件可用于此。
原噬菌体理解为意指与宿主基因组一起复制而且不形成感染性粒子的噬菌体，尤其是其基因组。缺陷噬菌体理解为意指由于各种突变而丧失了形成所谓的感染性粒子的能力的原噬菌体，尤其是其基因组。缺陷噬菌体也称作隐蔽原噬菌体。原噬菌体和缺陷噬菌体常以整合在其宿主染色体中的形式出现。现有技术中有进一步的描述，例如在由Edward A.Birge撰写的教科书(Bacterial and BacteriophageGenetics，第三版，Springer-Verlag，纽约，美国，1994)或由S.Klaus等人撰写的教科书(Bakterienviren，Gustav Fischer Verlag，Jena，德国，1992)中。
代表基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件或者编码所述原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的DNA的谷氨酸棒杆菌染色体区域的实例示于表12和13。DNA区域的位置参照EP-A-1108790或欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国和剑桥，英国)数据库中所示的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组图谱。
就表12的基因间区域而言，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，由于野生型与野生型菌株之间相互不同以及根据所接受的突变处理，根据本发明可以使用含有与表12所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且不具有编码功能即基因或等位基因的区域。
就选自表13的编码原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的DNA区域而言，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，由于野生型与野生型菌株之间相互不同以及根据所接受的突变处理，根据本发明可以使用含有与表13所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且编码原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的区域。
                                        表1
                        生产赖氨酸的可读框、基因和等位基因
   名称    所编码的酶或蛋白质的说明    参考文献    登录号
   accBC    酰基-CoA羧化酶EC 6.3.4.14(酰基-CoA羧化酶)    J_ger等人，Archives ofMicrobiology(1996)166：76-82EP1108790；WO0100805    U35023AX123524AX066441
   accDA    乙酰基-CoA羧化酶EC 6.4.1.2(乙酰基-CoA羧化酶)    EP1055725EP1108790WO0100805 AX121013AX066443
   cstA    Carbon Starvation Protein A(碳饥饿蛋白A)    EP1108790WO0100804    AX120811AX066109
   cysD    Sulfate Adenylyltransferase亚基IIEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶小链)    EP1108790    AX123177
   cysE    Serine AcetyltrahsferaseEC 2.3.1.30(丝氨酸乙酰基转移酶)    EP1108790WO0100843    AX122902AX063961
   cysH    3′-Phospho adenyl Sulfate ReductaseEC 1.8.99.4(3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸还原酶)    EP1108790WO0100842    AX123178AX066001
   cysK    Cysteine SynthaseEC 4.2.99.8(半胱氨酸合酶)    EP1108790WO0100843    AX122901AX063963
   cysN    Sulfate Adenylyltrahsferase亚基IEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶)    EP1108790    AX123176AX127152
   cysQ    Transport Protein CysQ(转运蛋白cysQ)    EP1108790WO0100805    AX127145AX066423
   dapA    Dihydrodipicolinate SynthaseEC 4.2.1.52(二氢二吡啶甲酸合酶)    Bonnassie等人，Nucleic AcidsResearch 18：6421(1990) Pisabarro等人，Journal ofBacteriology175：2743-2749(1993)EP1108790WO0100805EP0435132EP1067192EP1067193    X53993Z21502AX123560AX063773
   dapB    Dihydrodipicolinate ReductaseEC 1.3.1.26(二氢二吡啶甲酸还原酶)    EP1108790WO0100843EP1067192EP1067193Pisabarro等人，Journal ofBacteriology175：2743-2749(1993)JP1998215883JP1997322774JP1997070291JP1995075578    AX127149AX063753AX137723AX137602X67737Z21502E16749E14520E12773E08900
   dapC    N-Succinyl Aminoketopimelate    EP1108790    AX127146
   TransaminaseEC 2.6.1.17(N-琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶)    WO0100843EP1136559    AX064219
   dapD    Tetrahydrodipicolinate SuccinylaseEC 2.3.1.117(四氢二吡啶甲酸琥珀酰化酶)    EP1108790WO0100843Wehrmann等人，Journal ofBacteriology180：3159-3165(1998)    AX127146AX063757AJ004934
   dapE    N-Succinyl DiaminopimelateDesuccinylaseEC 3.5.1.18(N-琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶)    EP1108790WO0100843Wehrmann等人，Microbiology140：3349-3356(1994)    AX127146AX063749X81379
   dapF    Diaminopimelate EpimeraseEC 5.1.1.7(二氨基庚二酸差向异构酶)    EP1108790WO0100843EP1085094    AX127149AX063719AX137620
   ddh    Diaminopimelate DehydrogenaseEC 1.4.1.16(二氨基庚二酸脱氢酶)    EP1108790WO0100843Ishino等人，Nucleic AcidsResearch15：3917-3917(1987)JP1997322774JP1993284970Kim等人，Journal ofMicrobiology andBiotechnology5：250-256(1995)    AX127152AX063759Y00151E14511E05776D87976
   dps    DNA Protection Protein(在饥饿期间进行保护的蛋白)    EP1108790    AX127153
   eno    EnolaseEC 4.2.1.11(烯醇化酶)    EP1108790WO0100844EP1090998Hermann等人，Electrophoresis19：3217-3221(1998)    AX127146AX064945AX136862
   gap    Glyceraldehyde 3-PhosphateDehydrogenaseEC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)    EP1108790WO0100844Eikmanns等人，Journal ofBacteriology174：6076-6086    AX127148AX064941X59403
  77(2)：237-251(1989)
  pgk   Phosphoglycerate KinaseEC 2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶)   EP1108790WO0100844Eikmanns，Journal0f Bacteriology174：6076-6086(1992)   AX121838AX127148AX064943X59403
  pknA   Protein Kinase A(蛋白激酶A)   EP1108790   AX120131AX120085
  pknB   Protein Kinase B(蛋白激酶B)   EP1108790   AX120130AX120085
  pknD   Protein Kinase D(蛋白激酶D)   EP1108790   AX127150AX122469AX122468
  pknG   Protein Kinase G(蛋白激酶G)   EP1108790   AX127152AX123109
  ppsA   Phosphoenol Pyruvate SynthaseEC 2.7.9.2(磷酸烯醇丙酮酸合酶)   EP1108790   AX127144AX120700AX122469
  ptsH   Phosphotransferase System Protein HEC 2.7.1.69(磷酸转移酶系统组分H)   EP1108790WO0100844   AX122210AX127149AX069154
  ptsI   Phosphotransferase System Enzyme IEC 2.7.3.9(磷酸转移酶系统酶I)   EP1108790   AX122206AX127149
  ptsM   Glukose-specific PhosphotransferaseSystem Enzyme IIEC 2.7.1.69(葡萄糖磷酸转移酶系统酶II)   Lee等人，FEMSMicrobiologyLetters 119(1-2)：137-145(1994)   L18874
  pyc   Pyruvate CarboxylaseEC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)   WO9918228Peters-Wendisch等人，Microbiology144：915-927(1998)   A97276Y09548
  pycP458S   Pyruvate CarboxylaseEC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)氨基酸交换P458S   EP1108790
  sigC   Sigma Factor CEC 2.7.7.6(胞质外功能替代型σ因子C)   EP1108790   AX120368AX120085
  sigD   RNA Polymerase Sigma Factor DEC 2.7.7.6   EP1108790   AX120753AX127144
  (RNA聚合酶σ因子)
  sigE   Sigma Factor EEC 2.7.7.6(胞质外功能替代型σ因子E)   EP1108790   AX127146AX121325
  sigH   Sigma Factor HEC 2.7.7.6(σ因子SigH)   EP1108790   AX127145AX120939
  sigM   Sigma Factor MEC 2.7.7.6(σ因子SigM)   EP1108790   AX123500AX127145
  tal   TransaldolaseEC 2.2.1.2(转醛醇酶)   WO0104325   AX076272
  thyA   Thymidylate SynthaseEC 2.1.1.45(胸苷酸合酶)   EP1108790   AX121026AX127145
  tkt   TransketolaseEC 2.2.1.1(转酮醇酶)   Ikeda等人，NCBI   AB023377
  tpi   Triose Phosphate IsomeraseEC 5.3.1.1(丙糖磷酸异构酶)   Eikmanns，Journalof Bacteriology174：6076-6086(1992)   X59403
  zwa1   Cell Growth Factor 1(生长因子1)   EP1111062   AX133781
  zwf   Glucose 6-phosphate 1-DehydrogenaseEC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶)   EP1108790WO0104325   AX127148AX121827AX076272
  zwfA213T   Glucose 6-phosphate 1-DehydrogenaseEC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶)氨基酸交换A213T   EP1108790
                             表2
        编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因
  等位基因名称   更多信息   参考文献   登录号
  lysCFBR-E05108   JP 1993184366-A(序列1)   E05108
  lysCFB-E06825   lysC A279T   JP 1994062866-A(序列1)   E06825
  lysCFBR-E06826   lysC A279T   JP 1994062866-A(序列2)   E06826
  lysCFBR-E06827   JP 1994062866-A(序列3)   E06827
  lysCFBR-E08177   JP 1994261766-A(序列1)   E08177
  lysCFBR-E08178   lysC A279T   JP 1994261766-A(序列2)   E08178
  lysCFBR-E08179   lysC A279V   JP 1994261766-A(序列3)   E08179
  lysCFBR-E08180   lysC S301F   JP 1994261766-A(序列4)   E08180
  lysCFBR-E08181   lysC T308I   JP 1994261766-A(序列5)   E08181
  lysCFBR-E08182   JP 1994261766-A(序列6)   E08182
  lysCFBR-E12770   JP 1997070291-A(序列13)   E12770
  lysCFBR-E14514   JP 1997322774-A(序列9)   E14514
  lysCFBR-E16352   JP 1998165180-A(序列3)   E16352
  lysCFBR-E16745   JP 1998215883-A(序列3)   E16745
  lysCFBR-E16746   JP 1998215883-A(序列4)   E16746
  lysCFBR-I74588   US 5688671-A(序列1)   I74588
  lysCFBR-I74589   lysC A279T   US 5688671-A(序列2)   I74589
  lysCFBR-I74590   US 5688671-A(序列7)   I74590
  lysCFBR-I74591   lysC A279T   US 5688671-A(序列8)   I74591
  lysCFBR-I74592   US 5688671-A(序列9)   I74592
  lysCFBR-I74593   lysC A279T   US 5688671-A(序列10)   I74593
  lysCFBR-I74594   US 5688671-A(序列11)   I74594
  lysCFBR-I74595   lysC A279T   US 5688671-A(序列12)   I74595
  lysCFBR-I74596   US 5688671-A(序列13)   I74596
  lysCFBR-I74597   lysC A279T   US 5688671-A(序列14)  I74597
  lysCFBR-X57226   lysC S301Y   EP0387527Kalinowski等人，Molecular andGeneral Genetics224：317-324(1990)  X57226
  lysCFBR-L16848   lysC G345D   Follettie andSinskeyNCBI NucleotideDatabase(1990)  L16848
  lysCFBR-L27125   lysC R320GlysC G345D   Jetten等人，AppliedMicrobiologyBiotechnology43：76-82(1995)  L27125
  lysCFBR   lysC T311I   WO0063388(序列17)
  lysCFBR   lysC S301F   US3732144
  lysCFBR   lysC S381F
  lysCFBR   JP6261766(序列1)
  lysCFBR   lysC A279T   JP6261766(序列2)
  lysCFBR   lysC A279V   JP6261766(序列3)
  lysCFBR   lysCS 301F   JP6261766(序列4)
  lysCFBR   lysC T308I   JP6261766(序列5)
                                       表3
               用于整合生产赖氨酸的可读框、基因和等位基因的靶位点
基因名称   所编码的酶或蛋白质的说明   参考文献   登录号
aecD   beta C-S LyaseEC 2.6.1.1(βC-S裂合酶)   Rossol等人，Journal ofBacteriology 174(9)：2968-77(1992)   M89931
ccpA1   Catabolite Control Protein(分解代谢物控制蛋白A1)   WO0100844EP1108790   AX065267AX127147
ccpA2   Catabolite Control Protein(分解代谢物控制蛋白A2)   WO0100844EP1108790   AX065267AX121594
  citA   Sensor Kinase CitA(传感器激酶CitA)   EP1108790   AX120161
  citB   Transcription ReguIatorCitB(转录调控蛋白CitB)   EP1108790   AX120163
  citE   Citrate LyaseEC 4.1.3.6(柠檬酸裂合酶)   WO0100844EP1108790   AX065421AX127146
  fda   Fructose BisphosphateAldolaseEC 4.1.2.13(果糖-1，6-二磷酸醛缩酶)   von der Osten等人，Molecular Microbiology 3(11)：1625-37(1989)   X17313
  gluA   Glutamate TransportATP-binding Protein(谷氨酸转运ATP-结合蛋白)   Kronemeyer等人，Journalof Bacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluB   Glutamate-binding Protein(谷氨酸结合蛋白)   Kronemeyer等人，Journalof Bacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluC   Glutamate TransportPermease(谷氨酸运送系统通透酶)   Kronemeyer等人，Journalof Bacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluD   Glutamate TransportPermease(谷氨酸运送系统通透酶)   Kronemeyer等人，Journalof Bacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  luxR   Transcription RegulatorLuxR(转录调控蛋白LuxR)   WO0100842EP1108790   AX065953AX123320
  1uxS   Histidine Kinase LuxS(组氨酸激酶LuxS)   EP1108790   AX123323AX127145
  lysR1   Transcription RegulatorLysR1(转录调控蛋白LysR1)   EP1108790   AX064673AX127144
  lysR2   Transcription ActivatorLysR2(转录调控蛋白LysR2)   EP1108790   AX123312
  lysR3   Transcription RegulatorLysR3(转录调控蛋白LysR3)   WO0100842EP1108790   AX065957AX127150
  menE   O-Succinylbenzoic Acid CoALigaseEC 6.2.1.26(O-琥珀酰苯甲酸CoA连接酶)   WO0100843EP1108790   AX064599AX064193AX127144
  mqo   Malate-QuinoneOxidoreductase(苹果酸-苯醌-氧化还原酶)   Molenaar等人，Bur.Journal of Biochemistry1；254(2)：395-403(1998)   AJ224946
  pck   Phosphoenol PyruvateCarboxykinase(磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶)   WO0100844   AJ269506AX065053
  pgi   Glucose 6-phosphateIsomeraseEC 5.3.1.9(葡萄糖-6-磷酸异构酶)   EP1087015EP1108790   AX136015AX127146
  poxB   Pyruvate OxidaseEC 1.2.3.3(丙酮酸氧化酶)   WO0100844EP1096013   AX064959AX137665
  zwa2   Cell Growth Factor 2(生长因子2)   EP1106693EP1108790   AX113822AX127146
本发明相应地还提供制备生产L-赖氨酸的棒杆菌细菌的方法，包括
a)分离至少一种生产赖氨酸的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，可选地包括表达和/或调控信号，
b)为生产赖氨酸的ORF、基因或等位基因的5′和3′末端提供靶位点的核苷酸序列，其中所述位点选自基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件，
c)优选将带有靶位点核苷酸序列的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列整合进在棒杆菌细菌中不复制或仅进行有限复制的载体中，
d)将b)或c)的所述核苷酸序列或载体转移进棒杆菌细菌中，和
e)分离靶位点整合有根据a)的核苷酸序列的棒杆菌细菌。靶位点处未存留在所述微生物中能够/使得能够进行附加型复制，或能够/使得能够发生转座，或赋予其抗生素抗性的核苷酸序列，例如带有载体原点的核苷酸序列。
本发明还提供根据权利要求1的生产L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸的棒杆菌细菌，尤其是棒杆菌属的细菌。
本发明还提供根据权利要求20的制备L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸的方法。
“生产甲硫氨酸的可读框(ORF)、基因或等位基因的拷贝”理解为意指，所有在增强/过表达后具有提高甲硫氨酸生产这一效应的，优选内源的可读框、基因或等位基因。
这些除其它之外包括以下可读框、基因或等位基因：accBC、accDA、aecD、cstA、cysD、cysE、cysH、cysK、cysN、cysQ、dps、eno、fda、gap、gap2、gdh、gnd、glyA、hom、homFBR、lysC、lysCFBR、metA、metB、metE、metH、metY、msiK、opcA、oxyR、ppc、ppcFBR、pgk、pknA、pknB、pknD、pknG、ppsA、ptsH、ptsI、ptsM、pyc、pyc P458S、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tal、thyA、tkt、tpi、zwa1、zwf和zwf A213T。这些概括和解释在表4中。它们包括，尤其是编码“反馈”抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因(参见表2)和编码“反馈”抗性高丝氨酸脱氢酶homFBR等位基因。
“反馈”抗性高丝氨酸脱氢酶理解为意指，与野生型形式相比，对由苏氨酸或AHV(α-氨基-β-羟基戊酸)引起的抑制具有较低(至少5％至10％、10％至15％或10％至20％)敏感度的高丝氨酸脱氢酶。生产L-苏氨酸的菌株通常含有这样的“反馈”抗性的或脱敏的高丝氨酸脱氢酶(亦参见Eikmanns等人的第153至156页(Antonie vanLeuwenhoek 64：145-163，1993))。
在第三或第四个位点，可以整合生产甲硫氨酸的可读框(ORF)、基因或等位基因的第三或第四个拷贝。除其它之外，以下可读框、基因或核苷酸序列可用于此：brnE、brnF、brnQ、ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、ddh、gluA、gluB、gluC、gluD、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、menE、metD、metK、pck、pgi、poxB和zwa2。这些概括和说明在表5中。
所提到的位点当然不仅包括所提到的可读框或基因的编码区域，还包括位于上游负责表达和调控的区域或核苷酸序列，比如核糖体结合位点、启动子、调控蛋白结合位点、调控核糖核酸的结合位点和衰减子。这些区域通常位于编码区域上游1-800、1-600、1-400、1-200、1-100或1-50个核苷酸范围内。同样，位于下游的区域，比如转录终止子也包括在内。这些区域通常位于编码区域下游1-400、1-200、1-100、1-50或1-25个核苷酸范围内。
使用染色体内的基因间区域，也就是不具有编码功能的核苷酸序列。最后，通常包含在染色体中的原噬菌体或缺陷噬菌体或噬菌体组件也可用于此。
代表基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的谷氨酸棒杆菌染色体区域的实例示于表12和13。DNA区域的位置参照EP-A-1108790或欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国和剑桥，英国)数据库中所示的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组图谱。
就表12的基因间区域而言，对于本领域普通技术人员来说是显而易见的是，由于野生型与野生型菌株之间相互不同以及根据所接受的突变处理，根据本发明可以使用含有与表12所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且不具有编码功能即基因或等位基因的区域。
就选自表13的编码原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的DNA区域而言，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，由于野生型与野生型菌株之间相互不同以及根据所接受的突变处理，根据本发明可以使用含有与表13所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且编码原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的区域。
                                              表4
                           生产甲硫氨酸的可读框、基因和等位基因
   名称    所编码的酶或蛋白质的说明    参考文献    登录号
   AccBC    酰基-CoA羧化酶EC 6.3.4.14(酰基-CoA羧化酶)    J_ger等人，Archivesof Microbiology(1996)166：76-82EP1108790；WO0100805    U35023AX123524AX066441
   AccDA    乙酰基-CoA羧化酶EC 6.4.1.2    EP1055725EP1108790 AX121013
  (乙酰基-CoA羧化酶)   WO0100805   AX066443
  AecD   Cystathionine beta-LyaseEC 4.4.1.8(胱硫醚β-裂合酶)   Rossol等人，Journalof Bacteriology174：2968-2977(1992)   M89931
  CstA   Carbon Starvation Protein A(碳饥饿蛋白A)   EP1108790WO0100804   AX120811AX066109
  CysD   Sulfate Adenylyltransferase亚基IIEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶小链)   EP1108790   AX123177
  CysE   Serine AcetyltransferaseEC 2.3.1.30(丝氨酸乙酰基转移酶)   EP1108790WO0100843   AX122902AX063961
  CysH   3′-Phosphoadenyl Sulfate ReductaseEC 1.8.99.4(3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸还原酶)   EP1108790WO0100842   AX123178AX066001
  CysK   Cysteine SynthaseEC 4.2.99.8(半胱氨酸合酶)   EP1108790WO0100843   AX122901AX063963
  CysN   Sulfate Adenylyltransferase亚基IEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶)   EP1108790   AX123176AX127152
  CysQ   Transport protein CysQ(转运蛋白cysQ)   EP1108790WO0100805   AX127145AX066423
  Dps   DNA Protection Protein(在饥饿期间进行保护的蛋白)   EP1108790   AX127153
  Eno   EnolaseEC 4.2.1.11(烯醇化酶)   EP1108790WO0100844EP1090998Hermann等人，Electrophoresis19：3217-3221(1998)   AX127146AX064945AX136862
  Fda   Fructose Bisphosphate AldolaseEC 4.1.2.13(果糖二磷酸醛缩酶)   van der Osten等人，MolecularMicrobiology3：1625-1637(1989)   X17313
  Gap   Glyceraldehyde 3-PhosphateDehydrogenaseEC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)   EP1108790WO0100844Eikmanns等人，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992)   AX127148AX064941X59403
  gap2   Glyceraldehyde 3-PhosphateDehydrogenase   EP1108790WO0100844   AX127146AX064939
  EC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2)
  Gdh   Glutamate DehydrogenaseEC 1.4.1.4(谷氨酸脱氢酶)   EP1108790WO0100844Boermann等人，MolecularMicrobiology6：317-326(1992)；Guyonvarch等人，NCBI   AX127150AX063811X59404X72855
  GlyA   Glycine/SerineHydroxymethyltransferaseEC 2.1.2.1(甘氨酸/丝氨酸羟甲基转移酶)   EP1108790   AX127146AX121194
  Gnd   6-Phosphogluconate DehydrogenaseEC 1.1.1.44(6-磷酸葡糖酸脱氢酶)   EP1108790WO0100844   AX127147AX121689AX065125
  Hom   Homoserine DehydrogenaseEC 1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶)   Peoples等人，MolecularMicrobiology 2：63-72(1988)   Y00546
  homFBR   Homoserine Dehydrogenase feedbackresistant(fbr)EC 1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶fbr)   Reinscheid等人，Journal ofBacteriology173：3228-30(1991)
  LysC   Aspartate KinaseEC 2.7.2.4(天冬氨酸激酶)   BP1108790WO0100844Kalinowski等人，MolecularMicrobiology5：1197-204(1991)   AX120365AX063743X57226
  lysCFBR   Aspartate Kinase feedback resistant(fbr)EC 2.7.2.4(天冬氨酸激酶fbr)   参见表2
  MetA   Homoserine AcetyltransferaseEC 2.3.1.31(高丝氨酸乙酰基转移酶)   Park等人，MolecularCells 8：286-94(1998)   AF052652
  MetB   Cystathionine γ-LyaseEC 4.4.1.1(胱硫醚γ-裂合酶)   Hwang等人，MolecularCells 9：300-308(1999)   AF126953
  MetE   Homocysteine MethyltransferaseEC 2.1.1.14(高半胱氨酸甲基转移酶)   EP1108790   AX127146AX121345
  MetH   Homocysteine Methyltransferase(Vitamin B12-dependent)   EP1108790   AX127148AX121747
  EC 2.1.1.14(高半胱氨酸甲基转移酶)
  MetY   Acetylhomoserine Sulfhydrolase(乙酰基高丝氨酸硫水解酶)   EP1108790   AX120810AX127145
  MsiK   Sugar Importer(多种糖类输入蛋白)   EP1108790   AX120892
  OpcA   Glucose 6-phosphate Dehydrogenase(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的亚基)   WO0104325   AX076272
  OxyR   Transcription Regulator(转录调控蛋白)   EP1108790   AX122198AX127149
  ppcFBR   Phosphoenol Pyruvate Carboxylasefeedback resistentEC 4.1.1.31(反馈抗性的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)   EP0723011WO0100852
  Ppc   Phosphoenol Pyruvate CarboxylaseEC 4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)   EP1108790O′Reagan等人，Gene 77(2)：237-251(1989)   AX127148AX123554M25819
  Pgk   Phosphoglycerate KinaseEC 2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶)   EP1108790WO0100844Eikmanns，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992)   AX121838AX127148AX064943X59403
  PknA   Protein Kinase A(蛋白激酶A)   EP1108790   AX120131AX120085
  PknB   Protein Kinase B(蛋白激酶B)   EP1108790   AX120130AX120085
  PknD   Protein Kinase D(蛋白激酶D)   EP1108790   AX127150AX122469AX122468
  PknG   Protein Kinase G(蛋白激酶G)   EP1108790   AX127152AX123109
  PpsA   Phosphoenol Pyruvate SynthaseEC 2.7.9.2(磷酸烯醇丙酮酸合酶)   EP1108790   AX127144AX120700AX122469
  PtsH   Phosphotransferase System Protein HEC 2.7.1.69(磷酸转移酶系统组分H)   EP1108790WO0100844   AX122210AX127149AX069154
  PtsI   Phosphotransferase System Enzyme IEC 2.7.3.9(磷酸转移酶系统酶I)   EP1108790   AX122206AX127149
  PtsM   Glucose-specific PhosphotransferaseSystem Enzyme IIEC 2.7.1.69   Lee等人，FEMSMicrobiology Letters119(1-2)：137-145   L18874
  (葡萄糖磷酸转移酶系统酶II)   (1994)
  Pyc   Pyruvate CarboxylaseEC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)   WO9918228Peters-Wendisch等人，Microbiology144：915-927(1998)   A97276Y09548
  PycP458s   Pyruvate CarboxylaseEC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)氨基酸交换P458S   EP1108790
  SigC   Sigma Factor CEC 2.7.7.6(胞质外功能替代型σ因子C)   EP1108790   AX120368AX120085
  SigD   RNA Polymerase Sigma Factor DEC 2.7.7.6(RNA聚合酶σ因子)   EP1108790   AX120753AX127144
  SigE   Sigma Factor EEC 2.7.7.6(胞质外功能替代型σ因子E)   EP1108790   AX127146AX121325
  SigH   Sigma Factor HEC 2.7.7.6(σ因子SigH)   EP1108790   AX127145AX120939
  SigM   Sigma Factor MEC 2.7.7.6(σ因子SigM)   EP1108790   AX123500AX127153
  Tal   TransaldolaseEC 2.2.1.2(转醛醇酶)   WO0104325   AX076272
  ThyA   Thymidylate SynthaseEC 2.1.1.45(胸苷酸合酶)   EP1108790   AX121026AX127145
  Tkt   TransketolaseEC 2.2.1.1(转酮醇酶)   Ikeda等人，NCBI   AB023377
  Tpi   Triose Phosphate IsomeraseEC 5.3.1.1(丙糖磷酸异构酶)   Eikmanns，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992)   X59403
  zwa1   Cell Growth Factor 1(生长因子1)   EP1111062   AX133781
  Zwf   Glucose 6-phosphate 1-DehydrogenaseEC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶)   EP1108790WO0104325   AX127148AX121827AX076272
  ZwfA213T   Glucose 6-phosphate 1-DehydrogenaseEC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶)氨基酸交换A213T   EP1108790
                                            表5
                 用于整合生产甲硫氨酸的可读框、基因和等位基因的靶位点
  基因名称   所编码的酶和蛋白质的说明   参考文献   登录号
  BrnE   Transporter of branched-chainamino acids(支链氨基酸转运蛋白)   EP1096010   AX137709AX137714
  BrnF   Transporter of branched-chainamino acids(支链氨基酸转运蛋白)   EP1096010   AX137709AX137714
  BrnQ   Carrier protein ofbranched-chain amino acids(支链氨基酸运送系统载体蛋白)   Tauch等人，Archives ofMicrobiology 169(4)：303-12(1998)WO0100805EP1108790   M89931AX066841AX127150
  ccpA1   Catabolite Control Protein(分解代谢物控制蛋白A1)   WO0100844EP1108790   AX065267AX127147
  ccpA2   Catabolite Control Protein(分解代谢物控制蛋白A2)   WO0100844EP1108790   AX065267AX121594
  citA   Sensor Kinase CitA(传感器激酶CitA)   EP1108790   AX120161
  citB   Transcription Regulator CitB(转录调控蛋白CitB)   EP1108790   AX120163
  citE   Citrate LyaseEC 4.1.3.6(柠檬酸裂合酶)   WO0100844EP1108790   AX065421AX127146
  ddh   Diaminopimelate DehydrogenaseEC 1.4.1.16(二氨基庚二酸脱氢酶)   Ishino等人，NucleicAcids Research 15：3917(1987)EP1108790   S07384AX127152
  gluA   Glutamate TransportATP-binding Protein(谷氨酸转运ATP-结合蛋白)   Kronemeyer等人，Journalof Bacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluB   Glutamate-binding Protein(谷氨酸结合蛋白)   Kronemeyer等人，Journalof Bacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluC   Glutamate Transport Permease(谷氨酸运送系统通透酶)   Kronemeyer等人，Journalof Bacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluD   Glutamate Transport Permease(谷氨酸运送系统通透酶)   Kronemeyer等人，Journalof Bacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  luxR   Transcription Regulator LuxR(转录调控蛋白LuxR)   WO0100842EP1108790   AX065953AX123320
  luxS   Histidine Kinase LuxS(组氨酸激酶LuxS)   EP1108790   AX123323AX127145
  lysR1   Transcription Regulator LysR1(转录调控蛋白LysR1)   EP1108790   AX064673AX127144
  lysR2   Transcription Activator LysR2(转录调控蛋白LysR2)   EP1108790   AX123312
  lysR3   Transcription Regulator LysR3(转录调控蛋白LysR3)   WO0100842EP1108790   AX065957AX127150
  menE   O-Succinylbenzoic Acid CoALigaseEC 6.2.1.26(O-琥珀酰苯甲酸CoA连接酶)   WO0100843EP1108790   AX064599AX064193AX127144
  metD   Transcription Regulator MetD(转录调控蛋白MetD)   EP1108790   AX123327AX127153
  metK   Methionine AdenosylTransferaseEC 2.5.1.6(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)   WO0100843EP1108790   AX063959AX127148
  pck   Phosphoenol PyruvateCarboxykinase(磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶)   WO0100844   AJ269506AX065053
  pgi   Glucose 6-Phosphate IsomeraseEC 5.3.1.9(葡萄糖-6-磷酸异构酶)   EP1087015EP1108790   AX136015AX127146
  poxB   Pyruvate OxidaseEC 1.2.3.3(丙酮酸氧化酶)   WO0100844EP1096013   AX064959AX137665
  zwa2   Ce11 Growth Factor 2(生长因子2)   EP1106693EP1108790   AX113822AX127146
“生产苏氨酸的可读框(ORF)、基因或等位基因的拷贝”理解为意指，所有在增强/过表达后具有提高赖氨酸生产这一效应的，优选内源的可读框、基因或等位基因。
这些除其它之外包括以下可读框、基因或等位基因：accBC、accDA、cstA、cysD、cysE、cysH、cysI、cysN、cysQ、dps、eno、fda、gap、gap2、gdh、gnd、hom、homFBR、lysC、lysCFBR、msiK、opcA、oxyR、ppc、ppcFBR、pgk、pknA、pknB、pknD、pknG、ppsA、ptsH、ptsI、ptsM、pyc、pyc  P458S、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tal、thyA、tkt、tpi、thrB、thrC、thrE、zwa1、zwf和zwfA213T。这些概括和解释在表6中。它们包括，尤其是编码“反馈”抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因(参见表2)和编码“反馈”抗性高丝氨酸脱氢酶homFBR等位基因。
“反馈”抗性高丝氨酸脱氢酶理解为意指，与野生型形式相比，对由苏氨酸或AHV(α-氨基-β-羟基戊酸)引起的抑制具有较低(至少5％至10％、10％至15％或10％至20％)敏感度的高丝氨酸脱氢酶。生产L-苏氨酸的菌株通常含有这样的“反馈”抗性的或脱敏的高丝氨酸脱氢酶(亦参见Eikmanns等人的第153至156页(Antonie vanLeuwenhoek 64：145-163，1993))。
在第三或第四个位点，可以整合生产苏氨酸的可读框(ORF)、基因或等位基因的第三或第四个拷贝。除其它之外，以下可读框、基因或核苷酸序列可用作整合位点：ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、ddh、gluA、gluB、gluC、gluD、glyA、ilvA、ilvBN、ilvC、ilvD、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、mdh、menE、metA、metD、pck、poxB、sigB和zwa2。这些概括和说明在表7中。
所提到的位点当然不仅包括所提到的可读框或基因的编码区域，还包括位于上游负责表达和调控的区域或核苷酸序列，比如核糖体结合位点、启动子、调控蛋白结合位点、调控核糖核酸的结合位点和衰减子。这些区域通常位于编码区域上游1-800、1-600、1-400、1-200、1-100或1-50个核苷酸范围内。同样，位于下游的区域，比如转录终止子也包括在内。这些区域通常位于编码区域下游1-400、1-200、1-100、1-50或1-25个核苷酸范围内。
可以使用染色体内的基因间区域，也就是不具有编码功能的核苷酸序列。最后，通常包含在染色体中的原噬菌体或缺陷噬菌体或噬菌体组件也可用于此。
代表基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的谷氨酸棒杆菌染色体区域的实例示于表12和13。DNA区域的位置参照EP-A-1108790或欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国和剑桥，英国)数据库中所示的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组图谱。
就表12的基因间区域而言，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，由于野生型与野生型菌株之间相互不同以及根据所接受的突变处理，根据本发明可以使用含有与表12所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且不具有编码功能即基因或等位基因的区域。
就选自表13的编码原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的DNA区域而言，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，由于野生型与野生型菌株之间相互不同以及根据所接受的突变处理，根据本发明可以使用含有与表13所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且编码原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的区域。
                                          表6
                        生产苏氨酸的可读框、基因和等位基因
  名称   所编码的酶或蛋白质的说明   参考文献   登录号
  accBC   酰基-CoA羧化酶EC 6.3.4.14(酰基-CoA羧化酶)   J_ger等人，Archivesof Microbiology166：76-82(1996)EP1108790WO0100805   U35023AX123524AX066441
  accDA   乙酰基-CoA羧化酶EC 6.4.1.2(乙酰基-CoA羧化酶)   EP1055725EP1108790WO0100805 AX121013AX066443
  cstA   Carbon Starvation Protein A(碳饥饿蛋白A)   EP1108790WO0100804   AX120811AX066109
  cysD   Sulfate Adenylyltransferase亚基IIEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶小链)   EP1108790   AX123177
  cysE   Serine AcetyltransferaseEC 2.3.1.30(丝氨酸乙酰基转移酶)   EP1108790WO0100843   AX122902AX063961
  cysH   3′-Phosphoadenyl Sulfate ReductaseEC 1.8.99.4(3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸还原酶)   EP1108790WO0100842   AX123178AX066001
  cysK   Cysteine SynthaseEC 4.2.99.8(半胱氨酸合酶)   EP1108790WO0100843   AX122901AX063963
  cysN   Sulfate Adenylyltransferase亚基IEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶)   EP1108790   AX123176AX127152
  cysQ   Transport protein CysQ(转运蛋白cysQ)   EP1108790WO0100805   AX127145AX066423
  dps   DNA Protection Protein(在饥饿期间进行保护的蛋白)   EP1108790   AX127153
  eno   EnolaseEC 4.2.1.11(烯醇化酶)   EP1108790WO0100844EP1090998Hermann等人，Electrophoresis19：3217-3221(1998)   AX127146AX064945AX136862
  fda   Fructose Bisphosphate AldolaseEC 4.1.2.13(果糖二磷酸醛缩酶)   van der Osten等人，MolecularMicrobiology3：1625-1637(1989)   X17313
  gap   Glyceraldehyde 3-PhosphateDehydrogenaseEC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)   EP1108790WO0100844Eikmanns等人，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992)   AX127148AX064941X59403
  gap2   Glyceraldehyde 3-PhosphateDehydrogenaseEC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2)   EP1108790WO0100844   AX127146AX064939
  gdh   Glutamate DehydrogenaseEC 1.4.1.4(谷氨酸脱氢酶)   EP1108790WO0100844Boermann等人，MolecularMicrobiology6：317-326(1992)；Guyonvarch等人，NCBI   AX127150AX063811X59404X72855
  gnd   6-Phosphogluconate DehydrogenaseEC 1.1.1.44(6-磷酸葡糖酸脱氢酶)   EP1108790WO0100844   AX127147AX121689AX065125
  hom   Homoserine DehydrogenaseEC 1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶)   Peoples等人，MolecularMicrobiology 2：63-72   Y00546
  (1988)
  homFBR   Homoserine Dehydrogenase feedbackresistant(fbr)EC 1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶fbr)   Reinscheid等人，Journal ofBacteriology173：3228-30(1991)
  lysC   Aspartate KinaseEC 2.7.2.4(天冬氨酸激酶)   EP1108790WO0100844Kalinowski等人，MolecularMicrobiology5：1197-204(1991)   AX120365AX063743X57226
  lysCFBR   Aspartate Kinase feedback resistent(fbr)EC 2.7.2.4(天冬氨酸激酶fbr)   参见表2
  msiK   Sugar Importer(多种糖类输入蛋白)   EP1108790   AX120892
  opcA   Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的亚基)   WO0104325   AX076272
  oxyR   Transcription Regulator(转录调控蛋白)   EP1108790   AX122198AX127149
  ppcFBR   Phosphoenol Pyruvate Carboxylasefeedback resistentEC 4.1.1.31(反馈抗性的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)   EP0723011WO0100852
  ppc   Phosphoenol Pyruvate CarboxylaseEC  4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)   EP1108790O′Reagan等人，Gene 77(2)：237-251(1989)   AX127148AX123554M25819
  pgk   Phosphoglycerate KinaseEC 2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶)   EP1108790WO0100844Eikmanns，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992)   AX121838AX127148AX064943X59403
  pknA   Protein Kinase A(蛋白激酶A)   EP1108790   AX120131AX120085
  pknB   Protein Kinase B(蛋白激酶B)   EP1108790   AX120130AX120085
  pknD   Protein Kinase D(蛋白激酶D)   EP1108790   AX127150AX122469AX122468
  pknG   Protein Kinase G(蛋白激酶G)   EP1108790   AX127152AX123109
  ppsA   Phosphoenol Pyruvate SynthaseEC 2.7.9.2(磷酸烯醇丙酮酸合酶)   EP1108790   AX127144AX120700AX122469
  ptsH   Phosphotransferase System Protein HEC 2.7.1.69(磷酸转移酶系统组分H)   EP1108790WO0100844   AX122210AX127149AX069154
  ptsI   Phosphotransferase System Enzyme IEC 2.7.3.9(磷酸转移酶系统酶I)   EP1108790   AX122206AX127149
  ptsM   Glukose-SpecificPhosphotransferase System Enzyme IIEC 2.7.1.69(葡萄糖磷酸转移酶系统酶II)   Lee等人，FEMSMicrobiology Letters119 (1-2)：137-145(1994)   L18874
  pyc   Pyruvate CarboxylaseEC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)   WO9918228Peters-Wendisch等人，Microbiology144：915-927(1998)   A97276Y09548
  pycP458S   Pyruvate CarboxylaseEC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)氨基酸交换P458S   EP1108790
  sigC   Sigma Factor CEC 2.7.7.6(胞质外功能替代型因子C)   EP1108790   AX120368AX120085
  sigD   RNA Polymerase Sigma Factor DEC 2.7.7.6(RNA聚合酶σ因子)   EP1108790   AX120753AX127144
  sigE   Sigma Factor EEC 2.7.7.6(胞质外功能替代型σ因子E)   EP1108790   AX127146AX121325
  sigH   Sigma Factor HEC 2.7.7.6(σ因子SigH)   EP1108790   AX127145AX120939
  sigM   Sigma Factor MEC 2.7.7.6(σ因子SigM)   EP1108790   AX123500AX127153
  tal   TransaldolaseEC 2.2.1.2(转醛醇酶)   WO0104325   AX076272
  thrB   Homoserine KinaseEC 2.7.1.39(高丝氨酸激酶)   Peoples等人，MolecularMicrobiology 2：63-72(1988)   Y00546
  thrC   Threonine SynthaseEC 4.2.99.2   Han等人，MolecularMicrobiology   X56037
  (苏氨酸合酶)   4：1693-1702(1990)
  thrE   Threonine Exporter(苏氨酸输出载体)   EP1085091   AX137526
  thyA   Thymidylate SynthaseEC 2.1.1.45(胸苷酸合酶)   EP1108790   AX121026AX127145
  tkt   TransketolaseEC 2.2.1.1(转酮醇酶)   Ikeda等人，NCBI   AB023377
  tpi   Triose phosphate IsomeraseEC 5.3.1.1(丙糖磷酸异构酶)   Eikmanns，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992)   X59403
  zwa1   Cell Growth Factor 1(生长因子1)   EP1111062   AX133781
  zwf   Glucose 6-Phosphate1-DehydrogenaseEC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶)   EP1108790WO0104325   AX127148AX121827AX076272
  zwfA213T   Glucose 6-Phosphate1-DehydrogenaseEC 1.1.1.4 9(葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶)氨基酸交换A213T   EP1108790
                                         表7
                  用于整合生产苏氨酸的可读框、基因和等位基因的靶位点
  基因名称   所编码的酶或蛋白质的说明   参考文献   登录号
  ccpA1   Catabolite Control Protein(分解代谢物控制蛋白A1)   WO0100844EP1108790   AX065267AX127147
  ccpA2   Catabo1ite Control Protein(分解代谢物控制蛋白A2)   WO0100844EP1108790   AX065267AX121594
  citA   Sensor Kinase CitA(传感器激酶CitA)   EP1108790   AX120161
  citB   Transcription Regulator CitB(转录调控蛋白CitB)   EP1108790   AX120163
  citE   Citrate LyaseEC 4.1.3.6(柠檬酸裂合酶)   WO0100844EP1108790   AX065421AX127146
  ddh   Diaminopimelate DehydrogenaseEC 1.4.1.16(二氨基庚二酸脱氢酶)   Ishino等人，NucleicAcids Research 15：3917(1987)EP1108790   S07384AX127152
  gluA   Glutamate Transport ATP-bindingProtein(谷氨酸转运ATP-结合蛋白)   Kronemeyer等人，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluB   Glutamate-binding Protein(谷氨酸结合蛋白)   Kronemeyer等人，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluC   Glutamate Transport Permease(谷氨酸运送系统通透酶)   Kronemeyer等人，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluD   Glutamate Transport Permease(谷氨酸运送系统通透酶)   Kronemeyer等人，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  glyA   Glycine HydroxymethyltransferaseEC 2.1.2.1(甘氨酸羟甲基转移酶)   WO0100843   AX063861AF327063
  ilvA   Threonine DehydrataseEC 4.2.1.16(苏氨酸脱水酶)   M_ckel等人，Journalof Bacteriology 174(24)，8065-8072(1992)EP1108790   A47044L01508AX127150
  ilvBN   Acetolactate SynthaseEC 4.1.3.18(乙酰乳酸合酶)   Keilhauer等人，Journal ofBacteriology 175(17)：5595-603(1993)EP1108790   L09232AX127147
  ilvC   ReductoisomeraseEC 1.1.1.86(乙酮醇酸还原异构酶)   Keilhauer等人，Journal ofBacteriology 175(17)：5595-603(1993)EP1108790   C48648AX127147
  ilvD   Dihydroxy-acid DehydrataseEC 4.2.1.9(二羟酸脱水酶)   EP1006189   AX136925
  luxR   Transcription Regulator LuxR(转录调控蛋白LuxR)   WO0100842EP1108790   AX065953AX123320
  luxS   Histidine Kinase LuxS(组氨酸激酶LuxS)   EP1108790   AX123323AX127153
  lysR1   Transcription Regulator LysR1(转录调控蛋白LysR1)   EP1108790   AX064673AX127144
  lysR2   Transcription Activator LysR2   EP1108790   AX123312
  (转录调控蛋白LysR2)
  lysR3   Transcription Regulator LysR3(转录调控蛋白LysR3)   WO0100842EP1108790   AX065957AX127150
  mdh   Malate DehydrogenaseEC 1.1.1.37(苹果酸脱氢酶)   WO0100844   AX064895
  menE   O-Succinylbenzoic Acid CoA LigaseEC 6.2.1.26(O-琥珀酰苯甲酸CoA连接酶)   WO0100843EP1108790   AX064599AX064193AX127144
  metA   Homoserine O-AcetyltransferaseEC 2.3.1.31(高丝氨酸O-乙酰基转移酶)   Park等人，MolecularCells 30；8(3)：286-94(1998)WO0100843EP1108790   AX063895AX127145
  metD   Transcription Regulator MetD(转录调控蛋白MetD)   EP1108790   AX123327AX127153
  pck   Phosphoenol PyruvateCarboxykinase(磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶)   WO0100844   AJ269506AX065053
  poxB   Pyruvate OxidaseEC 1.2.3.3(丙酮酸氧化酶)   WO0100844EP1096013   AX064959AX137665
  sigB   RNA Polymerase TranscriptionFactor(RNA聚合酶转录因子)   EP1108790   AX127149
  zwa2   Cell Growth Factor 2(生长因子2)   EP1106693EP1108790   AX113822AX127146
本发明相应地还提供制备生产L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸的棒杆菌细菌的方法，包括
a)分离至少一种生产甲硫氨酸或苏氨酸的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，可选地包括表达和/或调控信号，
b)为ORF、基因或等位基因的5′和3′末端提供靶位点的核苷酸序列，其中所述位点选自基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件，
c)优选将所述带有靶位点核苷酸序列的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列整合进在棒杆菌细菌中不复制或仅进行有限复制的载体中，
d)将b)或c)的所述核苷酸序列或载体转移进棒杆菌细菌中，和
f)分离靶位点整合有根据a)的核苷酸序列的棒杆菌细菌。
优选靶位点处未存留在所述微生物中能够/使得能够进行附加型复制的核苷酸序列、能够/使得能够发生转座的核苷酸序列和赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供根据权利要求1的生产L-缬氨酸的棒杆菌细菌，尤其是棒杆菌属的细菌。
本发明还提供根据权利要求20的制备L-缬氨酸的方法。
“生产缬氨酸的可读框(ORF)、基因或等位基因的拷贝”理解为意指，所有在增强/过表达后具有提高缬氨酸生产这一效应的可读框、基因或等位基因。
这些除其它之外包括以下可读框、基因或等位基因：brnE、brnF、brnEF、cstA、cysD、dps、eno、fda、gap、gap2、gdh、ilvB、ilvN、ilvBN、ilvC、ilvD、ilvE、msiK、pgk、ptsH、ptsI、ptsM、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tpi、zwa1。这些概括和解释在表8中。它们尤其包括编码缬氨酸-抗性乙酰乳酸合酶的ilvBN等位基因。
“反馈”抗性乙酰乳酸合酶(＝乙酰羟酸合成酶)理解为意指，与野生型形式相比，对至少由缬氨酸或缬氨酸类似物2-噻唑丙氨酸(EPappln.No.03014640.1)引起的抑制具有较低(至少10％至15％或10％至20％)敏感度的乙酰乳酸合酶。
在第三或第四个位点，可以整合生产缬氨酸的可读框(ORF)、基因或等位基因的第三或第四个拷贝。除其它之外，以下可读框、基因或核苷酸序列可用于此：aecD、ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、ddh、gluA、gluB、gluC、gluD、glyA、ilvA、luxR、lySR1、lySR2、lysR3、panB、panC、poxB和zwa2。这些概括和说明在表9中。
所提到的位点当然不仅包括所提到的可读框或基因的编码区域，还包括位于上游负责表达和调控的区域或核苷酸序列，比如核糖体结合位点、启动子、调控蛋白结合位点、调控核糖核酸的结合位点和衰减子。这些区域通常位于编码区域上游1-800、1-600、1-400、1-200、1-100或1-50个核苷酸范围内。同样，位于下游的区域，比如转录终止子也包括在内。这些区域通常位于编码区域下游1-400、1-200、1-100、1-50或1-25个核苷酸范围内。
可以使用染色体内的基因间区域，也就是不具有编码功能的核苷酸序列。最后，通常包含在染色体中的原噬菌体或缺陷噬菌体或噬菌体组件可用于此。
代表基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的谷氨酸棒杆菌染色体区域的实例示于表12和13。DNA区域的位置参照EP-A-1108790或欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国和剑桥，英国)数据库中所示的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组图谱。
就表12的基因间区域而言，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，由于野生型与野生型菌株之间相互不同以及根据所接受的突变处理，根据本发明可以使用含有与表12所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且不具有编码功能即基因或等位基因的区域。
就选自表13的编码原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的DNA区域而言，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，由于野生型与野生型菌株之间相互不同以及根据所接受的突变处理，根据本发明可以使用含有与表13所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且编码原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的区域。
                                       表8
                     生产缬氨酸的可读框、基因和等位基因
 名称   所编码的酶或蛋白质的说明   参考文献   登录号
 brnEF   Export of branched-chain amino acids(支链氨基酸输出)   EP1096010Kennerknecht等人， AF454053
  NCBI
  cstA   Carbon Starvation Protein A(碳饥饿蛋白A)   EP1108790WO0100804   AX120811AX066109
  dps   DNA Protection Protein(在饥饿期间进行保护的蛋白)   EP1108790   AX127153
  eno   EnolaseEC 4.2.1.11(烯醇化酶)   EP1108790WO0100844EP1090998Hermann等人，Electrophoresis19：3217-3221(1998)   AX127146AX064945AX136862
  fda   Fructose Bisphosphate AldolaseEC 4.1.2.13(果糖二磷酸醛缩酶)   van der Osten等人，MolecularMicrobiology3：1625-1637(1989)   X17313
  gap   Glyceraldehyde 3-PhosphateDehydrogenaseEC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)   EP1108790WO0100844Eikmanns等人，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992)   AX127148AX064941X59403
  gap2   Glyceraldehyde 3-PhosphateDehydrogenaseEC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2)   EP1108790WO0100844   AX127146AX064939
  gdh   Glutamate DehydrogenaseEC 1.4.1.4(谷氨酸脱氢酶)   EP1108790WO0100844Boermann等人，MolecularMicrobiology6：317-326(1992)；Guyonvarch等人，NCBI   AX127150AX063811X59404X72855
  ilvBN   Acetolactate SynthaseEC 4.1.3.18(乙酰乳酸合酶)   Keilhauer等人，Journal ofBacteriology 175(17)：5595-603(1993)EP1108790   L09232AX127147
  ilvC   IsomeroreductaseEC 1.1.1.86(乙酰羟酸异构还原酶)   Keilhauer等人，Journal ofBacteriology 175(17)：5595-603   C48648AX127147
  (1993)BP1108790
  ilvD   Dihydroxy-acid DehydrataseEC 4.2.1.9(二羟酸脱水酶)   EP1006189   AX136925
  ilvE   Transaminase BEC 2.6.1.42(转氨酶B)   EP1108790   AX127150AX122498
  msiK   Sugar Importer(多种糖类输入蛋白)   EP1108790   AX120892
  pgk   Phosphoglycerate KinaseEC 2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶)   EP1108790WO0100844Eikmanns，Journalof Bacteriology174：6076-6086(1992)   AX121838AX127148AX064943X59403
  ptsH   Phosphotransferase System Protein HEC 2.7.1.69(磷酸转移酶系统组分H)   EP1108790WO0100844   AX122210AX127149AX069154
  ptsI   Phosphotransferase System Enzyme IEC 2.7.3.9(磷酸转移酶系统酶I)   EP1108790   AX122206AX127149
  ptsM   Glucose-specific PhosphotransferaseSystem Enzyme IIEC 2.7.1.69(葡萄糖磷酸转移酶系统酶II)   Lee等人，FEMSMicrobiologyLetters 119(1-2)：137-145(1994)   L18874
  sigC   Sigma Factor CEC 2.7.7.6(胞质外功能替代型σ因子C)   EP1108790   AX120368AX120085
  sigD   RNA Polymerase Sigma Factor DEC 2.7.7.6(RNA聚合酶σ因子)   EP1108790   AX120753AX127144
  sigE   Sigma Factor EEC 2.7.7.6(胞质外功能替代型σ因子E)   EP1108790   AX127146AX121325
  sigH   Sigma Factor HEC 2.7.7.6(σ因子SigH)   EP1108790   AX127145AX120939
  sigM   Sigma Factor MEC 2.7.7.6(σ因子SigM)   EP1108790   AX123500AX127153
  tpi   Triose Phosphate IsomeraseEC 5.3.1.1   Eikmanns，Journalof Bacteriology   X59403
  (丙糖磷酸异构酶)   174：6076-6086(1992)
  zwal   Cell Growth Factor 1(生长因子1)   EP1111062   AX133781
                                        表9
                用于整合生产缬氨酸的可读框、基因和等位基因的靶位点
  基因名称   所编码的酶或蛋白质的说明   参考文献   登录号
  aecD   beta C-S LyaseEC 2.6.1.1(βC-S裂合酶)   Rossol等人，Journal ofBacteriology 174(9)：2968-77(1992)   M89931
  ccpA1   Catabolite Control Protein(分解代谢物控制蛋白A1)   WO0100844EP1108790   AX065267AX127147
  ccpA2   Catabolite Control Protein(分解代谢物控制蛋白A2)   WO0100844EP1108790   AX065267AX121594
  citA   Sensor Kinase CitA(传感器激酶CitA)   EP1108790   AX120161
  citB   Transcription Regulator CitB(转录调控蛋白CitB)   EP1108790   AX120163
  citE   Citrate LyaseEC 4.1.3.6(柠檬酸裂合酶)   WO0100844EP1108790   AX065421AX127146
  ddh   Diaminopimelate DehydrogenaseEC 1.4.1.16(二氨基庚二酸脱氢酶)   Ishino等人，NucleicAcids Research 15：3917(1987)EP1108790   S07384AX127152
  gluA   Glutamate TransportATP-binding Protein(谷氨酸转运ATP-结合蛋白)   Kronemeyer等人，Journalof Bacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluB   Glutamate-binding Protein(谷氨酸结合蛋白)   Kronemeyer等人，Journalof Bacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluC   Glutamate Transport Permease(谷氨酸运送系统通透酶)   Kronemeyer等人，Journalof Bacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluD   Glutamate Transport Permease(谷氨酸运送系统通透酶)   Kronemeyer等人，Journalof Bacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  glyA   GlycineHydroxymethyltransferaseEC 2.1.2.1(甘氨酸羟甲基转移酶)   WO0100843   AX063861AF327063
  ilvA   Threonine DehydrataseEC 4.2.1.16(苏氨酸脱水酶)  M_ckel等人，Journal ofBacteriology 174(24)，8065-8072(1992)EP1108790   A47044L01508AX127150
  luxR   Transcription Regulator LuxR(转录调控蛋白LuxR)  WO0100842EP1108790   AX065953AX123320
  lysR1   Transcription Regulator LysR1(转录调控蛋白LysR1)  EP1108790   AX064673AX127144
  lysR2   Transcription Activator LysR2(转录调控蛋白LysR2)  EP1108790   AX123312
  lysR3   Transcription Regulator LysR3(转录调控蛋白LysR3)  WO0100842EP1108790   AX065957AX127150
  panB   KetopantoateHydroxymethyltransferaseEC 2.1.2.11(酮泛解酸羟甲基转移酶)  US6177264   X96580
  panC   Pantothenate SynthetaseEC 6.3.2.1(泛酸合成酶)  US6177264   X96580
  poxB   Pyruvate OxidaseEC 1.2.3.3(丙酮酸氧化酶)  WO0100844EP1096013   AX064959AX137665
  zwa2   Cell Growth Factor 2(生长因子2)  EP1106693EP1108790   AX113822AX127146
本发明相应地还提供制备生产L-缬氨酸的棒杆菌细菌的方法，包括
a)分离至少一种生产缬氨酸的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，可选地包括表达和/或调控信号，
b)为ORF、基因或等位基因的5′和3′末端提供靶位点的核苷酸序列，其中所述位点选自基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件，
c)优选将带有靶位点核苷酸序列的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列整合进在棒杆菌细菌中不复制或仅进行有限复制的载体中，
d)将b)或c)的所述核苷酸序列或载体转移进棒杆菌细菌中，和
e)分离靶位点整合有根据a)的核苷酸序列的棒杆菌细菌。靶位点处未存留在微生物中能够/使得能够进行附加型复制，或能够/使得能够发生转座，或赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供制备L-色氨酸的方法，其包括以下步骤：
a)发酵棒杆菌细菌，尤其是根据权利要求1的谷氨酸棒杆菌。
“生产色氨酸的可读框、基因或等位基因的拷贝”理解为意指，所有在增强/过表达后具有提高色氨酸生产这一效应的可读框、基因或等位基因。
这些除其它之外包括以下可读框、基因或等位基因：aroA，aroB，aroC，aroD，aroE，aroG，aroK，cstA，eno，gap，gap2，gnd，ppsA，rpe，serA，serB，serC，tal，thyA，tkt，tpi，trpA，trpB，trpC，可选地包括至少一种选自A215T(215位的丙氨酸替换为苏氨酸)、D138A(138位的天冬氨酸替换为丙氨酸)、S149F(149位的丝氨酸替换为苯丙氨酸)和A162E(162位的丙氨酸替换为谷氨酸)的氨基酸替换的trpD，trpE，包括例如氨基酸替换S38R(38位的丝氨酸替换为精氨酸)的trpEFBR，trpG，可选地包括突变W14*的trpL，zwa1，可选地包括氨基酸替换A213T(213位的丙氨酸替换为苏氨酸)的zwf。这些概括和解释在表10中。这些尤其包括包含trpE、trpG、trpD、trpC和trpA以及可选地trpL的色氨酸操纵子。此外，这些还特别包括编码色氨酸抗性邻氨基苯甲酸合酶的trpEFBR等位基因。
“反馈”抗性邻氨基苯甲酸合酶理解为意指，与野生型形式相比，对由色氨酸或5-氟色氨酸(Matsui等人，Journal of Bacteriology169(11)：5330-5332(1987))或类似物引起的抑制具有较低(至少5％至10％、10％至15％或10％至20％)敏感度的邻氨基苯甲酸合酶。生产L-色氨酸的菌株通常包含这样的“反馈”抗性的或脱敏的邻氨基苯甲酸合酶(参见例如US 6180373和EP0338474)。
在第三或第四个位点，可以整合生产色氨酸的可读框(ORF)、基因或等位基因的第三或第四个拷贝。除其它之外，以下可读框、基因或核苷酸序列可用作整合位点：ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、cysE、gluA、gluB、gluC、gluD、glyA、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、menE、pgi、pheA、poxB和zwa2。这些概括和说明在表11中。
所提到的位点当然不仅包括所提到的可读框或基因的编码区域，还包括位于上游负责表达和调控的区域或核苷酸序列，比如核糖体结合位点、启动子、调控蛋白结合位点、调控核糖核酸的结合位点和衰减子。这些区域通常位于编码区域上游1-800、1-600、1-400、1-200、1-100或1-50个核苷酸范围内。同样，位于下游的区域，比如转录终止子也包括在内。这些区域通常位于编码区域下游1-400、1-200、1-100、1-50或1-25个核苷酸范围内。
可以使用染色体内的基因间区域，也就是不具有编码功能的核苷酸序列。最后，通常包含在染色体中的原噬菌体或缺陷噬菌体或噬菌体组件也可用于此。
代表基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的谷氨酸棒杆菌染色体区域的实例示于表12和13。DNA区域的位置参照EP-A-1108790或欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国和剑桥，英国)数据库中所示的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组图谱。
                                     表10
                    生产色氨酸的可读框、基因和等位基因
  基因名称   所编码的酶或蛋白质的说明   参考文献   登录号
  aroA   Enolpyruvylshikimate PhosphateSynthaseEC 2.5.1.19(烯醇丙酮酸莽草酸3-磷酸合酶)   O′Donohue等人，NCBI   AF114233
  aroB   Dehydroquinate SynthetaseEC 4.6.1.3(脱氢奎尼酸合成酶)   Burke等人，NCBI   AF124600
  aroC   Chorismate SynthaseEC 4.6.1.4(分支酸合酶)   Burke等人，NCBI   AF124600
  aroD   Dehydroquinate DehydrataseEC 4.2.1.10(脱氢奎尼酸脱水酶)   Joy等人，NCBI   AF124518
  aroE   Shikimate Dehydrogenase   Joy等人，NCBI   AF124518
  EC 1.1.1.25(莽草酸脱氢酶)
  aroG   Dehydro-3-DeoxyphosphoheptonateAldolaseEC4.1.2.15(脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶)   Chen等人，FEMSMicrobioliologyLetters107：223-230(1993).   L07603
  aroK   Shikimate KinaseEC 2.7.1.71(莽草酸激酶)   Burke等人，NCBI   AF124600
  cstA   Carbon Starvation Protein A(碳饥饿蛋白A)   EP1108790WO0100804   AX120811AX066109
  eno   EnolaseEC 4.2.1.11(烯醇化酶)   EP1108790WO0100844EP1090998Hermann等人，Electrophoresis19：3217-3221(1998)   AX127146AX064945AX136862
  gap   Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenaseEC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)   EP1108790WO0100844Eikmanns等人，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992)   AX127148AX064941X59403
  gap2   Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenaseEC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2)   EP1108790WO0100844   AX127146AX064939
  gnd   6-Phosphogluconate DehydrogenaseEC 1.1.1.44(6-磷酸葡糖酸脱氢酶)   EP1108790WO0100844   AX127147AX121689AX065125
  ppsA   Phosphoenolpyruvate SynthetaseEc 2.7.9.2(磷酸烯醇丙酮酸合酶)   EP1108790   AX127144AX120700
  rpe   Ribulose-Phosphate EpimeraseEC 5.1.3.1(核酮糖-磷酸差向异构酶)   EP1108790   AX127148AX121852
  serA   Phosphoglycerate DehydrogenaseEC1.1.1.95(磷酸甘油酸脱氢酶)   EP1108790   AX127147AX121499
  serB   Phosphoserine PhosphataseEC 3.1.3.3   EP1108790   AX127144AX120551
  (磷酸丝氨酸磷酸酶)
  serC   Phosphoserine AminotransferaseEC 2.6.1.52(磷酸丝氨酸氨基转移酶)   EP1108790   AX127145AX121012
  tal   TransaldolaseEC 2.2.1.2(转醛醇酶)   WO0104325   AX076272
  thyA   Thymidylate SynthaseEC 2.1.1.45(胸苷酸合酶)   EP1108790   AX121026AX127145
  tkt   TransketolaseEC 2.2.1.1(转酮醇酶)   Ikeda等人，NCBI   AB023377
  tpi   Triose-phosphate IsomeraseEC 5.3.1.1(丙糖磷酸异构酶)   Eikmanns，Journalof Bacteriology174：6076-6086(1992)   X59403
  trpA   Tryptophane Synthase(alpha Kette)EC 4.2.1.20(色氨酸合酶(α链))   Matsui等人，Nucleic AcidsResearch14：10113-10114(1986)   X04960
  trpB   Tryptophane Synthase(βKette)EC 4.2.1.20(色氨酸合酶(β链))   Matsui等人，Nucleic AcidsResearch14：10113-10114(1986)   X04960
  trpC   PhosphoribosylanthranilateIsomeraseEC 5.3.1.24(磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶)   Matsui等人，Nucleic AcidsResearch14：10113-10114(1986)   X04960
  trpD   AnthranilatePhosphoribosyltransferaseEC  2.4.2.18(邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶)   Matsui等人，Nucleic AcidsResearch14：10113-10114(1986)   X04960
  trpDA125T，D138A，S149F，A162E   AnthranilatePhosphoribosyltransferaseEC 2.4.2.18邻氨基苯甲酸(磷酸核糖转移酶)氨基酸交换A125T、D138A、S149F、A162E   O′Gara等人，Applied andEnvironmentalMicrobiology61：4477-4479(1995)
  trpE   Anthranilate Synthase Komponente IEC 4.1.3.27   Matsui等人，Nucleic Acids   X04960
  (邻氨基苯甲酸合酶组分I)   Research14：10113-10114(1986)
  trpE fbr   Anthranilat Synthase Component Ifeedback resistentEC 4.1.3.27(反馈抗性的邻氨基苯甲酸合酶组分I)   Matsui等人，Journal ofBacteriology169：5330-5332(1987)
  trpG   Anthranilate Synthase Komponente IIEC 4.1.3.24(邻氨基苯甲酸合酶组分II)   Matsui等人，Nucleic AcidsResearch14：10113-10114(1986)   X04960
  trpL   Trp Operon Leader Peptide(trp操纵子引导肽)   Matsui等人，Nucleic AcidsResearch14：10113-10114(1986)   X04960
  trpLW14*   Trp Operon Leaderpeptid(trp操纵子引导肽突变W14*)   Herry等人，AppliedandEnvironmentalMicrobiology59：791-799(1993)
  zwal   Cell Growth Factor 1(生长因子1)   EP1111062   AX133781
  zwf   Glucose-6-phosphat1-1-DehydrogenaseEC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)   EP1108790WO0104325   AX127148AX121827AX076272
  zwfA213T   Glucose-6-phosphate-1-DehydrogenaseEC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)氨基酸交换A213T   EP1108790
                               表11
          用于整合生产色氨酸的可读框、基因和等位基因的靶位点
  基因名称   所编码的酶或蛋白质的说明   参考文献   登录号
  ccpA1   Catabolite Control Protein(分解代谢物控制蛋白A1)   WO0100844EP1108790   AX065267AX127147
  ccpA2   Catabolite Control Protein(分解代谢物控制蛋白A2)   WO0100844EP1108790   AX065267AX121594
  citA   Sensor-Kinase CitA(传感器激酶CitA)   EP1108790   AX120161
  citB   Transcription Regulator CitB(转录调控蛋白CitB)   EP1108790   AX120163
  citE   Citrate-LyaseEC 4.1.3.6(柠檬酸裂合酶)   WO0100844EP1108790   AX065421AX127146
  cysE   Serine O-AcetyltransferaseEC 2.3.1.30(丝氨酸O-乙酰基转移酶)   EP1108790   AX122902
  gluA   Glutamate Transport ATP-bindingProtein(谷氨酸转运ATP-结合蛋白)   Kronemeyer等人，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluB   Glutamate-binding Protein(谷氨酸结合蛋白)   Kronemeyer等人，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluC   Glutamate Transport Permease(谷氨酸运送系统通透酶)   Kronemeyer等人，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluD   Glutamate Transport Permease(谷氨酸运送系统通透酶)   Kronemeyer等人，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)   X81191
  glyA   glycine hydroxymethyltransferaseEC 2.1.2.1(甘氨酸羟甲基转移酶)   JP1997028391   E12594
  luxR   Transkription Regulator LuxR(转录调控蛋白LuxR)   WO0100842EP1108790   AX065953AX123320
  luxS   Histidine Kinase LuxS(组氨酸激酶LuxS)   EP1108790   AX123323AX127153
  lysR1   Transkription Regulator LysR1(转录调控蛋白LysR1)   EP1108790   AX064673AX127144
  lysR2   Transkription Activator LysR2(转录调控蛋白LysR2)   EP1108790   AX123312
  lysR3   Transkription Regulator LysR3(转录调控蛋白LysR3)   WO0100842EP1108790   AX065957AX127150
  menE   O-Succinylbenzoic acid-CoA-LigaseEC 6.2.1.26(O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶)   WO0100843EP1108790   AX064599AX064193AX127144
  pgi   Glucose-6-Phosphate-IsomeraseEC 5.3.1.9   EP1087015EP1108790   AX136015AX127146
  (葡萄糖-6-磷酸异构酶)
  pheA   Prephenate DehydrataseEC 4.2.1.51(预苯酸脱水酶)   Follettie等人，Journal ofBacteriology167：695-702(1986)   M13774
  poxB   Pyruvate-OxidaseEC 1.2.3.3(丙酮酸氧化酶)   WO0100844EP1096013   AX064959AX137665
  zwa2   Cell Growth Factor 2(生长因子2)   EP1106693EP1108790   AX113822AX127146
本发明相应地还提供制备生产L-色氨酸的棒杆菌细菌的方法，包括
a)分离至少一种生产色氨酸的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，可选地包括表达和/或调控信号，
b)为ORF、基因或等位基因的5′和3′末端提供靶位点的核苷酸序列，其中所述位点选自基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件，
c)优选将带有靶位点核苷酸序列的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列整合进在棒杆菌细菌中不复制或仅进行有限复制的载体中，
d)将b)或c)的所述核苷酸序列或载体转移进棒杆菌细菌中，和
e)分离靶位点整合有根据a)的核苷酸序列的棒杆菌细菌。靶位点处未存留在微生物中能够/使得能够进行附加型复制，或能够/使得能够发生转座，或赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。
                          表12
     作为整合可读框、基因和等位基因的靶位点的基因间区域
  参考文献   登录号   序列起始位置   序列终点位置
  EP1108790   AX120085   192176   194501
  EP1108790   AX127145   235840   237311
  EP1108790   AX127145   236096   237311
  EP1108790   AX127148   322628   330877
  EP1108790   AX127148   334045   336467
  EP1108790   AX127148   289565   291841
  EP1108790   AX127149   154823   161111
  EP1108790   AX127149   190088   193497
  EP1108790   AX127149   27398   28707
  EP1108790   AX127149   61478   62944
  EP1108790   AX127149   116234   117561
  EP1108790   AX127149   140847   144605
  EP1108790   AX127150   113274   114324
  EP1108790   AX127152   244281   246403
                          表13
适于整合可读框、基因和等位基因的并且编码噬菌体或噬菌体组件的靶位点
  参考文献   登录号   序列起始位置   序列终点位置
  EP1108790   AX127149   50474   51049
  EP1108790   AX127149   67886   68587
  EP1108790   AX127151   72893   73480
  EP1108790   AX127149   88231   89445
  EP1108790   AX127148   139781   140155
  EP1108790   AX127148   140546   141001
  EP1108790   AX127149   194608   195294
  EP1108790   AX127147   200185   200940
  EP1108790   AX127147   208157   208450
  EP1108790   AX127149   269616   269948
  EP1108790   AX127148   336468   338324
  EP1108790   AX127148   342235   342681
  EP1108790   AX127148   343518   345356
  EP1108790   AX127148   345872   346207
在本发明的研究工作中，将lysCFBR等位基因的第二个拷贝整合进谷氨酸棒杆菌的gluB基因，这样，在gluB基因位点就不存留在微生物中能够/使得能够进行附加型复制的核苷酸序列、能够/使得能够发生转座的核苷酸序列以及赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。这一称为DSM13994glu∷lysC的菌株，在其天然lysC位点携带lysCFBR等位基因lysC T311I，和在第二个位点(靶位点)，也即gluB基因处，携带第二个拷贝的lysCFBR等位基因lysC T311I。可以帮助实现将lysCFBR等位基因整合进gluB基因的质粒示于附图1。它称作pK18mobsacBglu1_1。
在本发明的研究工作中，将一个拷贝的lysCFBR等位基因整合进作为靶位点的谷氨酸棒杆菌gluB基因，这样，在gluB基因位点就不存留在微生物中能够/使得能够进行附加型复制的核苷酸序列、能够/使得能够发生转座的核苷酸序列以及赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。这一称为DSM12866glu∷lysC的菌株，在其天然lysC位点携带野生型的lysC基因，并在第二个位点(靶位点)，也即gluB基因处，携带形式为lysCFBR等位基因lysC T311I的第二个拷贝lysC基因。其已保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSM15039。可以帮助实现将lysCFBR等位基因整合进gluB基因的质粒示于附图1。它称作pK18mobsacBglu1_1。
在本发明的研究工作中，将一个拷贝的lysCFBR等位基因整合进作为靶位点的谷氨酸棒杆菌aecD基因，这样，在aecD基因位点就不存留在微生物中能够/使得能够进行附加型复制的核苷酸序列、能够/使得能够发生转座的核苷酸序列以及赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。这一称为DSM12866aecD∷lysC的菌株，在其天然lysC位点携带野生型的lysC基因，并在第二个位点(靶位点)，也即aecD基因处，携带形式为lysCFBR等位基因lysC T311I的第二个拷贝lysC基因。可以帮助实现将lysCFBR等位基因整合进aecD基因的质粒示于附图2。它称作pK18mobsacBaecD1_1。
在本发明的研究工作中，将一个拷贝的lysCFBR等位基因整合进作为靶位点的谷氨酸棒杆菌pck基因，这样，在pck基因位点就不存留在微生物中能够/使得能够进行附加型复制的核苷酸序列、能够/使得能够发生转座的核苷酸序列以及赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。这一称为DSM12866pck∷lysC的菌株，在其天然lysC位点携带野生型的lysC基因，并在第二个位点(靶位点)，也即pck基因处，携带形式为lysCFBR等位基因lysC T311I的第二个拷贝lysC基因。可以帮助实现将lysCFBR等位基因整合进pck基因的质粒示于附图3。它称作pK18mobsacBpck1_1。
在本发明的研究工作中，将一个拷贝的ddh基因整合进作为靶位点的谷氨酸棒杆菌gluB基因，这样，在gluB基因位点就不存留在微生物中能够/使得能够进行附加型复制的核苷酸序列、能够/使得能够发生转座的核苷酸序列以及赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。这一称为DSM12866glu∷ddh的菌株，在其天然ddh位点携带一个拷贝的ddh基因，并在第二个位点(靶位点)，也即gluB基因处，携带第二个拷贝的ddh基因。可以帮助实现将ddh基因整合进gluB基因的质粒示于附图4。它称作pK18mobsacBgluB2_1。
在本发明的研究工作中，将一个拷贝的dapA基因整合进作为靶位点的谷氨酸棒杆菌aecD基因，这样，在aecD基因位点就不存留在微生物中能够/使得能够进行附加型复制的核苷酸序列、能够/使得能够发生转座的核苷酸序列以及赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。这一称为DSM12866aecD∷dapA的菌株，在其天然dapA位点携带一个拷贝的dapA基因，并在第二个位点(靶位点)，也即aecD基因处，携带第二个拷贝的dapA基因。可以帮助实现将dapA基因整合进aecD基因的质粒示于附图5。它称作pK18mobsacBaecD2_1。
在本发明的研究工作中，将一个拷贝的pyc等位基因整合进作为靶位点的谷氨酸棒杆菌pck基因，这样，在pck基因位点就不存留在微生物中能够/使得能够进行附加型复制的核苷酸序列、能够/使得能够发生转座的核苷酸序列以及赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。这一称为DSM12866pck∷pyc的菌株，在其天然pyc位点携带野生型的pyc基因，并在第二个位点(靶位点)，也即pck基因处，携带形式为pyc等位基因pyc P458S的第二个拷贝pyc基因。可以帮助实现将pyc等位基因整合进pck基因的质粒示于附图6。它称作pK18mobsacBpck1_3。
在本发明的研究工作中，将一个拷贝的色氨酸操纵子整合进选自表12的谷氨酸棒杆菌基因间区域(靶位点)，这样，在靶位点就不存留在微生物中能够/使得能够进行附加型复制的核苷酸序列、能够/使得能够发生转座的核苷酸序列以及赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。这一称为ATCC21850nc∷trp的菌株，在其天然色氨酸操纵子位点携带一个拷贝的色氨酸操纵子，即菌株ATCC 21850的色氨酸操纵子，并在第二个位点(靶位点)，也即根据表12位置为27398至28707的基因间区域处，携带第二个拷贝的所述色氨酸操纵子。可以帮助实现将所述色氨酸操纵子整合进所述靶位点的质粒示于附图9。它称作pK18mobsacBnc∷trp。
在本发明的研究工作中，将一个拷贝的色氨酸操纵子整合进选自表12的编码原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的谷氨酸棒杆菌区域(靶位点)，这样，在靶位点就不存留在微生物中能够/使得能够进行附加型复制的核苷酸序列、能够/使得能够发生转座的核苷酸序列以及赋予其抗生素抗性的核苷酸序列。这一称为ATCC21850pha1∷trp菌株，在其天然色氨酸操纵子位点携带一个拷贝的色氨酸操纵子，即菌株ATCC 21850的色氨酸操纵子，并在第二个位点(靶位点)，也即根据表13位置为88231至89445的区域处，携带第二个拷贝的所述色氨酸操纵子。可以帮助实现将所述色氨酸操纵子整合进所述靶位点的质粒示于附图10。它称作pK18mobsacBpha1∷trp。
为生产化合物，根据本发明制备的棒杆菌细菌可以连续培养或者以分批法(分批培养)或补料分批(补料法)或重复补料分批法(重复补料法)进行不连续培养。已知培养方法的概述描述在Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))的教科书中。
所使用的培养基必须以适宜的方式符合特定菌株的要求。有关不同微生物培养基的说明在美国细菌学会的手册“Manual of Methodsfor Genera  Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)中有。
比如像葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素这样的糖类和碳水化合物，比如像大豆油、葵花子油、花生油和椰子油这样的油类和脂肪，比如像棕榈酸、硬脂酸和亚油酸这样的脂肪酸，比如像丙三醇和乙醇这样的醇类，以及比如像乙酸或乳酸这样的有机酸，可用作碳源。这些物质可以单独或混合使用。
有机含氮化合物，比如蛋白胨、酵母提取物、肉类提取物、麦芽提取物、玉米浸渍液、大豆粉和尿素，或者无机化合物，比如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，可用作氮源。氮源可以单独或混合使用。
磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者相应的钠盐可用作磷源。培养基还必须包括比如硫酸镁或硫酸铁这样的生长所必需的金属盐。最后，除上述物质之外还可以使用比如氨基酸和维生素这样的必需生长物质。此外，还可以在培养基中添加适宜的前体物质。所提到的起始物质可以单次加到培养基中，或者可以在培养过程中以适宜方式补料加入。
碱性化合物，比如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物，比如磷酸或硫酸，可以适宜的方式用于控制培养物的pH。可以用比如脂肪酸聚乙二醇酯这样的防沫剂来控制泡沫形成。可以向培养基中添加具有选择活性的适宜物质比如抗生素，以维持质粒的稳定性。为维持有氧状况，向培养基中导入氧气和含氧气体混合物，比如空气。培养温度通常为20℃至45℃，且优选25℃至40℃。持续培养直至形成最大量的目的化合物。通常在10至160小时内达到这一目标。
已经发现，根据本发明的棒杆菌细菌，尤其是生产L-赖氨酸的棒杆菌细菌，具有预料不到的高稳定性。它们保持稳定至少10-20、20-30、30-40、40-50、优选至少50-60、60-70、70-80和80-90个世代或细胞分裂周期。
以下微生物已经保藏：
根据布达佩斯条约，菌株谷氨酸棒杆菌DSM12866glu∷lysC以纯培养物形式于2002年6月5日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)(Braunschweig，Germany)，保藏编号为DSM15039。
根据布达佩斯条约，质粒pK18mobsacBglu1_1以大肠杆菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBglu1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBglu1_1)的纯培养物形式于2001年4月20日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSM14243。
根据布达佩斯条约，质粒pK18mobsacBaecD1_1以大肠杆菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBaecD1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBaecD1_1)的纯培养物形式于2002年6月5日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSM15040。
实施例1
将lysCFBR等位基因的第二个拷贝整合进菌株DSM13994和菌株DSM12866的染色体中
通过多次非直接诱变、选择和突变体选择从谷氨酸棒杆菌ATCC13032制得谷氨酸棒杆菌菌株DSM13994。该菌株对赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有抗性，并具有对由赖氨酸和苏氨酸混合物(各为25mM)引起的抑制不敏感的反馈抗性天冬氨酸激酶。该菌株的lysCFBR等位基因核苷酸序列示作SEQ ID NO：3。它在下文中也称作lysC T311I。所编码的天冬氨酸激酶蛋白质的氨基酸序列示作SEQID NO：4。根据布达佩斯条约，该菌株的纯培养物于2001年1月16日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)。
通过非直接诱变和选择L-赖氨酸累积最好的突变体，从谷氨酸棒杆菌ATCC13032制得了菌株DSM12866。它是甲硫氨酸敏感型的。通过添加苏氨酸可以在含有L-甲硫氨酸的基本培养基上重新生长。该菌株具有如SEQ ID NO：1所示的野生型lysC基因。相应的野生型天冬氨酸激酶蛋白质的氨基酸序列示作SEQ ID NO：2。根据布达佩斯条约，该菌株的纯培养物于1999年6月10日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)。
1.1分离菌株DSM13994的lysC等位基因DNA并测序
用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))从菌株DSM13994分离出染色体DNA。用聚合酶链式反应扩增出带有lysC基因或等位基因的DNA区段。根据已知的谷氨酸棒杆菌lysC基因序列(Kalinowski等人，Molecular Microbiology，5(5)，1197-1204(1991)；登录号X57226)，选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
lysC1beg(SEQ ID No：5)：
5′TA(G GAT CC)T CCG GTG TCT GAC CAC GGT G 3′
lysC2end：(SEQ ID NO：6)：
5′AC(G GAT CC)G CTG GGA AAT TGC GCT CTT CC 3′
所示引物由MWG Biotech合成，并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)进行PCR。这些引物可以扩增出携带有lysC基因或等位基因、长约1.7kb的DNA区段。此外这些引物还包含限制性内切酶BamHI的切割位点序列，其在如上所示核苷酸序列中用圆括号标记。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的长约1.7kb并携带有菌株DSM13994的lysC等位基因的DNA片段，并用常规方法从凝胶中分离和纯化(QIAquick凝胶抽提试剂盒，Qiagen，Hilden)。
然后用Topo TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，The Netherlands，目录编号K4600-01)将片段连接进载体pCRII-TOPO。将连接物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷兰)。通过将转化产物在含有卡那霉素(50mg/l)、X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷，64mg/l)的LB琼脂上涂板来选择携带有质粒的细胞。
分离DNA后，通过限制性切割检查所获得的质粒，并在琼脂糖凝胶中鉴定。所得质粒称作pCRIITOPOlysC。
用PE Applied Biosystems(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism377”测序装置并根据Sanger等人的双脱氧链终止法(Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA，74：5463-5467(1977))确定所扩增的DNA片段或PCR产物的核苷酸序列。PCR产物的编码区序列示于SEQ ID No：3。与之相关的天冬氨酸激酶蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。
在菌株DSM13994的lysCFBR等位基因的编码区域核苷酸序列(SEQID NO：3)第932位发现了碱基胸腺嘧啶。在野生型基因(SEQ ID NO：1)的相应位置发现了碱基胞嘧啶。
在菌株DSM13994的天冬氨酸激酶蛋白质的氨基酸序列(SEQ IDNo：4)第311位发现了氨基酸异亮氨酸。在野生型蛋白质(SEQ ID NO：2)的相应位置发现了氨基酸苏氨酸。
在编码区域第932位含有碱基胸腺嘧啶、并由此编码在氨基酸序列第311位含有氨基酸异亮氨酸的天冬氨酸激酶蛋白质的LysC等位基因，在下文中称作lysCFBR等位基因或lysC T311I。
根据布达佩斯条约，携带lysCFBR等位基因lysC T311I的质粒pCRIITOPOlysC以大肠杆菌菌株TOP10/pCRIITOPOlysC的纯培养物形式于2001年4月20日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSM14242。
1.2构建取代载体pK18mobsacBglu1_1
用谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032作染色体DNA供体。用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))从菌株ATCC13032分离出染色体DNA。借助聚合酶链式反应，扩增出带有gluB基因及其周边区域的DNA片段。根据已知的谷氨酸棒杆菌gluABCD基因簇的序列(Kronemeyer等人，Journal of Bacteriology，177：1152-1158(1995))(登录号X81191)，选择以下引物寡核苷酸进行PCR：gluBgl1(SEQ ID NO：7)：
5′TA(A GAT CT)G TGT TGG ACG TCA TGG CAA G 3′
gluBgl2(SEQ ID NO：8)：
5′AC(A GAT CT)T GAA GCC AAG TAC GGC CAA G 3′
所示引物由MWG Biotech合成，并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)进行PCR。这些引物可以扩增出携带有gluB基因及其周边区域、大小约1.7kb的DNA片段。周边区域是位于gluB上游、代表gluA基因3′末端、长约0.33kb的序列区段，以及位于gluB下游、代表gluC基因的5′末端、长约0.44kb的序列区段。此外这些引物还包含限制性内切酶BglII的切割位点序列，其在如上所示核苷酸序列中用圆括号标记。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的长约1.7kb并携带有菌株gluB基因及其周边区域的DNA片段，并用常规方法从凝胶中分离和纯化(QIAquick凝胶抽提试剂盒，Qiagen，Hilden)。
然后用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，The Netherlands，目录编号K4600-01)将片段连接进载体pCRII-TOPO。将连接物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷兰)。通过将转化产物在含有卡那霉素(50mg/l)、X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷，64mg/l)的LB琼脂上涂板来选择携带有质粒的细胞。
分离DNA后，用限制性切割检查所获得的质粒，并在琼脂糖凝胶中鉴定。所得质粒称作pCRII-TOPOglu。
用限制性酶BglII(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)切割质粒pCRII-TOPOglu，并在用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离开后，从琼脂糖凝胶中分离出长约1.7kb的gluB片段，将之与Sch_fer等人所述的可移动的克隆载体pK18mobsacB(Gene 14：69-73(1994))连接。该克隆载体事先用限制性酶BamHI切割并用碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，与长约1.7kb的gluB片段混合，用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理该混合物。
之后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pK18mobsacBglu1。
从携带质粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242(参见实施例1.1)分离出质粒DNA，并用限制性酶BamHI(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)切割，用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离开后，从琼脂糖凝胶中分离出了长约1.7kb、含有lysCFBR的DNA片段，并将其与上述载体pK18mobsacBglu1相连。该克隆载体事先用限制性酶BamHI切割并用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，与长约1.7kb的lysCFBR片段混合，用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理该混合物。
之后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德国)(Hanahan，In：DNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择出携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pK18mobsacBglu1_1。该质粒图谱示于附图1。
根据布达佩斯条约，质粒pK18mobsacBglu1_1以大肠杆菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBglu1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBglu1_1)的纯培养物形式于2001年4月20日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSM14243。
1.3利用取代载体pK18mobsacBglu1_1将lysCFBR等位基因lysCT311I的第二个拷贝整合进菌株DSM13994的染色体(靶位点：gluB基因)
根据Sch_fer等人(Journal of Microbiology 172：1663-1666(1990))的操作程序将实施例1.2中描述的载体pK18mobsacBglu1_1通过接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM13994。该载体不能在DSM13994中独立复制，并且只有在整合进染色体后才能保留在细胞中。将接合物在添加了15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold SpringHarbor，纽约，1989)上涂板，选择出带有整合态pK18mobsacBglu1_1的克隆或转接合子。将卡那霉素抗性转接合子在含有25mg/l卡那霉素的LB琼脂上涂板，并在33℃下培养48小时。
为了选择由于发生第二次重组事件而使得其中质粒被切除的突变体，将克隆在LB液体培养基中培养20小时，然后在含有10％蔗糖的LB琼脂上涂板，培养48小时。
质粒pK18mobsacBglu1_1，如同起始质粒pK18mobsacB一样，除包含卡那霉素抗性基因外，还包含一个拷贝的编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶的sacB基因。这一可被蔗糖诱导的表达会导致形成果聚糖蔗糖酶，该酶催化合成对谷氨酸棒杆菌有毒性的产物果聚糖。因此只有那些由于第二次重组事件而切除了其中所整合的pK18mobsacBglu1_1的克隆才会在LB琼脂上生长。根据第二次重组事件发生的位置，在切除之后，lysCFBR等位基因的第二个拷贝出现在染色体中的gluB座位，或者保留宿主的原始gluB座位。
大约检测了40至50个克隆的“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型。用聚合酶链式反应调查了大约20个显示“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型的克隆。在此，从这些克隆的染色体DNA扩增出了一个携带有gluB基因及其周边区域的DNA片段。选择了与实施例1.2所述用于构建整合质粒的相同的引物寡核苷酸进行PCR。
gluBgl1(SEQ ID NO：7)：
5′TA(A GAT CT)G TGT TGG ACG TCA TGG CAA G 3′
gluBgl2(SEQ ID NO：8)：
5′AC(A GAT CT)T GAA GCC AAG TAC GGC CAA G 3′
这些引物可以在带有原始gluB座位的对照克隆中扩增出大小约为1.7kb的DNA片段。从那些在染色体gluB座位带有第二个拷贝的lysCFBR等位基因的那些克隆中，扩增出了大小约为3.4kb的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的DNA片段。
用同样的方式鉴定到了一个克隆，它除了在lysC座位含有的一个拷贝外，还在染色体gluB座位含有第二个拷贝的lysCFRB等位基因lysCT311I。该克隆称作菌株DSM13994glu∷lysC。
1.4利用取代载体pK18mobsacBglu1_1将lysCFBR等位基因lysCT311I这一形式的第二拷贝lysC基因整合进菌株DSM12866的染色体(靶位点：gluB基因)
如实施例1.3中所述，将质粒pK18mobsacBglu1_1接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866。以实施例1.3中所述的方式鉴定到了一个克隆，它除了在lysC座位含有一个拷贝的野生型基因外，还在染色体gluB座位含有lysCFBR等位基因lysC T311I这一形式的第二拷贝lysC基因。该克隆称作菌株DSM12866glu∷lysC。
根据布达佩斯条约，在gluB基因处含有第二个拷贝的lysCFBR等位基因的本发明谷氨酸棒杆菌菌株以谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866glu∷lysC的纯培养物形式于2002年6月5日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSM15039。
1.5构建取代载体pK18mobsacBpck1_1
用谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032作染色体DNA供体。用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))从菌株ATCC13032分离出染色体DNA。用聚合酶链式反应，扩增出带有pck基因及其周边区域的DNA片段。根据已知的谷氨酸棒杆菌pck基因序列(EP1094111，和Riedel等人，Journal of Molecular andMicrobiological Biotechnology 3：573-583(2001))(登录号AJ269506)，选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
pck_beg(SEQ ID NO：9)：
5′TA(A GAT CT)G CCG GCA TGA CTT CAG TTT 3′
pck_end(SEQ ID NO：10)：
5′AC(A GAT CT)G GTG GGA GCC TTT CTT GTT ATT 3′
所示引物由MWG Biotech合成，并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guideto Methods and Applications，1990，Academic Press)进行PCR。这些引物可以扩增出携带有pck基因及其邻近区域、大小约2.9kb的DNA片段。这些引物还包含限制性内切酶BglII的切割位点序列，在如上所示核苷酸序列中用圆括号标记。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的长约2.9kb并携带有pck基因及其周边区域的DNA片段，并用常规方法从凝胶中分离和纯化(QIAquick凝胶抽提试剂盒，Qiagen，Hilden)。
然后用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，The Netherlands，目录编号K4600-01)将片段连接进载体pCRII-TOPO。将连接物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷兰)。将转化产物在含有卡那霉素(50mg/l)、X-Gal(64mg/l)的LB琼脂上涂板来选择携带有质粒的细胞。
分离DNA后，用限制性切割检查所获得的质粒，并在琼脂糖凝胶中鉴定。所得质粒称作pCRII-TOPOpck。
用限制性酶BglII(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)切割质粒pCRII-TOPOpck，并在用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离开后，从琼脂糖凝胶中分离出长约2.9kb的pck片段，将之与Sch_fer等人所述的可移动的克隆载体pK18mobsacB(Gene 14：69-73(1994))连接。该克隆载体事先用限制性酶BamHI切割并用碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，与长约2.9kb的pck片段混合，用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理该混合物。
之后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pK18mobsacBpck1。
从携带质粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242(参见实施例1.1)分离出质粒DNA，并用限制性酶BamHI(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)切割，用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离开后，从琼脂糖凝胶中分离出了长约1.7kb、含有lysCFBR的DNA片段，并将其与上述载体pK18mobsacBpck1相连。该克隆载体事先用限制性酶BamHI切割并用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，与长约1.7kb的lysCFBR片段混合，用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理该混合物。
之后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德国)(Hanahan，In：DNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择出携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pK18mobdsacBpck1_1。该质粒图谱示于附图3。
1.6利用取代载体pK18mobsacBpck1_1将lysCFBR等位基因lysCT311I这一形式的第二拷贝lysC基因整合进菌株DSM12866的染色体(靶位点：pck基因)
如实施例1.3所述，将实施例1.5中所述的质粒pK18mobsacBpck1_1接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866。如实施例1.3所述，选择谷氨酸棒杆菌DSM12866染色体中的靶向重组事件。根据第二次重组事件发生的位置，在切除之后，lysCFBR等位基因的第二个拷贝出现在染色体中的pck座位，或者保留宿主的原始pck座位。
大约检测了40至50个克隆的“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型。用聚合酶链式反应调查了大约20个显示“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型的克隆。在此，从这些克隆的染色体DNA扩增出了一个携带有pck基因及其周边区域的DNA片段。选择了与实施例1.5所述用于构建整合质粒的相同的引物寡核苷酸进行PCR。
pck_beg(SEQ ID NO：9)：
5′TA(A GAT CT)G CCG GCA TGA CTT CAG TTT 3′
pck_end(SEQ ID NO：10)：
5′AC(A GAT CT)G GTG GGA GCC TTT CTT GTT ATT 3′
这些引物可以在带有原始pck座位的对照克隆中扩增出大小约为2.9kb的DNA片段。从那些在染色体pck座位带有第二个拷贝的lysCFBR等位基因的那些克隆中，扩增出了大小约为4.6kb的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的DNA片段。
用这种方式鉴定到了一个克隆，它除了在lysC座位带有野生型基因拷贝外，还在染色体pck座位带有lysCFBR等位基因lysC T311I这一形式的第二拷贝lysC基因。该克隆称作菌株DSM12866pck：：lysC。
1.7构建取代载体pK18mobsacBaecD1_1
用谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032作染色体DNA供体。用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))从菌株ATCC13032分离出染色体DNA。借助聚合酶链式反应，扩增出带有aceD基因及其周边区域的DNA片段。根据已知的谷氨酸棒杆菌aecD基因序列(Rossol等人，Journal of Bacteriology 174：2968-2977(1992))(登录号M89931)，选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
aecD_beg(SEQ ID NO：11)：
5′GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC 3′
aecD_end(SEQ ID NO：12)：
5′AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3′
所示引物由MWG Biotech合成，并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)进行PCR。这些引物可以扩增出携带有aecD基因及其周边区域、大小约2.1kb的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的长约2.1kb的DNA片段，并用常规方法从凝胶中分离和纯化(QIAquick凝胶抽提试剂盒，Qiagen，Hilden)。
用限制性酶BamHI和EcoRV(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国)切割纯化的DNA片段。之后将该片段连接进载体pUC18(Norrander等人，Gene 26：101-106(1983))。该载体事先用限制性酶BglII和SmaI切割，去磷酸化，与长约1.5kb、携带有aecD的片段混合，用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理该混合物。将连接物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，The Netherlands)。将转化物在含有卡那霉素(50mg/l)和X-Gal(64mg/l)的LB琼脂上涂板，由此选择出携带质粒的细胞。
分离DNA后，所获质粒通过限制性酶切割来检查，在琼脂糖凝胶中鉴定。所得质粒称作pUC18aecD。
从携带质粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242(参见实施例1.1)分离出质粒DNA，并用限制性酶BamHI(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)切割以及之后用Klenow聚合酶处理。用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离开后，从琼脂糖凝胶中分离出长约1.7kb、含lysCFBR的DNA片段，并将之与上述载体pUC18aecD连接。该载体事先用限制性酶StuI切割并用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim，德国)去磷酸化，与长约1.7kb的lysCFBR片段混合，用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理该混合物。
之后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德国)(Hanahan，In：DNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择出携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pUC18aeCD1。
质粒pUC18aecD1用限制性酶KpnI切割，之后用Klenow聚合酶处理。然后用限制性酶SalI(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)切割该质粒，借助QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离开后，从琼脂糖凝胶中分离出携带有aecD和lysC、约为3.2kb的片段，并将之与Sch_fer等人(Gene14：69-73(1994))所述的可移动的克隆载体pK18mobsacB连接。该载体事先用限制性酶SmaI和SalI切割，并用碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，与长约3.2kb、带有aecD和lysC的片段混合，并用T4 DNA连接酶(Amer sham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理该混合物。
之后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pK18mobsacBaecDl_1。该质粒图谱示于附图2。
根据布达佩斯条约，质粒pK18mobsacBaecD1_1以大肠杆菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBaecD1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBaecD1_1)的纯培养物形式于2002年6月5日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSM15040。
1.8利用取代载体pK18mobsacBaecD1-1将作为lysCFBR等位基因的第二拷贝lysC基因整合进菌株DSM12866的染色体(靶位点：aecD基因)
如实施例1.3所述，将实施例1.4中所述的质粒pK18mobsacBaecD1_1接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866。如实施例1.3所述，选择谷氨酸棒杆菌DSM12866染色体中的靶向重组事件。根据第二次重组事件发生的位置，在切除之后，lysCFBR等位基因的第二个拷贝出现在染色体中的aecD座位，或者保留宿主的原始aecD座位。
大约检测了40至50个克隆的“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型。用聚合酶链式反应调查了大约20个显示“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型的克隆。在此，从这些克隆的染色体DNA中扩增出了一个携带有aecD基因及其周边区域的DNA片段。选择了与实施例1.7所述用于构建整合质粒的相同的引物寡核苷酸进行PCR。
aecD_beg(SEQ ID NO：11)：
5′GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC 3′
aecD_end(SEQ ID NO：12)：
5′AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3′
这些引物可以在带有原始aecD座位的对照克隆中扩增出大小约为2.1kb的DNA片段。从那些在染色体aecD座位带有第二拷贝lysCFBR等位基因的克隆中，扩增出大小约为3.8kb的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的DNA片段。
用这种方式鉴定到了一个克隆，它除了在lysC座位带有野生型基因拷贝外，还在染色体aecD座位带有lysCFBR等位基因lysC T311I这一形式的第二拷贝lysC基因。该克隆称作菌株DSM12866aecD∷lysC。
实施例2
将第二拷贝的ddh基因整合进菌株DSM12866的染色体(靶位点：gluB基因)
2.1构建取代载体pK18mobsacBglu2_1
用谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032作染色体DNA供体。用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))从菌株ATCC13032分离出染色体DNA。借助聚合酶链式反应，扩增出带有gluB基因及其周边区域的DNA片段。根据已知的谷氨酸棒杆菌gluABCD基因簇序列(Kronemeyer等人，Journal of Bacteriology，177：1152-1158(1995)；EP1108790)(登录号X81191和AX127149)，选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
gluA_beg(SEQ ID NO：13)：
5′CAC GGT TGC TCA TTG TAT CC 3′
gluD_end(SEQ ID NO：14)：
5′CGA GGC GAA TCA GAC TTC TT 3′
所示引物由MWG Biotech合成，并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)进行PCR。这些引物可以扩增出大小约为4.4kb、携带有gluB基因及其周边区域的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的DNA片段，并用常规方法从凝胶中分离和纯化(QIAquick凝胶抽提试剂盒，Qiagen，Hilden)。
用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，The Netherlands，目录编号K4600-01)将该片段连接进载体pCRII-TOPO。将连接物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷兰)。将转化物在含有卡那霉素(50mg/l)和X-Gal(64mg/l)的LB琼脂上涂板，由此选择出携带质粒的细胞。
分离DNA后，所获质粒通过限制性酶切割来检查，在琼脂糖凝胶中鉴定。所得质粒称作pCRII-TOPOglu2。
质粒pCRII-TOPOglu2用限制性酶EcoRI和SalI(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)切割，用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离开后，从琼脂糖凝胶中分离出长约3.7kb的gluB片段，并将之与Sch_fer等人(Gene 14，69-73(1994))所述的可移动的克隆载体pK18mobsacB相连。该载体事先用限制性酶EcoRI和SalI切割并用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，与长约3.7kb的gluB片段混合，并用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理该混合物。
之后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pK18mobsacBglu2。
如实施例2.1中所述，利用聚合酶链式反应还扩增出一段携带ddh基因的DNA片段。根据已知的谷氨酸棒杆菌ddh基因簇序列(Ishino等人，Nucleic Acids Research 15，3917(1987))(登录号Y00151)，
选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
ddh_beg(SEQ ID NO：15)：
5′CTG AAT CAA AGG CGG ACA TG 3′
ddh_end(SEQ ID NO：16)：
5′TCG AGC TAA ATT AGA CGT CG 3′
所示引物由MWG Biotech合成，并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)进行PCR。这些引物可以扩增出大小约为1.6kb、带有ddh基因的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的长约1.6kb并携带有ddh基因的DNA片段，并用常规方法从凝胶中分离和纯化(QIAquick凝胶抽提试剂盒，Qiagen，Hilden)。
纯化后，将携带有ddh基因的片段与上述载体pK18mobsacBglu2连接。该载体事先用限制性酶BamHI做了部分切割。通过用Klenow聚合酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理载体，切割末端的突出被补平为钝端，然后将该载体与长约1.6kb、带有ddh基因的DNA片段混合，并用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理混合物。通过将Vent聚合酶(New England Biolabs，Frankfurt，德国)用于PCR反应，产生了具有钝端且适于连接进经过预处理的载体pK18mobsacBglu2中的、带ddh的DNA片段。
之后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德国)(Hanahan，In：DNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择出携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pK18mobsacBglu2_1。该质粒图谱示于附图4。
2.2利用取代载体pK18mobsacBglu2_1将第二拷贝的ddh基因整合进菌株DSM12866的染色体(靶位点：gluB基因)
如实施例1.3所述，将实施例2.1中所述的质粒pK18mobsacBglu2_1接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866。如实施例1.3所述，选择谷氨酸棒杆菌DSM12866染色体中的靶向重组事件。根据第二次重组事件发生的位置，在切除之后，第二拷贝的ddh基因出现在染色体中的gluB座位，或者保留宿主的原始gluB座位。
大约检测了40至50个克隆的“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型。用聚合酶链式反应调查了大约20个显示“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型的克隆。在此，从这些克隆的染色体DNA扩增出了一个携带有所述glu区域的DNA片段。选择了与实施例2.1中所述用于构建取代质粒的相同的引物寡核苷酸进行PCR。
gluA_beg(SEQ ID NO：13)：
5′CAC GGT TGC TCA TTG TAT CC 3′
gluD_end(SEQ ID NO：14)：
5′CGA GGC GAA TCA GAC TTC TT 3′
这些引物可以在带有原始glu座位的对照克隆中扩增出大小约为4.4kb的DNA片段。从在染色体glu座位带有第二拷贝ddh基因的克隆中，扩增出大小约为6kb的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的DNA片段。
用这种方式鉴定到了一个克隆，它除了在ddh座位带有一个拷贝外，还在染色体gluB座位带有第二拷贝ddh基因。该克隆称作菌株DSM12866glu∷ddh。
实施例3
将第二拷贝的dapA基因整合进菌株DSM12866的染色体(靶位点：aecD基因)
3.1构建取代载体pK18mobsacBaecD2_1
用谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032作染色体DNA供体。用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))从菌株ATCC13032分离出染色体DNA。借助聚合酶链式反应，扩增出带有aecD基因及其周边区域的DNA片段。根据已知的谷氨酸棒杆菌aecD基因序列(Rossol等人，Journal of Bacteriology 174：2968-2977(1992))(登录号M89931)，选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
aecD_beg(SEQ ID NO：11)：
5′GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC 3′
aecD_end(SEQ ID NO：12)：
5′AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3′
所示引物由MWG Biotech合成，并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)进行PCR。这些引物可以扩增出携带有aecD基因及其邻近区域、大小约2.1kb的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的长约2.1kb的DNA片段，并用常规方法从凝胶中分离和纯化(QIAquick凝胶抽提试剂盒，Qiagen，Hilden)。
用限制性酶BglII和EcoRV(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国)切割纯化的DNA片段。之后将该片段连接进载体pUC18(Norrander等人，Gene 26：101-106(1983))。该载体事先用限制性酶BamHI和SmaI切割，去磷酸化，与长约1.5kb、携带有aecD的片段混合，用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理该混合物。将连接物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，The Netherlands)。将转化物在含有卡那霉素(50mg/l)和X-Gal(64mg/l)的LB琼脂上涂板，由此选择出携带质粒的细胞。
分离DNA后，所获质粒通过限制性酶切割来检查，在琼脂糖凝胶中鉴定。所得质粒称作pUC18aecD。
利用聚合酶链式反应，扩增出另一个带有dapA基因及其周边区域的DNA片段。根据已知的谷氨酸棒杆菌dapA基因序列(Bonassi等人，Nucleic Acids Research 18：5421(1990))(登录号X53993和AX127149)，选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
dapA_beg(SEQ ID NO：17)：
5′CGA GCC AGT GAA CAT GCA GA 3′
dapA_end(SEQ ID NO：18)：
5′CTT GAG CAC CTT GCG CAG CA 3′
所示引物由MWG Biotech合成，并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)进行PCR。这些引物可以扩增出携带有dapA基因及其邻近区域、大小约1.4kb的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的长约1.4kb的DNA片段，并用常规方法从凝胶中分离和纯化(QIAquick凝胶抽提试剂盒，Qiagen，Hilden)。
纯化后，将长约1.4kb、携带有dapA的DNA片段与上述载体pUC18aecD连接。该载体事先用限制性酶StuI切割，与长约1.4kb的DNA片段混合，并用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理混合物。
之后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德国)(Hanahan，In：DNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择出携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pUC18aecD2。
质粒pUC18aecD2用限制性酶SalI切割以及用EcoRI部分切割(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)，利用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离开后，从琼脂糖凝胶中分离出长约2.7kb、带有aecD和dapA的片段，并将之与Sch_fer等人(Gene 14：69-73(1994))所述的可移动的克隆载体pK18mobsacB连接。该克隆载体事先用限制性酶EcoRI和SalI切割并用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，BoehringerMannheim)去磷酸化，与带有aecD和dapA、长约2.7kb的片段混合，用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理该混合物。
之后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pK18mobsacBaecD2_1。质粒图谱示于附图5。
3.2用取代载体pK18mobsacBaecD2_1将第二拷贝的dapA基因整合进菌株DSM12866染色体中(靶位点：aecD基因)
如实施例1.3所述，将实施例3.1中所述的质粒pK18mobsacBaecD2_1接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866。如实施例1.3所述，选择谷氨酸棒杆菌DSM12866染色体中的靶向重组事件。根据第二次重组事件发生的位置，在切除之后，第二个拷贝的dapA基因出现在染色体中的aecD座位，或者保留宿主的原始aecD座位。
大约检测了40至50个克隆的“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型。用聚合酶链式反应调查了大约20个显示“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型的克隆。在此，从这些克隆的染色体DNA中扩增出了一个携带有aecD基因及其周边区域的DNA片段。选择了与实施例3.1中所述用于构建整合质粒的相同的引物寡核苷酸进行PCR。
aecD_beg(SEQ ID NO：11)：
5′GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC 3′
aecD_end(SEQ ID NO：12)：
5′AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3′
这些引物可以在带有原始aecD座位的对照克隆中扩增出大小约为2.1kb的DNA片段。从那些在染色体aecD座位带有第二拷贝dapA基因的克隆中，扩增出大小约为3.6kb的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的DNA片段。
用这种方式鉴定了一个克隆，它除了在dapA座位有一个拷贝之外，还在染色体的aecD座位具有第二拷贝的dapA基因。该克隆称作菌株DSM12866aecD∷dapA。
实施例4
将pyc等位基因pycP458S这一形式的第二拷贝pyc基因整合进菌株DSM12866的染色体(靶位点：pck基因)
4.1构建取代载体pK18mobsacBpck1_3
将实施例1.5中所述的取代载体pK18mobsacBpck1作为插pyc等位基因的基础载体。
如实施例2.1所述，用聚合酶链式反应还扩增出带有pyc基因及其周边区域的DNA片段。根据已知的谷氨酸棒杆菌pyc基因簇序列(Peters-Wendisch等人，Journal of Microbiology 144：915-927(1998))(登录号Y 09548)，选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
pyc_beg(SEQ ID NO：19)：
5′TC(A CGC GT)C TTG AAG TCG TGC AGG TCA G 3′
pyc_end(SEQ ID NO：20)：
5′TC(A CGC GT)C GCC TCC TCC ATG AGG AAG A 3′
所示引物由MWG Biotech合成，并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)进行PCR。这些引物可以扩增出大小约为3.6kb、带有pyc基因的DNA片段。这些引物还包含限制性内切酶MluI的切割位点序列，它在如上所示的核苷酸序列中用圆括号标记。
用限制性内切酶MluI切割所扩增出的长约3.6kb、带有pyc基因的DNA片段，通过在0.8％琼脂糖凝胶中的电泳进行鉴定，并用常规方法从凝胶中分离和纯化(QIAquick凝胶抽提试剂盒，Qiagen，Hilden)。
纯化后，将带有pyc基因的片段连入所述的载体pK18mobsacBpckl。该载体事先用限制性酶BssHII切割，用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim，德国)去磷酸化，与带有pyc基因、约3.6kb的DNA片段混合，并用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理混合物。
之后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德国)(Hanahan，In：DNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择出携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pK18mobsacBpck1_2。
4.2通过对野生型pyc基因进行位点特异性诱变来构建pyc等位基因pyc P458S
用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，USA)完成位点定向诱变。EP-A-1108790描述了谷氨酸棒杆菌pyc基因中可以提高L-赖氨酸生产的点突变。基于pyc基因核苷酸序列第1372位胞嘧啶变成胸腺嘧啶的点突变，从而导致在由该核苷酸序列衍生的氨基酸序列中第458位的脯氨酸被丝氨酸取代。该等位基因称作pyc P458S。为形成所述突变，选择以下引物寡核苷酸用于线性扩增：P458S-1(SEQ ID NO：21)：
5′GGATTCATTGCCGATCAC(TCG) CACCTCCTTCAGGCTCCA 3′
P458S-2(SEQ ID NO：22)：
5′GTGGAGGAAGTCCGAGGT(CGA) GTGATCGGCAATGAATCC 3′
所示引物由MWG Biotech合成。用于取代458位脯氨酸的丝氨酸的密码子在如上所示的核苷酸序列中用圆括号标记。将实施例4.1中所述的质粒pK18mobsacBpck1_2和两个各自互补于该质粒一条链的引物用于利用Pfu Turbo DNA聚合酶的线性扩增。通过这一引物延长，形成了呈断开环链的突变质粒。用DpnI(该内切酶特异性切割甲基化和半甲基化的模板DNA)处理线性扩增产物。将这一新合成的、断开的、突变的载体DNA转化进大肠杆菌菌株XL1 Blue(Bullock，Fernandez和Short，BioTechniques(5)376-379(1987))。转化后，XLl Blue细胞修复该突变质粒中的断裂(break)。在含有卡那霉素50mg/l的LB培养基上选择转化体。分离DNA后，利用限制性切割来检查所获得的质粒，在琼脂糖凝胶中鉴定。通过测序来检查突变DNA片段的DNA序列。PCR产物的序列与Ohnishi等人(2002)所述的序列一致。所得质粒称作pK18mobsacBpck1_3。该质粒图谱示于附图6。
4.3用取代载体pkl8mobsacBpck1_3将pyc等位基因pycP458S这一形式的第二拷贝pyc基因整合进菌株DSM12866的染色体(靶位点pck基因)
如实施例1.3所述，将实施例4.2中所述的质粒pK18mobsacBpck1_3接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866。如实施例1.3所述，选择谷氨酸棒杆菌DSM12866染色体中的靶向重组事件。根据第二次重组事件发生的位置，在切除之后，第二拷贝的pyc等位基因出现在染色体中的pck座位，或者保留宿主的原始pck座位。
大约检测了40至50个克隆的“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型。用聚合酶链式反应调查了大约20个显示“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型的克隆。在此，从这些克隆的染色体DNA中扩增出了一个携带有pck基因及其周边区域的DNA片段。选择了与实施例1.5中所述用于构建取代质粒的相同的引物寡核苷酸进行PCR。
pck_beg(SEQ ID NO：9)：
5′TA(A GAT CT)G CCG GCA TGA CTT CAG TTT 3′
pck_end(SEQ ID NO：10)：
5′AC(A GAT CT)G GTG GGA GCC TTT CTT GTT ATT 3′
这些引物可以在带有原始pck座位的对照克隆中扩增出大小约为2.9kb的DNA片段。从在染色体pck座位带有第二拷贝pyc等位基因的克隆中，扩增出大小约6.5kb的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的DNA片段。
用这种方式鉴定到了一个克隆，它除了在pyc座位带有一个拷贝的野生型基因外，还在染色体pck座位带有pyc等位基因pycP458S这一形式的第二拷贝pyc基因。该克隆称作菌株DSM12866pck∷pyc。
实施例5
制备赖氨酸
将实施例1、2、3和4中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM13994glu∷lysC、DSM12866glu∷lysC、DSM12866pck∷lysC、DSM12866aecD∷lysC、DSM12866glu∷ddh、DSM12866aecD∷dapA和DSM12866pck∷pyc培养在适于生产赖氨酸的营养培养基中，并测定培养物上清液中的赖氨酸含量。
为此，首先在33℃将培养物在脑-心琼脂平板(Merck，Darmstadt，德国)上培养24小时。从该琼脂平板培养物开始，接种预培养物(100ml锥形瓶中含10ml培养基)。用MM培养基作为预培养物的培养基。在240rpm的摇床上于33℃培养预培养物24小时。从该预培养物接种主培养物，使主培养物的起始OD(660nm)为0.1OD。还将MM培养基用于主培养物。
MM培养基
CSL                            5g/l
MOPS                           20g/l
葡萄糖(单独高压加热灭菌)       50g/l
盐类：
(NH4)2SO4                  25g/l
KH2PO4                      0.1g/l
MgSO4*7H2O                  1.0g/l
CaCl2*2H2O                  10mg/l
FeSO4*7H2O                  10mg/l
MnSO4*H2O                   5.0mg/l
生物素(无菌过滤)               0.3mg/l
硫胺素*HCl(无菌过滤)           0.2mg/l
CaCO3                         25g/l
用氨水将CSL(玉米浸渍液)、MOPS(吗啉代丙烷磺酸)和盐溶液调至pH7，并高压加热灭菌。然后添加无菌基质和维生素溶液，以及以干燥状态高压加热灭菌的CaCO3。
在含10ml体积培养基的100ml带挡板锥形瓶中完成培养。于33℃和80％大气湿度中进行培养。
48小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm测定波长处测定OD。用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德国)的氨基酸分析仪通过离子交换层析和柱后衍生茚三酮检测法测定所形成的赖氨酸量。
实验结果示于表14。
                         表14
  菌株   OD(660nm)   赖氨酸HClg/l
  DSM13994   12.0   19.1
  DSM13994glu∷lysC   9.9   20.0
  DSM12866   12.5   14.9
  DSM15039   11.4   16.2
  DSM12866pck∷lysC   12.6   16.5
  DSM12866aecD∷lysC   12.0   15.9
  DSM12866glu∷ddh   11.0   15.5
  DSM12866aecD∷dapA   11.1   16.2
  DSM12866pck∷pyc   10.9   16.9
实施例6
将一个拷贝的lysC_T3111I-等位基因整合进菌株DSM13992染色体的基因间区域ncode1
6.1构建交换载体pK18mobsacBnc1∷lysC
用谷氨酸棒杆菌菌株DSM13994(参见实施例1)作染色体DNA供体。用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))从菌株DSM13994分离出染色体DNA。借助聚合酶链式反应(PCR)，扩增出具有标记作“ncode1”的染色体基因间区域的DNA片段(SEQ ID NO：23)。该区域位于谷氨酸棒杆菌基因组序列第27398至28707位，它可以从登录代码AX127149(参见表12)获得。根据该区域的已知序列，选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
引物ncode 1(SEQ ID NO：24)：
5′GA(A GAT CT)A AGC TCT ATT GTC CCC TAC G 3′
引物ncode 2(SEQ ID NO：25)：
5′ GAT CCT TTT AAA AGC CAG TAA CAA G 3′
引物ncode 3(SEQ ID NO：26)：
5′CTT GTT ACT GGC TTT TAA AA G  GAT CCT_ATT AAA GAA CAC TCC CCTAT 3′
所示引物由MWG Biotech公司合成，并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR protocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)进行PCR，其中首先用引物组合ncode 1和ncode 2或者ncode 3和ncode 4扩增出两种产物，然后以这两种产物为模板与引物组合ncode 1和ncode 4一起用于第二次PCR。在这种方式中，所选择的引物可以扩增出大小约1.2kb的DNA片段，该片段在基因间区域具有一个人造的限制性内切酶BarnHI的接口(用下划线强调(SEQID NO：28))。此外，这些引物还包含限制性内切酶Bglll的接口序列，它在上述核苷酸系列中用括号标示。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的长约1.2kb、具有基因间区域ncode1的DNA片段，并用常规方法从凝胶中分离和纯化(QIAquick凝胶抽提试剂盒，Qiagen，Hilden)。
接下来，用Topo TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，Netherlands，目录编号K4600-01)将该片段连接进载体pCRII-TOPO。将连接物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，Netherlands)。将转化物在含有卡那霉素(50mg/l)和X-Gal(64mg/l)的LB琼脂上涂板，由此选择出携带质粒的细胞。
分离DNA后，所得质粒通过限制性断裂来加以证实，和在琼脂糖凝胶中鉴定。所得质粒称作pCRII-TOPOnc。
用限制性酶BglII(Amersham-Pharmarcia，Freiburg，德国)切割质粒pCRII-TOPOnc，并随后在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离，用Qiagenquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从琼脂糖凝胶中分离出长约1.2kb的片段，将该片段与Sch_fer等人(Gene 14：69-73(1994))所述的可移动的克隆载体pK18mobsacB连接。该载体首先用限制性酶BarnHI断开并用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，与长约1.2kb的片段混合，并用T4-DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理该培养物。
之后，用连接培养物转化大肠杆菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedings of the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA cloning.A practical approach.第1卷.ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化培养物在添加有25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，Cold SpringHarbor，纽约，1989)上涂板，由此选择携带质粒的细胞。
用Qiagen公司的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过用酶Xbal进行限制性切割及随后琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pK18mobsacBnc。
用限制性酶BamHI(Amersham-Pharmarcia，Freiburg，德国)切割实施例1中所述的质粒pCRIITOPOlysC。用Qiagenquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离之后，从琼脂糖凝胶中分离出长约1.7kb、包含lysCT311I的DNA片段，并将其与上述载体pK18mobsacBnc连接。该载体首先用限制性酶BamHI断开并用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim，德国)去磷酸化，与长约1.7kb的片段混合，并用T4-DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理该培养物。
之后，用连接培养物转化大肠杆菌菌株DH5omcr(LifeTechnologies GmbH，Karlsruhe，德国)(Hanahan，In.DNA cloning.A practical approach.第1卷.ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化培养物在添加有25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A laboratory manual。第二版，Cold Spring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择携带质粒的细胞。用Qiagen公司的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过用酶HindIII和Xbal进行限制性切割以及随后的琼脂糖凝胶电泳对其进行检查。该质粒称作pK18mobsacBnc∷lysC。附图7显示了该质粒的图谱。
6.2利用交换载体pK18mobsacBnc∷lysC将IYSCFBM等位基因lysCT311I这一形式的第二拷贝lysC基因整合进菌株DSM13992的染色体(靶位点：基因间区域ncode1)
根据Sch_fer等人的改良方案(1990Journal of Microbiology172：1663-1666)将实施例6.1中命名的载体pK18mobsacBnc∷lysC转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM13992。
通过重复的非定向诱变、选择和突变体选择从谷氨酸棒杆菌ATCC13032制备出谷氨酸棒杆菌菌株DSM13992。该菌株对抗生素链霉素有抗性，和对赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸在表型上有抗性。然而，该菌株具有对由赖氨酸和苏氨酸(各25mM)的混合物引起的抑制敏感的野生型天冬氨酸激酶。根据布达佩斯条约，该菌株的纯培养物于2001年1月16日在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)登记。
载体pK18mobsacBnc∷lysC不能在DSM13992中独立复制，并且只有在通过重组而整合进染色体后才能保留在细胞中。
将接合培养物在添加了15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂(Sambrock等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择出那些带有整合的pK18mobsacBnc∷lysC的克隆。将已经开始生长的克隆在含有25mg/l卡那霉素的LB琼脂板上涂板，于33℃培养16小时。为了实现通过第二次重组事件切除质粒，在LB液体培养基中培养16小时后用10％蔗糖起始这些克隆。质粒pK18mobsacB包含一个拷贝的sacB基因，该基因可以将蔗糖转化为对谷氨酸棒杆菌有毒性的果聚糖。
因此，只有整合的pK18mobsacBnc∷lysC已经被再次切除的克隆才能在含有蔗糖的LB琼脂上生长。依据切除时第二次重组事件发生的位置，或者一个拷贝的lysC及其周边基因间区域ncode1与该质粒一同被切除，或者仅仅是基因间区域ncode1被切除。
为了证明lysC拷贝保留在染色体的基因间区域ncode1中，根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)，利用聚合酶链式反应研究了大约20个表现“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型的克隆。在此，从这些克隆的染色体DNA扩增出了一个携带有lysC基因及其周边区域的DNA片段。选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
3371V(SEQ ID NO：29)：
5′TAT CAT GCG GTG AGC TGT GA 3′
3372N(SEQ ID NO：30)：
5′TAG GGG TGA TGT GCT ACT GT 3′
这些引物可以在具有原始ncode1位点的对照克隆中扩增出大小约为1.3kb的DNA片段。从那些在染色体的基因间区域ncode1中具有一个拷贝的lysC基因的克隆中，可以扩增出大小约3.0kb的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的DNA片段。
用这种方式鉴定到了一个克隆，它除了在lysC位点具有一个拷贝外，还在染色体的基因间区域ncode1中具有第二个拷贝的lysCFBR等位基因lysC T311I。该克隆名为菌株DSM13992nc∷lysC。
实施例7
将第二拷贝的ilvD基因整合进乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)菌株FERM BP-1763的染色体(靶位点：ddh基因)
将第二拷贝的编码二羟酸脱水酶的基因ilvD，导入乳发酵短杆菌菌株FERM BP-1763的编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因，以提高该菌株的缬氨酸生产。
乳发酵短杆菌菌株FERM BP-1763是对霉酚酸有抗性的缬氨酸生产者(US-A-5,188,948)。它是L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸营养缺陷型的。
7.1.分离菌株FERM BP-1763的ilvD基因的DNA
用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))从乳发酵短杆菌菌株FERM BP-1763分离出染色体DNA。利用聚合酶链式反应，扩增出包含ilvD基因的DNA区段。谷氨酸棒杆菌的ilvD基因序列是已知的(Genbank登录号AJ012293；DE19907567的SEQ.ID.No.1，登录号AX034412，和EP1108790的SEQ.ID.No.7063和1399，登录号AX127147和AX121483)。现存大量资料表明乳发酵短杆菌和谷氨酸棒杆菌即使不相同也是极为相关的(Abe等人，Journal of General and Applied Microbiology 13：279-301(1967)；Suzuki等人，International Journal of SystematicBacteriology 31：131-138(1981))。因此，根据已知的谷氨酸棒杆菌ilvD基因序列，选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
ilvD-A1(SEQ ID NO：31)：
5′ATC GTC  TCT AGA CTT GGA GCG CCA AAA GGC AC 3′
ilvD-E1(SEQ ID NO：32)：
5′GTC ATC  TCT AGA TCG AGG CAG AGT TCG CTG GT 3′
所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成，并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)进行PCR。这些引物可以扩增长约2970bp、带有ilvD基因及其周边区域的DNA片段。这些周边区域包含ilvD基因编码区域约284bp的上游区域和约819bp的下游区域。这些引物还包含限制性内切酶XbaI的切割位点序列，它在上述核苷酸序列中用下划线标记。
用限制性内切酶XbaI切割所扩增出的携带ilvD基因及其上游和下游区域的DNA片段，并在0.8％琼脂糖凝胶中通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。用常规方法从凝胶中分离和纯化出长约2.95kb的DNA片段(High Pure PCR Product Purification Kit，Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，德国)。
7.2构建取代载体pK18mobsacBddh∷ilvD
以实施例7.1中从菌株FERM BP-1763分离的染色体DNA为模板，构建ddh整合盒。术语“ddh整合盒”表示主要由ddh基因序列组成的DNA区段，它包括一个人造的限制酶位点，在这个位点中可以插入其它基因或序列。该最终结构可用于将基因或其它DNA序列整合进染色体ddh基因中。
根据已知的谷氨酸棒杆菌ddh基因序列(Ishino等人，NucleicAcids Research 15(9)，319及以下(1987)，Genbank登录号Y00151，以及EP1108790的SEQ ID No.7068和Nr.3494，登录号AX127152和AX123578)，选择以下引物寡核苷酸，利用基因SOEing法(GeneSplicing by Overlap Extension，Horton，MolecularBiotechnology 3：93-98(1995))，通过聚合酶链式反应(PCR)来产生ddh整合盒：
ddh_del1(SEQ ID NO：33)：
5′ATC GTC  GCT AGC CCA ACG AAT CTC CAC GAG ACG 3′
ddh_del2(SEQ ID NO：34)：
5′GAC ATC CGC ACC ATG CCT GA 3′
ddh_del3(SEQ ID NO：35)：
5′TCA GGC ATG GTG CGG ATG  TCT AGA GTC GGC AAC CAC GAA GCA TT3′
ddh_del4(SEQ ID NO：36)：
5′ATG CTC  GCT AGC ATG ACC AAC ATC CGC GTA GC 3′
所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成，并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)进行PCR。引物ddh_del1和ddh_del4各包含限制性内切酶NheI的切割位点序列(在上述核苷酸序列中用下划线表示的序列)。引物ddh_del3由两个核苷酸序列区域构成，其中一个与ddh基因编码区域第653至634位核苷酸结合，另一个与第606至587位核苷酸结合。在这两个区域之间，删除了ddh基因编码区域的27个碱基对，并在引物ddh_del3的这两个区域之间插入了四个碱基“TAGA”以形成一个限制性内切酶XbaI的人造切割位点。这四个碱基用斜体字母标出，该XbaI位点在上述序列中用下划线标注。引物ddh_del3的5′-末端区域反向互补于引物ddh_del2。
通过PCR，引物ddh_del1和ddh_del2可以扩增出长约0.75kb的DNA片段，它包含ddh基因的3′-末端区域和下游区域，引物ddh_del3和ddh_del4可以扩增出长约0.64kb的DNA片段，它包含ddh基因的5′-末端区域。之后在0.8％琼脂糖凝胶中进行琼脂糖凝胶电泳来检查扩增产物，用常规方法(High Pure PCR ProductPurification Kit，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)将其从凝胶中分离和纯化。这两个扩增产物可以一起用作另一使用引物ddh_del1和ddh_del4的PCR反应的模板。这产生大小约1.38kb、包含ddh基因的ddh整合盒，它包括31bp的缺失和一个人造的限制性酶XbaI切割位点，和ddh基因下游412bp的区域。
用限制性内切酶NheI切割这一ddh整合盒，并通过在0.8％琼脂糖凝胶中的琼脂糖凝胶电泳鉴定。用常规方法(High Pure PCR ProductPurification Kit，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)从凝胶中分离和纯化出长约1.36kb的DNA片段，并将之与Sch_fer等人(Gene145：69-73(1994))所述的可移动的克隆载体pK18mobsacB连接。该载体pK18mobsacB事先用限制性内切酶XbaI切割并用碱性磷酸酶(Boehringer，Mannheim)去磷酸化，之后与ddh整合盒混合，并用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。限制性切割酶NheI和XbaI的粘性末端是互补的，这样的连接产物不再能被这两种酶中的任何一种切割。
之后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pK18mobsacBddh_Xba。
用限制性酶XbaI切割载体pK18mobsacBddh_Xba，该酶只在ddh整合盒内部的人造XbaI-位点处切割一次。然后用碱性磷酸酶使(Boehringer Mannheim，德国)该载体去磷酸化，并将之与获自实施例7.1、长约2.95kb、已经用限制性酶XbaI切割过的ilvD片段混合。用T4DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国)处理该混合物。
然后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德国)(Hanahan，In.DNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷.ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，Cold SpringHarbor，纽约，1989)上涂板，由此选择携带质粒的细胞。
用Qiagen公司的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割以及随后的琼脂糖凝胶电泳对其进行检查。该质粒称作pK18mobs acBddh∷ilvD。附图8显示了该质粒的图谱。
7.3将第二拷贝的ilvD基因整合进染色体(靶位点：ddh基因)
根据Sch_fer等人的方案(Journal of Microbiology 172：1663-1666(1990))将实施例7.2中所述的载体pK18mobsacBddh∷ilvD接合转移进乳发酵短杆菌菌株FERM BP-1763。该载体不能在FERMBP-1763中独立复制，并且只有在整合进染色体后才能保留在细胞中，要么如同此处所必需的整合进ddh区域，要么整合进ilvD区域。首先，将接合物在添加了15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor，纽约，1989)上涂板，选择出在染色体内整合了pK18mobsacBddh∷ilvD的克隆或转接合子。将卡那霉素抗性转接合子在含有25mg/l卡那霉素的LB琼脂上涂板，并在33℃下培养48小时。之后就质粒在ddh座位的整合筛选所得转接合子。
利用聚合酶链式反应(PCR)，检测了20个卡那霉素抗性转接合子的质粒pK18mobsacBddh∷ilvD在ddh座位的整合。用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))分离这些克隆的染色体DNA。选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
ddh-int1(SEQ ID NO：37)：
5′-attcttccgcgaccgcgata-3′
ddh-A1(SEQ ID NO：38)：
5′-ccggataaaccaccatgaac-3′
所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成。它们位于ddh整合盒外，可以从在ilvD座位整合有载体pK18mobsacBddh∷ilvD的克隆的DNA扩增出约1.45kb的PCR片段。如果将这一大小约为10kb的载体整合进ddh座位，则不能得到可见的扩增产物。根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)进行PCR。
利用琼脂糖凝胶电泳鉴定所扩增的DNA片段。
利用两个不显示可见PCR扩增产物的克隆来选择其中由于第二次重组事件的发生而使得质粒被切除的克隆。将克隆在液体LB培养基中培养20个小时，之后在含有10％蔗糖的LB琼脂上涂板，并培养48小时。
如同起始质粒pK18mobsacB，质粒pK18mobsacBddh∷ilvD除包含卡那霉素抗性基因外，还包含一个拷贝的编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因。这一可被蔗糖诱导的表达会导致形成果聚糖蔗糖酶，该酶催化合成对谷氨酸棒杆菌有毒性的产物果聚糖。因此只有那些由于第二次重组事件而切除了其中整合的pK18mobsacBddh∷ilvD的克隆才会在添加了蔗糖的LB琼脂上生长。根据第二次重组事件发生的位置，在切除之后，第二个拷贝的ilvD基因出现在ddh座位，或者保留宿主的原始ddh座位。
大约检测了40至50个克隆的“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型。用聚合酶链式反应调查了20个显示“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型的克隆。用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology140：1817-1828(1994))从这些克隆分离出染色体DNA。
选择已在本实施例中描述过的引物寡核苷酸ddh-int1和ddh-A1(SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39)并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)完成PCR。这些引物可以扩增出包含ddh基因的DNA片段。在带有原始ddh座位的对照克隆中可以扩增出大小约1.65kb的DNA片段。从在染色体ddh座位整合有第二拷贝ilvD基因的克隆中，可以扩增出大小约4.6kb的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的DNA片段。
用这种方法鉴定到了一个克隆，它在染色体ddh座位整合有一个拷贝的ilvD基因。该克隆称作菌株FERM BP-1763ddh∷ilvD。
实施例8
L-缬氨酸的生产
在适于生产缬氨酸的营养培养基中培养实施例7.3中获得的乳发酵短杆菌菌株FERM BP-1763ddh∷ilvD并检测培养物上清液中的缬氨酸含量。
为此，首先于33℃在琼脂平板(脑/心琼脂)上培养菌株24小时。从这个琼脂平板培养物开始，接种预培养物(100ml锥形瓶中含10ml培养基)。用完全培养基CgIII(2.5g/l NaCl，10g/l细菌培养用蛋白胨，10g/l细菌培养用酵母提取物，pH7.4，20g/l葡萄糖(单独高压加热灭菌)作为此预培养物的培养基。于33℃将预培养物在240rpm的摇床上培养48小时。从这一预培养物接种主培养物，使主培养物的起始光密度(OD，660nm)为0.1OD。主培养物使用MM培养基。
MM培养基
CSL(玉米浸渍液)              5g/l
MOPS(吗啉代丙烷磺酸)         20g/l
葡萄糖(单独高压加热灭菌)     50g/l
盐类：
(NH4)2SO4                25g/l
KH2PO4                    0.1g/l
MgSO4*7H2O            1.0g/l
CaCl2*2H2O            10mg/l
FeSO4*7H2O            10mg/l
MnSO4*H2O             5.0mg/l
异亮氨酸(无菌过滤)       0.1g/l
甲硫氨酸(无菌过滤)       0.1g/l
硫胺素*HCl(无菌过滤)     0.2mg/l
亮氨酸(无菌过滤)         0.1g/l
CaCO3                   25g/l
用氨水将CSL、MOPS和盐溶液调至pH7，并高压加热灭菌。然后添加无菌基质和维生素溶液，以及以干燥状态高压加热灭菌的CaCO3。
在含10ml体积培养基的100ml带扰流器(flow spoilers)的锥形瓶中完成培养。于33℃和80％大气湿度中进行培养。
48小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm测定波长处测定OD。用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德国)的氨基酸分析仪通过离子交换层析和柱后衍生茚三酮检测法测定所形成的缬氨酸量。实验结果示于表15。
                        表15
  菌株   OD(660)   缬氨酸g/l
  FERM BP-1763   8.6   12.1
  FERM BP-1763ddh∷ilvD   8.5   12.9
实施例9
将第二拷贝的色氨酸操纵子整合进谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21850染色体(靶位点：基因间区域ncode1)(US 3,849,251)
将第二拷贝的色氨酸操纵子导入谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21850的基因间区域ncode1(区域ncode1对应于谷氨酸棒杆菌基因组第27398和28707位间的序列，参见表12、实施例6.1和SEQ ID NO：23)以提高该菌株的L-色氨酸生产。
谷氨酸棒杆菌的色氨酸操纵子含有基因trpL，它编码对于衰减控制很重要的色氨酸操纵子引导肽，基因trpE，它编码邻氨基苯甲酸合酶成分I，基因trpG，它编码邻氨基苯甲酸合酶成分II，基因trpD，它编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，基因trpC，它编码磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶，基因trpB，它编码色氨酸合酶(β链)，和基因trpA，它编码色氨酸合酶(α链)。
谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21850(US 3,849,251)是对L-色氨酸和其它芳香族氨基酸的化学类似物具有多重抗性的色氨酸生产者。它是L-苯丙氨酸和L-酪氨酸营养缺陷型的。
来自ATCC21850的基因trpL的核苷酸序列在第42位由腺嘌呤代替鸟嘌呤。这导致编码引导肽第14位氨基酸色氨酸的密码子tgg变成终止密码子tga。该无义突变的位置防止终止结构的形成并导致组成型抗终止应答(Heery和Dunican，Applied and EnvironmentalMicrobiology 59(3)：791-799(1993))。
9.1.分离包含菌株ATCC21850的色氨酸操纵子的DNA
用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))从谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21850分离染色体DNA。用聚合酶链式反应，扩增出带有色氨酸操纵子的DNA区段。谷氨酸棒杆菌的染色体核苷酸序列是已知的，可以在专利申请EP-A-1108790和欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国和Cambridge，UK)核苷酸序列数据库的登录号AX114121中找到。还可以在国家医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库中找到它。色氨酸操纵子中的基因核苷酸序列的登录号为AX123436(trpE)、AX123438(trpG)、AX123439(trpD)、AX123440(trpC)、AX123442(trpB)和AX123443(trpA)。可以在登录号M17892下找到trpL的核苷酸序列。
根据已知的谷氨酸棒杆菌色氨酸操纵子序列，选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
trp-A1(SEQ ID NO：39)：
5′GTAC  GGA TCC CAA GGA CAG CTC GTG TAG AC 3′
trp-E1(SEQ ID NO：40)：
5′AGCT  GGA TCC CAC CGG CTC GAA GCT AAG AT 3′
所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成，用Eppendorf(Hamburg，德国)的TripleMaster PCR系统完成PCR反应。这些引物可以扩增出长约7.95kb、带有色氨酸操纵子及其周边区域的DNA片段。这些引物还包含限制性内切酶BamHI的切割位点序列，它在上述核苷酸序列中用下划线标记。
用限制性内切酶BamHI切割所扩增出的带有色氨酸操纵子及其上游和下游区域的DNA片段，并通过在0.8％的琼脂糖凝胶中进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定。用常规方法从凝胶中分离和纯化长约7.93kb的DNA片段(高纯度PCR产物纯化试剂盒，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)。
9.2构建取代载体pK18mobsacBnc∷trp
在实施例6.1中获得的质粒pK18mobsacBnc包含基因间区域ncodel(SEQ ID NO：23)。该质粒用限制性酶BamHI切割，然后用碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim，德国)去磷酸化，与获自实施例9.1包含色氨酸操纵子、已用限制性酶BamHI切割并纯化的DNA片段混合。用T4DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国)处理该混合物。
然后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德国)(Hanahan，In.DNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷.ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择携带质粒的细胞。
用Qiagen公司的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割以及随后的琼脂糖凝胶电泳对其进行检查。该质粒称作pK18mobsacBnc∷trp。该质粒的图谱示于附图9。
9.3将第二拷贝的色氨酸操纵子整合进染色体基因间区域ncode1
用Sch_fer等人的方案(Journal of Microbiology 172：1663-1666(1990))将实施例9.2中所述的载体pK18mobsacBnc∷trp接合转移进菌株ATCC21850。该载体不能在ATCC21850中独立复制，并且只有在整合进染色体后才能保留在细胞中，要么如同此处所必需的整合进ncode1区域，要么整合进色氨酸操纵子区域。首先，将接合物在添加了15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold SpringHarbor，纽约，1989)上涂板，选择出在染色体内整合了pK18mobsacBnc∷trp的克隆或转接合子。将卡那霉素抗性转接合子在含有25mg/l卡那霉素的LB琼脂上涂板，并在33℃下培养48小时。然后就发生在ncode1区域内的整合事件筛选所得的转接合子。
利用聚合酶链式反应(PCR)，检测了20个卡那霉素抗性转接合子的质粒pK18mobsacBnc∷trp在ncode1座位的整合。用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))分离这些克隆的染色体DNA。选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
ncode1-A1(SEQ ID NO：41)：
5′-ACT ATC ATG CGG TGA GCT GT-3′
ncodel-E1(SEQ ID NO：42)：
5′-GGC AGC TCT GTA GCC ATA TT-3′
所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成。它们位于染色体内ncodel区域的克隆部分之外，可以从具有整合进色氨酸操纵子的载体pK18mobsacBnc∷trp的克隆的DNA扩增出约1.47kb的PCR片段。如果这一大小为14.9kb的载体整合进ncode1区域，将不会出现可见扩增产物。根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，1990，Academic Press)进行PCR。
利用琼脂糖凝胶电泳鉴定所扩增的DNA片段。
利用两个不显示可见PCR扩增产物的克隆来选择其中由于第二次重组事件的发生而使得质粒被切除的克隆。将克隆在液体LB培养基中培养20个小时，之后在含有10％蔗糖的LB琼脂上涂板，并培养48小时。
如同起始质粒pK18mobsacB，质粒pK18mobsacBnc∷trp除包含卡那霉素抗性基因外，还包含一个拷贝的编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因。这一可被蔗糖诱导的表达会导致形成果聚糖蔗糖酶，该酶催化合成对谷氨酸棒杆菌有毒性的产物果聚糖。因此只有那些由于第二次重组事件而切除了其中整合的pK18mobsacBnc∷trp的克隆才会在添加了蔗糖的LB琼脂上生长。根据第二次重组事件发生的位置，在切除之后，第二个拷贝的色氨酸操纵子出现在ncode1座位，或者保留宿主的原始ncode1座位。
大约检测了40至50个克隆的“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型。用聚合酶链式反应调查了20个显示“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型的克隆。用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))从这些克隆分离出染色体DNA。
选择已在本实施例中描述的引物寡核苷酸ncode1-A1(SEQ IDNO：41)，和另一个引物trp-test进行PCR：
trp-test(SEQ ID NO：43)：
5′-CCA ACC ACG ATG AGA AGG AC -3′
根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，1990，Academic Press)完成PCR。这些引物只可以从在染色体ncode1区域内整合有第二个拷贝的trp操纵子的克隆中扩增大小约为0.92kb的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的DNA片段。
用这种方式鉴定了一个在染色体基因间区域ncode1内整合有一个拷贝色氨酸操纵子的克隆。该克隆称作菌株ATCC21850nc∷trp。
实施例10
将色氨酸操纵子的第二拷贝整合进谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21850染色体(靶位点：噬菌体组件pha1)(US 3,849,251)
在本实施例中，将第二个拷贝的色氨酸操纵子导入谷氨酸棒杆菌ATCC21850的噬菌体组件phal(Genebank登录号AX127149：第88231-89445位核苷酸，参见表13)以提高菌株的色氨酸生产。
10.1构建取代载体pK18mobsacBpha1∷trp
以实施例9.1中分离的菌株ATCC21850染色体DNA作为扩增噬菌体组件pha1整合盒的模板。术语“噬菌体组件pha1整合盒”表示主要由噬菌体组件pha1序列组成的DNA区段，包括一个可以插入其它基因或序列的人工构建的限制性酶BamHI位点。该最终结构可用于将基因或其它DNA序列整合进染色体噬菌体组件pha1。
通过SOEing法(Gene Splicing by Overlap Extension，Horton，Molecular Biotechnology 3：93-98(1995))利用聚合酶链式反应扩增噬菌体组件phal整合盒。表13中提到了谷氨酸棒杆菌的噬菌体组件phal的核苷酸序列，它可以在Genebank登录号AX127149下的核苷酸序列第88231-89445位找到。选择以下引物进行PCR：
pha1-int1(SEQ ID NO：44)：
5′A GTC  GTC GAC GCT ATC AAC GCT TCG ATC AC 3′
pha1-int2(SEQ ID NO：45)：
5′CTG TCT CGT ACG GAT GAC AG 3′
pha1-int3(SEQ ID NO：46)：
5′CTG TCA TCC GTA CGA GAC AG G GAT CCA TAC CTT GCC AGT CAA ATCT 3′
pha1-int4(SEQ ID NO：47)：
5′G TCA  GAA TTC GCA GCA TGT AAC GGA TAG GT 3′
所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成，并根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)进行PCR。引物pha1-int1和pha1-int 4包含限制性内切酶SalI和EcoRI的切割位点序列，它们在上述核苷酸序列中用下划线标示。引物pha1-int3由噬菌体组件pha1核苷酸序列的两个区域组成，在这两个区域之间删除了该核苷酸序列的17个碱基并整合了五个碱基“GATCC”以形成一个人造的限制性内切酶BamHI切割位点。在上述序列中这五个碱基用斜体字母标示，BamHI位点用下划线标示。引物pha1-int3的5′-末端区域反向互补于引物pha1-int2。
借助PCR，引物pha1-int1和pha1-int2可以扩增出长约0.59kb的DNA片段，引物pha1-int3和pha1-int4可以扩增出长约0.9kb的DNA片段。之后在0.8％琼脂糖凝胶中进行琼脂糖凝胶电泳来检查扩增产物，用常规方法(High Pure PCR Product Purification Kit，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)将其从凝胶中分离和纯化。这两个扩增产物可以一起用作另一使用引物pha1-int1和pha1-int4的PCR反应的模板。这产生大小约1.48kb、包含噬菌体组件pha1及其周边区域的噬菌体组件pha1整合盒，它包括17bp的缺失和一个人造的限制性酶BamHI切割位点。
用限制性内切酶SalI和EcoRI切割噬菌体组件pha1整合盒，并在0.8％琼脂糖凝胶中进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定。用常规方法(HighPure PCR Product Purification Kit，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)从凝胶中分离和纯化出长约1.47kb的DNA片段，并将之与Sch_fer等人(Gene 145：69-73(1994))所述的可移动的克隆载体pK18mobsacB连接。该载体pK18mobsacB事先用限制性内切酶SalI和EcoRI切割，之后与噬菌体组件pha1整合盒混合，并用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。
之后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，纽约，1989)上涂板，由此选择携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep SpinMiniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳来检查。该质粒称作pK18mobsacBphal。
用限制性酶BamHI切割载体pK18mobsacBpha1，该酶只在噬菌体组件pha1整合盒内部的人造BamHI-位点处切割一次。然后用碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim，德国)使该载体去磷酸化，并将之与获自实施例9.1、包含色氨酸操纵子、已经用限制性酶BamHI切割并纯化过的DNA片段混合。用T4DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国)处理该混合物。
然后用连接物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德国)(Hanahan，In.DNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)。将转化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，Cold SpringHarbor，纽约，1989)上涂板，由此选择携带质粒的细胞。
用Qiagen公司的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体分离出质粒DNA，并通过限制性切割以及随后的琼脂糖凝胶电泳对其进行检查。该质粒称作pK18mobsacBpha1∷trp。附图10显示了该质粒的图谱。
10.3将色氨酸操纵子的第二个拷贝整合进染色体(靶位点：噬菌体组件pha1)
用Sch_fer等人的方案(Journal of Microbiology 172：1663-1666(1990))将实施例10.2中所述的载体pK18mobsacBpha1∷trp接合转移进谷氨酸棒杆菌ATCC21850。该载体在ATCC21850中不能独立复制，并且只有在整合进染色体后才能保留在细胞中，要么如同此处所必需的整合进噬菌体组件pha1，要么整合进色氨酸操纵子。首先，将接合物在添加了15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂(Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual.第二版，Cold Spring Harbor，纽约，1989)上涂板，选择出在染色体内整合了pK18mobsacpha1∷trp的克隆或转接合子。将卡那霉素抗性转接合子在含有25mg/l卡那霉素的LB琼脂上涂板，并在33℃下培养48小时。之后质粒在噬菌体组件pha1中的整合筛选所得转接合子。
利用聚合酶链式反应(PCR)，检测了20个卡那霉素抗性转接合子的质粒pK18mobsacBpha1∷trp在噬菌体组件pha1的整合。用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))分离这些克隆的染色体DNA。选择以下引物寡核苷酸进行PCR：
pha1-test1(SEQ ID NO：48)：
5′-GCG CTC CAT CAC TAG AGT TC-3′
pha1-test2(SEQ ID NO：49)：
5′-GGT CAG AGT GAG CAC CTA AG-3′
所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成。它们位于噬菌体组件pha1整合盒外，可以从在色氨酸操纵子整合有载体pK18mobsacBphal∷trp的克隆的DNA扩增出约1.56kb的PCR片段。如果将这一大小约为15kb的载体整合进噬菌体组件pha1，则不能得到可见的扩增产物。根据Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)进行PCR。
利用琼脂糖凝胶电泳鉴定所扩增的DNA片段。
利用两个不显示可见PCR扩增产物的克隆来选择其中由于第二次重组事件的发生而使得质粒被切除的克隆。将克隆在液体LB培养基中培养20个小时，之后在含有10％蔗糖的LB琼脂上涂板，并培养48小时。
如同起始质粒pK18mobsacB，质粒pK18mobsacBpha1∷trp除包含卡那霉素抗性基因外，还包含一个拷贝的编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因。这一可被蔗糖诱导的表达会导致形成果聚糖蔗糖酶，该酶催化合成对谷氨酸棒杆菌有毒性的产物果聚糖。因此只有那些由于第二次重组事件而切除了其中所整合的pK18mobsacBpha1∷trp的克隆才会在添加了蔗糖的LB琼脂上生长。根据第二次重组事件发生的位置，在切除之后，第二个拷贝的色氨酸操纵子出现在噬菌体组件phal中，或者保留宿主的原始噬菌体组件pha1。
大约检测了40至50个克隆的“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型。用聚合酶链式反应调查了20个显示“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型的克隆。用常规方法(Eikmanns等人，Microbiology 140：1817-1828(1994))从这些克隆分离出染色体DNA。
选择已在本实施例中描述过的引物寡核苷酸pha1-test1(SEQ IDNO：48)，和另一个引物pha1-test3进行PCR：
pha1-test3(SEQ ID NO：50)：
5′-CTG CGA GCT TCA TTC GAT CC  -3′
用Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，1990，Academic Press)完成PCR。这些引物只可以从在染色体噬菌体组件pha1处整合有第二拷贝的色氨酸操纵子的克隆中扩增出大小约1.6kb的DNA片段。
在0.8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定所扩增出的DNA片段。
用这种方法鉴定到了一个克隆，它在染色体噬菌体区域pha1处整合有一个拷贝的色氨酸操纵子。该克隆称作菌株ATCC21850pha1∷trp。
实施例11
L-色氨酸的生产
在适于生产色氨酸的营养培养基中培养获自实施例9.3的谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21850nc∷trp和获自实施例10.2的谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21850phal∷trp，并检测培养物上清液中的色氨酸含量。
为此，首先于33℃在琼脂平板(脑/心琼脂)上培养菌株24小时。从这个琼脂平板培养物开始，接种预培养物(100ml锥形瓶中含10ml培养基)。用完全培养基CgIII(2.5g/l NaCl，10g/l细菌培养用蛋白胨，10g/l细菌培养用酵母提取物，pH7.4，20g/l葡萄糖(单独高压加热灭菌)作为这些预培养物的培养基。于33℃将预培养物在240rpm的摇床上培养16小时。
主培养物使用添加了L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的色氨酸生产培养基。
色氨酸生产培养基
摩砾层                      100g/l
CSL(玉米浸渍液)             10g/l
盐类：
(NH4)2SO4               20g/l
KH2PO4                   0.5g/l
MgSO4*7H2O               0.25g/l
K2HPO4                   0.5mg/l
L-苯丙氨酸(无菌过滤)        0.3g/l
L-酪氨酸(无菌过滤)          0.15g/l
用氨水将摩砾层、CSL和盐溶液调至pH7，并高压加热灭菌。然后添加无菌基质。
为了对在带扰流器(flow spoilers)的500ml锥形瓶中的50ml色氨酸生产培养基接种，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm测定波长处测定光密度(OD)。之后离心预培养物，去除上清液，将各个沉淀重悬于5ml色氨酸生产培养基中。从该悬液接种主培养物，使主培养物的起始光密度(OD，660nm)为0.1OD。将该培养物在150rpm的摇床上于33℃培养5天。
5天后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm测定波长处测定各培养物的光密度(OD)。用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德国)的氨基酸分析仪通过离子交换层析和柱后衍生茚三酮检测法测定所形成的色氨酸量。
实验结果示于表16。
                           表16
  菌株   OD(660)   色氨酸HClg/l
  ATCC21850   10.3   1.0
  ATCC21850nc∷trp   10.1   1.4
  ATCC21850pha1∷trp   10.2   1.5
附图简述：
所述的碱基对编号是在重复测量的情况下获得的近似值。
附图1：质粒pK18mobsacBglu1_1的图谱
所使用的缩写和标记具有以下含义：
KanR：            卡那霉素抗性基因
HindIII：         限制性酶HindIII的切割位点
BamHI：           限制性酶BamHI的切割位点
lysC：            lysCFBR等位基因，lysC T311I
′gluA：          gluA基因的3′末端片段
gluB′：          gluB基因的5′末端片段
′gluB：          gluB基因的3′末端片段
gluC′：          gluC基因的5′末端片段
sacB：            sacB基因
RP4mob：          带有转移复制原点(oriT)的mob区域
oriV：            复制原点V
附图2：质粒pK18mobsacBaecD1_1的图谱
所使用的缩写和标记具有以下含义：
KanR：          卡那霉素抗性基因
SalI：          限制性酶SalI的切割位点
lysC：          lysCFBR等位基因，lysC T311I
aecD′：        aecD基因的5′末端片段
′aecD：        aecD基因的3′末端片段
sacB：          sacB基因
RP4mob：        带有转移复制原点(oriT)的mob区域
oriV：          复制原点V
附图3：质粒pK18mobsacBpck1_1的图谱
所使用的缩写和标记具有以下含义：
KanR：          卡那霉素抗性基因
BamHI：         限制性酶BamHI的切割位点
lysC：          lysCFBR等位基因，lysC T311I
pck′：         pck基因的5′末端片段
′pck：         pck基因的3′末端片段
sacB：          sacB基因
RP4mob：        带有转移复制原点(oriT)的mob区域
oriV：          复制原点V
附图4：质粒pK18mobsacBgluB2_1的图谱.
所使用的缩写和标记具有以下含义：
KanR：          卡那霉素抗性基因
SalI            限制性酶SalI的切割位点
EcoRI           限制性酶EcoRI的切割位点
BamHI：         限制性酶BamHI的切割位点
ddh：           ddh基因
gluA                 gluA基因
gluB′：             gluB基因的5′末端片段
′gluB：             gluB基因的3′末端片段
gluC                 gluC基因
gluD′：             gluD基因的5′末端片段
sacB：               sacB基因
RP4mob：             带有转移复制原点(oriT)的mob区域
oriV：               复制原点V
附图5：质粒pK18mobsacBaecD2_1的图谱.
所使用的缩写和标记具有以下含义：
KanR：               卡那霉素抗性基因
EooRI                限制性酶EooRI的切割位点
SalI：               限制性酶SalI的切割位点
dapA：               dapA基因
aecD′：             aecD基因的5′末端片段
′aecD：             aecD基因的3′末端片段
sacB：               sacB基因
RP4mob：             带有转移复制原点(oriT)的mob区域
oriV：               复制原点V
附图6：质粒pK18mobsacBpck1_3的图谱.
所使用的缩写和标记具有以下含义：
KanR：               卡那霉素抗性基因
pyc：                pyc等位基因，pyc P458S
pck′：              pck基因的5′末端片段
′pck：              pck基因的3′末端片段
sacB：               sacB基因
RP4mob：             带有转移复制原点(oriT)的mob区域
oriV：            复制原点V
附图7：质粒pK18mobsacBnc∷lysC的图谱
所使用的缩写和标记具有以下含义：
KanR：            卡那霉素抗性基因
BamHI：           限制性酶BamHI的切割位点
HindIII           限制性酶HindIII的切割位点
XbaI              限制性酶XbaI的切割位点
lysC：            lysCFBR等位基因，lysC T311I
sacB：            sacB基因
RP4mob：          带有转移复制原点(oriT)的mob区域
oriV：            复制原点V
附图8：质粒pK18mobsacBddh∷ilvD的图谱
所使用的缩写和标记具有以下含义：
Kan：             卡那霉素抗性基因
XbaI：            限制性酶XbaI的切割位点
NheI：            限制性酶NheI的切割位点
ddh int′         ddh基因的5′末端片段
′ddh int         ddh基因的3′末端片段
ilvD              ilvD基因
sacB：            sacB基因
RP4mob：          带有转移复制原点(oriT)的mob区域
oriV：            复制原点V
附图9：质粒pK18mobsacBnc∷trp的图谱
所使用的缩写和标记具有以下含义：
KmR：            卡那霉素抗性基因
BamHI：          限制性酶BamHI的切割位点
HindIII：           性酶HindIII的切割位点
nc′                ncode1区域的5′末端片段
′nc                ncode1区域的3′末端片段
trpL                trpL基因
trpE                trpE基因
trpG                trpG基因
trpD                trpD基因
trpC                trpC基因
trpB                trpB基因
trpA                trpA基因
sacB：              sacB基因
RP4mob：            带有转移复制原点(oriT)的mob区域
oriV：              复制原点V
附图9：质粒pK18mobsacBph1∷trp的图谱
所使用的缩写和标记具有以下含义：
KmR：               卡那霉素抗性基因
BamHI：             限制性酶BamHI的切割位点
EcoRI：             限制性酶EcoRI的切割位点
SalI：              限制性酶SalI的切割位点
phage′             噬菌体区域phal的5′末端片段
′phage             噬菌体区域phal的3′末端片段
trpL                trpL基因
trpE                trpE基因
trpG                trpG基因
trpD                trpD基因
trpC                trpC基因
trpB                trpB基因
trpA                trpA基因
sacB：              sacB基因
RP4mob：            带有转移复制原点(oriT)的mob区域
oriV：              复制原点V
                            用于专利程序目的的
                       国际承认的在微生物保藏方面的
                            布达佩斯特条约
                                                                
Figure A20048000352901151
                           INTERNATIONALFORM
Degussa AG
Kantstr.2
33790Halle(Westf.)                                          RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT
                                                            issued pursuant to Rule 7.1 by the
                                                            INTERNATILONAL DEPOSITARY AUTHORITY
                                                            identified at the bottom of this page
Figure A20048000352901152
1Where Rule 6.4(d)applies，such date is the date on which the status of international depositary authority was acquired.Form USMZ-BP/4(sole page)12/2001
                                 用于专利程序目的的
                           国际承认的在微生物保藏方面的
                                布达佩斯特条约
                                                              
Figure A20048000352901161
                                  INTERNATIONAL FORM
Degussa AG
Kantstr.2
33790 Halle(Wesff.)
                                                              VIABILITY STATEMENT
                                                              issued pursuant to Rule 10.2by the
                                                              INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
                                                              identified at the bottom of this page
Figure A20048000352901162
1 Indicate the date of original deposit or，where a new deposit or a transfer has been made，the most recent relevanl date(date of the new deposit or dateof the transfer).
2 In the cases referred to in Rule 10.2(a)(ii)and(iii)，refer to the most recent viability test.
3 Mark with a cross the applicable box.
4 Fill in if the information has been requested and ifthe results of the test were negative.Form DSMZ-BP/9(sole page)12/2001
                             用于专利程序目的的
                          国际承认的在微生物保藏方面的
                             布达佩斯特条约
                                       INTERNATIONAL FORM
Degussa AG
Kantstr.2
33790Halle/Künsebeck
                                                                  RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT
                                                                  issued pursuant to Rule 7.1 by the
                                                                  INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
                                                                  identifled at the bottom of this page
Figure A20048000352901171
1Where Rule 6.4(d)applies，such date is the date on which the status of international depositary authority was acquiredForm DSMZ-BP/4(sole page)00196
                              用于专利程序目的的
                         国际承认的在微生物保藏方面的
                              布达佩斯特条约
                               INTERNATIONAL FORM
Degussa AG
Kantstr.2
33790 Halle/Künsebeck
                                                           VIABILITY STATEMENT
                                                           issued pursuant to Rule 10.2 by the
                                                           INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
                                                           identified at the bottom of this page
1 Indicate the date of original deposit or，where a new deposit or a transfer has been made，the most recent relevant date(date of the new deposit ordate of the transfer).
2 In the cases referred to in Rule 10.2(a)(ii)and(iii)，refer to the most recent viabillty test.
3 Mark with a cross the applicable box.
4 Fill in if the information has been requested and if the results of the test were negative.Form DSMZ-BP/9(sole page)0196
                                 用于专利程序目的的
                            国际承认的在微生物保藏方面的
                                布达佩斯特条约
                                                        
                                  INTERNATIONAL FORM
Degussa AG
Kantstr.2
33790Halle(Westf.)                                              RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT
                                                                issred pursuant to Rule 7.1 by the
                                                                INTERNATJONAL DEPOSITARY AUTHORITY
                                                                identified at the bottorm of this page
1Where Rule 6.4(d)applies，such date is the date on which the status of international depositary authority was acquired.Form DSMZ-BP/4(sole page)12/2001
                                用于专利程序目的的
                          国际承认的在微生物保藏方面的
                                  布达佩斯特条约
                                                               
Figure A20048000352901201
                                  INTERNATIONAL FORM
Degussa AG
Kantstr. 2
33790 Halle(Westf.)
                                                          VIABILTTY STATEMENT
                                                          issred pursuant to Rule 10.2 by the
                                                          INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
                                                          identified at the bottom of this page
Figure A20048000352901202
1 Indicate the date of original deposit or，where a new deposit or a transfer has been made，the most recent relevant date(date of the new deposit or dateof the transfer).
2 In the cases referred to in Rulc 10.2(e)(ii)and(iii)，refer to the most recent viability test.
3 Mark with a cross the applicable box.
4 Fill in if the information has been requested and if the results of the test were negative.Form DSMZ-BP/9(sole page)12/2001
序列表
<110>Degussa AG
<120>细菌和用所述细菌I生产化合物的方法
<130>010301 BT
<160>50
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1263
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1263)
<223>lysC野生型基因
<400>1
gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg    48
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                   10                  15
gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct    96
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
            20                  25                  30
gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat    144
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
        35                  40                  45
gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt    192
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
    50                  55                  60
gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc    240
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg    288
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                85                  90                  95
ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc    336
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100             105                     110
att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc    384
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
        115                 120                 125
aag atc tgc att gtt get ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc    432
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                 140
gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg    480
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt    528
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
                165                 170                 175
gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag    576
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                 185                 190
ctg gaa aag ctc age ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc    624
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                 200                 205
tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat    672
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    210                 215                 220
gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg    720
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc    768
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                 250                 255
ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att    816
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                 265                 270
tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat    864
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
        275                 280                 285
gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa    912
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                 295                 300
gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc    960
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc    1008
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
                325                 330                 335
aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct    1056
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                 345                 350
ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg    1104
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                 360                 365
cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt    1152
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                 375                 380
att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca    1200
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat    1248
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                 410                 415
gca ggc acc gga cgc                                                1263
Ala Gly Thr Gly Arg
            420
<210>2
<211>421
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>2
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                   10                  15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
            20                  25                  30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
        35                  40                  45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
    50                  55                  60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100                 105                 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
        115                 120                 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
                165                 170                 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                 185                 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                 200                 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    2l0                 215                 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                 250                 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                 265                 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
        275                 280                 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                 295                 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
                325                 330                 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                 345                 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                 360                 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                 375                 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                 410                 415
Ala Gly Thr Gly Arg
            420
<210>3
<211>1263
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1263)
<223>lysC-fbr allele lysC T311I
<400>3
gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg    48
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                   10                  15
gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct    96
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
            20                  25                  30
gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat    144
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
        35                  40                  45
gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt    192
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
    50                  55                  60
gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc    240
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg    288
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Glv Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                85                  90                  95
ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc    336
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100                 105                 110
att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc    384
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
        115                 120                 125
aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc    432
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                 140
gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg    480
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt    528
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
                165                 170                 175
gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag    576
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                 185                 190
ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc    624
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu MetLeu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                 200                205
tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat    672
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    210                 215                 220
gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg    720
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc    768
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                 250                 255
ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att    816
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                 265                 270
tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat    864
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
        275                 280                 285
gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa    912
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                 295                 300
gac ggc acc acc gac atc atc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc    960
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc    1008
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
                325                 330                 335
aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct    1056
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                 345                 350
ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg    1104
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                 360                 365
cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt    1152
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                 375                 380
att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca    1200
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat    1248
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                 410                 415
gca ggc acc gga cgc                                                1263
Ala Gly Thr Gly Arg
            420
<210>4
<211>421
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>4
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                   10                  15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
            20                  25                  30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
        35                  40                  45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
    50                  55                  60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100                 105                 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
        115                 120                 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys G1u I1e Tyr Ser Asp Val
                165                 170                 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                 185                 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                 200                 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    210                 215                 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                 250                 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                 265                 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
        275                 280                 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                 295                 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
                325                 330                 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                 345                 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                 360                 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                 375                 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                 410                 415
Ala Gly Thr Gly Arg
            420
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物lysC1beg
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物lysC1beg
<400>5
taggatcctc cggtgtctga ccacggtg                      28
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物lysC2end
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(29)
<223>引物lysC2end
<400>6
acggatccgc tgggaaattg cgctcttcc                         29
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物gluBgl1
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物gluBgl1
<400>7
taagatctgt gttggacgtc atggcaag                          28
<210>8
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物gluBgl2
<400>8
acagatcttg aagccaagta cggccaag                          28
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pck_beg
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(27)
<223>引物pck_anf
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(27)
<223>引物pck_beg
<400>9
taagatctgc cggcatgact tcagttt                            27
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pck_end
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>引物pck_end
<400>10
acagatctgg tgggagcctt tcttgttatt                         30
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物aecD_beg
<400>11
gaacttacgc caagctgttc                             20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物aecD_end
<400>12
agcaccacaa tcaacgtgag                             20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物gluA_beg
<400>13
cacggttgct cattgtatcc                            20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物gluD_end
<400>14
cgaggcgaat cagacttctt                            20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物ddh_beg
<400>15
ctgaatcaaa ggcggacatg                            20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物ddh_end
<400>16
tcgagctaaa ttagacgtcg                            20
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物dapA_beg
<400>17
cgagccagtg aacatgcaga                            20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物dapA_end
<400>18
cttgagcacc ttgcgcagca                                20
<210>19
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pyc_beg
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物pyc_anf
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物pyc_beg
<400>19
tcacgcgtct tgaagtcgtg caggtcag                            28
<210>20
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pyc_end
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物pyc_end
<400>20
tcacgcgtcg cctcctccat gaggaaga                            28
<210>21
<211>39
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(39)
<223>引物P458S-1
<400>21
ggattcattg ccgatcactc gcacctcctt caggctcca                    39
<210>22
<211>39
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(39)
<223>引物P458S-2
<400>22
gtggaggaag tccgaggtcg agtgatcggc aatgaatcc                    39
<210>23
<211>1310
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1310)
<223>基因间区域ncode1
<400>23
aagctctatt gtcccctacg tgctcgtttc tggcctttta gtaagcacca ggaataagcg    60
ccgatgaaga cacaatcata ccgacaatta atcgtgccga tatgagctct taaaagacag    120
cataaaacga gtttttcaaa agcctattaa gtgtcaatta cgacgtgcat taatagatac    180
tcaatcacct taaattgttg acacactcca ctaaaacagg tctattaaaa gacaattgaa    240
ttacgcccta gtagtacttg tttcaggcca ccacttagaa ggcttttaag tatccactat    300
gtatcaatta tctagaacct ttagtgactt tgaaacggca gtactctatt ggctcttaat    360
ggtcaattac ataacaatta tattgagcct ttgaaacaac tcactctgct gcatattaaa    420
aggtcgatta actaacgatt gaattgatcc ttaaaaagcc tttatctatc gcattatgaa    480
taaatattta atcgaccttt aatagtgacc taaaagcctt ttaaaagcca acgcattcag    540
tgacttttaa aaggctatta agtgtcaatt gaattgcctt gttactggct tttaaaaggc    600
tattaaagaa cactccccta ttgtctttta atcgtcactt aatcgacctc taaaaggtaa    660
ctaattgact cttgagtgac acatatttaa ttgaccttta agtaacgatt ataaggcaat    720
taatgtgacc aaataaagac acgtaactga ctaatcttta tctgactatt acaaggcttt    780
aaaagagcac ttatgtgtcg attaagtgtc tacgcaataa ctgtgcttta agaggcttta    840
aaaactacaa ttgaatcgac cactaatcgt tacttaaatg actattaaca aaagtcactt    900
ttagagcacc gcaaaagcct tttaatggtc acgcaataag cctttaagta acaattaaat    960
aagtggcttt aaaatcacta ctgcagcacg attgaaaggt aattagcggt cgattaagtg    1020
tcaattaatt aatagtgatt caaaatctca ttaaagcgca attcaattga cagctaataa    1080
gcccttaagt aacaaatact ttatccgtac tttaagggca cgctaaaagc cttttaatcg    1140
acatctaatt gtcataacgc ttcgatgcgc ccatgggaat acacttagcg gtcgattaaa    1200
tggatactaa gtagcaatta gccagagtcg cgtgacagag ttgtggcgca cagtagcaca    1260
tcacccctac ccccgtgcat ctcttaatta gcactaaaac aacatttatc               1310
<210>24
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物ncode 1
<400>24
gaagatctaa gctctattgt cccctacg                                      28
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223>引物ncode 2
<400>25
gatcctttta aaagccagta acaag                            25
<210>26
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(47)
<223>引物ncode 3
<400>26
cttgttactg gcttttaaaa ggatcctatt aaagaacact cccctat             47
<210>27
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物ncode 4
<400>27
gaagatctcg actctggcta attgctac                                  28
<210>28
<211>1249
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR-Produkt
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1249)
<223>PCR之后的基因间区域ncode1
<400>28
gaagatctaa gctctattgt cccctacgtg ctcgtttctg gccttttagt aagcaccagg    60
aataagcgcc gatgaagaca caatcatacc gacaattaat cgtgccgata tgagctctta    120
aaagacagca taaaacgagt ttttcaaaag cctattaagt gtcaattacg acgtgcatta    180
atagatactc aatcacctta aattgttgac acactccact aaaacaggtc tattaaaaga    240
caattgaatt acgccctagt agtacttgtt tcaggccacc acttagaagg cttttaagta    300
tccactatgt atcaattatc tagaaccttt agtgactttg aaacggcagt actctattgg    360
ctcttaatgg tcaattacat aacaattata ttgagccttt gaaacaactc actctgctgc    420
atattaaaag gtcgattaac taacgattga attgatcctt aaaaagcctt tatctatcgc    480
attatgaata aatatttaat cgacctttaa tagtgaccta aaagcctttt aaaagccaac    540
gcattcagtg acttttaaaa ggctattaag tgtcaattga attgccttgt tactggcttt    600
taaaaggatc ctattaaaga acactcccct attgtctttt aatcgtcact taatcgacct    660
ctaaaaggta actaattgac tcttgagtga cacatattta attgaccttt aagtaacgat    720
tataaggcaa ttaatgtgac caaataaaga cacgtaactg actaatcttt atctgactat    780
tacaaggctt taaaagagca cttatgtgtc gattaagtgt ctacgcaata actgtgcttt    840
aagaggcttt aaaaactaca attgaatcga ccactaatcg ttacttaaat gactattaac    900
aaaagtcact tttagagcac cgcaaaagcc ttttaatggt cacgcaataa gcctttaagt    960
aacaattaaa taagtggctt taaaatcact actgcagcac gattgaaagg taattagcgg    1020
tcgattaagt gtcaattaat taatagtgat tcaaaatctc attaaagcgc aattcaattg    1080
acagctaata agcccttaag taacaaatac tttatccgta ctttaagggc acgctaaaag    1140
ccttttaatc gacatctaat tgtcataacg cttcgatgcg cccatgggaa tacacttagc    1200
ggtcgattaa atggatacta agtagcaatt agccagagtc gagatctag                1249
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物3371V
<400>29
tatcatgcgg tgagctgtga                                               20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物3372N
<400>30
taggggtgat gtgctactgt                                    20
<210>31
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ilvD-A1
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(32)
<223>引物ilvD-A1
<400>31
atcgtctcta gacttggagc gccaaaaggc ac                        32
<210>32
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ilvD-E1
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(32)
<223>引物ilvD-E1
<400>32
gtcatctcta gatcgaggca gagttcgctg gt                        32
<210>33
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ddh_del1
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(33)
<223>引物ddh_del1
<400>33
atcgtcgcta gcccaacgaa tctccacgag acg                            33
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物ddh_del2
<400>34
gacatccgca ccatgcctga                                        20
<210>35
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ddh_del3
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(44)
<223>引物ddh_del3
<400>35
tcaggcatgg tgcggatgtc tagagtcggc aaccacgaag catt            44
<210>36
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ddh_del4
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(32)
<223>引物ddh_del4
<400>36
atgctcgcta gcatgaccaa catccgcgta gc                            32
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物ddh-int1
<400>37
attcttccgc gaccgcgata                                          20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物ddh_A1
<400>38
ccggataaac caccatgaac                                    20
<210>39
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物trp-A1
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>引物trp-A1
<400>39
gtacggatcc caaggacagc tcgtgtagac                                30
<210>40
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物trp-E1
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>引物trp-E1
<400>40
agctggatcc caccggctcg aagctaagat                                30
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物ncode1-A1
<400>41
actatcatgc ggtgagctgt                                    20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物ncode1-E1
<400>42
ggeagctctg tagccatatt                                    20
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物trp-test
<400>43
ccaaccacga tgagaaggac                                    20
<210>44
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pha1-int1
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>引物pha1-int1
<400>44
agtcgtcgac gctatcaacg cttcgatcac                                30
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物phal-int2
<400>45
ctgtctcgta cggatgacag                                           20
<210>46
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pha1-int3
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(45)
<223>引物pha1-int3
<400>46
ctgtcatccg tacgagacag ggatccatac cttgccagtc aaatc                 45
<210>47
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pha1-int4
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>引物pha1-int4
<400>47
gtcagaattc gcagcatgta acggataggt                                  30
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物pha1-test1
<400>48
gcgctccatc actagagttc                                    20
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物pha1-test2
<400>49
ggtcagagtg agcacctaag                                    20
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物pha1-test3
<400>50
ctgcgagctt cattcgatcc                                    20

Claims (36)

1.棒杆菌细菌，它除了在天然位点(座位)含有一个拷贝的一或多个编码用于合成化合物的蛋白质或RNA的可读框(ORF)、基因或等位基因外，
a)还在整合进染色体的位点处含有一或多个拷贝的所述可读框(ORF)、基因或等位基因，由此
b)不含有在微生物中能够/使得能够发生复制或转座的核苷酸序列，和
c)在所述位点不含有赋予抗生素抗性的核苷酸，和
d)所述位点与对所述细菌的生长以及目的化合物的生产而言至关重要的可读框(ORF)、基因或等位基因无关，
e)至少一个所述位点选自基因间区域、原噬菌体和缺陷噬菌体或噬菌体组件或者编码所述原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的DNA。
2.根据权利要求1的棒杆菌细菌，其中基因间区域与选自下表的多核苷酸至少70％相同   参考文献   登录号   序列起始位置   序列结束位置   EP1108790   AX120085   192176   194501   EP1108790   AX127145   235840   237311   EP1108790   AX127145   236096   237311   EP1108790   AX127148   322628   330877   EP1108790   AX127148   334045   336467   EP1108790   AX127148   289565   291841   EP1108790   AX127149   154823   161111   EP1108790   AX127149   190088   193497   EP1108790   AX127149   27398   28707   EP1108790   AX127149   61478   62944   EP1108790   AX127149   116234   117561   EP1108790   AX127149   140847   144605   EP1108790   AX127150   113274   114324   EP1108790   AX127152   244281   246403
。
3.根据权利要求1的棒杆菌细菌，其中包含在染色体内的原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件与选择下表的多核苷酸至少70％相同   参考文献   登录号   序列起始位置   序列结束位置   EP1108790   AX127149   50474   51049   EP1108790   AX127149   67886   68587   EP1108790   AX127151   72893   73480   EP1108790   AX127149   88231   89445   EP1108790   AX127148   139781   140155   EP1108790   AX127148   140546   141001   EP1108790   AX127149   194608   195294   EP1108790   AX127147   200185   200940   EP1108790   AX127147   208157   208450   EP1108790   AX127149   269616   269948   EP1108790   AX127148   336468   338324   EP1108790   AX127148   342235   342681   EP1108790   AX127148   343518   345356   EP1108790   AX127148   345872   346207
。
4.根据权利要求1的棒杆菌细菌，其中所述棒杆菌细菌属于棒杆菌属。
5.根据权利要求2的棒杆菌属的棒杆菌细菌，它们属于谷氨酸棒杆菌物种。
6.根据权利要求1的棒杆菌细菌，其中所述化合物选自L-氨基酸、维生素、核苷和核苷酸。
7.根据权利要求1的棒杆菌细菌，其中化合物是一或多种选自L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸的L-氨基酸。
8.根据权利要求6的棒杆菌细菌，其中L-氨基酸是L-赖氨酸。
9.根据权利要求8的棒杆菌细菌，其中编码用于生产赖氨酸的蛋白质的一或多个所述可读框(ORF)、基因或等位基因选自accBC、accDA、cstA、cysD、cysE、cysH、cysK、cysN、cysQ、dapA、dapB、dapC、dapD、dapE、dapF、ddh、dps、eno、gap、gap2、gdh、gnd、lysC、lysCFBR、lysE、msiK、opcA、oxyR、ppc、ppcFBR、pgk、pknA、pknB、pknD、pknG、ppsA、ptsH、ptsI、ptsM、pyc、pyc P458S、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tal、thyA、tkt、tpi、zwal、zwf和zwf A213T。
10.根据权利要求8的棒杆菌细菌，其中编码用于生产赖氨酸的蛋白质的一或多个所述可读框、基因或等位基因选自dapA、ddh、lysCFBR和pyc P458S。
11.根据权利要求8的棒杆菌细菌，其中含有编码反馈抗性形式的天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因。
12.根据权利要求11的棒杆菌细菌，其中含有由lysCFBR等位基因编码、具有包含一或多个选自A279T、A279V、S301F、T308I、S301Y、G345D、R320G、T311I和S381F的氨基酸取代的根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的反馈抗性天冬氨酸激酶。
13.根据权利要求11的棒杆菌细菌，其中由lysCFBR等位基因编码的反馈抗性天冬氨酸激酶包括根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
14.根据权利要求11的棒杆菌细菌，其中lysCFBR等位基因编码区域包括SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
15.根据权利要求8的棒杆菌细菌，其中所述基因或等位基因的第三或第四个拷贝整合在选自aecD、ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、fda、gluA、gluB、gluC、gluD、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、menE、mqo、pck、pgi和poxB的位点。
16.根据权利要求15的棒杆菌细菌，其中位点是aecD基因位点。
17.根据权利要求151的生产L-赖氨酸的棒杆菌细菌，其中位点是gluB基因位点。
18.根据权利要求15的生产L-赖氨酸的棒杆菌细菌，其中位点是pck基因位点。
19.制备化合物的方法，包括在适宜培养基中对权利要求1至18的棒杆菌细菌进行发酵。
20.通过发酵棒杆菌细菌制备化合物的方法，其中进行以下步骤：
a)发酵棒杆菌细菌，该棒杆菌细菌除了在天然位点(座位)存在至少一个拷贝的一或多个编码用于合成所述化合物的蛋白质或RNA的可读框(ORF)、基因或等位基因外，
b)还在整合进染色体的位点含有一或多个，尤其是第二个、可选地第三或第四个拷贝的所述可读框(ORF)、基因或等位基因，发酵在可以使所述可读框(ORF)、基因或等位基因表达的条件下进行，由此
c)不带有在微生物中能够/使得能够进行附加体型复制或转座的核苷酸序列和
d)在所述位点不带有赋予其抗生素抗性的核苷酸序列，由此
e)至少一个所述位点选自所有包含在染色体内的基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件或者编码所述原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的DNA，
f)浓缩发酵液体培养基和/或细菌细胞中的化合物，
g)分离该化合物，可选地
h)连同来自发酵液体培养基和/或生物质中的成分一起，直至＞(大于)0至100wt％。
21.根据权利要求20的方法，其中基因间区域选自权利要求2的表格。
22.根据权利要求20的方法，其中所述原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件选自权利要求3的表格。
23.根据权利要求20的方法，其中使用了这样的棒杆菌细菌，这些细菌中由所述可读框、基因或等位基因编码的相应蛋白质的细胞内活性被提高，尤其是编码这些蛋白质的核苷酸序列过表达。
24.根据权利要求20至29的方法，其中所述细菌属于棒杆菌属。
25.根据权利要求24的方法，其中所述细菌属于谷氨酸棒杆菌物种。
26.根据权利要求20至25的方法，其中化合物选自L-氨基酸、维生素、核苷和核苷酸。
27.根据权利要求27的方法，其中化合物是一或多种选自L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸的L-氨基酸。
28.根据权利要求26的方法，其中化合物是L-赖氨酸。
29.根据权利要求20至26的制备L-赖氨酸的方法，其中使用了这样的棒杆菌细菌，这些细菌中一或多个可读框、基因或等位基因选自accBC、accDA、cstA、cysD、cysE、cysH、cysK、cysN、cysQ、dapA、dapB、dapC、dapD、dapE、dapF、ddh、dps、eno、gap、gap2、gdh、gnd、lysC、lysCFBR、lysE、msiK、opcA、oxyR、ppc、ppcFBR、pgk、pknA、pknB、pknD、pknG、ppsA、ptsH、ptsI、ptsM、pyc、pycP458S、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tal、thyA、tkt、tpi、zwal、zwf和zwf A213T。
30.根据权利要求20至26的制备L-赖氨酸的方法，其中发酵一或多个可读框、基因或等位基因选自基因或等位基因dapA、ddh、lysCFBR和pyc P458S的棒杆菌细菌。
31.根据权利要求30的制备L-赖氨酸的方法，其中等位基因是编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因。
32.根据权利要求31的制备L-赖氨酸的方法，其中由lysCFBR等位基因编码的反馈抗性天冬氨酸激酶包含含有一或多个选自A279T、A279V、S301F、T308I、S301Y、G345D、R320G、T311I和S381F的氨基酸取代的根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
33.根据权利要求31的制备L-赖氨酸的方法，其中由lysCFBR等位基因编码的反馈抗性天冬氨酸激酶包括根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
34.根据权利要求31的制备L-赖氨酸的方法，其中lysCFBR等位基因编码区域包括SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
35.根据权利要求20至26的制备L-赖氨酸的方法、其中对第三或第四个位点选自aecD、ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、fda、gluA、gluB、gluC、gluD、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、menB、mqo、pck、pgi和poxB的棒杆菌细菌进行发酵。
36.生产棒杆菌细菌的方法，包括：
a)优选地从棒杆菌细菌中分离至少一种编码用于生产化合物的蛋白质或RNA的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，可选地包括表达和/或调控信号，
b)为所述ORF、基因或等位基因的5′和3′末端提供靶位点的核苷酸序列，
c)其中所述位点选自基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件，
d)优选将带有靶位点核苷酸序列的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列整合进在棒杆菌细菌中不复制或仅进行有限复制的合适载体中，
e)将b)或c)的所述核苷酸序列转移进棒杆菌细菌中，和
f)分离在靶位点整合了根据a)的核苷酸序列的棒杆菌细菌。
CNA2004800035293A 2003-02-05 2004-01-29 细菌和用所述细菌生产化合物的方法 Pending CN1748031A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/358,405 US7160711B2 (en) 2001-08-06 2003-02-05 Coryneform bacteria which produce chemical compounds I
US10/358,405 2003-02-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1748031A true CN1748031A (zh) 2006-03-15

Family

ID=32849572

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2004800035293A Pending CN1748031A (zh) 2003-02-05 2004-01-29 细菌和用所述细菌生产化合物的方法

Country Status (6)

Country Link
US (3) US7160711B2 (zh)
EP (1) EP1590463A2 (zh)
KR (1) KR20050100389A (zh)
CN (1) CN1748031A (zh)
BR (1) BRPI0407284A (zh)
WO (1) WO2004069996A2 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101838663B (zh) * 2009-12-18 2013-05-22 江南大学 一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体及其构建方法
CN105734004A (zh) * 2016-03-02 2016-07-06 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其制备方法、应用
CN113201514A (zh) * 2020-10-16 2021-08-03 中国科学院天津工业生物技术研究所 具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其在生产氨基酸中的应用
WO2022037338A1 (zh) 2020-08-19 2022-02-24 中国科学院天津工业生物技术研究所 具有启动子活性的多核苷酸及其在生产氨基酸中的应用

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10047404A1 (de) * 2000-09-26 2002-04-11 Degussa Neue für das msik-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
US7160711B2 (en) * 2001-08-06 2007-01-09 Degussa Ag Coryneform bacteria which produce chemical compounds I
DE102004061696A1 (de) 2004-12-22 2006-07-06 Degussa Ag Mutante des proB-Gens aus coryneformen Bakterien
DE102005013676A1 (de) 2005-03-24 2006-09-28 Degussa Ag Allele des zwf-Gens aus coryneformen Bakterien
DE102005023829A1 (de) 2005-05-24 2006-11-30 Degussa Ag Allele des opcA-Gens aus coryneformen Bakterien
JP5172697B2 (ja) 2006-01-04 2013-03-27 メタボリック エクスプローラー 硫酸透過酵素の発現が増強された微生物を用いてメチオニンおよびその前駆体ホモセリンまたはスクシニルホモセリンを製造するための方法
DE102006032634A1 (de) 2006-07-13 2008-01-17 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
KR100905381B1 (ko) 2006-07-28 2009-06-30 씨제이제일제당 (주) Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법
DE102006048882A1 (de) * 2006-10-17 2008-04-24 Evonik Degussa Gmbh Allele des rel-Gens aus coryneformen Bakterien
DE102006050489A1 (de) * 2006-10-26 2008-04-30 Evonik Degussa Gmbh Allele des prpD1-Gens aus coryneformen Bakterien
KR100838035B1 (ko) 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
KR100838038B1 (ko) * 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
KR100830826B1 (ko) * 2007-01-24 2008-05-19 씨제이제일제당 (주) 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법
ES2534375T3 (es) 2007-04-11 2015-04-22 Cj Cheiljedang Corporation Composiciones y procedimientos de producción de metionina
US8133714B2 (en) 2007-09-27 2012-03-13 Evonik Degussa Gmbh Process for the fermentative preparation of organic chemical compounds using coryneform bacteria in which the SugR gene is present in attenuated form
US7851180B2 (en) * 2008-04-04 2010-12-14 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism
US9005952B2 (en) 2008-04-04 2015-04-14 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
KR101126041B1 (ko) 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
DE102009030342A1 (de) 2009-06-25 2010-12-30 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von organisch chemischen Verbindungen
DE102010003419B4 (de) 2010-03-30 2019-09-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Ornithin
EP2615170B1 (en) * 2010-09-08 2015-11-04 Green Phenol Development Co., Ltd. Coryneform bacterium transformant and method for producing phenol using same
DE102011006716A1 (de) 2011-04-04 2012-10-04 Evonik Degussa Gmbh Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung
DE102011118019A1 (de) 2011-06-28 2013-01-03 Evonik Degussa Gmbh Varianten des Promotors des für die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden gap-Gens
US9347048B2 (en) 2012-04-27 2016-05-24 Evonik Technochemie Gmbh Feedback-resistant alpha-isopropylmalate synthases
EP2762571A1 (de) 2013-01-30 2014-08-06 Evonik Industries AG Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren
PL2811028T3 (pl) 2013-06-03 2017-07-31 Evonik Degussa Gmbh Sposób wytwarzania L-waliny z zastosowaniem zrekombinowanych bakterii maczugowatych zawierających operon ilvBN indukowany propionianem
CN103361289B (zh) * 2013-07-08 2014-12-31 南京工业大学 一株产l-赖氨酸的菌株及其生产l-赖氨酸的方法
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US11293029B2 (en) 2015-12-07 2022-04-05 Zymergen Inc. Promoters from Corynebacterium glutamicum
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
EP3478845A4 (en) 2016-06-30 2019-07-31 Zymergen, Inc. METHODS OF PRODUCING A GLUCOSE PERMEASE BANK AND USES THEREOF
WO2018005655A2 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Zymergen Inc. Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US20200239897A1 (en) 2017-06-07 2020-07-30 Zymergen Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum and uses thereof in regulating ancillary gene expression
EP3415622A1 (en) 2017-06-14 2018-12-19 Evonik Degussa GmbH Method for production of fine chemicals using a corynebacterium secreting modified alpha-1,6-glucosidases
KR102035844B1 (ko) * 2018-02-23 2019-10-23 씨제이제일제당 주식회사 L-트립토판을 생산하는 재조합 코리네형 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법
CN112969797A (zh) 2018-09-07 2021-06-15 阿彻丹尼尔斯米德兰德公司 工程化棒状杆菌属菌株

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1193665B (it) 1983-02-08 1988-07-21 Sclavo Inst Sieroterapeut Procedimento per la produzione di un tossoide difterico con rese elevate
IE892893A1 (en) 1990-03-11 1991-09-25 Charles O Kane Phage-like bacteriocins
JP3036912B2 (ja) * 1991-09-02 2000-04-24 協和醗酵工業株式会社 遺伝子発現調節ｄｎａ
DE4232468A1 (de) * 1992-09-28 1994-03-31 Consortium Elektrochem Ind Mikroorganismen für die Produktion von Tryptophan und Verfahren zu ihrer Herstellung
EP0974666A4 (en) 1996-06-26 2004-12-15 Yakult Honsha Kk METHODS FOR TRANSFERRING GENES INTO A CHROMOSOME
DE19931317A1 (de) * 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
US6171833B1 (en) * 1998-12-23 2001-01-09 Massachusetts Institute Of Technology Pyruvate carboxylase from corynebacterium glutamicum
AU3837400A (en) 1999-04-19 2000-11-02 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Novel desensitized aspartokinase
DE19924364A1 (de) * 1999-05-27 2000-11-30 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
US20030049804A1 (en) * 1999-06-25 2003-03-13 Markus Pompejus Corynebacterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins
US20020086371A1 (en) * 1999-07-07 2002-07-04 Degussa-Huls Aktiengesellschaft L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of L-lysine
PT1208205E (pt) * 1999-07-23 2006-12-29 Archer Daniels Midland Co Métodos para produzir l-aminoácidos por aumento do nadph celular
AU6511000A (en) 1999-08-02 2001-02-19 Baylor College Of Medicine Novel vectors and system for selectable targeted integration of transgenes into a chromosome without antibiotic resistance markers
US6713289B2 (en) * 1999-10-05 2004-03-30 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the eno gene
DE19950409A1 (de) 1999-10-20 2001-04-26 Degussa Neue für das pck-Gen codierende Nukleotidsequenzen
DE19959328A1 (de) 1999-12-09 2001-06-13 Degussa Neue für das zwa1-Gen codierende Nukleotidsequenzen
JP4623825B2 (ja) 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
DE10032173A1 (de) * 2000-07-01 2002-01-17 Degussa Neue für das plsC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
US7160711B2 (en) 2001-08-06 2007-01-09 Degussa Ag Coryneform bacteria which produce chemical compounds I
CN100336901C (zh) 2001-08-06 2007-09-12 德古萨股份公司 生产化合物ⅱ的棒状细菌
CN100554426C (zh) 2001-08-06 2009-10-28 德古萨股份公司 用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌生产l-赖氨酸

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101838663B (zh) * 2009-12-18 2013-05-22 江南大学 一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体及其构建方法
CN105734004A (zh) * 2016-03-02 2016-07-06 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其制备方法、应用
CN105734004B (zh) * 2016-03-02 2020-06-19 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其制备方法、应用
WO2022037338A1 (zh) 2020-08-19 2022-02-24 中国科学院天津工业生物技术研究所 具有启动子活性的多核苷酸及其在生产氨基酸中的应用
CN113201514A (zh) * 2020-10-16 2021-08-03 中国科学院天津工业生物技术研究所 具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其在生产氨基酸中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20050100389A (ko) 2005-10-18
BRPI0407284A (pt) 2006-01-31
US20030219881A1 (en) 2003-11-27
WO2004069996A2 (en) 2004-08-19
WO2004069996A3 (en) 2004-12-09
US20100159523A1 (en) 2010-06-24
US7160711B2 (en) 2007-01-09
US20070111291A1 (en) 2007-05-17
EP1590463A2 (en) 2005-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100336901C (zh) 生产化合物ⅱ的棒状细菌
CN1748031A (zh) 细菌和用所述细菌生产化合物的方法
CN1539015A (zh) 用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌生产l-赖氨酸
CN1206342C (zh) 生产l－赖氨酸的棒状菌和制备l－赖氨酸的方法
CN1161470C (zh) 用于产生l-赖氨酸的方法
CN1273592C (zh) 用于产生l－赖氨酸的方法
CN1210396C (zh) L－氨基酸生产菌以及用于生产l－氨基酸的方法
CN1117152C (zh) 生产l－赖氨酸的方法
CN1934265A (zh) 使用棒状细菌生产l－氨基酸的方法
CN1165619C (zh) 制备l-赖氨酸的方法
CN1246468C (zh) 使用肠细菌科菌株发酵生产l－氨基酸的方法
CN1262666C (zh) 用人工转座子扩增基因的方法
CN1079836C (zh) 通过发酵生产l-赖氨酸及l-谷氨酸的方法
CN1231574C (zh) 生产l－赖氨酸的棒状菌和制备赖氨酸的方法
CN101080489A (zh) 棒状细菌gnd基因的等位基因
CN1572868A (zh) 生产靶物质的方法
CN1639350A (zh) 生产氨基酸的细菌及制备l－氨基酸的方法
CN1618970A (zh) 用甲基营养菌生产l－氨基酸的方法
CN1550546A (zh) 通过发酵生产l—精氨酸或l—赖氨酸的方法
CN1502690A (zh) 利用甲醇同化细菌生产l-赖氨酸或l-精氨酸的方法
CN1289676C (zh) 经扩增zwf基因发酵制备L－氨基酸的方法
CN1898259A (zh) 用于编码精细化学品的代谢途径的蛋白质的基因变体
CN1578834A (zh) 编码代谢途径蛋白的基因
CN1656229A (zh) 发酵生产含硫精细化学品的方法
CN1231591C (zh) 通过发酵棒状细菌生产l－氨基酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication