CN1747967A - 肽缀合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了血小板替代物，其不诱导通过造成血管中休眠血小板的凝集而引起的不需要血栓的形成和血管内血凝固，并具有特异凝集活性。结果发现肽缀合物，其中包含于纤维蛋白原GPIIb/IIIa识别位点的十二肽的合成形式与微粒结合，其具有仅与充分活化的GPIIb/IIIa特异结合的性质，其优选作为血小板替代物，因而实现本发明。

Description

肽缀合物

本申请要求享有日本专利申请2003-029847号和日本专利申请2004-017046号的优先权，其全文纳入本文参考。

技术领域

本发明涉及具有血小板替代功能的肽缀合物。尤其地，本申请涉及带有能特异识别活化的血小板的寡肽的微粒、包含缀合物的血小板替代物，通过利用缀合物控制血小板凝集的方法，生产缀合物的方法，以及包含缀合物的诊断剂。

发明背景

对于诸如血小板减少症的疾病来说，或者由于使用诸如抗肿瘤剂的化疗剂而使血小板数量暂时下降的时候，其造成了出血的倾向以及出血时不容易止血的症状。作为治疗该症状的方法，可服用人血小板制剂。可是，由于它们来自人体，存在感染病毒和病原菌风险的问题，更重要的是，人血小板制剂的保存期极短，室温下仅3天，因此急需研制能够解决这些问题的血小板替代物。

包含由人体收集的血小板的血小板制剂对于血小板减少症等的治疗是至关重要的，但由于它们的保存期短，并且也因为诸如感染风险的问题，已经在进行研究能够长期保存的血小板替代物。

至今，将通过冷冻干燥固定有多聚甲醛的人血小板制备的产品是已知的老的血小板替代物(参见专利文献1)。该产品通过固定处理使血小板代谢功能失活并且同时只保持血小板膜上GPIb的活性，从而可能长期保存。近来，已知有通过结合诸如GPIb或GPIIb/IIIa的功能性大分子制备的产品，因为糖蛋白己知存在于血小板膜上并被认为能将血小板吸附或凝集到某些微粒表面。这些产品里，由于具有基于GPIb和von Willebrand因子(vW因子)间相互作用的吸附活性，预计有GPIb的产品可用作血小板替代物，在另一方面，由于具有基于GPIIb/IIIa和纤维蛋白原和/或vW因子间相互作用的凝集活性，预计有GPIIb/IIIa的产品可用作血小板替代物。

此外，对于结合这些功能性大分子的微粒，已知的有诸如小囊泡(脂质体)的脂质膜、人白蛋白或其多聚物、人红血球等等。特别地，已知有将GPIb结合到由小囊泡(脂质体)作为微粒制备的产品(参见专利文献2)、将GPIb结合到由人白蛋白多聚物作为微粒制备的产品(参见专利文献3)、将GPIIb/IIIa结合到小囊泡(脂质体)作为微粒制备的产品(参见非专利文献1)等。

另外，尽管上述产品是仅有一种功能性大分子的产品，可是已知有既有GPIb又有GPIIb/IIIa的血小板替代物。特别地，已知有在血小板上活化随后用多聚甲醛固定GPIIb/IIIa的产品(参见专利文献4)。

另一方面，不像这些产品通过在血小板上有功能性大分子从而用作血小板替代物，通过辅助保留在患者血中血小板的活性从而诱导血凝集的那些产品也是已知的，也可被视为血小板替代物。例如，已知有通过引起血小板上GPIIb/IIIa相互作用来诱导血凝集的产品。特别地，已知有通过将具有RGD序列(Arg-Gly-Asp)(SEQ ID NO：2)的肽结合到小囊泡(脂质体)所制备的产品(参见非专利文献2)、通过将纤维蛋白原结合到人白蛋白多聚物所制备的产品(参见非专利文献3)、通过将包含十二肽(His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val)的肽，其中该十二肽位于纤维蛋白原的GPIIb/IIIa识别位点中，结合到人白蛋白所制备的产品(参见专利文献5)等等。

相关文献

专利文献1：美国专利4287087号

专利文献2：JP-A-9-208599，美国专利6177059和EP-A-0894807

专利文献3：JP-A-2001-151800

专利文献4：JP-A-2001-131078

专利文献5：美国专利4661471号

非专利文献1：M.E.Rybak，Thrombosis and Haemostasis， 55，240-245(1986)

非专利文献2：T.Nishiya和S.Sloan，Biochim.Biophys.Res.Comun.，224，242-245(1996)

非专利文献3：S.Takeoka等，Biomacromolecules， 2，1192-1197(2001)

发明内容

在生产血小板替代物中最紧要关注的事务之一是控制血小板替代物凝集的能力从而使生产的血小板替代物不产生严重的副作用，如血管阻塞，其通过诱导血栓的形成和血管内血凝固而形成，其由非必要情况在血管中的凝集而造成。事实上，在人血小板中，GPIIb/IIIa在通常状态下是休眠的，仅在必要应答时才被活化。通过控制该代谢，在活体内可抑制不必要的血栓形成或血凝固。可是，考虑到固定的血小板或传统的血小板替代物中GPIIb/IIIa与载体相连，还未知有带有这种控制机制的产品。

另一方面，血小板替代物，其通过辅助患者血液中保留的血小板活性而诱导血凝固，其需要结合纤维蛋白利用血小板上活化的GPIIb/IIIa并凝集血小板。可是，本发明人所作的研究发现，通过休眠的GPIIb/IIIa，具有RGD序列的肽与微粒结合所形成的血小板替代物甚至有与GPIIb/IIIa处在休眠状态下的血小板结合的活性。该事实表明即使辅助了血小板活性的血小板替代物有可能具有副作用，如形成不必要的血栓或血管内血凝固。另外，也预计通过将纤维蛋白原结合到微粒所制备的产品有只与活化的GPIIb/IIIa特异结合的活性，但是考虑到纤维蛋白原不稳定的性质，认为会存在问题(参见上述非专利文献3)。除了这些，考虑到通过结合含有包含在纤维蛋白原的GPIIb/IIIa识别位点中的十二肽部分的肽所制备的产品，其特定的具体实施方式没有在现有技术中完全被披露，而且诸如其稳定性和例证性活性以及效果的性质未被披露(参见上述专利文献5)。

基于以上事实，现在仍需要血小板替代物，其不诱导通过造成血管中休眠的血小板凝集而引起的不必要的血栓形成或血管内血凝固，并具有特异性凝集活性。

本发明深入研究了具有特异性凝集活性的血小板替代物，结果发现肽缀合物，其中合成形式的十二肽包含于纤维蛋白原的GPIIb/IIIa识别位点中，具有仅特异性结合充分活化的GPIIb/IIIa的性质，其优选作为血小板替代物从而实现本发明。另外，由于本发明的血小板替代物中不使用人源成分，而代之使用这些成分的合成形式和重组形式，因而能够避免病毒等造成的感染风险。

即，本发明的内容如下。

1，一种缀合物，是以下通式：

(微粒)-[(接头)-Cys-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val-COOH]n，

或以下通式：

(微粒)-[(间隔基)-(接头)-Cys-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val-COOH]n，

其中n是整数。

2，根据上述第1项所述的缀合物，其中微粒选自由小囊泡、胶粒、蛋白质多聚物和合成聚合物组成的组。

3，根据上述第1或2项所述的缀合物，其中微粒选自由小囊泡、重组白蛋白多聚物、乳胶粒和生物可降解的聚合物所组成的组。

4，根据上述第1-3项之任一所述的缀合物，其中微粒具有50nm或更大的颗粒直径。

5，根据上述第1-4项之任一所述的缀合物，其中微粒具有10μm或更小的颗粒直径。

6，根据上述第1-5项之任一所述的缀合物，其中接头为化合物，该化合物一个末端与SH基团反应，而且另一个末端与OH基团、COOH基团和NH₂基团之任一反应。

7，根据上述第1-6项之任一所述的缀合物，其中接头选自由二羧酸、氨基羧酸、双马来酰亚胺化合物、双卤羰基化合物、卤羰基马来酰亚胺化合物、二硫代马来酰亚胺、二硫代羧酸和马来酰亚胺羧酸所组成的组。

8，根据上述第1-7项之任一所述的缀合物，其中接头选自由二羧酸、氨基羧酸、双马来酰亚胺化合物、双卤羰基化合物、卤羰基马来酰亚胺化合物、二硫代马来酰亚胺、二硫代羧酸和马来酰亚胺羧酸所组成的组，而且其具有C2-10的碳链。

9，根据上述第1-8项之任一所述的缀合物，其中间隔基是选自由聚乙二醇、多肽、多糖、白蛋白和抗体所组成的组的一个或至少两个组合。

10，根据上述第1-9项之任一所述的缀合物，其中微粒是乳胶粒，间隔基是白蛋白，而且接头是二硫代羧酸。

11，根据上述第1-10项之任一所述的缀合物，其中微粒是小囊泡，间隔基是聚乙二醇，而且接头是马来酰亚胺羧酸。

12，包含上述第1-11项之任一所述的缀合物的血小板替代物。

13，控制血小板凝集的方法，其包括使用上述第1-11项之任一所述的缀合物。

14，生产上述第1-11项之任一所述的缀合物的方法。

15，包含上述第1-11项之任一所述的缀合物的诊断剂或试剂。

16，根据上述第15项所述的诊断剂或试剂，其是血小板功能紊乱的诊断剂、生物或医学试剂、血小板凝集抑制剂、筛选抗血栓剂的试剂、或检查血管损伤区域和血栓形成区域的诊断或治疗剂。

17，包含上述第1-11项之任一所述的缀合物的药物载体。

18，包含根据上述第17项所述的缀合物的药物载体，其中药物选自由止血剂、血管收缩剂、抗炎剂、抗血凝结剂和抗血小板剂所组成的组。

19，包含上述第1-11项之任一所述的缀合物的药物组合物。

20，包含根据上述第19项所述的缀合物的药物组合物，其包含的药物选自由止血剂、血管收缩剂、抗炎剂、抗血凝结剂和抗血小板剂所组成的组。

21，根据上述第19或20项所述的药物组合物，其用于预防或治疗血管失调、血管损伤和血栓症。

附图的简要说明

图1显示胶原蛋白表面上的血小板的表面覆盖度的周期变化。

图2显示十二肽偶联的乳胶珠(H12-LB)上的血小板的表面覆盖度的周期变化。

图3显示流过表面的SEM观察图。

图4显示对休眠血小板的结合能力测试的凝集率。

图5显示H12进入小囊泡的量和血小板凝集效果。

图6显示胶原蛋白表面上的血小板的表面覆盖度。

发明的最佳实施方式

本发明的肽缀合物是以下通式：

(微粒)-[(接头)-Cys-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val-COOH]n，

或以下通式：

(微粒)-[(间隔基)-(接头)-Cys-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val-COOH]n，

在通式中，n是整数。十二肽“His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val”是通常已知的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，包含于纤维蛋白原的GPIIb/IIIa识别位点中。该序列能用通常已知的合成方法来合成并不限于特定方式(The Peptides Analysis，Synthesis，andBiology，卷2，pp.1-284，Academic Press(1980))。末端羧基来源于氨基酸Val。

在通式中，微粒指能非肠道给药的药用载体，只要有生物相容性，其不限于特定方式。现在已知的常规合适的微粒材料有小囊泡、胶粒、蛋白质多聚物、合成聚合物等，其中特定示例包括小囊泡(脂质体)、重组白蛋白多聚物、乳胶粒、生物降解多聚物等。

小囊泡(脂质体)是人工脂质膜组成的颗粒，是由磷脂、甘油糖脂、胆固醇等生产的脂双层。对于其制备，广泛范围的常规已知方法，如表面活性剂去除方法、水合方法、超声波方法、反相蒸馏方法、冻融方法、乙醇注射方法、挤压方法和高压乳化方法都可以使用。制备小囊泡(脂质体)的详情如上述专利文献2和非专利文献2所详细叙述。尽管本发明的发明实施例和测试实施例中使用的是小囊泡(脂质体)，但是也能选择和使用那些有生物相容性的微粒。

对于重组白蛋白，其可使用已知的基因工程技术生产，没有特殊的限制。例如，用酵母作为宿主生产重组白蛋白在实现水平是合适的。通常已知的是白蛋白的微粒形式(多聚体)，本发明人在JP-A-2001-151800中公开的白蛋白多聚体的制备方法是合适的。另外，制备重组白蛋白的方法在以下方法中有详述(JP-A-5-317079、JP-A-6-56883、JP-A-6-245789和JP-A-8-116985中的每一个)，而且实施例1中所用的rHSA是通过这些方法获得的。

本发明实施例中使用的是乳胶粒，也能选择和使用那些有生物相容性的微粒。生物降解多聚物通过例如，聚合乳酸和/或乙醇酸形成微粒所获得的多聚体来制备。它们要确定分子量、共聚物成分和混合率来使用，从而它们在活体内具有周期性降解或溶解的性质。

该方式制备的微粒的颗粒直径优选约50nm或更多，优选10μm或更小，根据表面识别区域的导入量和其功能运用以及体内动力学来确定。其进一步优选约50nm至约500nm，更优选约100nm至约400nm。

通式中的接头不限于特定方式，只要其能在微粒和肽末端的SH基团间形成交联，而且其为常规已知的生物可接受化合物，但其优选是一种化合物，其一个末端与SH基团反应，而另一个末端与OH基团、COOH基团和NH₂基团之任一反应。接头的例子包括二羧酸、氨基羧酸、双马来酰亚胺化合物、双卤羰基化合物、卤羰基马来酰亚胺化合物、二硫代马来酰亚胺、二硫代羧酸和马来酰亚胺羧酸等。其中优选碳链为C2-10。

通式中的间隔基不限于特定方式，只要其处于微粒和接头之间，能调节微粒表面和肽间的长度并具有生物相容性。可用选自聚乙二醇、多肽、多糖、白蛋白和抗体或其2个或更多的组合。

优选结合到微粒上的十二肽的分子数量为高密度的，因为与血小板结合的可能性增加了而且快速形成凝集。在通式中，n指整数并代表结合微粒的十二肽分子的数量。本领域技术人员按照所需凝集程度和凝集率可以任意改变和调节该数量。例如，如测试实施例4中所示使用小囊泡(脂质体)时，可确定十二肽修饰率的最优值(如从0.3mol％至0.6mol％)，而且可用相同方式通过改变条件获得其优化条件。在某些值或较少修饰率时效果不够好，而在某些值或较多修饰率时不会影响效果。

制备微粒后，通过将微粒表面制成一种状态从而进行化学结合，如果需要可将其活化，接着让必要的接头或间隔基接头与其结合，随后使十二肽与其反应，由此制备出来微粒、接头或间隔基-接头和十二肽的缀合物。可选的，事先制备出接头或间隔基-接头和十二肽的反应物，最后让其与活化的微粒反应。对于反应条件，可使用任何常规已知的适合各种微粒的方法。十二肽和微粒的混合率根据最终缀合物中十二肽所需的密度值来调节。

对于小囊泡，小囊泡表面可用十二肽通过混合连有十二肽的两性分子来修饰，其中所述十二肽能先同脂形成脂双层组成成分，所述脂在有机溶剂中形成小囊泡，然后用常规方式制备小囊泡。

接着，如果需要，本发明的缀合物可用生理可接受的水溶液来洗涤，进行无菌过滤，配制，然后制成液体制剂、颗粒剂和悬液制剂。根据很多通常已知的药物生产方法来制备药物制剂。另外，药物制剂也可通过冻干液体制剂然后减压干燥它们来制成冻干的制剂。在该线路中，当进行冻干时，单糖(如葡萄糖等)、二糖(如蔗糖等)等可配成保护剂。本发明的药物制剂可用作为稳定剂的大分子物质配制，它们选自白蛋白、葡聚糖、乙烯基聚合物、凝胶和羟乙基淀粉。相对于1个重量份的脂，稳定剂的加入量为0.5至10个重量份，优选1至5个重量份。

由于包含本发明缀合物制成的药物制剂显示出与活化血小板GPIIb/IIIa选择性结合，因此它们不会造成血管中休眠血小板的凝集，它们与血小板的凝集是在诸如血管伤口区域的血小板活化区，从而提供了一种控制血小板凝集的方法。本发明的缀合物本身可成为合成血小板替代物。另外，由于本发明的缀合物具有在诸如血管伤口区域的血小板活化区聚集的性质，因此可用作包含药物的组合物的实施方案(药物载体)。这样的药物不限于特定方式，只要其在血管伤口区聚集时在生理学上和药理学上是有效的，其例子包括止血剂、血管收缩剂、抗炎剂、抗血凝结剂、抗血小板剂等。本发明缀合物的给药剂量约为0.001至1,000mg的十二肽。根据每个患者的性别、年龄、症状等，可选择增加或减少剂量。更合适地，本发明缀合物通过非肠道途径给药。特定例子包括血管内(动脉内或静脉内)注射、连续滴注、皮下给药、局部给药、肌肉内给药等。包括本发明缀合物的药物组合物的例子包括诸如血小板替代物的药物，血管失调、血管伤口和血栓的预防或治疗剂，或诸如血小板机能不全的血小板功能失调的诊断剂，生物或医学试剂，筛选血小板凝集抑制剂或抗血栓剂的试剂等等。其也可用作检查血管伤口区域和血栓形成区域的诊断剂或治疗剂。

实施例

本发明将参考生产实施例和测试实施例在下面作详细叙述，但是本发明不仅限于此。

实施例1

合成十二肽[以下称为“H12”(SEQ ID NO：1)]-偶联的乳胶珠(以下称为“H12-LB”)的方法

重组人血清白蛋白(以下称为“rHSA”)溶液(50mg/ml，1.5ml)和颗粒直径为1μm的乳胶珠(以下称为“LB”)悬液混合在一起并震荡(20℃，2小时)。离心沉淀LB(13000g，5分钟，4℃，3次)以去除上清液中未吸附的rHSA，然后用磷酸缓冲液(以下称为“PBS”，500μl)重悬。

SPDP(N-琥珀酰亚胺3，2-吡啶基二硫丙酸盐)乙醇溶液(5mM，5μl)加入到吸附HSA的LB悬液[以下称为“(HSA)LB”](4.0×10⁶颗粒/μl，500μl)，接着震荡(20℃，30分钟)。离心(13000g，5分钟，4℃，3次)去除未反应的SPDP和副产品，获得了吡啶二硫化物(以下称为“PD”)-偶联的(HSA)LB[以下称为“PD-(HSA)LB”]。该PD-(HSA)LB(4.0×10⁶颗粒/μl，500μl)与Cys-H12(Cys加入到H12的末端)(10mM，8μl)混合，接着震荡(20℃，12小时)。离心(13000g，5分钟，4℃，3次)除去上清后，获得H12-LB(2.0×10⁶颗粒/μl，1ml)。LB表面上H12的偶联量用测定343nm处的2硫吡啶酮(以下称为“2TP”)的吸光度来确定，其中2-硫吡啶酮通过硫醇-二硫化物交换反应形成(HPLC，TSK-GEL G3000SWXL柱，7.8mmo.d.×300mmh，1ml/min，PBS)。

实施例2

合成H12(SEQ ID NO：1)-偶联的小囊泡(以下称为“H12-PEG小囊泡”)的方法

合成PEG-Glu2C18用作H12-PEG-Glu2C18的对照。谷氨酸(2.96g，20mmol)和p-甲苯磺酸一水合物(4.56g，24mmol)溶于150ml苯中，接着于105℃回流1小时，同时用Dean-Stark仪去除形成的水。硬脂醇(11.9mg，44mmol)加入其中，接着于105℃回流14小时，同时去除形成的水。减压蒸去溶剂，然后残余物溶于150ml氯仿中，用150ml饱和碳酸钠水溶液洗涤2次，再用150ml水洗2次。收集氯仿层并用5g硫酸钠脱水，然后减压去除溶剂。残余物于60℃溶于400ml甲醇中，如果出现不溶物就过滤掉，在4℃重结晶，过滤，然后干燥获得Glu2C18白色粉末(13.3g，85％产率)(参考分子式1)。

该Glu2C18(50.08mg，76.8μmol)和MeO-PEG-COOH(α-羧基-ω-甲氧基聚乙二醇)(Mw＝5150)(200mg，38.4μmol)和HOBT(1-羟基-苯并三唑)(5.2mg，38.4μmol)溶于5ml二氯甲烷，然后向其加入DCC(N，N’-二环己基碳化二亚胺)(9.58mg，46.4μmol)，接着搅拌12小时。过滤去除不溶物后，向250ml二乙醚中滴加反应溶液，收集不溶物。收集的物质溶于苯中，接着冻干以获得PEG-Glu2C18白色粉末(204mg，83％产率)(n＝115)(参考分子式1)。合成的概要如分子式1所示。

分子式1

在另一方面，本发明的H12-PEG-Glu2C18用以下方式制备。Glu2C18(115.1mg，176μmol)和TEA(三乙胺)(24.6μl，176μmol)加入到5ml氯仿中，然后在里面溶解MAL-PEG-NHS(α-马来酰亚胺-ω-N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇)(Mw＝3400)(300mg，58.8μmol)，接着在室温搅拌12小时。向250ml二乙醚中滴加反应溶液，收集不溶物。收集的物质溶于苯中，接着冻干以获得MAL-PEG-Glu2C18白色粉末(264.8mg，64％产率)(参考分子式2)。该MAL-PEG-Glu2C18(n＝71)(100mg，25.37μmol)和Cys-Hl2(32.8mg，25.37μmol)溶于5mlDMF中，接着在室温下搅拌12小时。向250ml二乙醚中滴加反应溶液，收集不溶物。加入水并去除不溶物后，用冷冻干燥机去除溶剂以获得H 12-PEG-Glu2C 18灰黄色粉末(62.8mg，47％产率)(参考分子式2)。合成的概要如分子式2所示。

分子式2：

接着，用前述制备的PEG-Glu2C18和H12-PEG-Glu2C18将H12导入小囊泡中。向DPPC(100mg，136μmol)和胆固醇(52.7mg，136μmol)中加入任意比例的PEG-Glu2C18和/或H12-PEG-Glu2C18，由此制得的混合脂溶于5ml苯，接着冷冻干燥3小时。干燥后，往里面加入10ml纯水，接着搅拌12小时，然后用制粒设备(挤压机)通过有孔的过滤膜来进行颗粒直径控制。混合物按顺序通过过滤膜{3000nm→800nm→650nm→450nm→300nm→220nm(×2)}。离心(33000rpm，30分钟)2次，小囊泡悬浮于5mlPBS以获得小囊泡悬液。根据包含的PEG-Glu2C18和/或H12-PEG-Glu2C18的量，仅包含PEG-Glu2C18的小囊泡(4.74mg，0.817μmol)定义为PEG-小囊泡，而仅包含H12-PEG-Glu2C18的小囊泡(4.34mg，0.817μmol)定义为H12-PEG-小囊泡，而包含PEG-Glu2C18(4.74mg，0.817μmol)和H12-PEG-Glu2C18(14.34-0.34mg，2.72-0.0817μmol)的小囊泡定义为H12-PEG(PEG)小囊泡。

在该路线中，制备的磷脂小囊泡(H12-PEG小囊泡，1.8wt％)用PBS稀释30倍，在37℃震荡12小时，然后离心(33000rpm，1h)沉淀小囊泡并悬浮，然后冻干，获得的粉末进行¹H-NMR测定。由于H12-PEG小囊泡在37℃震荡12小时后，DPPC、胆固醇和H12-PEG-Glu2C18的摩尔比率不发生改变，因此确认了H12-PEG-Glu2C18没有从磷脂小囊泡中释放，其中仍保持稳定。

测试实施例1

乳胶珠用作载体时的血小板凝集试验：

血小板减少模型血通过全血穿过白细胞去除过滤膜来制备，通过重力获得无白细胞的制剂(NEOIJ，Nihon Pall)，并通过加入富含血小板的血浆(PRP)将血小板浓度调节到2.0×10⁴/μl(自动血细胞计数器K-4500，Sysmex，Kobe)。

H12-LB(1.0×10⁵颗粒/μl)加入到5ml血小板减少模型血中，使之竖立(37℃，10分钟)，用泵使之在胶原蛋白固定的表面流过(切向速率150s^-1)，然后在荧光显微镜下或通过CCD照相机观察。微粒对于每个表面的粘附获得率[表面覆盖度(以下称为“SC”)]用图像分析仪来测量(Argus-50，HamamatsuPhotonics)。

仅血小板用荧光标记[3，3’-二己氧基羰花青碘化物(DiOC₆)]，周期性观察它们的吸附行为。结果，随着时间流逝表面上血小板的SC增加了，在180秒后为3.1±0.4％(图1：口，对照)。而且，由于该倾向几乎与未加入LB的系统相同，即仅有血小板的系统(3.0±0.6％，图1：●)，反映出仅通过LB对血小板吸附没有发生影响。所以，当H12-LB代替LB加入时，血小板吸附比LB加入的情况有进一步扩增，在180秒后为5.1±03％，或比对照扩大了约1.7倍(图1：○)。

在另一方面，在观察用FITC标记的LB的H12-LB和LB的吸附行为时，H12-LB中的初始吸附率与图1所示的血小板的相比明显和缓，而SC逐渐增加了(图2：△)。另外，当血小板浓度为0.2×10⁴/μl(图2：●)时，与表面结合的H12-LB数量受到抑制，而在LB中几乎没有见到这种情况(图2：□)。

因此，在SEM(扫描电镜)下观察流过后的表面时，血小板首先吸附到胶原蛋白表面，然后在那里与H12-LB结合，而且通过其他血小板的进一步H12-LB-导致的吸附能被确证(图3)。

根据上述事实，能确证H12-LB与胶原蛋白表面的吸附是由血小板的出现而诱导的，H12-LB通过吸附于胶原蛋白而结合在活化的血小板上，而且通过相同方式的诱导和吸附流动的血小板，由此接连不断地形成双迭片结构。

测试实施例2

对休眠血小板的结合测试：

休眠血小板(2.0×10⁴/μl)同1.0×10⁵/μl的LB、H12-LB和CGGRGDF-LB[与含有RGD序列(Arg-Gly-Asp)的肽结合的LB]中的每一个混合，接着震荡(37℃，30分钟)，在每种情况下的凝集率通过流式细胞仪来评估。结果，LB和H12-LB没有显示凝集率的增加，而CGGRGDF-LB显示为2.9+1.3％(图4)。基于该事实，确证了相对于CGGRGDF-LB，H12-LB几乎不能与休眠的血小板粘着。

测试实施例3

H12导入小囊泡的量和血小板凝集效果：

通过向全血中加入1/9(v/v)柠檬酸钠的水溶液(3.8％)，接着离心(600rpm，15分钟)，从而获得富含血小板的血浆(PRP)。通过进一步离心沉淀(2500rpm，10分钟)来获得少含血小板的血浆(PPP)。通过混合PRP和PPP来制备血小板减少的血浆(180μl，[PLT]＝10×10⁴/μl)。向其中加入10μl小囊泡悬液后，进一步加入10μlADP(腺苷5’-磷酸)(300μM)以凝集血小板。

根据血小板凝集计的测量，当PPP看作100％的渗透性，而血小板减少的血浆看作0％的渗透性，测定凝集渗透性的增加，评估加入H12-PEG(PEG)小囊泡的情况和加入同样浓度PEG-小囊泡之间的渗透性差异。

在每种小囊泡中发现了血小板凝集的加速，其中小囊泡包含0.1mol％、0.2mol％和0.3mol％的H12-PEG-Glu2C18，当H12导入小囊泡的量增加时，血小板加速凝集(图5)。

测试实施例4

小囊泡用作载体时的血小板凝集试验：

血小板用DiOC₆荧光标记，向5ml血小板减少的血([血小板]＝5.0×10⁴/μl)中加入H12-PEG(PEG)小囊泡(1.5wt％，200μl)，使之竖立(37℃，10分钟)，使之在胶原蛋白表面以150s^-1的切向速率流过，然后在荧光显微镜下观察。用Argus-20分析表面上血小板的SC。当向血小板减少的血([血小板]＝5.0×10⁴/μl)中加入H12-PEG小囊泡(H12-PEG-Glu2C18：0.3mol％)或PEG小囊泡并使之在胶原蛋白表面上流过时，相对于加入PEG小囊泡的系统，加入H12-PEG小囊泡的系统中SC增加了(表1)。

表1

存在H12-PEG(PEG)小囊泡或H12-PEG小囊泡时血小板的加速凝集

样品	血小板的SC(％)
		PEG小囊泡H12-PEG小囊泡H12-PEG(PEG)小囊泡	9.6±0.915.0±5.017.3±1.9

我们认为SC的增加是因为血小板首先吸附于胶原蛋白表面，磷脂小囊泡结合于吸附的血小板上增加了与流动血小板结合的位点，而血小板进一步与磷脂小囊泡结合。另外，当使H12-PEG(PEG)小囊泡在相同条件下流过表面时，相对于加入PEG小囊泡的系统，加入H12-PEG(PEG)小囊泡的系统中也以相同方式增加了SC(表1)。所以，这显示了即使为了增强血液的保持力而将PEG脂导到小囊泡表面上时，也没有抑制H12的识别反应。

接着，当具有不同H12-PEG修饰率的H12-PEG(PEG)小囊泡加入到血小板减少的血中时，胶原蛋白表面的血小板的SC变得如图6所示。这些结果表明当H12-PEG-Glu2C18修饰率为0.1mol％或更少时，胶原蛋白表面的血小板的SC几乎与PEG小囊泡的情形相同，而在0.3mol％或更多的修饰率处效果似乎增加了。这些结果被认为是因为与H12-PEG-Glu2C18修饰量成比例，增加了吸附在由胶原蛋白活化的血小板的H12-PEG(PEG)小囊泡数量。

测试实施例5

小囊泡用作载体时与血小板的相互作用：

制备80μl血小板减少的血([血小板]＝5.0×10⁴/μl)后，向其中加入荧光标记的H12-PEG(PEG)小囊泡(8.2μM，20μl)或荧光标记的抗体和H12-PEG(PEG)小囊泡(0.082μM，20μl)，接着搅拌(30分钟，37℃)。混合物接着用甲醛(3.7％)固定，稀释10倍，然后用流式细胞仪测定。

如表2所示，根据加入了H12-PEG(PEG)小囊泡的血小板，向血小板加入PBS或PEG小囊泡的系统中抗体结合量没有变化。另外，H12-PEG(PEG)小囊泡本身也几乎没有显示出与血小板的相互作用。所以，确认了H12-PEG(PEG)小囊泡不与普通血小板相互作用，因而不会在血流中活化。基于此，确认了H12-PEG(PEG)小囊泡几乎不与休眠的血小板凝集。

表2

PAC-1与血小板的结合

样品	PAC-1结合(％)	小囊泡结合(％)
			PBSPEG小囊泡H12-PEG(PEG)小囊泡	3.8±0.93.4±0.33.7±0.4	-1.3±0.71.4±0.6

工业实用性

由于偶联合成的包含于纤维蛋白原GPIIb/IIIa识别区域的十二肽所制备的缀合物特异性地仅与充分活化的GPIIb/IIIa结合，它不诱导由血管中休眠血小板凝结所造成的血栓形成或血管内血凝固。另外，由于在本发明肽缀合物中没用到人源成分，而且在此使用这些成分的合成形式和重组形式，避免了感染风险。因此，本发明的肽缀合物用作血小板替代物。

                    序列表

<110>学校法人庆应义塾

<110>三菱制药株式会社

<120>肽缀合物

<130>GP04-1003

<150>JP P2003-029847

<151>2003-02-06

<150>JP P2004-017046

<151>2004-01-26

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<223>基于GP IIb/IIIa设计的肽

<400>1

His His Leu Gly Gly Ala Lys Gln Ala Gly Asp Val

1               5                   10

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<223>基于GP IIb/IIIa设计的肽

<400>1

Cys Gly GlyArg Gly Asp Phe

1                  5

Claims (21)

1，一种缀合物，具有以下通式：

(微粒)-[(接头)

-Cys-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val-COOH]n，

或以下通式：

(微粒)-[(间隔基)-(接头)

-Cys-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val-COOH]n，

其中n是整数。

2，根据权利要求1所述的缀合物，其中微粒选自由小囊泡、胶粒、蛋白质多聚物和合成聚合物组成的组。

3，根据权利要求1或2所述的缀合物，其中微粒选自由小囊泡、重组白蛋白多聚物、乳胶粒和生物可降解的聚合物所组成的组。

4，根据权利要求1-3之任一所述的缀合物，其中微粒具有50nm或更大的颗粒直径。

5，根据权利要求1-4之任一所述的缀合物，其中微粒具有10μm或更小的颗粒直径。

6，根据权利要求1-5之任一所述的缀合物，其中接头为化合物，该化合物一个末端与SH基团反应，而且另一个末端与OH基团、COOH基团和NH₂基团之任一反应。

7，根据权利要求1-6之任一所述的缀合物，其中接头选自由二羧酸、氨基羧酸、双马来酰亚胺化合物、双卤羰基化合物、卤羰基马来酰亚胺化合物、二硫代马来酰亚胺、二硫代羧酸和马来酰亚胺羧酸所组成的组。

8，根据权利要求1-7之任一所述的缀合物，其中接头选自由二羧酸、氨基羧酸、双马来酰亚胺化合物、双卤羰基化合物、卤羰基马来酰亚胺化合物、二硫代马来酰亚胺、二硫代羧酸和马来酰亚胺羧酸所组成的组，而且其具有C2-10的碳链。

9，根据权利要求1-8之任一所述的缀合物，其中间隔基是选自由聚乙二醇、多肽、多糖、白蛋白和抗体所组成的组的一个或至少两个组合。

10，根据权利要求1-9之任一所述的缀合物，其中微粒是乳胶粒，间隔基是白蛋白，而且接头是二硫代羧酸。

11，根据权利要求1-9之任一所述的缀合物，其中微粒是小囊泡，间隔基是聚乙二醇，而且接头是马来酰亚胺羧酸。

12，包含根据权利要求1-11之任一所述的缀合物的血小板替代物。

13，控制血小板凝集的方法，其包括使用根据权利要求1-11之任一所述的缀合物。

14，生产根据权利要求1-11之任一所述的缀合物的方法。

15，包含根据权利要求1-11之任一所述的缀合物的诊断剂或试剂。

16，根据权利要求15所述的诊断剂或试剂，其是血小板功能紊乱的诊断剂、生物或医学试剂、血小板凝集抑制剂、筛选抗血栓剂的试剂、或检查血管损伤区域和血栓形成区域的诊断或治疗剂。

17，包含根据权利要求1-11之任一所述的缀合物的药物载体。

18，包含根据权利要求17所述的缀合物的药物载体，其中药物选自由止血剂、血管收缩剂、抗炎剂、抗血凝结剂和抗血小板剂所组成的组。

19，包含根据权利要求1-11之任一所述的缀合物的药物组合物。

20，包含根据权利要求19所述的缀合物的药物组合物，其包含的药物选自由止血剂、血管收缩剂、抗炎剂、抗血凝结剂和抗血小板剂所组成的组。

21，根据权利要求19或20所述的药物组合物，其用于预防或治疗血管失调、血管损伤和血栓症。

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