CN104548069B - 具有缓释性能的多肽‑降钙素超分子聚集体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，提供了一种具有缓释性能的多肽‑降钙素超分子聚集体，该聚集体由降钙素和两亲性多肽组成，降钙素与两亲性多肽之间通过亲疏水相互作用及正负电荷相互作用聚集成纳米级颗粒。其制备方法如下：（1）将降钙素和两亲性多肽溶解于pH值为5～10的溶剂中形成混合液；（2）将所述混合液在5℃～60℃静置1h～300h或者搅拌1h～300h即形成多肽‑降钙素超分子聚集体。本发明所述超分子聚集体能缓慢释放出降钙素，能大幅度延长单次用药后体内血钙浓度处于正常水平的时间，从而降低注射频率。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及一种具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体及其制备方法。
背景技术
骨骼是人体的重要组成部分，它构成了人体的支架，起保护、支持和运动的作用，还与机体的钙磷等矿质元素的代谢密切相关。人的一生中，骨骼不断地进行着新陈代谢，骨骼代谢包括骨的形成和骨的重吸收两个方面，正常情况下，它们之间处于一种动态平衡状态，但外界原因或体内激素分泌失调会导致骨骼代谢失常，从而引发骨质疏松症、畸形性骨炎等疾病。随着我国老年人口的增加，骨质疏松症的发病率处于上升趋势，在我国乃至全球都是一个值得关注的健康问题。
降钙素（calcitonin，CT）为含有32个氨基酸的直线型多肽类激素，能增加骨钙量和降低血液中的钙浓度。目前用于治疗畸形性骨炎及骨质疏松症，尤其是绝经后妇女骨质疏松症的药物多为降钙素类药物，且需要长期用药。
目前市面上降钙素的剂型主要为注射液，其主要成分是降钙素单体，给药方式为皮下注射，但由于降钙素是多肽类药物，其半衰期非常短，常用的注射针剂一般进行皮下注射后1小时就能达到血浆最高浓度，在注射3小时后几乎代谢完全，因而注射频率很高，而频繁的注射会给病人带来极大的痛苦和不便。鉴于上述情况，研制具有良好缓释性能的降钙素剂型是目前国内外共同关注的课题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体及其制备方法，所述超分子聚集体具有良好的缓释性能，能大幅度延长单次用药后体内血钙浓度处于正常水平的时间，从而降低注射频率；所述方法反应条件温和，不会破坏降钙素的生物活性。
本发明所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体，由降钙素和两亲性多肽组成，降钙素与两亲性多肽之间通过亲疏水相互作用及正负电荷相互作用聚集成纳米级颗粒。
上述超分子聚集体的流体力学直径为50nm～800nm。
上述超分子聚集体中，所述降钙素为鲑鱼降钙素或人降钙素。
上述超分子聚集体中，所述两亲性多肽是指一端具有疏水性另一端具有亲水性的多肽，所述两亲性多肽的氨基酸残基为2～30个。
上述超分子聚集体中，所述两亲性多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4或SEQ ID No：5所示，或者所述两亲性多肽的氨基酸序列为Asp-Phe或者Asp-Asp-Phe。
本发明还提供了一种具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的制备方法，工艺步骤如下：
（1）将降钙素及两亲性多肽溶解于pH值为5～10的溶剂中形成混合液，所述降钙素在混合液中的浓度为0.01mg/mL～400mg/mL，所述两亲性多肽在混合液中的浓度为0.01mg/mL～400mg/mL；
（2）将步骤（1）形成的混合液在5℃～60℃静置1h～300h或者搅拌1h～300h即形成多肽-降钙素超分子聚集体，将多肽-降钙素超分子聚集体保存在反应液中备用；或者将多肽-降钙素超分子聚集体与反应液分离，并用蒸馏水洗涤后冷冻干燥。
上述方法中，所述降钙素在混合液中的浓度优选为0.34mg/mL～34mg/mL，所述两亲性多肽在混合液中的浓度优选为0.28mg/mL～97mg/mL。
上述方法中，所述pH值为5～10的溶剂为pH值为7.19～9.10的tris-HCl缓冲盐溶液，pH值为5～6的醋酸钠缓冲液，pH值为5～8的磷酸盐缓冲液，pH值为5～6的柠檬酸缓冲液中的任一种。
上述方法中，步骤（2）所述搅拌的速度为100r/min～2000r/min。
上述方法中，两亲性多肽均通过多肽固相合成法合成，具体合成方法可参见HAYDNL.BALL and PAOLO MASCAGNI，Chemical synthesis and purification of proteins:amethodology，Int.J.Pepride Proteitl Rrs.48,1996,31-47。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了多肽-降钙素超分子聚集体这种新的药物，体外模拟释放实验表明，该聚集体能缓慢释放出降钙素，动物实验表明，注射本发明所述聚集体后，动物体内的血钙浓度至少能在24h内维持在较低水平，与现有技术相比，大大延长了单次用药后体内血钙浓度处于正常水平的时间，缓释效果优良（见实施例10、11）。
2、本发明所述多肽-降钙素超分子聚集体由可生物降解的多肽和降钙素通过亲疏水相互作用及正负电荷相互作用聚集形成超分子聚集体，因而其生物相容性及血液相容性好，对机体无毒副作用。
3、本发明所述多肽-降钙素超分子聚集体的流体力学直径在1微米以下，同一多肽与降钙素形成的聚集体的粒径分布窄，因而能够保证所述聚集体能在血液中顺利循环。
4、本发明所述方法的工艺条件十分温和，不会破坏降钙素本身的结构，因而能够保证降钙素的生物活性。
5、本发明所述方法的工艺简单，易于实现工业化生产。
附图说明
图1为本发明所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的形成过程示意图，图中，1—降钙素，2—两亲性多肽，3—多肽-降钙素超分子聚集体。
图2为具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的透射电子显微镜照片，其中，图（A）、（B）、（C）、（D）分别为实施例1、2、3、4制备的超分子聚集体的透射电子显微镜照片。
图3为具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的zeta粒径测试结果，其中，图（A）、（B）、（C）、（D）分别为实施例1、2、3、4制备的超分子聚集体的zeta粒径测试结果。
图4为实施例10中各组SD大鼠体内24小时内的血钙控制曲线。
图5为实施例1制备的多肽-降钙素超分子聚集体的体外模拟释放曲线。
具体实施方式
以下通过实施例结合附图对本发明所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体及其制备方法作进一步说明。下述各实施例中，所述人降钙素、鲑鱼降钙素均从sigma公司购买；所述注射用鲑鱼降钙素由湘北威尔曼制药股份有限公司生产；合成所述两亲性多肽所需氨基酸均从吉尔生化（上海）有限公司购买；其他试剂均购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；所述场发射透射电子显微镜由FEI公司生产，型号为Tecnai G2 F20 S-TWIN；所述zeta粒度仪由英国马尔文生产。
下述各实施例中所使用的两亲性多肽均通过多肽固相合成法合成，方法如下：
（1）称取0.5mmol的2-氯-3-苯甲基氯树脂加入固相合成器中，用二氯甲烷溶胀5min后将液体压除干净；
（2）根据目标多肽的氨基酸序列，将0.6mmol第一个Fmoc保护的氨基酸溶解在2mL无水二氯甲烷中，加入0.6mmol的N,N-二异丙基乙基胺，然后转移到上述固相合成器中，再补加0.6mmolN,N-二异丙基乙基胺，在室温、氮气保护下反应1h；
（3）将固相合成器中液体除净，然后用5mL无水二氯甲烷洗涤，加入体积百分数为10%的甲醇3mL，在室温、氮气保护下反应10min；
（4）将固相合成器中液体压净，用5mL无水二氯甲烷洗涤，再用5mL N,N－二甲基甲酰胺洗涤，加入含20%（体积百分数）哌啶的N,N－二甲基甲酰胺溶液5mL，在室温、氮气保护下反应30min，再用5mL含20%（体积百分数）哌啶的N,N－二甲基甲酰胺溶液洗涤，然后用5mLN,N－二甲基甲酰胺洗涤；
（5）根据目标多肽的氨基酸序列，取第二个Fmoc保护的氨基酸1.5mmol、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯1.5mmol、N,N-二异丙基乙基胺3mmol和无水N,N－二甲基甲酰胺3mL配制成溶液，把配好的溶液加入到上述固相合成器中，在室温、氮气保护下反应2h；
（6）根据目标多肽的氨基酸序列，重复步骤（4）和（5）的方法依次加入Fmoc保护的氨基酸；然后用N,N－二甲基甲酰胺洗涤，无水二氯甲烷洗涤；
（7）将三氟乙酸与无水二氯甲烷配制成三氟乙酸体积百分比为1%的三氟乙酸溶液，每次取该三氟乙酸溶液3mL加入到上述固相合成器中，共加十次，每次反应1min，把产物从2-氯三苯甲基氯树脂上切下，浓缩，加入两次甲苯以除去残留的三氟乙酸，用油泵抽干，得到粗品，之后用HPLC分离提纯，即得目标两亲性多肽。
实施例1
图1为本发明所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的形成过程示意图，本实施例的工艺步骤如下：
（1）将鲑鱼降钙素8g、氨基酸序列为Asp-Phe（天冬氨酸-苯丙氨酸）的两亲性多肽4g加入已装有磁力搅拌子的50mL圆底烧瓶中，然后向其中加入pH=7.0的磷酸钠缓冲液20mL形成混合液，所述鲑鱼降钙素在混合液中的浓度为400mg/mL，所述两亲性多肽在混合液中的浓度为200mg/mL；
（2）将所述装有混合液的圆底烧瓶放入恒温磁力搅拌器上的水浴中，水浴温度为60℃，然后以180r/min的转速搅拌0.5h，搅拌时间届满后，得到超分子聚集体，取反应完毕的胶体溶液（即含多肽-降钙素超分子聚集体的反应液）5mL于4℃密封保存备用，将剩余的胶体溶液采用冷冻离心机在5℃、10000r/min的转速下冷冻离心20min，弃掉离心所得上清液，将所得沉淀用蒸馏水洗涤3次，然后采用冷冻干燥机冻干成粉末，并将所得粉末于-20℃密封保存。
用移液枪取4℃密封避光保存备用的胶体溶液滴加在铜网格上，然后用磷钨酸盐染色3min、烘干，再在场发射透射电子显微镜下观察所述超分子聚集体的形态，结果如图2（A）所示。
取4℃密封避光保存备用的胶体溶液，采用zeta粒度仪测试zeta粒径，结果如图3（A）所示，聚集体的平均zeta粒径为180nm，并且粒径分布窄，因而能够保证所述聚集体能在血液中顺利循环。
实施例2
图1为本发明所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的形成过程示意图，本实施例的工艺步骤如下：
（1）将鲑鱼降钙素680mg、氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：5所示的两亲性多肽1.94g加入已装有磁力搅拌子的50mL圆底烧瓶中，然后向其中加入pH=5.0的磷酸钠缓冲液20mL形成混合液，所述鲑鱼降钙素在混合液中的浓度为34mg/mL，所述两亲性多肽在混合液中的浓度为97mg/mL；
（2）将所述装有混合液的圆底烧瓶放入恒温磁力搅拌器上的水浴中，水浴温度为5℃，然后以2000r/min的转速搅拌1h，搅拌时间届满后，得到超分子聚集体，取反应完毕的胶体溶液（即含多肽-降钙素超分子聚集体的反应液）5mL于4℃密封保存备用，将剩余的胶体溶液采用冷冻离心机在5℃、10000r/min的转速下冷冻离心20min，弃掉离心所得上清液，将所得沉淀用蒸馏水洗涤2次，然后采用冷冻干燥机冻干成粉末，并将所得粉末于-20℃密封保存。
用移液枪取4℃密封避光保存备用的胶体溶液滴加在铜网格上，然后用磷钨酸盐染色3min、烘干，再在场发射透射电子显微镜下观察所述超分子聚集体的形态，结果如图2（B）所示；
取4℃密封避光保存备用的胶体溶液，采用zeta粒度仪测试zeta粒径，结果如图3（B）所示，聚集体的平均zeta粒径为238nm，并且粒径分布窄，因而能够保证所述聚集体能在血液中顺利循环。
实施例3
图1为本发明所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的形成过程示意图，本实施例的工艺步骤如下：
（1）将鲑鱼降钙素0.2g、氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示的两亲性多肽0.2g加入已装有磁力搅拌子的50mL圆底烧瓶中，然后向其中加入pH=8.0的磷酸钠缓冲液20mL形成混合液，所述鲑鱼降钙素在混合液中的浓度为10mg/mL，所述两亲性多肽在混合液中的浓度为10mg/mL；
（2）将所述装有混合液的圆底烧瓶放入恒温磁力搅拌器上的水浴中，水浴温度为25℃，然后以180r/min的转速搅拌24h，搅拌时间届满后，得到超分子聚集体，取反应完毕的胶体溶液（即含多肽-降钙素超分子聚集体的反应液）5mL于4℃密封保存备用，将剩余的胶体溶液采用冷冻离心机在5℃、10000r/min的转速下冷冻离心20min，弃掉离心所得上清液，将所得沉淀用蒸馏水洗涤2次，然后采用冷冻干燥机冻干成粉末，并将所得粉末于-20℃密封保存。
用移液枪取4℃密封避光保存备用的胶体溶液滴加在铜网格上，然后用磷钨酸盐染色3min、烘干，再在场发射透射电子显微镜下观察所述多肽-降钙素超分子聚集体的形态，结果如图2（C）所示；
取4℃密封避光保存备用的胶体溶液，采用zeta粒度仪测试zeta粒径，结果如图3（C）所示，聚集体的平均zeta粒径为410nm，并且粒径分布窄，因而能够保证所述聚集体能在血液中顺利循环。
实施例4
图1为本发明所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的形成过程示意图，本实施例的工艺步骤如下：
（1）将人降钙素6.8mg、氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：4所示的两亲性多肽5.6mg加入50mL圆底烧瓶中，然后向其中加入pH=7.9的tris-HCl缓冲液20mL形成混合液，所述人降钙素在混合液中的浓度为0.34mg/mL，所述两亲性多肽在混合液中的浓度为0.28mg/mL；
（2）将所述装有混合液的圆底烧瓶放入恒温磁力搅拌器上的水浴中，水浴温度为5℃，然后静置300h，静置时间届满后，得到超分子聚集体，取反应完毕的胶体溶液（即含多肽-降钙素超分子聚集体的反应液）5mL于4℃密封保存备用，将剩余的胶体溶液采用冷冻离心机在5℃、10000r/min的转速下冷冻离心20min，弃掉离心所得上清液，将所得沉淀用蒸馏水洗涤2次，然后采用冷冻干燥机冻干成粉末，并将所得粉末于-20℃密封保存。
用移液枪取4℃密封避光保存备用的胶体溶液滴加在铜网格上，然后用磷钨酸盐染色3min、烘干，再在场发射透射电子显微镜下观察所述超分子聚集体的形态，结果如图2（D）所示；
取4℃密封避光保存备用的胶体溶液，采用zeta粒度仪测试zeta粒径，结果如图3（D）所示，聚集体的平均zeta粒径为570nm，并且粒径分布窄，因而能够保证所述聚集体能在血液中顺利循环。
实施例5
图1为本发明所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的形成过程示意图，本实施例的工艺步骤如下：
（1）将鲑鱼降钙素13.6mg、氨基酸序列为Asp-Phe（天冬氨酸-苯丙氨酸）的两亲性多肽11.2mg加入已装有磁力搅拌子的50mL圆底烧瓶中，然后向其中加入pH=9.1的tris-HCl缓冲液20mL形成混合液，所述鲑鱼降钙素在混合液中的浓度为0.68mg/mL，所述两亲性多肽在混合液中的浓度为0.56mg/mL；
（2）将所述装有混合液的圆底烧瓶放入恒温磁力搅拌器上的水浴中，水浴温度为37℃，然后以180r/min的转速搅拌72h，搅拌时间届满后，得到超分子聚集体，取反应完毕的胶体溶液（即含多肽-降钙素超分子聚集体的反应液）5mL于4℃密封保存备用，将剩余的胶体溶液采用冷冻离心机在5℃、10000r/min的转速下冷冻离心20min，弃掉离心所得上清液，将所得沉淀用蒸馏水洗涤3次，然后采用冷冻干燥机冻干成粉末，并将所得粉末于-20℃密封保存。
实施例6
图1为本发明所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的形成过程示意图，本实施例的工艺步骤如下：
（1）将鲑鱼降钙素6.8mg、氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：2所示的两亲性多肽9.7mg加入已装有磁力搅拌子的50mL圆底烧瓶中，然后向其中加入pH=5.0的醋酸钠缓冲液20mL形成混合液，所述鲑鱼降钙素在混合液中的浓度为0.34mg/mL，所述两亲性多肽在混合液中的浓度为0.485mg/mL；
（2）将所述装有混合液的圆底烧瓶放入恒温磁力搅拌器上的水浴中，水浴温度为50℃，然后以240r/min的转速搅拌180h，搅拌时间届满后，得到超分子聚集体，取反应完毕的胶体溶液（即含多肽-降钙素超分子聚集体的反应液）5mL于4℃密封保存备用，将剩余的胶体溶液采用冷冻离心机在5℃、10000r/min的转速下冷冻离心20min，弃掉离心所得上清液，将所得沉淀用蒸馏水洗涤3次，然后采用冷冻干燥机冻干成粉末，并将所得粉末于-20℃密封保存。
实施例7
图1为本发明所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的形成过程示意图，本实施例的工艺步骤如下：
（1）将鲑鱼降钙素6.8mg、氨基酸序列为Asp-Asp-Phe（天冬氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸）的两亲性多肽9.7mg加入已装有磁力搅拌子的50mL圆底烧瓶中，然后向其中加入pH=6.0的醋酸钠缓冲液20mL形成混合液，所述鲑鱼降钙素在混合液中的浓度为0.34mg/mL，所述两亲性多肽在混合液中的浓度为0.485mg/mL；
（2）将所述装有混合液的圆底烧瓶放入恒温磁力搅拌器上的水浴中，水浴温度为50℃，然后以240r/min的转速搅拌180h，搅拌时间届满后，得到超分子聚集体，取反应完毕的胶体溶液（即含多肽-降钙素超分子聚集体的反应液）5mL于4℃密封保存备用，将剩余的胶体溶液采用冷冻离心机在5℃、10000r/min的转速下冷冻离心20min，弃掉离心所得上清液，将所得沉淀用蒸馏水洗涤3次，然后采用冷冻干燥机冻干成粉末，并将所得粉末于-20℃密封保存。
实施例8
图1为本发明所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的形成过程示意图，本实施例的工艺步骤如下：
（1）将人降钙素40mg、氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：2所示的两亲性多肽97mg加入已装有磁力搅拌子的50mL圆底烧瓶中，然后向其中加入pH=5.0的柠檬酸缓冲液20mL形成混合液，所述人降钙素在混合液中的浓度为2mg/mL，所述两亲性多肽在混合液中的浓度4.85mg/mL；
（2）将所述装有混合液的圆底烧瓶放入恒温磁力搅拌器上的水浴中，水浴温度为17℃，然后以680r/min的转速搅拌36h，搅拌时间届满后，得到超分子聚集体，取反应完毕的胶体溶液（即含多肽-降钙素超分子聚集体的反应液）5mL于4℃密封保存备用，将剩余的胶体溶液采用冷冻离心机在5℃、10000r/min的转速下冷冻离心20min，弃掉离心所得上清液，将所得沉淀用蒸馏水洗涤3次，然后采用冷冻干燥机冻干成粉末，并将所得粉末于-20℃密封保存。
实施例9
图1为本发明所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的形成过程示意图，本实施例的工艺步骤如下：
（1）将鲑鱼降钙素17mg、氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：3所示的两亲性多肽18mg加入已装有磁力搅拌子的50mL圆底烧瓶中，然后向其中加入pH=6.0的柠檬酸缓冲液20mL形成混合液，所述鲑鱼降钙素在混合液中的浓度为0.85mg/mL，所述两亲性多肽在混合液中的浓度0.9mg/mL；
（2）将所述装有混合液的圆底烧瓶放入恒温磁力搅拌器上的水浴中，水浴温度为40℃，然后以100r/min的转速搅拌10h，搅拌时间届满后，得到超分子聚集体，取反应完毕的胶体溶液（即含多肽-降钙素超分子聚集体的反应液）5mL于4℃密封保存备用，将剩余的胶体溶液采用冷冻离心机在5℃、10000r/min的转速下冷冻离心20min，弃掉离心所得上清液，将所得沉淀用蒸馏水洗涤3次，然后采用冷冻干燥机冻干成粉末，并将所得粉末于-20℃密封保存。
实施例10
实验动物及分组：8周大的健康SD大鼠24只，体重210～240g，购自四川大学华西动物实验中心；将所述大鼠随机分为四组，每组6只。
给药方式及剂量：根据大鼠的体重以200μg/kg的剂量腹部皮下注射给药。
根据每组中各只大鼠的体重，按照注射剂量分别将实施例1、实施例4制备的超分子聚集体胶体溶液以及注射用鲑鱼降钙素用PBS缓冲液（PBS缓冲液的配方：NaCl 8g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.63g、KH2PO4 0.24g，调pH至7.4，并用蒸馏水稀释至1000mL）配制成注射液0.4mL，注射前将大鼠禁食12h，禁食期间可自由取水。
第一组为空白对照组，每只大鼠注射0.4mL上述PBS缓冲液；
第二组注射以实施例1制备的超分子聚集体配制的注射液，每只大鼠注射0.4mL；
第三组注射以实施例4制备的超分子聚集体配制的注射液，每只大鼠注射0.4mL；
第四组注射以注射用鲑鱼降钙素配制的注射液，每只大鼠注射0.4mL。
注射前分别用电子称称取大鼠的体重并做好记录，从大鼠的尾静脉取血0.4mL；分别于注射给药后1h、3h及24h用2mL的注射器（用肝素钠浸润）从大鼠的尾静脉取血0.4mL于1.5mL的聚丙烯管（PP管）中，半小时内，于4℃、10000rpm的转速下离心30min，吸取上清液置于冰箱下层保存。PP管用肝素钠润洗后烘干再用，需提前一天准备。用钙离子比色生物试剂盒分别测试所得血样中的血钙浓度，检测波长为570nm，检测仪器为酶标仪。各组大鼠体内的血钙浓度随时间的变化曲线如图4所示，由图4可知，降钙素与两亲性多肽形成的超分子聚集体比降钙素单体具有更好的降血钙作用，其降血钙能力比降钙素单体强；降钙素通过聚集体的解离缓慢释放出降钙素单体，因此注射所述超分子聚集体后，在本实验的24h内，大鼠体内的血钙浓度能够维持较低水平，从而达到降血钙的目的，由此说明实施例1及实施例4制备的超分子聚集体能在较长时间范围内维持体内血钙浓度在较低水平；由图4还可以看出，实施例1及实施例4制备的超分子聚集体具有良好的生物活性，其降血钙的能力并没有因为形成降钙素聚集体而下降。
实施例11
本实施例对本发明所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体进行体外模拟释放实验。
取实施例1制备的超分子聚集体粉末3mg加入1mL缓冲液中混合均匀，然后装入截留分子量为5000道尔顿的透析袋中，将透析袋放入装有34mL缓冲液的烧杯中，烧杯的容量为50mL，于37℃、振荡下进行体外释放实验，分别于第1h、2h、3h、5h、7h、9h、11h、13h、21h、26h、31h、36h及第50h从烧杯中取出3mL溶液，然后再用移液枪向烧杯中滴加3mL新鲜的缓冲液。所述缓冲液为含有0.01%w/v叠氮钠的5mM pH为7.4的磷酸钠缓冲液，加入叠氮钠的目的是防止细菌生长。通过HPLC定量测试取出的样品中降钙素的浓度。
实施例1制备的超分子聚集体的体外模拟释放曲线如图5所示，从图5可知，实施例1制备的超分子聚集体在测试的50h内缓慢释放，并且在体外模拟释放实验中未观察到降钙素的暴释或突释，说明实施例1制备的超分子聚集体具有良好的缓释性能，能提高降钙素的生物利用度，克服现有降钙素注射剂频繁用药的缺陷；同时，可避免由于降钙素的突释导致体内血药浓度接近或超过中毒水平，产生明显不良反应，能有效降低用药风险。
Claims (5)
1.具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体，其特征在于由降钙素和两亲性多肽组成，降钙素与两亲性多肽之间通过亲疏水相互作用及正负电荷相互作用聚集成纳米级颗粒，所述降钙素为鲑鱼降钙素或人降钙素，所述两亲性多肽的氨基酸序列如序列表中SEQID No：4所示，或者所述两亲性多肽的氨基酸序列为Asp-Phe，所述纳米级颗粒的流体力学直径为50nm～800nm。
2.具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的制备方法，其特征在于工艺步骤如下：
(1)将降钙素和两亲性多肽溶解于pH值为5～10的溶剂中形成混合液，所述降钙素在混合液中的浓度为0.01mg/mL～400mg/mL，所述两亲性多肽在混合液中的浓度为0.01mg/mL～400mg/mL；所述降钙素为鲑鱼降钙素或人降钙素，所述两亲性多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：4所示，或者所述两亲性多肽的氨基酸序列为Asp-Phe；
(2)将步骤(1)形成的混合液在5℃～60℃静置1h～300h或者搅拌1h～300h即形成多肽-降钙素超分子聚集体，将多肽-降钙素超分子聚集体保存在反应液中备用；或者将多肽-降钙素超分子聚集体与反应液分离，并用蒸馏水洗涤后冷冻干燥。
3.根据权利要求2所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的制备方法，其特征在于所述降钙素在混合液中的浓度为0.34mg/mL～34mg/mL，所述两亲性多肽在混合液中的浓度为0.28mg/mL～97mg/mL。
4.根据权利要求2或3所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述溶剂是pH值为7～10的tris-HCl缓冲盐溶液、pH值为5～6的醋酸钠缓冲液、pH值为5～8的磷酸盐缓冲液、pH值为5～6的柠檬酸缓冲液中的任一种。
5.根据权利要求2或3所述具有缓释性能的多肽-降钙素超分子聚集体的制备方法，其特征在于步骤(2)中对混合液进行搅拌的速度为100r/min～2000r/min。
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