CN1839799A - 一种凝集素修饰的经鼻入脑的药物传递系统 - Google Patents
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Abstract
本发明属化学制药领域，涉及药物传递系统，具体涉及一种凝集素修饰的经鼻入脑的载药传递系统。本发明由药物载体纳米粒、囊泡或脂质体的表面修饰凝集素构成。本传递系统鼻腔给药后可延长载药系统在鼻粘膜上的滞留时间，介导粘膜对载药系统的吸收摄取，选择性地递送小分子化学药物、诊断药物、多肽蛋白药物以及基因药物进入脑内，有利于提高药物的入脑量，相应减少外周组织中的药量，在增强中枢疾病预防、治疗和诊断效果的同时，降低全身性毒副作用。
Description
技术领域
本发明属化学制药领域，涉及药物传递系统，具体涉及一种凝集素修饰的经鼻入脑的载药传递系统。
技术背景
血脑屏障(BBB)是存在于血液和脑组织之间的一层屏障系统，由极化的脑毛细血管内皮细胞通过复杂的细胞间紧密连接构成，它对维系脑内环境的相对稳定十分重要，但同时也是药物进入脑组织发挥预防、治疗和诊断作用的主要屏障。
为了实现药物的脑内递释，多种脑内靶向递药策略得到应用，如药物的酯化修饰和化学传递系统，载体、受体和吸附介导的脑内靶向递药系统，鼻腔给药等。其中唯有鼻腔给药是以非侵入性的给药方式提高药物的脑内递释，因其安全、有效，已经成为脑内靶向给药研究的热点之一。鼻腔与脑组织间存在解剖学上的直接联系：鼻腔的嗅粘膜上皮含双极嗅细胞，由其形成的嗅神经穿过筛板进入中枢神经系统的嗅球；而围绕嗅神经束的间质液与蛛网膜下隙的脑脊液(CSF)相通，因此，鼻腔给药后药物有可能经嗅粘膜吸收进入嗅球或CSF，从而绕过BBB直接转运入脑，发挥中枢预防和治疗作用。然而，药物经鼻腔途径转运入脑的绝对量仍然较低，特别对于一些具有中枢治疗活性的多肽蛋白类药物、基因药物，这是由于药物本身穿透粘膜的能力较差，且易受鼻腔中酶系统的降解和鼻纤毛的清除，入脑的药量往往仅占给药剂量的0.01-1％，不能达到有效的临床治疗效果。
药物传递系统如纳米粒、囊泡、脂质体等的应用为各种药物，特别是多肽蛋白类药物、基因药物的鼻腔给药提供了有效的载体，其不但能够有效减少药物受酶的降解，而且有望通过载体的跨膜转运或细胞旁转运增加透膜性差的药物的粘膜吸收。然而，普通药物载体鼻腔给药后都面临一个问题，那就是鼻纤毛的清除作用。鼻纤毛对鼻粘膜表面物质的清除速率为3～25mm/min。普通的粉末或溶液剂在鼻腔中的清除半衰期为15～20min，普通药物载体在鼻腔极可能未被摄取就被清除，因而不能被完全、有效地吸收。所以，近年来具有生物粘附性的材料如壳聚糖在鼻腔中的应用受到重视。但是，这些生物粘附性材料的粘附功能往往基于其与鼻腔中粘液的相互作用如静电相互作用，这种作用往往不具特异性及部位的选择性，无法选择性增加介导药物入脑的嗅粘膜对药物载体的吸收。同时，由于鼻腔中粘液的更新速度很快，通常，一个小时内就有多次更新，因而，这种基于粘液的生物粘附作用而产生的延长给药系统在鼻腔中滞留时间的效果并不十分理想。
延长给药系统在粘膜上的滞留时间，并选择性地促进其吸收的一个有效方法就是表面修饰具有特异性靶向递送功能的配体。
近年来，在口服给药系统中，已经开始基于受体-配体特异性结合的第二代生物粘附性材料-凝集素的研究。研究发现，将凝集素共价结合于脂质体或纳米粒的表面，通过凝集素与小肠上皮细胞上特异糖基的结合，可以介导细胞对药物载体的胞吞转运，能够提高递药载体口服给药后的胃肠道粘膜吸收。
鼻腔粘膜上皮细胞表面也存在多种糖基，和胃肠道粘膜不同的是鼻腔粘膜通常分为两部分：呼吸部粘膜和嗅粘膜。药物通过呼吸部粘膜吸收进入体循环，通过嗅粘膜吸收可以直接进入脑组织。如能采用特异靶向结合嗅粘膜的凝集素修饰载药系统，将有望选择性地增加药物的脑内转运，同时减少外周吸收，从而提高药物对中枢疾病的预防、治疗和诊断效果，降低全身性的毒副作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够通过无创性鼻腔给药途径，增加脑内递送药物目的的药物传递系统。具体涉及一种凝集素修饰的经鼻入脑的药物传递系统。
通常，药物传递系统是指能够包载并输送药物的复合体。本发明所涉及的药物传递系统，是以药剂学手段制备的纳米粒、脂质体或囊泡作为药物载体，表面修饰以凝集素的复合体。
本发明的特点是利用呼吸部粘膜和嗅粘膜表面糖基种类和数量的不同，选择更能与嗅粘膜结合的凝集素修饰载药系统，从而选择性地延长载药系统在鼻粘膜，尤其是嗅粘膜上的停留时间，更多地介导嗅粘膜对载药系统的胞吞吸收，选择性地增加药物的脑内转运；同时减少药物的外周吸收，从而提高药物对中枢疾病的预防、治疗和诊断效果，降低全身性的毒副作用。
本发明所述的凝集素修饰的药物传递系统，通过下述方法制备：
将凝集素修饰于药物载体的表面，凝集素通过共价连接或非共价连接的方式与药物载体连接。所述的凝集素的表面修饰方式是：在药物载体制备完成后进行或将凝集素先与高分子材料共价连接后制备药物载体。
本发明药物传递系统经鼻腔给药后能够靶向传递、增加小分子化学药物、诊断药物、多肽蛋白药物以及基因药物传递入脑，在提高中枢预防、治疗和诊断效果的同时减少外周系统的毒副作用。
本发明所述的凝集素修饰的经鼻入脑药物传递系统，其特征在于所述的凝集素选自麦胚凝集素，荆豆凝集素-I、II、III，双花扁豆凝集素，刀豆凝集素，花生凝集素，大豆凝集素，番茄凝集素，菜豆凝集素或槲寄生凝集素中的一种或几种。其中优选凝集素为麦胚凝集素，荆豆凝集素-I或双花扁豆凝集素。
鼻腔粘膜上皮细胞表面表达多种糖基，如α-D-半乳糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-D-葡萄糖胺、唾液酸、L-岩藻糖和甘露糖等。其中，嗅粘膜表面更集中地表达N-乙酰-D-葡萄糖胺、L-岩藻糖和N-乙酰-D-半乳糖胺等。本发明所述的载药系统经凝集素修饰后与上述糖基特异性结合，能延长其在嗅粘膜的滞留时间，进而诱导嗅粘膜摄取载药系统，增加药物吸收进入脑内，从而表现出脑内靶向递送药物的能力。
本发明所述的药物载体纳米粒选用高分子材料聚酯类生物降解性材料及其衍生物制备。优选聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物(PEG-PLA)和功能性聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物。其中聚乙二醇部分为单甲氧基聚乙二醇；功能性聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物中的功能性基团是马来酰亚胺基、巯基、酰肼基、生物素或亲和素中的一种。或选用氰基丙烯酸聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物[Poly(PEGCA-co-HDCA)]和氰基丙烯酸功能性聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物。其中功能性聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物中聚乙二醇一端的功能性基团是马来酰亚胺基、巯基、酰肼基、生物素或亲和素中的一种。制备纳米粒的高分子材料还可采用乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)或聚乳酸(PLA)。
本发明所述的纳米粒的制备方法是将PEG-PLA和功能性聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物按1000∶1-1∶1混合，或将Poly(PEGCA-co-HDCA)和氰基丙烯酸功能性聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物1000∶1-1∶1混合，按下述方法中的一种或几种制备纳米粒，所述方法包括：以水相作为连续相的乳化溶剂蒸发法、以油相作为连续相的乳化溶剂蒸发法、界面聚合法、溶剂沉淀法、溶剂蒸发法、单体聚合法和水溶性聚合物乳化交联法。其中乳化法制备的乳滴是单乳或复乳。所述乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乳酸还采用乳化聚合法、界面聚合法、溶剂沉淀法、溶剂蒸发法、单体聚合法或乳化交联法制备包载药物的纳米粒。
制备本发明所述的药物载体囊泡，材料选用：聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物(PEG-PLA)和功能性聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物；聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物(PEG-PCL)和功能性聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物。其中，功能性聚乙二醇部分的功能性基团是马来酰亚胺基、巯基、酰肼基、羧基、生物素或亲和素中的一种。
所述囊泡的制备方法是：将PEG-PLA和功能性聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物按1000∶1-1∶1混合，或将PEG-PCL和功能性聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物混合，按薄膜水化法、注入法、溶剂非溶剂法或聚合物直接水化法制备。
上述聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物、聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物纳米粒，聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物、聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物囊泡通过其表面功能性聚乙二醇末端的功能性基团与凝集素连接。所述功能性基团及连接方式是功能性聚乙二醇一端的马来酰亚胺基团与凝集素或巯基化凝集素上的巯基通过硫醚键连接；功能性聚乙二醇一端的酰肼基团通过羧基活化剂如1-乙基-3-二甲氨基丙基-碳二亚胺盐酸盐(EDAC)，与凝集素氨基酸残基的氨基通过酰胺键共价连接；功能性聚乙二醇一端的巯基通过3-(2-吡啶基巯基)丙酸-N-琥珀酰亚胺(SPDP)与巯基化凝集素上的巯基连接；功能性聚乙二醇一端通过生物素-亲和素与凝集素连接。乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸纳米粒通过羧基活化剂如1-乙基-3-二甲氨基丙基-碳二亚胺盐酸盐(EDAC)单用或加用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后与凝集素氨基酸残基上的氨基共价连接。
制备本发明所述的药物载体脂质体采用凝集素磷脂复合物和鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸或胆固醇及其衍生物中的一种或多种。其中凝集素磷脂复合物为凝集素、磷脂共价结合或非共价结合复合物。凝集素、磷脂共价结合是酸性磷脂上的羧基通过羧基活化剂经羧基活化剂1-乙基-3-二甲氨基丙基-碳二亚胺盐酸盐(EDAC)单用或EDAC、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)合用活化后，再与凝集素上的游离氨基连接；凝集素、磷脂非共价结合是凝集素和磷脂通过生物素/亲和素系统连接。
所述的脂质体的制备方法采用薄膜水化法、注入法、复乳法、熔融法、冷冻干燥法、逆向蒸发法、高压乳匀法或超声法及Ca2+融合法。
本发明采用乳化/溶剂蒸发法可以包载水溶性小分子药物、多肽蛋白类药物以及基因药物。将所述药物首先溶解于内水相，将高分子材料溶解于有机溶剂，超声乳化形成W/O型初乳，再加入外水相乳化形成W/O/W型复乳，除去有机溶剂后即形成载药纳米粒。对于疏水性药物，可与聚合物一起溶解于有机溶剂中，缓慢滴加入水相，以水相作为连续相乳化形成O/W型乳滴，除去有机溶剂后即形成载药纳米粒。
本发明药物传递系统的粒径范围为1-1000nm，优选粒径50-200nm，其中，连接在每个纳米粒表面的凝集素个数为1-1000个。
包载于载体中的药物是小分子化学药物、诊断药物、多肽蛋白药物以及基因药物中的一种或者几种，主要是中枢疾病治疗和诊断药物，或是通过中枢作用发挥全身性治疗作用的药物。
本发明所述的载药系统采用喷雾或滴鼻形式通过鼻腔途径给药。
本发明所述的载药系统可以分散在药剂学上可以接受的各种缓冲溶液环境中，包括HEPES缓冲液、生理盐水、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液以及其它的缓冲溶液环境中，缓冲液中可以含钙、镁等金属离子，其中钙离子的浓度优选为0.01-1.0mmol/L。
本发明的传递系统具有下述优点：
①与常规给药系统和给药方法相比，能够延长载药系统在鼻粘膜上的滞留时间，并可主动介导嗅粘膜摄取，提高载药系统的入脑量，同时相应减少外周组织分布的药量，在增强中枢预防、治疗和诊断效果的同时，降低全身性毒副作用；
②使用安全方便，患者顺应性提高。
附图说明
图1.麦胚凝集素修饰纳米粒和普通纳米粒大鼠鼻腔给药后，全血和各脑组织的药时曲线图。
图2.透射电镜照片，其中，(A)：麦胚凝集素修饰纳米粒依次加山羊抗麦胚凝集素一抗、10nm金标记兔抗山羊IgG二抗37℃孵育；(B)：麦胚凝集素修饰纳米粒加10nm金标记兔抗山羊IgG二抗37℃孵育；(C)普通纳米粒依次加山羊抗WGA一抗，10nm金标记兔抗山羊IgG二抗37℃孵育。
具体实施方式
本发明通过以下描述和实施例进行说明，以下描述为非限制性的，并不限制本发明的权利要求范围。
实施例1：凝集素修饰纳米粒载药系统的构建及其影响因素
1)麦胚凝集素(WGA)的巯基化：取不同量WGA溶解于1ml pH＝8.0的硼酸钠溶液中，加入过量的巯基化试剂2-iminothiolane hydrochloride(2-IT)，低速磁力搅拌1h，脱盐柱分离巯基化蛋白及未反应完的巯基化试剂。Ellman’s试剂测定WGA的巯基化程度均在0.2-5mol巯基/mol蛋白之间。
2)制备PEG化纳米粒(NP)：将50μl蒸馏水加入1ml含有不同比例单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(MPEG-PLA)、马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸(Mal-PEG-PLA)嵌段共聚物的二氯甲烷溶液中，220W连续超声30s制备w/o型初乳。将初乳加入2ml1％的胆酸钠溶液中，220W间断超声30次(1s/次)，得到w/o/w型复乳。将复乳加入25ml 0.5％的胆酸钠溶液中，搅拌5min后旋转蒸发除去二氯甲烷，4℃14000rpm离心45min，去除上清，用0.01mol/L pH7.0HEPES重新分散。
3)制备WGA表面修饰的纳米粒(WGA-NP)：将巯基化的WGA与纳米粒中马来酰亚胺基按照一定比例进行反应，室温搅拌反应一段时间。反应液经过1.5cm×20cm Sepharose CL-4B凝胶柱分离，得到WGA-NP。
4)研究各项参数的影响：凝集素巯基化前采用Iodogen固相法标记125I-WGA，采用上述方法制备WGA-NP，γ计数器测定纳米粒洗脱液放射性强度，计算求得每ml含纳米粒洗脱液连接蛋白量个数M，浊度法测定纳米粒浓度W，光散射法测定粒径X，根据公式N＝6×W×10-3/[π×(X×10-7)3×ρ]计算每毫升纳米粒洗脱液中含有的纳米粒个数N；WGA-NP表面的WGA数目＝M/N；WGA的连接率(％)＝测得蛋白总量/蛋白投料量。通过上述指标考察构建过程中各项参数的影响。表1是各项参数对载药系统粒径、蛋白连接率及纳米粒表面蛋白连接量的影响。
表1
| 2-IT/WGA | 巯基/WGA | MPEG-PLA/MalPEG-PLA | MalPEG-PLA/WGA | 孵育时间(h) | 粒径(nm) | 连接率(％) | WGA/NP |
| 6060 | -- | 99 | 33 | 28 | 88.698.6 | 13.5733.02 | 1563 |
| 606060602060500606060 | ----0.21.115--- | 910091999999 | 33333330.2350 | 24121212888121212 | 163.586.4142.834088.698.698.5136.7142.8130.5 | 35.3742.4136.434.4629.5833.0231.532.7636.464.28 | 30872111000246330244.8211.217.7 |
实施例2：载荧光探针6-香豆素的凝集素修饰纳米粒的大鼠脑内靶向性评价
1)分别按实施例1的方法制备载荧光探针6-香豆素WGA-NP，荆豆凝集素修饰纳米粒(UEA-NP)和双花扁豆凝集素修饰纳米粒(DBA-NP)。
2)采用Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS测得及包载6-coumarin的WGA-NP、UEA-NP、DBA-P及NP的数均粒径分别为80-90nm、84-95nm、80-94nm和70-80nm。
3)分别于pH7.4、pH4.0PBS漏槽条件下测定NP和凝集素修饰纳米粒载6-香豆素体外泄漏情况，结果表明，所载6-香豆素在两种介质中的泄漏均较低(24h均不超过4％)，所以，6-香豆素是一种较理想的荧光探针，可用于示踪纳米粒在大鼠体内的转运情况。
4)三种纳米粒分别稀释至浓度为25mg/ml，清醒大鼠鼻腔给药20μl(每只鼻孔10μl)，每一时间点重复4只大鼠。以普通纳米粒(NP)作为对照，同法操作。给药后分别于0.25，0.5，1，2，4，8，12和24h处死动物，立刻断头取血1ml，血样存放于加有肝素的离心管中，-20℃冻存。取出脑组织，分离嗅球、嗅区、大脑皮层及小脑，生理盐水洗尽血污，-20℃冻存。脑组织样品经预处理后进行高效液相(HPLC)分析，同时制备相应的标准曲线，计算血中及各脑组织中摄取的纳米粒浓度。
5)数据处理：不同脑组织摄取WGA-NP及NP的药时曲线见附图1。梯形法计算药时曲线下面积AUC0→t，以实测值表示血药峰浓度Cmax。表2是WGA-NP及未修饰纳米粒鼻腔给药的脑部摄取情况结果。
表2
| Cmax(ng/ml g) | AUC0-24h(ng·h/ml g) | |||
| WGA-NP | NP | WGA-NP | NP | |
| BloodOBOTCRCL | 21.56±3.80a33.25±6.3736.03±5.3238.15±8.3638.15±6.71 | 10.48±5.6413.94±7.7415.56±9.8319.75±11.1615.09±10.14 | 68.13±8.07b182.01±14.68b209.28±17.31b230.43±20.84b217.97±26.76b | 48.38±7.8492.90±17.87100.06±12.19112.76±13.10107.49±12.35 |
WGA-NP：WGA修饰纳米粒；NP：未修饰的普通纳米粒；
OB：嗅球；OT：嗅区；CR：大脑；CL：小脑
amean±S.D.
b与未修饰纳米粒存在显著性差异，P＜0.05.
结果表明，WGA修饰后显著增加纳米粒鼻腔给药后的脑内摄取，嗅球、嗅区、大脑皮层、小脑的AUC均显著高于未修饰纳米粒，各脑组织WGA-NP峰浓度均为未修饰纳米粒的2倍以上。
通过计算4种纳米粒的AUC0-24h，脑组织/AUC0-24h，血评价各制剂鼻腔给药后的脑内靶向性，不同纳米粒间两两比较采用student’s t检验进行统计分析。表3是不同凝集素修饰纳米粒鼻腔给药后纳米粒AUC0-24h，脑组织/AUC0-24h，血比值。
表3
| WGA-NP | UEA-NP | DBA-NP | NP | |
| OBOTCRCL | 2.67±0.38*3.07±0.44**3.38±0.50**3.20±0.55** | 5.10±0.97**5.44±1.02**5.53±0.92**5.69±0.96** | 4.24±1.08**4.78±1.22**4.96±1.35**5.34±1.49** | 1.92±0.482.07±0.422.33±0.462.22±0.44 |
WGA-NP：WGA修饰纳米粒；UEA-NP：UEA修饰纳米粒；DBA-NP：DBA修饰纳米粒；
NP：未修饰纳米粒；OB：嗅球；OT：嗅区；CR：大脑；CL：小脑
*与未修饰纳米粒存在显著性差异，p＜0.01；**与未修饰纳米粒存在极显著性差异，p＜0.001上述结果显示，三种凝集素修饰纳米粒的脑内靶向效率均高于未修饰纳米粒，靶向能力由大到小依次为：UEA-NP＞DBA-NP＞WGA-NP＞NP。
实施例3：制备载有脑血管扩张药尼莫地平的药物传递系统
1)凝集素的巯基化：称取适量的凝集素，加入HEPES溶液(pH 7.4)溶解并稀释制成0.2-5mg/ml的溶液，加入适量S-乙酰-巯基乙酸-N-琥珀酰亚胺(SATA)的二甲基亚砜溶液，搅拌30min，超滤去除二甲基亚砜。每毫升凝集素溶液加入适量羟胺反应30min，得到巯基化凝集素。经Ellman’s试剂测定凝集素的巯基化程度在0.2-5mol巯基/mol蛋白之间。
2)采用相分离-透析法制备载尼莫地平的纳米粒
取0.2g MPEG-PLA、0.02g maleimide-PEG-PLA嵌段共聚物和0.1g尼莫地平溶于6ml DMF中，搅拌下缓慢滴加到14ml水中，所得乳液装入透析袋中，用3L水分六次透析48h以除去DMF。将透析好的乳液于10000rpm离心10min，未包封的药物和聚集的载药聚合物纳米粒沉降下来，转移上层胶体液得到载尼莫地平的纳米粒。
3)制备载尼莫地平的凝集素表面共价结合的纳米粒(Lectin-NP)
将巯基化的凝集素按照蛋白与纳米粒中马来酰亚胺基按一定的摩尔比(1∶0.2-1∶5)进行反应，室温搅拌过夜。反应液经1.5cm×20cm Sepharose CL-4B凝胶柱分离，得Lectin-NP。
4)免疫电镜法鉴定纳米粒表面连接WGA：取WGA-NP分散在磷酸盐缓冲液中，依次加入山羊抗WGA一抗、胶体金标记兔抗山羊IgG二抗孵育，分离除去未结合二抗，收集含有纳米粒的洗脱液，磷钨酸染色后进行透射电镜观察。同时进行阴性对照试验：a.1mg WGA-NP，同法操作，但不加入一抗；b.1mg NP，同法操作。结果见附图2，透射电镜下观察在WGA-NP表面有胶体金的黑色颗粒存在，而在两个阴性对照NP表面均无胶体金的黑色颗粒存在，说明WGA-NP表面确实连接有WGA。
实施例4制备载精氨酸血管加压素(AVP)的WGA修饰囊泡
1)PEG-PCL和生物素-PEG-PCL按1∶9比例混合，溶解于二氯甲烷溶液中，旋转蒸发除去二氯甲烷，形成的薄膜迅速加入含药物AVP的水溶液进行水化，置60℃水浴保温使得囊泡(PV)进一步形成。
2)制备载血管活性肠肽(AVP)的凝集素修饰囊泡(WGA-PV)：1ml囊泡溶液中加入0.5mg/ml亲和素水溶液，37℃孵育1小时，过Sepharose CL-4B凝胶柱除去未结合亲和素，加入0.5mg/ml生物素标记WGA，37℃孵育1小时，过Sepharose CL-4B凝胶柱除去未结合凝集素，得到载精氨酸血管加压素(AVP)的WGA修饰囊泡。
3)红细胞凝集试验鉴定囊泡表面凝集素的生物活性：取新鲜大鼠全血1ml，肝素抗凝，1000rpm离心5min，弃上清，沉淀加5ml等渗PBS重悬制得红细胞悬液。再于7只离心管中分别加入：
a 200μl红细胞悬液+200μl稀释液(阴性对照)
b 200μl红细胞悬液+200μl PV(阴性对照)
c 200μl红细胞悬液+200μl WGA-PV(浓，10mg/ml)
d 200μl红细胞悬液+200μl WGA-PV(稀，0.5mg/ml)
e 200μl WGA-PV(浓，10mg/ml)+5mg 2-乙酰氨基葡萄糖，37℃孵育30min后，
+200μl红细胞悬液(阴性对照)
f 200μl WGA-PV(稀，0.5mg/ml)+3mg 2-乙酰氨基葡萄糖，37℃孵育30min后，
+200μl红细胞悬液(抑制试验)
g 200gl红细胞悬液+200μl WGA(0.125mg/ml)(抑制试验)
七只离心管37℃孵育30min后观察红细胞凝集情况，评价修饰于囊泡表面的凝集素的生物活性。表4是红细胞凝集试验结果。
表4
| 阴性对照 | WGA-PV | 抑制试验 | 阳性对照组 | ||||
| 结果 | a | b | c | d | e | f | g |
| - | - | +++ | +++ | + | + | +++ | |
“-”：不发生红细胞凝集；“+++”：红细胞发生严重凝集；“+”：红细胞发生轻微凝集。
结果表明，所制备的WGA-PV表面确实连接有WGA，且WGA保持其原有的生物活性。
实施例5：制备载有99mTc标记的小鼠抗人Aβ1-40单克隆抗体(99mTc-Aβ1-40MAb)的药物传递系统。
1)凝集素巯基化同实施例1。
2)采用复乳/溶剂蒸发法制备载99mTc-Aβ1-40MAb纳米粒
将1％99mTc- Aβ1-40 MAb水溶液100μl加入2ml含36mgPoly(MPEGCA-co-HDCA)和4mg氰基丙烯酸马来酰亚胺基聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物Poly(maleimide-PEGCA-co-HDCA)的二氯甲烷中，冰浴中55W连续超声30s，得初乳。将初乳加入4ml 2％的聚乙烯醇溶液中，冰浴中超声20s，得到w/o/w复乳，低速搅拌10min，旋转蒸发除去残留二氯甲烷，15000rpm离心去上清。用0.01mol/L pH7.0HEPES重新混悬。
3)制备载99mTc-Aβ1-40MAb的凝集素修饰纳米粒
将巯基化的凝集素按照蛋白与纳米粒中马来酰亚胺基的摩尔比1∶3进行反应，室温搅拌过夜。反应液经过1.5cm×20cm Sepharose CL-4B凝胶柱分离，得到Lectin-NP。
实施例6：制备载抗肿瘤药物阿柔比星的药物传递系统
1)采用复乳/溶剂蒸发法制备载阿柔比星的PLGA纳米粒
2)载阿柔比星的PLGA纳米粒表面连接凝集素：取适量载阿柔比星的PLGA纳米粒分散于pH7.0HEPES溶液中，依次加入适量EDAC的HEPES(pH7.0)溶液及适量NHS的HEPES(pH7.0)溶液活化纳米粒表面羧基，4℃10000rpm离心45min除去过量羧基活化剂，加入适量凝集素的HEPES(pH7.0)溶液，反应2-18h，而后加入适量20％甘氨酸溶液孵育1h以封闭未反应的活化基团。最后，采用pH7.0HEPES离心洗涤，得到纳米粒用等渗pH7.4HEPES再分散，粒经在100-400nm之间。
实施例7：制备载镇痛药美普他酚的凝集素修饰脂质体
1)凝集素共价连接N-戊二醛磷脂酰乙醇胺(NGPE)：1.2mg NGPE溶解于2ml pH5.5的MES缓冲液(含5mg/ml n-辛基葡糖苷)中，加入48mg EDAC、60mg NHS，混合物室温孵育5min，然后加入4ml含2mg/ml凝集素的HEPES缓冲液(pH7.5)，调节pH至7.6，4℃低速搅拌过夜。产物用pH7.6PBS透析2天除去过量试剂，得到的Lectin-NGPE溶液4℃保存待用。
2)载美普他酚的凝集素修饰脂质体的制备：30mg二油酰磷脂酰胆碱溶于氯仿∶乙酸乙酯(1∶10)混合溶剂中，旋转蒸发得到脂膜，干燥的脂膜加入3ml含有Lectin-NGPE、美普他酚的水溶液进行水化。得到的脂质体冻融后过0.1μm的聚碳酸酯膜，然后加适量Na2S2O5∶K2S2O8(1∶1)室温过夜氧化聚合。最后，脂质体过凝胶柱分离纯化。
实施例8：制备载有血管活性肠肽(VIP)的药物传递系统
1)凝集素的巯基化：称取适量的凝集素，加入HEPES溶液(pH 8.0)溶解并稀释制成0.2-5mg/ml的溶液，加入适量3-(2-吡啶基巯基)丙酸-N-琥珀酰亚胺(SPDP)的二甲亚砜溶液，搅拌0.5-2h，脱盐柱分离蛋白及未反应完的试剂。得到的蛋白溶液加入适量二巯基苏糖醇(DTT)反应一段时间，最后所得的巯基化蛋白经脱盐柱分离纯化。Ellman’s试剂测定凝集素的巯基化程度在0.2-5mol巯基/mol蛋白之间。
2)采用复乳/溶剂蒸发法制备载VIP的纳米粒
3)制备载VIP的凝集素共价结合的纳米粒(Lectin-NP)
将巯基化的凝集素按照蛋白与纳米粒中马来酰亚胺基的摩尔比1∶1进行反应，室温搅拌过夜。反应液经1.5cm×20cm Sepharose CL-4B凝胶柱分离，得到Lectin-NP。
实施例9：制备载有脑源性神经生长因子(BDNF)的药物传递系统
1)蛋白巯基化方法同实施例1。
2)采用复乳/溶剂蒸发法制备载BDNF的纳米粒。
3)制备载BDNF的凝集素共价结合的纳米粒(Lectin-NP)。
将巯基化的凝集素按照蛋白与纳米粒中马来酰亚胺基的摩尔比1∶3进行反应，室温搅拌6小时。反应液经1.5cm×20cm Sepharose CL-4B凝胶柱分离，得到Lectin-NP。
实施例10：制备载肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosisinducing ligand，TRAIL)基因的药物传递系统
1)蛋白巯基化方法同实施例1。
2)采用复乳/溶剂蒸发法制备载BDNF的纳米粒载有TRAIL基因的纳米粒：将250μg pORF-hTRAIL质粒溶于50μl Tris-EDTA缓冲液中(TE buffer，pH 8.0)作为内水相，按照实施例1方法制备载质粒纳米粒(NP-hTRAIL)。其中，Maleimide-PEG-PLA∶MPEG-PLA为1∶9，以120W、15s连续超声制备初乳，以120W、1s/次×15次间断超声制备复乳。将制备得到的NP-hTRAIL用生理盐水洗涤3次，除去吸附在纳米粒表面的pDNA。
3)制备载有TRAIL基因的凝集素共价结合的纳米粒(Lectin-NP)：方法同实施例1。
Claims (13)
1、一种凝集素修饰的经鼻入脑的药物传递系统，其特征在于，是以纳米粒、脂质体或囊泡作为药物载体，表面修饰以凝集素的复合体。
2、按权利要求1所述的凝集素修饰的经鼻入脑的药物传递系统，其特征在于所述的凝集素选自麦胚凝集素、荆豆凝集素-I、II、III、双花扁豆凝集素、刀豆凝集素、花生凝集素、大豆凝集素、番茄凝集素、菜豆凝集素或槲寄生凝集素中的一种或几种。
3、按权利要求1所述的凝集素修饰的经鼻入脑的药物传递系统，其特征在于所述的纳米粒采用聚乙二醇—聚乳酸嵌段共聚物和功能性聚乙二醇—聚乳酸嵌段共聚物、氰基丙烯酸聚乙二醇酯—氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物和氰基丙烯酸功能性聚乙二醇酯—氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物、乳酸—羟基乙酸共聚物或聚乳酸为制备材料。
4、按权利要求3所述的凝集素修饰的经鼻入脑的药物传递系统，其特征在于所述的功能性聚乙二醇—聚乳酸嵌段共聚物、氰基丙烯酸功能性聚乙二醇酯—氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物中的功能性聚乙二醇部分，其功能性基团是马来酰亚胺基、巯基、酰肼基、羧基、生物素或亲和素中的一种。
5、按权利要求1所述的凝集素修饰的经鼻入脑的药物传递系统，其特征在于所述的囊泡采用聚乙二醇—聚乳酸嵌段共聚物和功能性聚乙二醇—聚乳酸嵌段共聚物或聚乙二醇—聚己内酯嵌段共聚物和功能性聚乙二醇—聚己内酯嵌段共聚物为制备材料。
6、按权利要求5所述的凝集素修饰的经鼻入脑的药物传递系统，其特征在于所述的功能性聚乙二醇—聚乳酸嵌段共聚物、功能性聚乙二醇—聚己内酯嵌段共聚物中的功能性聚乙二醇部分，其功能性基团是马来酰亚胺基、巯基、酰肼基、羧基、生物素或亲和素中的一种。
7、按权利要求1所述的凝集素修饰的经鼻入脑药物传递系统，其特征在于所述的脂质体采用凝集素磷脂复合物和鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸或胆固醇及其衍生物中的一种或多种为制备材料。
8、按权利要求7所述的凝集素修饰的经鼻入脑药物传递系统，其特征在于所述的凝集素磷脂复合物为凝集素、磷脂共价结合或非共价结合复合物，其中凝集素、磷脂共价结合是酸性磷脂上的羧基通过羧基活化剂经羧基活化剂EDAC单用或EDAC和NHS合用活化后，再与凝集素上的游离氨基连接，凝集素、磷脂非共价结合是凝集素和磷脂通过生物素/亲和素系统连接。
9、按权利要求1所述的凝集素修饰的经鼻入脑的药物传递系统的制备方法，其特征是：将凝集素修饰于药物载体纳米粒、脂质体或囊泡的表面，凝集素通过共价连接或非共价连接的方式与药物载体连接。
10、按权利要求9所述的凝集素修饰的经鼻入脑的药物传递系统的制备方法，其特征在于所述的凝集素修饰的纳米粒的制备方法是：将聚乙二醇—聚乳酸嵌段共聚物和功能性聚乙二醇—聚乳酸嵌段共聚物混合，或将氰基丙烯酸聚乙二醇酯—氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物和氰基丙烯酸功能性聚乙二醇酯—氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物按1000∶1-1∶1比例混合后，按常规方法制备包载药物的纳米粒，得到的纳米粒通过表面功能性聚乙二醇与凝集素通过硫醚键、酰胺键、二硫键共价连接或生物素/亲和素系统非共价连接；乳酸—羟基乙酸共聚物或聚乳酸通过常规方法制备包载药物的纳米粒，得到的纳米粒表面羧基经羧基活化剂1-乙基-3-二甲氨基丙基-碳二亚胺盐酸盐单用或EDAC、N-羟基琥珀酰亚胺合用活化后与凝集素上的氨基共价连接。
11、按权利要求9所述的凝集素修饰的经鼻入脑的药物传递系统的制备方法，其特征在于所述的凝集素修饰的囊泡的制备方法是：将聚乙二醇—聚乳酸嵌段共聚物和功能性聚乙二醇—聚乳酸嵌段共聚物混合，或将聚乙二醇—聚己内酯嵌段共聚物和功能性聚乙二醇—聚己内酯嵌段共聚物按1000∶1-1∶1比例混合后通过薄膜水化法、注入法、溶剂非溶剂法或聚合物直接水化法制备包载药物的囊泡，得到的囊泡通过表面功能性聚乙二醇与凝集素通过硫醚键、酰胺键、二硫键共价连接或生物素/亲和素系统非共价连接。
12、按权利要求1的药物传递系统，其特征在于所述的纳米粒、囊泡、脂质体包载的药物是小分子化学药物、诊断药物、多肽蛋白药物或基因药物中的一种或几种。
13.按权利要求1所述的药物传递系统，其特征在于所述的药物传递系统以喷雾或滴鼻形式通过鼻腔给药。
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