CN1745176A

CN1745176A - 使用含有弱化的yjgF ORF序列的肠杆菌科菌株发酵生产L－氨基酸的方法

Info

Publication number: CN1745176A
Application number: CN200380109389.3A
Authority: CN
Inventors: 梅希特希尔德·里平
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2003-01-30
Filing date: 2003-12-16
Publication date: 2006-03-08
Anticipated expiration: 2023-12-16
Also published as: BR0318058A; DE60323681D1; WO2004067757A1; DE10303571A1; BRPI0318058B1; AU2003290053A1; US7638313B2; EP1587938A1; ES2314263T3; EP1587938B1; US20040191885A1; ATE408703T1; CN100351387C

Abstract

本发明涉及一种生产L－氨基酸，尤其是L－苏氨酸的方法，其中进行如下步骤：a)发酵产生所需L－氨基酸的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的微生物，其中所述微生物的yjgF ORF或编码其的核苷酸序列被弱化，特别是被消除，b)浓缩培养基或细菌细胞中的L－氨基酸，及任选地c)分离所述L－氨基酸。

Description

使用含有弱化的yjgF ORF序列的肠杆菌科菌株发酵生产L-氨基酸的方法

发明领域

本发明涉及使用肠杆菌科(Enterobacteriaceae)菌株发酵生产L-氨基酸，特别是L-苏氨酸的方法，其中称为yigF的开放读框(ORF)被弱化。

现有技术

L-氨基酸，特别是L-苏氨酸用于人类医学和制药工业、食品工业，并特别用于动物营养。

已知通过发酵肠杆菌科菌株，尤其大肠杆菌(E.coli)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)生产L-氨基酸。因为其极大的重要性，一直研究着改良该生产方法。方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或者营养培养基的组成，如发酵期间的糖浓度，或者逐渐达到产物形式，例如通过离子交换层析，或者微生物自身独特的产出性质。

诱变、选择和突变选择的方法用于改良这些微生物的产出性质。以此方式获得对抗代谢物如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV)有抗性的菌株，或者对调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L-氨基酸如L-苏氨酸的菌株。

近年来重组DNA技术的方法也已经用于生产L-氨基酸的肠杆菌科菌株的改良，通过扩增各个氨基酸生物合成基因并研究对生产的作用而进行。大对肠杆菌和沙门氏菌的细胞和分子生物学的概述信息见于Neidhardt(编辑)：Escherichia coli and Salmonella，Cellular andMolecular Biology，第二版，ASM Press，Washington，D.C.，USA。

发明目的

本发明的目的是提供L-氨基酸，特别是L-苏氨酸的改良的发酵生产新措施。

发明概述

本发明提供了使用肠杆菌科微生物发酵生产L-氨基酸，特别是L-苏氨酸的方法，其中所述微生物已经生产L-氨基酸并且其中至少编码yjgF ORF或其等位基因的核苷酸序列被弱化。

发明详述

当下文提及L-氨基酸时，是指选自如下一组的一或多种氨基酸，包括其盐：L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸和L-精氨酸。特别优选L-苏氨酸。

文中所用术语“弱化”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度降低或消除，例如通过使用弱启动子或编码具有低活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因或ORF，或者失活相应的酶或蛋白质或基因或ORF而进行弱化，任选地组合使用这些措施。

开放读框(ORF)是指编码或可以编码现有技术中未知功能的蛋白质或多肽或核糖核酸的核苷酸序列片段。在确定了所述核苷酸序列片段的功能之后，其通常被称作基因。等位基因通常是指给定基因的意义变体(meaning variant)。这些等位基因通过核苷酸序列的不同而区分。

由一个核苷酸序列即ORF、基因或等位基因编码的蛋白质，或者所编码的核糖核酸通常称作基因产物。

通过弱化措施，本发明的相应蛋白质或现有技术的蛋白质的活性或浓度通常降低为野生型蛋白质的活性或浓度或者起始微生物中蛋白质的活性或浓度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％。起始微生物是指进行本发明措施的微生物。

所述方法特征在于进行如下步骤：

a)发酵产生所需L-氨基酸的肠杆菌科微生物，其中所述微生物的yjgF ORF或编码其的核苷酸序列被弱化，

b)浓缩培养基或肠杆菌科微生物的细胞中相应的L-氨基酸，及任选地

c)分离所需L-氨基酸，任选地，发酵肉汤和/或生物量的组分全部或部分(＞0-100％)保留在产物中。

本发明提供的微生物，尤其是重组微生物可以从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、任选地淀粉、任选地纤维素或从甘油和乙醇中产生L-氨基酸。它们是选自如下肠杆菌科的代表性菌株：埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属(Serratia)。优选埃希氏菌属和沙雷氏菌属。可提及的是埃希氏菌属，特别是大肠杆菌菌种及沙雷氏菌属，特别是粘质沙雷氏菌菌种。

生产L-苏氨酸的合适菌株，特别是埃希氏菌属，尤其是大肠杆菌菌种的菌株例子为：

-大肠杆菌H4581(EP0 301 572)

-大肠杆菌KY10935(Bioscience Biotechnology and Biochemistry61(11)：1877-1882(1997)

-大肠杆菌VNIIgenetika MG442(US-A-4278,765)

-大肠杆菌VNIIgenetika M1(US-A-4.321.325)

-大肠杆菌VNIIgenetika 472T23(US-A-5,631,157)

-大肠杆菌BKIIM B-3996(US-A-5.175.107)

-大肠杆菌kat13(WO98/04715)

-大肠杆菌KCCM-10132(WO00/09660)

合适的生产L-苏氨酸的沙雷氏菌属，特别是粘质沙雷氏菌菌种的例子为：

-粘质沙雷氏菌HNr21(Applied and Environmental Microbiology38(6)：1045-1051(1979))

-粘质沙雷氏菌TLr156(Gene 57(2-3)：151-158(1987))

-粘质沙雷氏菌T-2000(Applied Biochemistry and Biotechnology37(3)：255-265(1992))

生产L-苏氨酸的肠杆菌科菌株优选具有选自如下一组的一或多种遗传或表型特征：α-氨基β-羟戊酸抗性、硫赖氨酸(thialysine)抗性、乙硫氨酸抗性、α-甲基丝氨酸抗性、二氨基琥珀酸抗性、α-氨基丁酸抗性、疏螺旋体素抗性、环戊烷-羧酸抗性、利福平抗性、缬氨酸类似物例如缬氨酸氧肟酸抗性、嘌呤类似物例如6-二甲基氨基嘌呤抗性、需要L-甲硫氨酸、任选地部分且可补偿地需要L-异亮氨酸、需要间二氨基庚二酸、对于含苏氨酸二肽为营养缺陷型、L-苏氨酸抗性、苏氨酸萃余液(raffinate)抗性、L-高丝氨酸抗性、L-赖氨酸抗性、L-甲硫氨酸抗性、L-谷氨酸抗性、L-天冬氨酸抗性、L-亮氨酸抗性、L-苯丙氨酸抗性、L-丝氨酸抗性、L-半胱氨酸抗性、L-缬氨酸抗性、氟丙酮酸敏感性、缺陷的苏氨酸脱氢酶、任选地有蔗糖利用能力、苏氨酸操纵子的增强、高丝氨酸脱氢酶I-天冬氨酸激酶I的增强，优选地为反馈抗性形式、高丝氨酸激酶的增强、苏氨酸合酶的增强、天冬氨酸激酶的增强，任选地为反馈抗性形式、天冬氨酸半醛脱氢酶的增强、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的增强，任选地为反馈抗性形式、磷酸烯醇丙酮酸合酶的增强、转氢酶的增强、RhtB基因产物的增强、RhtC基因产物的增强、YfiK基因产物的增强、丙酮酸羧化酶的增强、及乙酸形成的弱化。

已经发现肠杆菌科的微生物在yjgF基因或其开放读框(ORF)或等位基因被弱化、特别是被消除后以改良的形式产生L-氨基酸，尤其L-苏氨酸。

大肠杆菌的基因或开放读框(ORF)的核苷酸序列属于现有技术并也可以在由Blattner等(Science 277：1453-1462(1997))公布的大肠杆菌基因组序列中发现。

大肠杆菌K12的yjgF ORF通过如下数据描述：

描述：开放读框

功能：未知功能

描述：开放读框yjgF编码15.1kDa蛋白质，等电点为5.8；

在染色体上位于例如大肠杆菌K12 MG1655，其位于编

码P-Typ1的Mg²⁺转运ATP酶的基因mgtA和编码天冬

氨酸氨甲酰转移酶的调节亚基的pyrI基因的基因间区

域。

参考文献：Wasinger VC.and Humphery-Smith I.；FEMS

Microbiology Letters 169(2)：375-382(1998)

Volz K.；Protein Science 8(11)：2428-2437(1999)

Parsons et al.；Biochemistry 42(1)：80-89(2003)

登记号： AE000495

来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的yjgF ORF在如下参考文献中描述：Enos-Berlage et al.；Journal of Bacteriology 180(24)：6519-6528(1998)。

核酸序列可在如下数据库中发现：the National Library ofMedicine(Bethesda，MD，USA)的National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)，European Molecular Biologies Laboratories(EMBL，Heidelberg，Germany or Cambridge，UK)的核苷酸序列数据库，或者日本DNA数据库(DDBJ，Mishima，Japan)。

为了更好地阐明，大肠杆菌的yjgF ORF的已知序列示于SEQ IDNO：1，鼠伤寒沙门氏菌的yjgF ORF的已知序列示于SEQ ID NO：11。由这些读框编码的蛋白质示于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12。

提及的参考文献中所述的开放读框根据本发明可以使用。也可以使用由于遗传密码的简并性或者如下所述的突变所致的这些开放读框或基因尤其是肠杆细菌科的开放读框或基因的等位基因。优选使用内源性基因或开放读框。

“内源性基因”或“内源性核苷酸序列”是指一个物种群体中存在的基因或开放读框等位基因或核苷酸序列。

合适的yjgF ORF的等位基因包括含有中性功能突变或“有义突变”的那些。这些包括导致由其编码的蛋白质中至少一个(1)保守的氨基酸置换的那些等位基因。保守氨基酸置换的最大数目可以涉及2、3、5、10、20，但决不超过30个氨基酸。通过所述保守氨基酸置换，功能性降低或增加0％至不超过24％、20％、10％、5％、3％、2％或1％。

在芳族氨基酸的情况中，保守置换是指苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸彼此相互置换。在疏水性氨基酸的情况中，保守置换是指亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸彼此相互置换。在极性氨基酸的情况中，保守置换是指谷氨酰胺和天冬酰胺彼此相互置换。在碱性氨基酸的情况中，保守置换是指精氨酸、赖氨酸和组氨酸彼此相互置换。在酸性氨基酸的情况中，保守置换是指天冬氨酸和谷氨酸彼此相互置换。在含有羟基基团的氨基酸的情况中，保守置换是指丝氨酸和苏氨酸彼此相互置换。所有其它氨基酸置换均称为非保守的氨基酸置换。

同样，也可以使用编码所述蛋白质的变体的那些核苷酸序列，所述蛋白质的变体在其N或C末端额外含有至少一个氨基酸(1)的延长或缩短。这种延长或缩短不超过30、20、10、5、3或2个氨基酸或氨基酸基团。

合适的等位基因还包括编码其中插入(插入)或除去(缺失)至少一个(1)氨基酸的蛋白质的那些等位基因。这种称为插入/缺失(indels)的改变的最大数目可涉及2、3、5、10、20但决不超过30个氨基酸。

合适的等位基因进一步包括使用SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11或其部分，特别是编码区或与其互补的序列，通过杂交，特别是在严格条件下杂交可获得的那些等位基因。

利用杂交鉴别DNA序列的指导可见于专业手册“The DIGSystem Users Guide for Filter Hybridization”，Boehringer MannheimGmbH(Mannheim，Germany，1993)及Liebl et al.(International Journalof Systematic Bacteriology 41：255-260(1991))。杂交在严格条件下发生，也就是说只形成了其中探针和靶序列，即用探针处理的多核苷酸是至少70％相同的杂交体。已知通过改变缓冲液组成、温度和盐浓度可以影响或确定杂交包括洗涤步骤的严格性。杂交反应一般在与洗涤步骤相比相对低的严格条件下进行(Hybaid Hybridisation Guide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。

杂交反应可以利用例如在大约50-68℃相应于5×SSC的缓冲液进行。探针在此也可以和与探针序列具有少于70％相同性的多核苷酸杂交。这种杂交体稳定性较低并通过在严格条件下洗涤而除去。这可以例如在大约50-68℃下，通过将盐浓度降低至2×SSC及任选随后降低至0.5×SSC(The DIG System User′s Guide for FilterHybridisation，Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany，1995)而实现。任选地可以将盐浓度降低至相应于0.2×SSC或0.1×SSC的浓度。与所用的探针序列有例如至少70％或至少80％或至少90％-95％或者至少96％-99％相同性的多核苷酸片段可以通过将杂交温度从50℃逐步(大约1-2℃)提高至68℃而分离。关于杂交的进一步的指导在市场上可以所谓的试剂盒形式获得(例如DIG Easy Hyb，Roche Diagnostics′GmbH，Mannheim，Germany，Catalogue No.1603558)。

为实现弱化，例如可以将基因或开放读框的表达或者酶蛋白质的催化性质降低或消除。可以任选地组合这两种措施。

基因表达的降低可通过适当的培养、通过遗传修饰(突变)基因表达的信号结构或者也通过反义RNA技术而发生。基因表达的信号结构是例如阻抑基因、激活基因、操纵基因、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。专业人员可以在例如如下文献中发现这方面的信息：Jensen and Hammer(Biotechnology andBioengineering 58：191-195(1998)，Carrier und Keasling(BiotechnologyProgress 15：58-64(1999))，Franch and Gerdes(Current Opinion inMicrobiology 3：159-164(2000))及已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Knippers(″Molekulare Genetik″，6th edition，Georg ThiemeVerlag，Stuttgart，Germany，1995)或者Winnacker(″Gene und Klone″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)所著教科书。

导致酶蛋白质的催化性质改变或降低的突变已为本领域所已知。可以提及的实例是如下人员的研究：Qiu and Goodman(Journal ofBiological Chemistry 272：8611-8617(1997))，Yano et al.(Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 95：5511-5515(1998))，Wente and Schachmann(Journal of BiologicalChemistry 266：20833-20839(1991))。概括描述可在已知的遗传学和分子生物学教科书中发现，例如Hagemann(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。

可能的突变是转换、颠换、插入和缺失至少一个(1)碱基对或核苷酸。根据突变所致氨基酸置换对酶活性的作用，称作“错义突变”或“无义突变”。错义突变导致蛋白质中一个特定的氨基酸置换为另一个，特别是非保守的氨基酸置换。蛋白质的功能性或活性通过这种方式削弱并降低至0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％。无义突变在基因的编码区内产生一个终止密码子并因此提前中断翻译。在基因中插入或缺失至少一个碱基对导致“移码突变”，这导致掺入不正确的氨基酸或提前中断翻译。如果终止密码子由于突变的结果而在编码区内形成，这也导致翻译的提前终止。缺失至少一个(1)或多个密码子典型地也导致酶活性的完全丧失。

产生这种突变的指导是现有技术并可以见于已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Knippers(″Molekulare Genetik″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker(″Gene undKlone″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或Hagemann(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)所著教科书。

基因中的合适突变例如缺失突变(见SEQ ID NO：10)可以通过基因或等位基因置换而掺入合适的菌株中。

通常的方法是Hamilton等(Journal of Bacteriology 171：4617-4622(1989))所述的借助于条件性复制的pSC101衍生物pMAK705的基因置换。另外可以应用本领域所述的其它方法，例如Martinez-Morales et al.(Journal of Bacteriology 181：7143-7148(1999))或者Boyd et al.(Journal of Bacteriology 182：842-847(2000))所述方法。

也可以通过缀合或转导将特定基因中的突变或者影响特定基因或开放读框表达的突变转移进不同菌株中。

关于遗传学和分子生物学中术语的更详细的解释见已知的遗传学和分子生物学的教科书所述，例如Birge(Bacterial andBacteriophage Genetics，4th ed.，Springer Verlag，New York(USA)，2000)或Berg，Tymoczko and Stryer(Biochemistry，5^th ed.，Freeman andCompany，New York(USA)，2002)所著教科书或者Sambrook et al.(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，(3 volume set)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001)所著手册。

除了弱化yjgF ORF之外，增强已知苏氨酸生物合成途径的一或多种酶或者添补代谢的酶或者生产还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶或者糖酵解的酶或者PTS酶或者硫代谢的酶对使用肠杆菌科菌株生产L-氨基酸特别是L-苏氨酸另有优势。

文中所用术语“增强”是指例如使用编码具有高活性的相应酶或蛋白质的有力启动子或基因或开放读框，通过增加一或多个基因或开放读框的拷贝数而增加微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度，及任选组合这些措施。

通过增强措施，特别是过表达，相应蛋白质的活性或浓度在野生型蛋白质或者起始微生物中蛋白质的活性或浓度基础上一般增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、或500％，直至最大值1000％或2000％。

为生产L-氨基酸，特别是L-苏氨酸，除了弱化yjgF ORF之外，同时增强，特别是过表达选自如下一组的一或多个基因是有利的：

·编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子(US-A-4,278,765)，

·编码丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的pyc基因(WO99/18228)，

·编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(Molecular and GeneralGenetics 231(2)：332-336(1992))，

·编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(Gene 31：279-283(1984))，

·编码转氢酶的pntA和pntB基因(European Journal ofBiochemistry 158：647-653(1986))，

·赋予高丝氨酸抗性的rhtB基因(EP-A-0 994 190)，

·编码苹果酸:醌氧化还原酶的mqo基因(WO 02/06459)，

·赋予苏氨酸抗性的rhtC基因(EP-A-1 013 765)，

·编码苏氨酸输出蛋白的谷氨酸棒杆菌的thrE基因(WO01/92545)，

·编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因(Nucleic Acids Research 11：5257-5266(1983)；Gene 23：199-209(1983))，

·编码DNA结合蛋白HLP-II的hns基因(WO 03/004671)，

·编码葡糖磷酸变位酶的pgm基因(WO 03/004598)，

·编码果糖二磷酸醛缩酶的fba基因(WO 03/004664)，

·编码磷酸转移酶系统PTS的磷酸组氨酸蛋白质己糖磷酸转移酶的ptsHIcrr操纵子的ptsH基因(WO 03/004674)，

·编码磷酸转移酶系统PTS的酶I的ptsHIcrr操纵子的ptsI基因(WO 03/004674)，

·编码磷酸转移酶系统PTS的葡萄糖特异性IIA成分的ptsHIcrr操纵子的crr基因(WO 03/004674)，

·编码葡萄糖特异性IIBC成分的ptsG基因(WO 03/004670)，

·编码亮氨酸调节子的调节物的lrp基因(WO 03/004665)，

·编码全局调节物Csr的csrA基因(Journal of Bacteriology 175：4744-4755(1993))，

·编码fad调节子的调节物的fadR基因(Nucleic Acids Research16：7995-8009(1988))，

·编码中心中间代谢(central intermediate metabolism)的调节物的iclR基因(Journal of Bacteriology 172：2642-2649(1990))，

·编码10kd侣伴蛋白的mopB基因(WO 03/004669)，其也已知称作groES，

·编码烷基氢过氧化物还原酶的小亚基的ahpCF操纵子的ahpC基因(WO 03/004663)，

·编码烷基氢过氧化物还原酶的大亚基的ahpCF操纵子的ahpF基因(WO 03/004663)，

·编码半胱氨酸合酶A的cysK基因(WO 03/006666)，

·编码cys调节子的调节物的cysB基因(WO 03/006666)，

·编码NADPH亚硫酸盐还原酶的黄素蛋白的cysJIH操纵子的cysJ基因(WO 03/006666)，

·编码NADPH亚硫酸还原酶的血蛋白的cysJIH操纵子的cysI基因(WO 03/006666)，

·编码腺苷酰硫酸还原酶的cysJIH操纵子的cysH基因(WO03/006666)，

·编码pho调节子的阳性调节物PhoB的phoBR操纵子的phoB基因(WO 03/008606)，

·编码pho调节子的传感蛋白的phoBR操纵子的phoR基因(WO03/008606)，

·编码外细胞膜蛋白E的phoE基因(WO 03/008606)，

·编码果糖刺激的丙酮酸激酶I的pykF基因(WO 03/008609)，

·编码6-果糖磷酸激酶II的pfkB基因(WO 03/008610)，

·编码麦芽糖转运的周质结合蛋白(periplasmic binding protein)的malE基因(WO 03/008605)，

·编码超氧化物歧化酶的sodA基因(WO 03/008613)，

·编码具有抗sigmaE活性的膜蛋白的rseABC操纵子的rseA基因(WO 03/008612)，

·编码sigmaE因子的全局调节物的rseABC操纵子的rseC基因(WO 03/008612)，

·编码2-酮戊二酸脱氢酶的脱羧酶亚基的sucABCD的sucA基因(WO 03/008614)，

·编码2-酮戊二酸脱氢酶的二氢硫辛酸转琥珀酸酶E2亚基的sucABCD的sucB基因(WO 03/008614)，

·编码琥珀酰-CoA合成酶的β亚基的sucABCD操纵子的sucC基因(WO 03/008615)，

·编码琥珀酰-CoA合成酶的α亚基的sucABCD操纵子的sucD基因(WO 03/008615)，

·编码腺苷酸激酶的adk基因(Nucleic Acids Research 13(19)：7139-7151(1985))，

·编码具有侣伴蛋白样功能的周质蛋白的hdeA基因(Journal ofBacteriology 175(23)：7747-7748(1993))，

·编码具有侣伴蛋白样功能的周质蛋白的hdeB基因(Journal ofBacteriology 175(23)：7747-7748(1993))，

·编码异柠檬酸脱氢酶的icd基因(Journal of BiologicalChemistry 262(22)：10422-10425(1987))，

·编码周质葡萄糖结合转运蛋白HLP-II的mglB基因(Molecularand General Genetics 229(3)：453-459(1991))，

·编码二氢硫辛酰胺脱氢酶的lpd基因(European Journal ofBiochemistry 135(3)：519-527(1983))，

·编码丙酮酸脱氢酶复合物的E1成分的aceE基因(EuropeanJournal of Biochemistry 133(1)：155-162(1983))，

·编码丙酮酸脱氢酶复合物的E2成分的aceF基因(EuropeanJournal of Biochemistry 133(3)：481-489(1983))，

·编码氨肽酶B的pepB基因(Journal of Fermentation andBioengineering 82：392-397(1996))，

·编码醛脱氢酶的aldH基因(E.C.1.2.1.3)(Gene 99(1)：15-23(1991))，

·编码离子贮存同源蛋白(ion storage homoprotein)(细菌铁蛋白)的bfr基因(Journal of Bacteriology 171(7)：3940-3947(1989))，

·编码尿苷磷酸酶的udp基因(Nucleic Acids Research 17(16)：6741(1989))及

·编码sigmaE因子活性调节物的rseB基因(MolecularMicrobiology 24(2)：355-371(1997))。

一般优选使用内源基因或开放读框。

除了弱化yjgF ORF之外，弱化特别是消除或降低选自如下一组的一或多个基因的表达对生产L-氨基酸特别是苏氨酸也是有利的：

·编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因(Journal of Bacteriology 169：4716-4721(1987))，

·编码苹果酸脱氢酶的mdh基因(E.C.1.1.1.37)(Archives inMicrobiology 149：36-42(1987))，

·开放读框(orf)yjfA的基因产物(Accession Number AAC77180，the National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080)，

·开放读框(orf)ytfP的基因产物(Accession Number AAC77179，the National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080)，

·编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因(WO 02/29080)，

·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(WO 02/36797)，

·编码异柠檬酸裂合酶的aceA基因(WO 02/081722)，

·编码磷酸转移酶系统的DgsA调节物的dgsA基因(WO02/081721)，其也已知称为mlc基因，

·编码果糖阻抑物的fruR基因(WO 02/081698)，其也已知称作cra基因，

·编码sigma³⁸因子的rpoS基因(WO 01/05939)，其也已知称作katF基因，

·编码天冬氨酸铵裂合酶(天冬氨酸酶)的aspA基因(WO03/008607)及

·编码苹果酸合酶A的aceB基因(WO 03/008603)。

除了弱化yjgF ORF之外，消除不希望的副反应对L-氨基酸、特别是L-苏氨酸的生产是有利的(Nakayama：″Breeding of Amino AcidProducing Microorganisms″，in：Overproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。

根据本发明产生的微生物可以分批次培养(分批培养)，补料分批培养(补料方法)或者重复补料分批培养(重复补料方法)。已知培养方法的概述见Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))所著教科书中所述。

使用的培养基必须以合适的方式符合特定菌株的需要。关于各种微生物的培养基的描述见“Manual of Methods for GeneralBacteriology”of the American Society for Bacteriology(WashingtonD.C.，USA，1981)所述。

糖和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉，及任选地纤维素，油和脂肪例如豆油、葵花子油、花生油和椰子油，脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇例如甘油和乙醇，及有机酸例如乙酸可用作碳源。这些物质可单独应用或作为混合物应用。

有机含氮化合物如胨、酵母提取物、肉膏、麦芽膏、玉米浸液、大豆粉和尿素，或者无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和柠檬酸铵可用作氮源。这些氮源可以单独使用或作为混合物使用。

磷酸、磷酸二氢钾或者磷酸氢二钾或者相应的含钠盐可用作磷源。培养基必须另外包含生长必需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外还可以应用必需的生长物质如氨基酸和维生素。合适的前体可以另外加入培养基中。起始物质可以单批加入培养物中，或者可以在培养期间以合适的方式补料。

发酵一般在pH5.5-9.0、特别是在6.0-8.0下进行。可以适当方式应用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或者酸性化合物如磷酸或硫酸，以控制培养物的pH。可以应用抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯以控制泡沫的产生。可以将具有选择作用的适当物质例如抗生素加入培养基中以保持质粒的稳定性。为保持有氧条件，将氧气或含氧气体混合物如空气导入培养物中。培养温度通常为25℃-45℃，优选30℃-40℃。持续培养直至形成最大量的L-氨基酸或L-苏氨酸。这个目标通常在10小时至160小时内达到。

L-氨基酸的分析可以如Spackman et al.(Analytical Chemistry，30：1190-1206(1958))所述，通过阴离子交换层析及随后的茚三酮衍生反应而进行，或者可以如Lindroth et al.(Analytical Chemistry 51：1167-1174(1979))所述通过反向HPLC进行。

本发明的方法用于发酵生产L-氨基酸，例如L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-高丝氨酸和L-赖氨酸，特别是L-苏氨酸。

大肠杆菌K-12菌株DH5α/pMAK705的纯培养物根据布达佩斯条约于2000年9月8日保藏在德国微生物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)，保藏号为DSM 13720。

本发明借助于如下实施例得以更详细的阐述。

培养大肠杆菌所使用的基本培养基(M9)和完全培养基(LB)由J.H.Miller(A Short Course in Bacterial Genetics(1992)，Cold SpringHarbor Laboratory Press)描述。质粒DNA从大肠杆菌中的分离及限制、连接、Klenow和碱性磷酸酶处理的所有技术均通过Sambrook等(Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press)所述技术进行。除非特别说明，大肠杆菌的转化通过Chung等(Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 86：2172-2175(1989))所述方法进行。

制备菌株和转化体的保温温度是37℃。在Hamilton等的基因置换方法中使用的温度是30℃和44℃。

实施例1：yjgF ORF的缺失突变的构建

使用聚合酶链反应(PCR)及合成寡核苷酸，从大肠杆菌K12中扩增位于yjgF ORF上游和下游的部分基因区域以及yjgF ORF的部分5’和3’区域。从yjgF ORF的核苷酸序列及位于大肠杆菌K12 MG1655(SEQ ID NO：1，登记号AE000495)上游和下游的序列出发，合成如下PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)：

yjgF-1：5-TCGCGATCTGGTACTGTAAG-3(SEQ ID NO：3)

yjgF-2：5-CTGTACGTAAGGACCGATAG-3(SEQ ID NO：4)

yjgF-3：5-CGCTGTTCGTCGCTAATCTT-3(SEQ ID NO：5)

yjgF-4：5-GATCTTCTTCGGACCGATCA-3(SEQ ID NO：6)

用于PCR的大肠杆菌K12 MG1655染色体DNA根据厂商指导用“Qiagen Genomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，Germany)分离。来自yjgF ORF的5’区域的大小为622bp的一个DNA片段被称为yjgF5’并示于SEQ ID NO：7，来自yjgF ORF的3’区域的大小为612bp的一个DNA片段被称为yjgF3’并示于SEQ ID NO：8，这两个片段可以使用特异性引物，用Taq-DNA聚合酶(Gibco-BRL，Eggenstein，Germany)在标准PCR条件下扩增(Innis et al.(1990)PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，Academic Press)。

将每个PCR产物根据厂商指导与载体pCR2.1TOPO(TOPO TACloning Kit，Invitrogen，Groningen，The Netherlands)连接并转化入大肠杆菌菌株TOP10F′中。在加入50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA后，将载体pCR2.1yjgF5′用限制酶Ec1136II和XbaI切割，随后在0.8％琼脂糖凝胶中分离，yjgF5′片段借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)分离。分离质粒DNA之后，将载体pCR2.1yjgF3′用酶EcoRV和XbaI切割并与分离的yjgF5′片段连接。将大肠杆菌菌株DH5α用连接混合物转化并在加入了50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。分离质粒DNA之后，将克隆有SEQ ID NO：9所示突变DNA序列的那些质粒通过用酶HindIII/XbaI和StuI/HincII对照切割而进行检测。这些质粒有一个被称作pCR2.1TOPOΔyjpF。

实施例2：置换载体pMAK705ΔyjgF的构建

实施例1所述缺失的yjgF ORF在用酶HindIII和XbaI消化载体pCR2.1TOPOΔyjgF并在0.8％琼脂糖凝胶中分离之后从所述载体中分离，并与已经用酶HindIII和Xbal消化的质粒pMAK705(Hamilton etal.(1989)Journal of Bacteriology 171，4617-4622)连接。将连接混合物转化进DH5α中并在加入了20μg/ml氯霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA并用酶HindIII/XbaI和PstI切割后，证实克隆成功。形成的置换载体pMAK705ΔyjgF(＝pMAK705deltayjgF)如图1所示。

实施例3：大肠杆菌菌株MG442中yjgF ORF的位点特异性诱变

生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株MG442在专利说明书US-A-4.278.765中描述，并保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM，Moscow，Russia)，保藏号为CMIM B-1628。

为了用质粒编码的缺失构建体置换染色体yjgF ORF，将MG442用质粒pMAK705ΔyjgF转化。基因置换通过Hamilton等(1989)Journalof Bacteriology 171，4617-4622)所述选择方法进行，并使用如下引物通过标准PCR方法证实(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press)：

yjgF-1：5′-TCGCGATCTGGTACTGTAAG-3′(SEQ ID NO：3)

yjgF-4：5′-GATCTTCTTCGGACCGATCA-3′(SEQ ID NO：6)

在发生置换后，MG442含有SEQ ID NO：10所示ΔyjgF等位基因形式。获得的菌株称作MG442ΔyjgF。

实施例4：使用菌株MG442ΔyjgF制备L-苏氨酸

MG442ΔyjgF在具有如下成分的基本培养基上培养：3.5g/lNa₂HPO₄*2H₂O，1.5g/l KH₂PO₄，1g/l NH₄Cl，0.1g/l MgSO₄*7H₂O，2g/l葡萄糖，20g/l琼脂。在100ml锥形瓶中的10ml分批培养物中检测L-苏氨酸的形成。为此，接种具有如下成分的10ml预培养基：2g/l酵母提取物，10g/l(NH₄)₂SO₄，1g/l KH₂PO₄，0.5g/lMgSO₄*7H₂O，15g/l CaCO₃，20g/l葡萄糖，并将混合物在来自KhnerAG(Birsfelden，Switzerland)的ESR温箱上在37℃以180rpm保温16小时。将250μl这种预培养物接种进10ml生产培养基(25g/l(NH₄)₂SO₄，2g/l KH₂PO₄，1g/lMgSO₄*7H₂O，0.03g/l FeSO₄*7H₂O，0.018g/l MnSO₄*1H₂O，30g/l CaCO₃，20g/l葡萄糖)，并将混合物在37℃保温48小时。在保温后，培养物悬浮液的光密度(OD)用来自Dr-Lange(Dusseldorf，Germany)的LP2W光度计在660nm测定波长测定。

然后使用来自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)的氨基酸分析仪，通过离子交换层析和带有茚三酮检测的柱后反应，确定无菌过滤的培养上清中形成的L-苏氨酸的浓度。

实验结果示于表1。

表1

菌株	OD(660nm)	L-苏氨酸
菌株	OD(660nm)	L-苏氨酸	MG442	6.0	1.5
MG442ΔyigF	6.3	2.1	MG442	6.0	1.5

附图简述

图1：pMAK705ΔyjgF(＝pMAK705deltayjgF)。

长度数据是近似值。所用缩写和名称具有如下含义：

·cat：氯霉素抗性基因

·rep-ts：质粒pSC101的温度敏感性复制区

·yjgF5’：yjgF ORF的5’区域以及上游区域的一部分

·yjgF3’：yjgF ORF的3’区域以及下游区域的一部分

限制酶的缩写具有如下含义：

·EcoRV：来自大肠杆菌RY13的限制性内切核酸酶

·Ec1136II：来自大肠杆菌的限制性内切核酸酶

·HincII：来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)R_C的限制性内切核酸酶

·HindIII：来自流感嗜血杆菌R_D的限制性内切核酸酶

·PstI：来自Providencia stuartii的限制性内切核酸酶

·StuI：来自Streptomyces tubercidicus的限制性内切核酸酶

·XbaI：来自Xanthomonas badrii的限制性内切核酸酶

序列表

<110>德古萨股份公司

<120>使用含有弱化的yjgF ORF序列的肠杆菌科菌株发酵生产L-氨基酸的方法

<130>020491 BT

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1548

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>DNA

<222>(1)..(1548)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(527)..(952)

<223>yjgF-Orf

<400>1

tcgcgatctg gtactgtaag gggaaataga gatgacacac gataataaat tgcaggttga 60

agctattaaa cgcggcacgg taattgacca tatccccgcc cagatcggtt ttaagctgtt 120

gagtctgttc aagctgaccg aaacggatca gcgcatcacc attggtctga acctgccttc 180

tggcgagatg ggccgcaaag atctgatcaa aatcgaaaat acctttttga gtgaagatca 240

agtagatcaa ctggcattgt atgcgccgca agccacggtt aaccgtatcg acaactatga 300

agtggtgggt aaatcgcgcc caagtctgcc ggagcgcatc gacaatgtgc tggtctgccc 360

gaacagcaac tgtatcagcc atgccgaacc ggtttcatcc agctttgccg tgcgaaaacg 420

cgccaatgat atcgcgctca aatgcaaata ctgtgaaaaa gagttttccc ataatgtggt 480

gctggccaat taattgcggt tggtaataaa agtctggctc cctata atg agc cag 535

Met Ser Gln

1

act ttt tac cgc tgt aat aaa gga gaa atc atg agc aaa act atc gcg 583

Thr Phe Tyr Arg Cys Asn Lys Gly Glu Ile Met Ser Lys Thr Ile Ala

5 10 15

acg gaa aat gca ccg gca gct atc ggt cct tac gta cag ggc gtt gat 631

Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro Tyr Val Gln Gly Val Asp

20 25 30 35

ctg ggc aat atg atc atc acc tcc ggt cag atc ccg gta aat ccg aaa 679

Leu Gly Asn Met Ile Ile Thr Ser Gly Gln Ile Pro Val Asn Pro Lys

40 45 50

acg ggc gaa gta ccg gca gac gtc gct gca cag gca cgt cag tcg ctg 727

Thr Gly Glu Val Pro Ala Asp Val Ala Ala Gln Ala Arg Gln Ser Leu

55 60 65

gat aac gta aaa gcg atc gtc gaa gcc gct ggc ctg aaa gtg ggc gac 775

Asp Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala Gly Leu Lys Val Gly Asp

70 75 80

atc gtt aaa act acc gtg ttt gta aaa gat ctg aac gac ttc gca acc 823

Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp Leu Asn Asp Phe Ala Thr

85 90 95

gta aac gcc act tac gaa gcc ttc ttc acc gaa cac aac gcc acc ttc 871

Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr Glu His Asn Ala Thr Phe

100 105 110 115

ccg gca cgt tct tgc gtt gaa gtt gcc cgt ctg ccg aaa gac gtg aag 919

Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg Leu Pro Lys Asp Val Lys

120 125 130

att gag atc gaa gcg atc gct gtt cgt cgc taa tcttgatgga aatccgggct 972

Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg

135 140

atcatgcccg gattaagtct gatgacaaac gcaaaatcgc ctgatgcgct acgcttatca 1032

ggcctacgtg attcctgcaa tttattgaat ttgttggccg gataaggcat ttacgccgca 1092

tccggcatga acaaaactca ctttgtctac aatctgaatc ggggctatcg tgcccagttt 1152

attctttatt gccagccgta acgacggcta tagaaccctt tcaccaactg ggttaatgtc 1212

atataccctg ccagaatcgc aaccagccac gggaaatagc ttaacggcag cgcctgtaat 1272

tgcagataac tggccagcgg tgaaaacggc aatgcgatcc cgacaatcat cacgatcacg 1332

gtcatgatca ttaacggcca cgatgcacag ctctgaataa acggcacacg gcgggtgcgg 1392

atcatatgca caatcagcgt ttgcgacagt aagcccacca caaaccatcc cgactggaac 1452

agcgtttgcg tttccggcgt gttggcatgg aatacccacc acatcaggca aaacgtcaaa 1512

atatcgaaga tcgagctgat cggtccgaag aagatc 1548

<210>2

<211>141

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<400>2

Met Ser Gln Thr Phe Tyr Arg Cys Asn Lys Gly Glu Ile Met Ser Lys

1 5 10 15

Thr Ile Ala Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro Tyr Val Gln

20 25 30

Gly Val Asp Leu Gly Asn Met Ile Ile Thr Ser Gly Gln Ile Pro Val

35 40 45

Asn Pro Lys Thr Gly Glu Val Pro Ala Asp Val Ala Ala Gln Ala Arg

50 55 60

Gln Ser Leu Asp Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala Gly Leu Lys

65 70 75 80

Val Gly Asp Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp Leu Asn Asp

85 90 95

Phe Ala Thr Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr Glu His Asn

100 105 110

Ala Thr Phe Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg Leu Pro Lys

115 120 125

Asp Val Lys Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg

130 135 140

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>Primer

<222>(1)..(20)

<223>yjgF-1

<400>3

tcgcgatctg gtactgtaag 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>Primer

<222>(1)..(20)

<223>yjgF-2

<400>4

ctgtacgtaa ggaccgatag 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>Primer

<222>(1)..(20)

<223>yjgF-3

<400>5

cgctgttcgt cgctaatctt 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>Primer

<222>(1)..(20)

<223>yjgF-4

<400>6

gatcttcttc ggaccgatca 20

<210>7

<211>622

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(622)

<223>PCR product yjgF5′

<400>7

tcgcgatctg gtactgtaag gggaaataga gatgacacac gataataaat tgcaggttga 60

agctattaaa cgcggcacgg taattgacca tatccccgcc cagatcggtt ttaagctgtt 120

gagtctgttc aagctgaccg aaacggatca gcgcatcacc attggtctga acctgccttc 180

tggcgagatg ggccgcaaag atctgatcaa aatcgaaaat acctttttga gtgaagatca 240

agtagatcaa ctggcattgt atgcgccgca agccacggtt aaccgtatcg acaactatga 300

agtggtgggt aaatcgcgcc caagtctgcc ggagcgcatc gacaatgtgc tggtctgccc 360

gaacagcaac tgtatcagcc atgccgaacc ggtttcatcc agctttgccg tgcgaaaacg 420

cgccaatgat atcgcgctca aatgcaaata ctgtgaaaaa gagttttccc ataatgtggt 480

gctggccaat taattgcggt tggtaataaa agtctggctc cctataatga gccagacttt 540

ttaccgctgt aataaaggag aaatcatgag caaaactatc gcgacggaaa atgcaccggc 600

agctatcggt ccttacgtac ag 622

<210>8

<211>612

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(612)

<223>PCR product yjgF3′

<400>8

cgctgttcgt cgctaatctt gatggaaatc cgggctatca tgcccggatt aagtctgatg 60

acaaacgcaa aatcgcctga tgcgctacgc ttatcaggcc tacgtgattc ctgcaattta 120

ttgaatttgt tggccggata aggcatttac gccgcatccg gcatgaacaa aactcacttt 180

gtctacaatc tgaatcgggg ctatcgtgcc cagtttattc tttattgcca gccgtaacga 240

cggctataga accctttcac caactgggtt aatgtcatat accctgccag aatcgcaacc 300

agccacggga aatagcttaa cggcagcgcc tgtaattgca gataactggc cagcggtgaa 360

aacggcaatg cgatcccgac aatcatcacg atcacggtca tgatcattaa cggccacgat 420

gcacagctct gaataaacgg cacacggcgg gtgcggatca tatgcacaat cagcgtttgc 480

gacagtaagc ccaccacaaa ccatcccgac tggaacagcg tttgcgtttc cggcgtgttg 540

gcatggaata cccaccacat caggcaaaac gtcaaaatat cgaagatcga gctgatcggt 600

ccgaagaaga tc 612

<210>9

<211>1411

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1411)

<223>

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(57)

<223>Technical DNA/residues of polylinker sequence

<220>

<221>misc_feature

<222>(58)..(671)

<223>Part of the upstream region and part of the 5′region of the

yjgF Orf

<220>

<221>misc_feature

<222>(672)..(737)

<223>Technical DNA/residues of polylinker sequence

<220>

<221>misc_feature

<222>(738)..(1359)

<223>Part of the 3′region of the yjgF Orf and part of the downstream

region

<220>

<221>misc_feature

<222>(1359)..(1411)

<223>Technical DNA/residues of polylinker sequence

<400>9

agcttggtac cgagctcgga tccactagta acggccgcca gtgtgctgga attcgccctt 60

gatcttcttc ggaccgatca gctcgatctt cgatattttg acgttttgcc tgatgtggtg 120

ggtattccat gccaacacgc cggaaacgca aacgctgttc cagtcgggat ggtttgtggt 180

gggcttactg tcgcaaacgc tgattgtgca tatgatccgc acccgccgtg tgccgtttat 240

tcagagctgt gcatcgtggc cgttaatgat catgaccgtg atcgtgatga ttgtcgggat 300

cgcattgccg ttttcaccgc tggccagtta tctgcaatta caggcgctgc cgttaagcta 360

tttcccgtgg ctggttgcga ttctggcagg gtatatgaca ttaacccagt tggtgaaagg 420

gttctatagc cgtcgttacg gctggcaata aagaataaac tgggcacgat agccccgatt 480

cagattgtag acaaagtgag ttttgttcat gccggatgcg gcgtaaatgc cttatccggc 540

caacaaattc aataaattgc aggaatcacg taggcctgat aagcgtagcg catcaggcga 600

ttttgcgttt gtcatcagac ttaatccggg catgatagcc cggatttcca tcaagattag 660

cgacgaacag cgaagggcga attctgcaga tctcggatcc actagtaacg gccgccagtg 720

tgctggaatt cgcccttctg tacgtaagga ccgatagctg ccggtgcatt ttccgtcgcg 780

atagttttgc tcatgatttc tcctttatta cagcggtaaa aagtctggct cattataggg 840

agccagactt ttattaccaa ccgcaattaa ttggccagca ccacattatg ggaaaactct 900

ttttcacagt atttgcattt gagcgcgata tcattggcgc gttttcgcac ggcaaagctg 960

gatgaaaccg gttcggcatg gctgatacag ttgctgttcg ggcagaccag cacattgtcg 1020

atgcgctccg gcagacttgg gcgcgattta cccaccactt catagttgtc gatacggtta 1080

accgtggctt gcggcgcata caatgccagt tgatctactt gatcttcact caaaaaggta 1140

ttttcgattt tgatcagatc tttgcggccc atctcgccag aaggcaggtt cagaccaatg 1200

gtgatgcgct gatccgtttc ggtcagcttg aacagactca acagcttaaa accgatctgg 1260

gcggggatat ggtcaattac cgtgccgcgt ttaatagctt caacctgcaa tttattatcg 1320

tgtgtcatct ctatttcccc ttacagtacc agatcgcgaa agggcgaatt ctgcagatat 1380

ccatcacact ggcggccgct cgagcatgca t 1411

<210>10

<211>177

<212>DNA

<213>Articifial sequence

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(177)

<223>

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

<223>Start codon of the delta yjgF Orf

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(99)

<223>5′region of the delta yjgF Orfs

<220>

<221>misc_feature

<222>(100)..(162)

<223>Technical DNA/residues of polylinker sequence

<220>

<221>misc_feature

<222>(163)..(174)

<223>3′region of the delta yjgF Orf

<220>

<221>misc_feature

<222>(175)..(177)

<223>Stop codon of the delta yjgF Orf

<400>10

atgagccaga ctttttaccg ctgtaataaa ggagaaatca tgagcaaaac tatcgcgacg 60

gaaaatgcac cggcagctat cggtccttac gtacagaagg gcgaattcca gcacactggc 120

ggccgttact agtggatccg agatctgcag aattcgccct tcgctgttcg tcgctaa 177

<210>11

<211>387

<212>DNA

<213>Salmonella typhimurium

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(387)

<223>yjgF Orf

<400>11

atg agc aaa act att gcg acg gaa aat gca cca gca gca atc ggc cca 48

Met Ser Lys Thr Ile Ala Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro

1 5 10 15

tac gta cag ggc gtt gac ctg ggt agc atg gta atc act tcc ggt cag 96

Tyr Val Gln Gly Val Asp Leu Gly Ser Met Val Ile Thr Ser Gly Gln

20 25 30

atc ccg gtc gat ccg aaa acc ggt gcc gta gcg gaa gac gta tcc gct 144

Ile Pro Val Asp Pro Lys Thr Gly Ala Val Ala Glu Asp Val Ser Ala

35 40 45

cag gca cgt cag tcg ctg gaa aac gtt aaa gct atc gtg gaa gcc gct 192

Gln Ala Arg Gln Ser Leu Glu Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala

50 55 60

ggc ctg aaa gta ggc gac att gtg aaa acg acc gta ttc gtg aaa gac 240

Gly Leu Lys Val Gly Asp Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp

65 70 75 80

ctg aac gat ttc gcg acc gtc aac gcc acc tac gaa gcc ttc ttc acc 288

Leu Asn Asp Phe Ala Thr Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr

85 90 95

gag cac aac gcc acc ttc ccg gcg cgt tcc tgc gtg gaa gtt gcc cgt 336

Glu His Asn Ala Thr Phe Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg

100 105 110

ctg ccg aaa gac gtg aaa att gag att gaa gcg atc gct gtt cgt cgc 384

Leu Pro Lys Asp Val Lys Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg

115 120 125

taa 387

<210>12

<211>128

<212>PRT

<213>Salmonella typhimurium

<400>12

Met Ser Lys Thr Ile Ala Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro

1 5 10 15

Tyr Val Gln Gly Val Asp Leu Gly Ser Met Val Ile Thr Ser Gly Gln

20 25 30

Ile Pro Val Asp Pro Lys Thr Gly Ala Val Ala Glu Asp Val Ser Ala

35 40 45

Gln Ala Arg Gln Ser Leu Glu Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Glu His Asn Ala Thr Phe Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg

100 105 110

Leu Pro Lys Asp Val Lys Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg

115 120 125

Claims

1.生产L-氨基酸、特别是L-苏氨酸的方法，其中进行如下步骤：

a)发酵生产所需L-氨基酸的肠杆菌科的微生物，其中所述微生物的yjgF ORF或其编码核苷酸序列被弱化，特别是被消除，及

b)浓缩培养基或微生物细胞中的所需L-氨基酸。

2.权利要求1的方法，其中分离所需L-氨基酸，产物中任选保留全部或部分(＞0-100％)发酵肉汤和/或生物量的组分。

3.通过发酵肠杆菌科的微生物而生产L-氨基酸、特别是L-苏氨酸或者包含这些化合物的饲料添加剂的方法，其中所述微生物的yjgFORF或其编码核苷酸序列被弱化，特别是被消除，并且分离所需产物。

4.权利要求1、2或3的方法，其中通过弱化yjgF ORF使得yjgFORF基因产物的活性或浓度降低至野生型蛋白质或者起始微生物中的活性或浓度的0-75％。

5.权利要求1、2或3的方法，其中采用这样的微生物，所述微生物中所需L-氨基酸的生物合成途径的另外基因被额外增强。

6.权利要求1、2或3的方法，其中采用这样的微生物，所述微生物中降低所需L-氨基酸形成的代谢途径至少被部分地消除。

7.权利要求1、2或3的方法，其中编码开放读框yjgF的产物的多核苷酸的表达被弱化，特别是被消除。

8.权利要求1或4的方法，其中开放读框yjgF的多核苷酸所编码的多肽的调节和/或催化性质被降低。

9.权利要求1或3的生产L-氨基酸的方法，其中发酵这样的肠杆菌科微生物，所述微生物中选自如下一组的一或多个基因同时被额外增强，尤其被过表达：

9.1编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶，高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子，

9.2编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，

9.3编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因，

9.4编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因，

9.5编码转氢酶的pntA和pntB基因，

9.6赋予高丝氨酸抗性的rhtB基因，

9.7编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因，

9.8赋予苏氨酸抗性的rhtC基因，

9.9编码苏氨酸输出蛋白的thrE基因，

9.10编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因，

9.11编码DNA结合蛋白HLP-II的hns基因，

9.12编码葡糖磷酸变位酶的pgm基因，

9.13编码果糖二磷酸醛缩酶的fba基因，

9.14编码磷酸组氨酸蛋白己糖磷酸转移酶的ptsH基因，

9.15编码磷酸转移酶系统的酶I的ptsI基因，

9.16编码葡萄糖特异性IIA成分的crr基因，

9.17编码葡萄糖特异性IIBC成分的ptsG基因，

9.18编码亮氨酸调节子的调节物的lrp基因，

9.19编码全局调节物Csr的csrA基因，

9.20编码fad调节子的调节物的fadR，

9.21编码中心中间代谢的调节物的iclR基因，

9.22编码10Kd侣伴蛋白的mopB基因，

9.23编码烷基氢过氧化物还原酶的小亚基的ahpC基因，

9.24编码烷基氢过氧化物还原酶的大亚基的ahpF基因，

9.25编码半胱氨酸合酶A的cysK基因，

9.26编码cys调节子的调节物的cysB基因，

9.27编码NADPH亚硫酸盐还原酶的黄素蛋白的cysJ基因，

9.28编码NADPH亚硫酸盐还原酶的血蛋白的cysI基因，

9.29编码腺苷酰硫酸还原酶的cysH基因，

9.30编码pho调节子的阳性调节物PhoB的phoB基因，

9.31编码pho调节子的传感蛋白的phoR基因，

9.32编码外细胞膜蛋白E的phoE基因，

9.33编码果糖刺激的丙酮酸激酶I的pykF基因，

9.34编码6-果糖磷酸激酶II的pfkB基因，

9.35编码麦芽糖转运的周质结合蛋白的malE基因，

9.36编码超氧化物歧化酶的sodA基因，

9.37编码具有抗sigmaE活性的膜蛋白的rseA基因，

9.38编码sigmaE因子的全局调节物的rseC基因，

9.39编码2-酮戊二酸脱氢酶的脱羧酶亚基的sucA基因，

9.40编码2-酮戊二酸脱氢酶的二氢硫辛酸转琥珀酸酶E2亚基的sucB基因，

9.41编码琥珀酰-CoA合成酶的β亚基的sucC基因，

9.42编码琥珀酰-CoA合成酶α亚基的sucD基因，

9.43编码腺苷酸激酶的adk基因，

9.44编码具有侣伴蛋白样功能的周质蛋白的hdeA基因，

9.45编码具有侣伴蛋白样功能的周质蛋白的hdeB基因，

9.46编码异柠檬酸脱氢酶的icd基因，

9.47编码周质半乳糖结合转运蛋白的mglB基因，

9.48编码二氢硫辛酰胺脱氢酶的lpd基因，

9.49编码丙酮酸脱氢酶复合物的E1成分的aceE基因，

9.50编码丙酮酸脱氢酶复合物的E2成分的aceF基因，

9.51编码氨肽酶B的pepB基因，

9.52编码醛脱氢酶的aldH基因，

9.53编码离子贮存同源蛋白的bfr基因，

9.54编码尿苷磷酸化酶的udp基因，和

9.55编码sigma E因子活性的调节物的rseB基因。

10.权利要求1或3的生产L-氨基酸的方法，其中发酵这样的肠杆菌科的微生物，所述微生物中选自如下一组的一或多个基因表达同时被额外弱化，尤其是被消除或降低：

10.1编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因，

10.2编码苹果酸脱氢酶的mdh基因，

10.3开放读框(orf)yjfA的基因产物，

10.4开放读框(orf)ytfP的基因产物，

10.5编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因，

10.6编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，

10.7编码异柠檬酸裂合酶的aceA基因，

10.8编码磷酸转移酶系统的DgsA调节物的dgsA基因，

10.9编码果糖阻抑物的fruR基因，

10.10编码sigma³⁸因子的rpoS基因，

10.11编码天冬氨酸铵裂合酶(天冬氨酸酶)的aspA基因，和

10.12编码苹果酸合酶A的aceB基因。