BRPI0318058B1 - Processo para preparação fermentativa de l-treoninas usando cepas da família enterobacteriaceae que contêm uma sequência orf yjgf atenuada - Google Patents

Processo para preparação fermentativa de l-treoninas usando cepas da família enterobacteriaceae que contêm uma sequência orf yjgf atenuada Download PDF

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Evonik Degussa Gmbh
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Abstract

"processo para a preparação fermentativa de l-aminoácidos usando cepas da família enterobacteria-ceae que contêm uma seqüência orf yjgf atenuada". a presente invenção refere-se a um processo para a preparação de l-aminoácidos, em particular l-treonina, em que as seguintes etapas são realizadas: a)fermentação de microorganismos da família enterobacteriace-ae que produz o l-aminoácido desejado e em que a seqüência de orf yjgf ou nucleotídeos que codifica é atenuada, em particular eliminada, b) concentração de l-aminoácido no meio ou nas células da bactéria, e opcionalmente c) isolamento do l-aminoácio.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO PARA PREPARAÇÃO FERMENTATIVA DE L-TREONINAS USANDO CEPAS DA FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE QUE CONTÊM UMA SEQUÊNCIA ORF YJGF ATENUADA.
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a um processo para a preparação fermentativa de L-aminoácidos, em particular L-treonina, usando cepas da família Enterobacteriaceae onde o quadro de leitura aberto (ORF) com a designação yjgF é atenuado.
Técnica Anterior
L-aminoácidos, em particular L-treonina, são usados em medicina humana e nas indústrias farmacêuticas, na indústria de alimentos e muito particularmente em nutrição animal.
É conhecido preparar-se L-aminoácidos através de fermentação de cepas de Enterobacteriaceae, em particular Escherichia coli (E. coli) e Serratia marcescens. Devido sua grande importância, trabalho é constantemente empreendido para aperfeiçoamento de processos de preparação. Aperfeiçoamentos para o processo podem se relacionar a medidas de fermentação, tais como, por exemplo, agitação e suprimento de oxigênio, ou a composição dos meios nutrientes, como, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fermentação ou o trabalho para a forma produto, através de, por exemplo, cromatografia de troca de ions, ou as intrínsecas propriedades de produção dos próprios micro-organismos.
Métodos de mutagênese, seleção e seleção de mutante são usados para aperfeiçoamento das propriedades de produção destes microorganismos. Cepas que são resistentes a antimetabólitos, como, por exemplo, o análogo de treonina ácido alfa-amino-beta-hidroxi valérico (AHV), ou são auxotróficos para metabólitos de importância reguladora e produzem Laminoácidos, tais como, por exemplo, L-treonina, são obtidos desta maneira.
Processos da técnica de DNA recombinante também têm sido empregados a alguns anos para aperfeiçoamento de cepa da família Enterobacteriaceae que produzem L-aminoácidos, através de amplificação de
Petição 870160032352, de 29/06/2016, pág. 7/31
genes de biossíntese de aminoácido individual e investigando o efeito sobre a produção. Resumo de informação sobre a biologia de célula e molecular de Escherichia coli e Salmonella é para ser encontrada em Neidhardt (ed): Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, 2nd edition, 5 ASM Press, Washington, D.C., USA.
Objeto da Invenção
O objeto da invenção é prover novas medidas para aperfeiçoada preparação fermentativa de L-aminoáctdos, em particular L-treonina. Sumário da Invenção
A invenção provê um processo para a preparação fermentativa de L-aminoácidos, em particular L-treonina, usando microorganismos da família Enterobacteriaceae que, em particular, já produzem L-aminoácidos e onde pelo menos a seqüência de nucleotídeos que codifica o ORF yjgF ou seus alelos é ou são atenuadas.
Descrição Detalhada da Invenção
Onde L-aminoácidos ou aminoácidos são mencionados no que se segue, isto significa um ou mais aminoácidos, incluindo seus sais, escolhidos do grupo consistindo em L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina,
L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano, e L-arginina. L-treonina é particularmente preferida.
O termo atenuação neste sentido descreve a redução ou eliminação da atividade intracelular ou concentração de uma ou mais enzimas ou proteínas em um microorganismo que são codificadas pelo correspondente
DNA, por exemplo, através do uso de um promotor fraco ou um gene ou alelo ou ORF que codifica uma correspondente enzima ou proteína com uma baixa atividade ou inativa a correspondente enzima ou proteína ou gene ou
ORF e opcionalmente combinando estas medidas.
Quadro de leitura aberto (ORF) descreve uma seção de uma seqüência de nucleotídeo que codifica ou pode codificar uma proteína ou polipeptídeo ou ácido ribonucléico ao qual nenhuma função pode ser cedida de acordo com a técnica anterior. Após designação de uma função para a seção
de seqüência de nucleotídeo em questão, ela é em geral referida como um gene. Alelos são em geral entendidos como significando variantes de um dado gene. Estes são distinguidos por diferenças na seqüência de nucleotídeos.
A proteína codificada por uma sequência de nucleotídeos, isto é, um ORF, um gene ou um alelo, ou o ácido ribonucléico codificado é em geral * chamado o produto de gene.
Através de medidas de atenuação, a atividade ou concentração da correspondente proteína de acordo com a invenção ou também de proteínas da técnica anterior é em geral reduzida para 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a φ 10 25%, 0 a 10%, ou 0 a 5% da atividade ou concentração da proteína tipo selvagem ou da atividade ou concentração da proteína no microorganismo de partida. O microorganismo de partida é entendido como significando o microorganismo sobre o qual as medidas inventivas são realizadas.
* O processo é caracterizado em que as seguintes etapas são realizadas:
a) fermentação de microorganismos da família Enterobacteriaceae que produzem o desejado L-aminoácido e nos quais o ORF yjgF ou
1/L seqüências de nucleotídeos para o mesmo é ou são atenuados,
b) concentração do correspondente L-aminoácido no meio ou nas
células dos microorganismos da família Enterobacteriaceae, e opcionalmente
c) isolamento do desejado L-aminoácido, constituintes do caldo de fermentação e/ou a biomassa em sua totalidade ou porções (>0 a 100%) do mesmo opcionalmente restando no produto.
Os microorganismos, em particular microorganismos recombi25 nantes, que a presente invenção provê podem produzir L-aminoácidos a partir de glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, opcionalmente amido, opcionalmente celulose ou a partir de glicerol e etanol. Eles são representativos da família Enterobacteriaceae escolhida dos gêneros Escheri chia, Erwinia, Providencia e Serratia. Os gêneros Escherichia e Serratia são preferidos. Do gênero Escherichia em particular as espécies Escherichia coli e do gênero Serratia em particular as espécies Serratia marcescens são pa ra serem mencionadas.
Apropriadas cepas, que produzem L-treonina em particular, do gênero Escherichia, em particular das espécies Escherichia coli, são, por exemplo,
- Escherichia coli Η458Ϊ (EP 0 301 572)
- Escherichia coli KY10935 (Bi-os-cience
Biõtechnology and Biochemistry 61(11):1877-1882 (1997)
- Escherichia coli
- Escherichia coli
- Escherichia coli
- Escherichia coli
- Escherichia coli
- Escherichia coli
VNIIgenetika MG442
VNIIgenetika Ml
VNITgenetika 472T23
BKIIM B-3996 kat 13
KCCM-10132 (US-A-4278,765) (US-A-4.321.325) (US-A-5,631,157) (US-A-5.175.107) (WO 98/04715) (WO 00/09660)
Apropriadas cepas produzindo L-treonina do gênero Serratia, em particular das espécies Serratia marcescens, são, por exemplo,
- Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental
Microbiology 38(6): 1045-1051 (1979))
- Serratia marcescens TLrl56 (Gene 57(2-3): 151-158 (1987))
- Serratia marcescens T-2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37(3): 255-265 (1992))
Cepas da família Enterobacteriaceae que produzem L-treonina preferivelmente têm, inter alia, uma ou mais características genéticas ou fenotípicas escolhidas do grupo consistindo em: resistência a ácido alfa-aminobeta-hidróxi valérico, resistência a tialisina, resistência a etionina, resistência 10 a alfa-metil serina, resistência a ácido diaminos succínico, resistência a ácido alfa-aminobutírico, resistência a borrelidina, resistência a ácido ciclo pentano carboxilico, resistência a rifampicina, resistência a análogos de valina, tais como, por exemplo, hidroxamato de valina, resistência a análogos de
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purina, tais como, por exemplo, 6-dimetilaminopurina, uma necessidade por L-metionina, opcionalmente uma necessidade parcial e compensável por L-isoleucina, uma necessidade por ácido meso-diaminopimélico, auxotrofia em relação a dipeptídeos contendo treonina, resistência a L-treonina, resistência 5 a rafinato de treonina, resistência a L-homosserina, resistência a L-lisina, * resistência a L-metionina, resistência ácido L-glutâmico, resistência a L-aspartato, resistência a L-leucina, resistência a L-fenilalanina, resistência a L-serina, resistência a L-cisteína, resistência a L-valina, sensitividade a fluorpiruvato, treonina desidrogenase defectiva, opcionalmente uma habilidade para utiliφ 10 zação de sacarose, aperfeiçoamento do óperon treonina, aperfeiçoamento de homosserina desidrogenase l-aspartato cinase l, preferivelmente da forma resistente a retroalimentação, aperfeiçoamento de homosserina cinase, aperfeiçoamento de treonina sintase, aperfeiçoamento de aspartato cinase, • opcionalmente da forma resistente a retroalimentação, aperfeiçoamento de aspartato semi-aldeído desidrogenase, aperfeiçoamento de fosfoenol piruva« to carboxilase, opcionalmente da forma resistente a retroalimentação, aperfeiçoamento de fosfoenol piruvato sintase, aperfeiçoamento de transidrogenase, aperfeiçoamento do produto de gene RhtB, aperfeiçoamento do produto de gene RhtC, aperfeiçoamento do produto de gene YfiK, aperfeiçoamen20 to de um piruvato carboxilase, e atenuação de formação de ácido acético.
Foi verificado que microorganismos da família Enterobacteriaceae produzem L-aminoácidos, em particular L-treonina, em uma maneira aperfeiçoada após atenuação, em particular eliminação, do gene yjgF ou quadro de leitura aberto (ORF) ou seus alelos.
As seqüências de nucleotídeos dos genes ou quadros de leitura abertos (ORF) de Escherichia coli pertencem à técnica anterior e podem ser encontradas na seqüência de genoma de Escherichia coli publicada por Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)).
O ORF yjgF de Escherichia coli K12 é descrito, inter alia, pelos seguintes dados:
Descrição: quadro de leitura aberto
Função:
função desconhecida
Descrição: o quadro de leitura aberto yjgF codifica uma proteína de 15,1 kDa, o ponto isoelétrico é 5,8; cromossomalmente localizado, por exemplo, E. coli K12 MG1655 ele está na região intergene dos genes mgtA, que 5 codificam uma ATPase de transporte de Mg2+ de
P-Typ-1, e o gene pyrl, que codifica a subunidade reguladora de aspartato carbamoiltransferase
Referência: Wasinger VC. and Humphery-Smith I.; FEMS Microbiology Letters 169(2):375-382 (1998) Volz K.;
Protein Science 8(11):2428-2437 (1999); Parsons et al.; Biochemistry 42(1 ):80-89 (2003)
N- de acesso: AE000495
O ORF yjgF de Salmonella typhimurion é descrito, inter alia, na * seguinte referência: Enos-Berlage et al.; Journal of Bacteriology 180(24):
6519-6528(1998).
As sequências de ácidos nucléicos podem ser encontradas nos bancos de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) of the National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), o banco de dados de seqüência de nucleotídeos do European Molecular Biologies Laboratories
(EMBL, Heidelberg, Germany or Cambridge, UK) ou o banco de dados de DNA do Japão (DDBJ, Mishima, Japan).
Para melhor clareza, a sequência conhecida para o ORF yjgF de
Escherichia coli é mostrado sob SEQ ID NO: 1 e a seqüência, que é também conhecida, para o ORF yjgF de Salmonella typhimurium é mostrada sob
SEQ ID NO: 11. As proteínas codificadas por estes quadros de leitura são mostradas como SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 12.
Os quadros de leitura abertos descritos nos textos referências mencionados podem ser usadas de acordo com a invenção. Alelos destes quadros de leitura abertos ou genes, em particular de Enterobacteriaceae, 30 que resultam da degenerescência do código genético ou devido a mutações tais como são descritas abaixo podem além disso ser usados. O uso de genes endógenos ou quadros de leitura abertos é preferido.
Genes endógenos ou seqüências de nucleotídeos endógenas são entendidas como significando os genes ou quadros de leitura abertos, alelos ou seqüências de nucleotídeos presentes na população de uma espécie.
Alelos apropriados do ORF yjgF incluem aqueles que contêm mutações de função neutra ou mutações sentido. Estas incluem, inter alia, aquelas que conduzem a pelo menos uma (1) troca de aminoácido conservativa na proteína codificada pelos mesmos. O número máximo de trocas de aminoácidos conservativas pode se relacionar a 2, 3, 5, 10, 20 mas em nenhum caso mais que 30 aminoácidos. Através das trocas de aminoácido 10 conservativas mencionadas, a capacidade funcional é diminuída ou aumentada por 0% a não mais que 24%, 20%, 10%, 5%, 3%, 2% ou 1 %.
No caso de aminoácidos aromáticos, trocas conservativas são referidas quando fenilalanina, triptofano e tirosina são trocados uns pelos * outros. No caso de aminoácidos hidrofóbicos, trocas conservativas são refe15 ridas quando leucina, isoleucina e valina são trocados uns pelos outros. No caso de aminoácidos polares, trocas conservativas são referidas quando glutamina e asparagina são trocados um pelo outro. No caso de aminoácidos básicos, trocas conservativas são referidas quando arginina, lisina e histidina são trocados uns pelos outros. No caso de aminoácidos ácidos, trocas
conservativas são referidas quando ácido aspártico e ácido glutâmico são trocados um pelo outro. No caso de aminoácidos contendo grupos hidroxila, trocas conservativas são referidas quando serina e treonina são trocados um pelo outro. Todas as outras trocas de aminoácidos são chamadas trocas de aminoácidos não-conservativas.
Da mesma maneira, aquelas seqüências de nucleotídeos que codificam variantes das proteínas mencionadas que adicionalmente contêm um aumento ou diminuição de pelo menos um (1) aminoácido sobre o terminus N ou C também podem ser usadas. Este aumento ou diminuição não é mais que 30, 20, 10, 5, 3 ou 2 aminoácidos ou radicais aminoácidos.
Alelos apropriados também incluem aqueles que codificam proteínas nas quais pelo menos um (1) aminoácido é inserido (inserção) ou removido (supressão). O número máximo de tais mudanças, chamadas indels, podem se • · • ·
relacionara 2, 3, 5, 10, 20 mas em nenhum caso mais que 30 aminoácidos.
Alelos apropriados além disso incluem aqueles que são obteníveis por hibridização, em particular sob condições rigorosas, usando SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 11 ou suas partes, em particular as regiões codifican5 tes ou as seqüências complementares para as mesmas.
* Instruções para identificação de seqüências de DNA por meio de hibridização podem ser encontradas por aqueles versados, inter alia, no handbook The DIG System Users Guide for Filter Hybridization de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) e em Liebl et al. (Inφ 10 ternational Journal of Systematic Bacteriology 41:255-260 (1991)). A hibridização ocorre sob condições rigorosas, ou seja somente híbridos nos quais a sonda e seqüência alvo, isto é, os polinucleotídeos tratados com a sonda, são pelo menos 70% idênticos são formados. É conhecido que a rigorosida» de da hibridização, incluindo as etapas de lavagem, é influenciada ou deter15 minada através de variação de composição tampão, a temperatura e a concentração de sal. A reação de hibridização é em geral realizada sob uma rigorosidade relativamente baixa comparado com as etapas de lavagem (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
Um tampão correspondendo a tampão 5x SSC em uma tempe-
ratura de aproximadamente 50-68°C, por exemplo, pode ser empregado para a reação de hibridização. Sondas também podem hibridizar aqui com polinucleotídeos que são menos que 70% idênticos à seqüência da sonda. Tais híbridos são menos estáveis e são removidos por lavagem sob condições rigorosas. Isto pode ser obtido, por exemplo, através de diminuição de con25 centração de sal para 2x SSC e opcionalmente subseqüentemente 0,5x SSC (The DIG System Usei^s Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995) uma temperatura de aproximadamente 50-68°C sendo estabelecida. É opcionalmente possível diminuir a concen tração de sal para uma concentração correspondendo a 0,2x SSC ou 0,1x
SSC. Fragmentos de polinucleotídeos que são, por exemplo, 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% a 95% ou pelo menos 96% a 99% idênticos à seqüência da sonda empregada podem ser isolados através de aumento de • · • · · temperatura de hibridização em etapas a partir de 50°C para 68°C em etapas de aproximadamente 1-2°C. Ainda instruções sobre hibridização são obteníveis no mercado na forma de assim chamados kits (por exemplo, DIG Easy Hyb de Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalogue NQ 1603558).
Para obter-se uma atenuação, por exemplo, expressão dos genes ou quadros de leitura abertos ou as propriedades catalíticas da proteína enzima podem ser reduzidas ou eliminadas. As duas medidas podem ser opcionalmente combinadas.
A redução em expressão de gene pode ocorrer através de aproφ 10 priada cultura, por modificação genética (mutação) das estruturas sinais de expressão de gene ou também pela técnica de RN A anti-sentido. Estruturas sinais de expressão de gene são, por exemplo, genes repressores, genes ativadores, operadores, promotores, atenuadores, locais de ligação de ribossoma, o códon de partida e terminadores. Aqueles versados podem encon15 trar informação neste sentido, inter alia, por exemplo, em Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58:191-195 (1998)), em Carrier und Keasling (Biotechnology Progress 15:58-64 (1999)), Franch and Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159-164 (2000)) e em livros textos conhecidos de genética e biologia molecular, como, por exemplo, o livro texto
por Knippers (Molekulare Genetik, 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) ou aquele por Wínnacker (Gene und Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990).
Mutações que conduzem a uma mudança ou redução nas propriedades catalíticas de proteínas enzimas são conhecidas da técnica ante25 rior. Exemplos que podem ser mencionados são os trabalhos de Qiu and
Goodman (Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
América 95:5511-5515 (1998)), Wente and Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833-20839 (1991)). Descrições resumidas podem ser 30 encontradas em livros textos conhecidos de genética e biologia molecular, como, por exemplo, aquele por Hagemann (Allgemeine Genetik, Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Mutações possíveis são transições, transversões, inserções e supressões de pelo menos um (1) par de bases ou nucleotídeo. Dependendo do efeito da troca de aminoácido causada pela mutação sobre a atividade de enzima, mutações de sentido errado ou mutações não-sentido são referidas. Mutação de sentido errado conduz a uma troca de um dado ami* noácido em uma proteína por outro, está sendo, em particular, uma troca de aminoácido não-conservativa. A capacidade funcional ou atividade da proteína é prejudicada por este meio e reduzida para um valor de 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% ou 0 a 5%. Mutação não-sentido conduz a um códon de interrupção na região codificante do gene e por isso a uma prematura interrupção na tradução. Inserções ou supressões de pelo menos um par de bases em um gene conduz a mutações de desvio de quadro, que conduzem a aminoácidos incorretos sendo incorporados ou tradução sendo inter.* rompida prematuramente. Se um códon de interrupção é formado na região codificante como uma conseqüência da mutação, isto também conduz a uma terminação prematura da tradução. Supressões de pelo menos um (1) ou mais códons tipicamente também conduzem a uma completa perda da atividade de enzima.
Instruções sobre degeneração de tais mutações são técnica an-
terior e podem ser encontradas em livros textos conhecidos de genética e biologia molecular, como, por exemplo, o livro texto por Knippers (Molekulare Genetik, 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), aquele por Winnacker (Gene und Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990) ou aquele por Hagemann (Allgemeine Genetik,
Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Mutações apropriadas no gene, tais como as mutações de supressão mencionadas a título de exemplo (ver, SEQ ID N- 10), podem ser incorporadas em cepas apropriadas por através de substituição de gene ou alelo.
Um processo comum é o processo, descrito por Hamilton et al.
(Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), de substituição de gene com o auxílio de um derivado de pSC101 replicando condicionalmente pMAK705. Outros processos descritos na técnica anterior, como, por exemplo,
• · · aquele de Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 181:7143-7148 (1999)) ou aquele de Boyd et al. (Journal of Bacterilogy 182:842-847 (2000)), da mesma maneira podem ser usados.
É também possível transferir-se mutações nos genes particula5 res ou mutações que afetam expressão dos particulares genes ou quadros de leitura abertos em várias cepas por conjugação ou transdução.
Explanações mais detalhadas dos termos em genética e biologia molecular são encontradas em livros textos conhecidos de genética e biologia molecular, como, por exemplo, o livro texto de Birge (Bacterial and Bacterioφ 10 phage Genetics, 4th ed., Springer Verlag, New York (USA), 2000) ou o livro texto por Berg, Tymoczko and Stryer (Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company, New York (USA), 2002) ou o handbook por Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (3 volume set), Cold Spríng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001).
Além disso pode ser vantajoso para a produção de L-aminoácidos, em particular L-treonina, com cepas da família Enterobacteriaceae aperfeiçoar uma ou mais enzimas do caminho de biossíntese de treonina conhecido ou enzimas de metabolismo anaplerótico ou enzimas para a produção de reduzido nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato ou enzimas de 20 glicólise ou enzimas PTS ou enzimas de metabolismo de enxofre, em adição à atenuação do ORF yjgF.
O termo aperfeiçoamento'' neste sentido descreve o aumento na atividade intracelular ou concentração de uma ou mais enzimas ou proteínas em um microorganismo que são codificadas pelo correspondente DNA, 25 por exemplo, através do aumento de número de cópias do gene ou genes ou quadros de leitura abertos, usando um potente promotor ou um gene ou quadro de leitura aberto que codifica uma correspondente enzima ou proteína com uma alta atividade, e opcionalmente combinando estas medidas.
Por medidas de aperfeiçoamento, em particular superexpressão, a atividade ou concentração da correspondente proteína é em geral aumentada por pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, até um máximo de 1000% ou 2000%, baseado naquela da proteína tipo selvagem ou a atividade ou concentração da proteína no microorganismo de partida.
Para a produção de L-aminoácidos, em particular L-treonina, pode ser vantajoso, em adição à atenuação do ORF yjgF, ao mesmo tempo para um ou mais dos genes escolhidos do grupo consistindo em • o óperon thrABC que codifica aspartato cinase, homosserina desidrogenase, homosserina cinase e treonina sintase (US-A-4 278 765), • o gene pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato carboxilase (WO 99/18228), · o gene pps que codifica fosfoenol piruvato sintase (Molecular and General Genetics 231(2): 332-336 (1992)), • o gene ppc que codifica fosfoenol piruvato carboxilase (Gene 31:279-283(1984)), • os genes pntA e pntB que codificam transidrogenase (European
Journal of Biochemistry 158:647-653 (1986)), • o gene rhtB que proporciona resistência a homosserina (EP-A0 994 190), • o gene mqo que codifica malato:quinona óxidorredutase (WO
02/06459), • o gene rhtC que proporciona resistência a treonina (EP-A-1 013 765), • o gene thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica a proteína de exportação de treonina (WO 01/92545), • o gene gdhA que codifica glutamato desidrogenase (Nucleic Acids Research 11:5257-5266 (1983); Gene 23:199-209 (1983)), • o gene hns que codifica a proteína de ligação de DNA HLP-II (WO 03/004671), • o gene pgm que codifica fosfoglucomutase (WO 03/004598), • o gene fba que codifica frutose bifosfato aldolase (WO 03/004664), • o gene ptsH do óperon ptsHIcrr que codifica a proteína fosfohis· tidina hexose fosfotransferase do sistema fosfotransferase PTS (WO 03/004674), • o gene ptsl do óperon ptsHIcrr que codifica enzima l do sistema
fosfotransferase PTS (WO 03/004674), • o gene crr do óperon ptsHIcrr que codifica o componente IIA específico - glicose do sistema fosfotransferase PTS (WO 03/004674), • o gene ptsG que codifica o componente IIBC específico - glicose «I φ 10 (WO 03/004670), • o gene Irp que codifica o regulador do regulon leucina (WO 03/004665), • o gene csrA que codifica o regulador global Csr (Joumal of bacteriology 175:4744-4755 (1993)), • o gene fadR que codifica o regulador do regulon fad (Nucieic Acids Research 16:7995-8009 (1988)), • o gene iclR que codifica o regulador de metabolismo intermediário central (Journal of bacteriology 172:2642-2649 (1990)), • o gene mopB que codifica o chaperone de 10 kd (WO 03/004669) e
é também conhecido pelo nome groES, • o gene ahpC do óperon ahpCF que codifica a subunidade pequena de alquil hidroperóxido redutase (WO 03/004663), • o gene ahpF do óperon ahpCF que codifica a subunidade grande de alquil hidroperóxido redutase (WO 03/004663), • o gene cysK que codifica cisteína sintase A (WO 03/006666), • o gene cysB que codifica o regulador do regulon cys (WO 03/006666), • o gene cysJ do óperon cysJIH que codifica a flavoproteína de NADPH sulfito redutase (WO 03/006666), • o gene cysl do óperon cysJIH que codifica a hemoproteína de NADPH sulfito redutase (WO 03/006666), • o gene cysH do óperon cysJIH que codifica a adenilil sulfato redutase (WO 03/006666), • o gene phoB do óperon phoBR que codifica o regulador positivo PhoB do regulon pho (WO 03/008606), • o gene phoR do óperon phoBR que codifica a proteína sensora do regulon pho (WO 03/008606), • o gene phoE que codifica proteína E a membrana exterior de cé30 φ 10
lula (WO 03/008606), • o gene pykF que codifica piruvato cinase-l estimulada porfrutose (WO 03/008609), • o gene pfkB que codifica 6-fosfo frutocinase II (WO 03/008610), • o gene malE que codifica a proteína de ligação periplásmica de transporte de maltose (WO 03/008605), • o gene sodA que codifica superóxido dismutase (WO 03/008613), • o gene rseA do óperon rseABC que codifica uma proteína de membrana com atividade anti-sigmaE (WO 03/008612), • o gene rseC do óperon rseABC que codifica um regulador global do fator sigmaE (WO 03/008612), • o gene sucA do óperon sucABCD que codifica a subunidade descarboxilase de 2-cetoglutarato desidrogenase (WO 03/008614), • o gene sucB do óperon sucABCD que codifica a subunidade diidrolipoil transsuccinase E2 de 2-cetoglutarato desidrogenase (WO 03/008614), • o gene sucC do óperon sucABCD que codifica a subunidade-β de succinil-CoA sintetase (WO 03/008615) • o gene sucD do óperon sucABCD que codifica a subunidade-a de succinil-CoA sintetase (WO 03/008615), • o gene adk que codifica adenilato cinase (Nucleic Acids Research 13(19):7139-7151 (1985)), • o gene hdeA que codifica uma proteína periplásmica com uma função semelhante à chaperonina (Journal of Bacteriology 175(23):7747-7748(1993)), • o gene hdeB que codifica uma proteína periplásmica com uma função semelhante à chaperonina (Journal of Bacteriology 175(23):7747-7748(1993)), • o gene icd que codifica isocitrato desidrogenase (Journal of Bio-
logical Chemistry 262(22):10422-10425 (1987)), • o gene mglB que codifica a proteína de transporte ligante de galactose, periplásmica, HLP-II (Molecular and General Genetics ···
229(3): 453-459(1991)), • o gene Ipd que codifica diidrolipoamida desidrogenase (European Journal of Biochemistry 135(3):519-527 (1983)), • o gene aceE que codifica o componente E1 do complexo piruvato desidrogenase (European Journal of Biochemistry 133(1):155-162 (1983)), • o gene aceF que codifica o componente E2 do complexo piruvato desidrogenase (European Journal of Biochemistry 133(3):481489 (1983)),
o gene pepB que codifica aminopeptidase B (Journal of Fermen tation and Bioengineering 82:392-397 (1996)), • o gene aldH que codifica aldeído desidrogenase (E.C.1.2.1.3)(Gene
99(1):15-23(1991)), • o gene bfr que codifica a homoproteína de estocagem de ferro (bacterioferritina)( Journal of Bacteriology 171(7):3940-3947 (1989)), • o gene udp que codifica uridina fosforilase (Nucleic Acids Research 17(16):6741 (1989)) e • o gene rseB que codifica o regulador de atividade de fator sigma E (Molecular Microbiology 24(2):355-371 (1997)),ser aperfeiçoa do, em particular superexpresso.
O uso de genes endógenos ou quadros de leitura abertos é em geral preferido.
Além disso pode ser vantajoso para a produção de L-aminoácidos, em particular treonina, em adição à atenuação do ORF yjgF, para um ou mais dos genes escolhidos do grupo consistindo em • o gene tdh que codifica treonina desidrogenase (Journal of Bacteriology 169:4716-4721 (1987)), • o gene mdh que codifica malato desidrogenase (E.C.1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)), o produto de gene do quadro de leitura aberto (orf) yjfA (Número de Acesso AAC77180 of the National Center for Biotechnology
Information (NCBI, Bethesda, MD, USA), WO 02/29080), • · · ·«··· · · · • o produto de gene do quadro de leitura aberto (orf) ytfP (Número de Acesso AAC77179 of the National Center for Bíotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA), WO 02/29080), • o gene pckA que codifica a enzima fosfoenol piruvato carboxici- nase (WO 02/29080), * · o gene poxB que codifica piruvato oxidase (WO 02/36797), • o gene aceA que codifica a enzima isocitrato liase (WO 02/081722), • o gene dgsA que codifica o regulador DgsA do sistema fosfotransferase (WO 02/081721) e é também conhecido sob o nome φ 10 dogenemlc, • o gene fruR que codifica o repressor de frutose (WO 02/081698) e é também conhecido sob o nome do gene cra, • o gene rpoS que codifica o fator sigma38 (WO 01/05939) e é “ também conhecido sob o nome do gene katF, · o gene aspA que codifica aspartato amônio liase (aspartase) (WO 03/008607) e • o gene aceB que codifica malato sintase A (WO 03/008603) serem atenuados, em particular eliminados ou suas expressões para serem reduzidas.
Em adição à atenuação do ORF yjgF além disso pode ser vantajoso para a produção de L-aminoácidos, em particular L-treonina, eliminar indesejáveis reações secundárias (Nakayama: Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms, in: Overproduction of Microbial Products, Krum phanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
Os microorganismos produzidos de acordo com a invenção podem ser cultivados no processo de batelada (cultura de batelada), o processo de batelada alimentada (processo de alimentação) ou o processo de batelada alimentada repetida (processo de alimentação repetitiva). Um resumo de processos de cultura conhecidos é descrito no livro texto por Chmiel (Bio30 prozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro texto por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).
O meio de cultura a ser usado tem de satisfazer os requisitos das particulares cepas em uma maneira apropriada. Descrições de meios de cultura para vários microorganismos estão contidas no handbook Manual of Methods for General Bacteriology da American Society for Bacteriology 5 (Washington D.C., USA, 1981).
Açúcares e carboidratos, tais como, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, amido e opcionalmente celulose, óleos e gorduras, tais como, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim, e gordura de coco, ácidos graxos, tais como, por exemplo, 10 ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoléico, álcoois, tais como, por exemplo, glicerol e etanol, e ácidos orgânicos, como, por exemplo, ácido acético, podem ser usados como a fonte de carbono. Estas substâncias podem ser usadas individualmente ou como uma mistura.
Compostos contendo nitrogênio, tais como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor de infusão de milho, farinha de soja e uréia, ou compostos inorgânicos, como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio, podem ser usados como a fonte de nitrogênio. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou como uma mistura.
Ácido fosfórico, diidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de dipotássio ou os correspondentes sais contendo sódio podem ser usados como a fonte de fósforo. O meio de cultura além disso tem de compreender sais de metais, tais como, por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para crescimento. Finalmente, substâncias essenciais para crescimento, tais como aminoácidos e vitaminas, podem ser empregadas em adição às substâncias mencionadas acima. Apropriados precursores além disso podem ser adicionados ao meio de cultura. As substâncias de partida mencionadas podem ser adicionadas à cultura na forma de uma batelada simples, ou podem ser alimentadas durante a cultura em uma maneira apropriada.
A fermentação é em geral realizada em um pH de 5,5 a 9,0, em particular 6,0 a 8,0. Compostos básicos, como hidróxido de sódio, hidróxido • · · · · · · · « · · de potássio, amônia ou amônia aquosa, ou compostos ácidos, como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, podem ser empregados em uma maneira apropriada para controlar o pH da cultura. Antiespumantes, como, por exemplo, poliglicol ésteres de ácido graxo, podem ser empregados para controle de desenvolvimento de espuma. Substâncias apropriadas tendo uma ação sele* tiva, por exemplo, antibióticos, podem ser adicionadas ao meio para manutenção de estabilidade de plasmídeos. Para manter condições aeróbicas, oxigênio ou misturas de gases contendo oxigênio, como, por exemplo, ar, são introduzidas na cultura. A temperatura da cultura é usualmente 25 a
45°C, e preferivelmente 30 a 40°C. A cultura é continuada até um máximo de L-aminoácidos ou L-treonina ser formado. Este alvo é usualmente atingido dentro de 10 horas a 160 horas.
A análise de L-aminoácidos pode ser realizada por cromatografia de troca de ânion com subseqüente derivação com niidrina, como descrito por Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30.Ί190-1206 (1958)) ou pode ser realizada por HPLC de fase reversa, como descrito por Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51:1167-1174 (1979)).
O processo de acordo com a invenção é usado para a preparação fermentativa de L-aminoácidos, tais como, por exemplo, L-treonina, L-iso-
leucina, L-valina, L-metionina, L-homosserina e L-lisina, em particular L-treonina.
Uma cultura pura de Escherichia coli K-12 cepa DH5alfa/pMAK705 foi depositada como DSM 13720 em 8 de setembro de 2000 no Deutsche
Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collecti25 on of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany) de acordo com o Tratado de Budapeste.
A presente invenção é explicada em mais detalhes no que se segue com o auxílio de exemplos de modalidades.
Os meios mínimo (M9) e completo (LB) para Escherichia coli usados são descritos por J.H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). O isolamento de DNA plasmídeo de Escherichia coli e todas as técnicas de restrição, ligamento, Klenow e
tratamento com fosfatase alcalina são realizados pelo processo de Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). A menos que de outro modo descrito, a transformação de Escherichia coli é realizada pelo processo de Chung et al. (Procee5 dings of the National Academy of Sciences of the United States of América 86:2172-2175(1989)).
A temperatura de incubação para a preparação de cepas e transformantes é 37°C. Temperaturas de 30°C e 44°C são usadas no pro cesso de substituição de gene de Hamilton et al..
φ 10 Exemplo 1
Construção da mutação de supressão do ORF yjgF
Partes das regiões de gene a montante e a jusante e ORF yjgF e partes da região 5’ e 3’ do ORF yjgF são amplificadas de Escherichia coli K-12 fr usando a reação de cadeia polimerase (PCR) e oligonucleotídeos sintéticos.
Partindo da seqüência de nucleotídeos do ORF yjgF e seqüências estando a montante e a jusante em E. coli K12 MG1655 (SEQ ID NO:1, Número de Acesso AE000495), os seguintes iniciadores PCR são sintetizados (MWG Biotech, Ebersberg, Germany):
yjgF-l: 5' - TCGCGATCTGGTACTGTAAG - 3' (SEQ ID No. 3)
yjgF-2: 5' - CTGTACGTAAGGACCGATAG - 3' (SEQ ID NO. 4)
yjgF-3: 5' - CGCTGTTCGTCGCTAATCTT - 3' (SEQ ID No. 5)
yjgF-4: 5' - GATCTTCTTCGGACCGATCA - 3' (SEQ ID NO. 6)
O DNA de E. coli K12 MG1655 cromossômico para a PCR é iso20 lado de acordo com as instruções do fabricante com Qiagen Genomic-tips
100/G (QIAGEN, Hilden, Germany). Um fragmento de DNA de aproximadamente 622 pb em tamanho a partir da região 5’ do ORF yjgF, chamado yjgF5’ e mostrado em SEQ ID NO; 7 e um fragmento de DNA de aproximadamente 612 pb em tamanho a partir da região 3’ do ORF yjgF, chamado yjgF3’ e mostrado em SEQ ID NO: 8, podem ser amplificados com os específicos iniciadores sob condições padrão de PCR (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) com Taq20
DNA polimerase (Gibco-BRL, Eggenstein, Germany).
Os produtos de PCR são ligados com o vetor pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, The Netherlands) de acordo com as instruções dos fabricantes e transformados em E. coli cepa 5 TOP10F’. Seleção de células carregando plasmídeo ocorre sobre LB ágar, * ao qual 50 pg/mL de ampicilina foram adicionados. Após isolamento do DNA plasmídeo, o vetor pCR2.1yjgF5’ é clivado com as enzimas de restrição Ec1136II e Xbal e, após separação em gel agarose 0,8%, o fragmento yjgF5’ é isolado com o auxílio do QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, φ 10 Germany). Após isolamento do DNA plasmídeo, o vetor pCR2.1yjgF3’ é clivado com as enzimas EcoRV e Xbal e ligado com o fragmento yjgF5’ isolado. E. coli cepa DH5alfa é transformada com a batelada de ligação e células carregando plasmídeo são selecionadas sobre LB ágar, ao qual 50 pg/mL de ampicilina * são adicionados. Após isolamento do DNA plasmídeo aqueles plasmídeos 15 nos quais a seqüência de DNA mutagênica mostrada em SEQ ID NO: 9 é * clonada são detectados por divagem de controle com as enzimas Hindlll/Xbal e Stul/Hincl I. Um dos plasmídeos é chamado pCR2.1TOPOAyjgF.
Exemplo 2
Construção do vetor de substituição pMAK7O5AyjgF
O ORF yjgF suprimido descrito no exemplo 1 é isolado do vetor pCR2.1TOPOAyjgF após restrição com as enzimas Hindlll e Xbal e separação em gel agarose 0,8%, e ligado com o plasmídeo pMAK705 (Hamilton et al.
(1989) Journal of Bacteriology 171, 4617-4622), que foi digerido com as enzi mas Hindlll e Xbal. A batelada de ligação é transformada em DH5alfa e células carregando plasmídeo são selecionadas sobre LB ágar, ao qual 20 pg/mL de cloranfenicol são adicionados. Clonagem bem sucedida é demonstrada após isolamento do DNA plasmídeo e divagem com as enzimas Hindlll/Xbal e Pstl.
O vetor de substituição formado, pMAK705AyjgF (= pMAK705deltayjgF), é mostrado na figura 1.
Exemplo 3
Mutagênese específica de posição do ORF yjgF em E.coli cepa MG442
E. coli cepa MG442 produzindo L-treonina é descrita na patente
US-A-4 278 765 e depositada como CMIM B-1628 em Russian National Collection for Industrial Microorganisms (VKPM, Moscow, Rússia).
Para substituição do ORF yjgF cromossomal com a construção de supressão codificada de plamídeo, MG442 é transformado com o plasmí5 deo pMAK705AyjgF. A substituição de gene é realizada através do processo de seleção descrito por Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 171, 4617-4622) e é verificada por processos PCR padrão (Innis et al., (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) com
os seguintes iniciadores oligonucleotídeos:
yjgF-1: 5' - TCGCGATCTGGTACTGTAAG - 3' (SEQ ID No. 3) yjgF-4: 5' - GATCTTCTTCGGACCGATCA - 3' (SEQ ID No. 6.)
Após a substituição ter ocorrido, MG442 contém a forma do alelo
AyjgF mostrada em SEQ ID NO: 10. A cepa obtida é chamada MG442AyjgF. Exemplo 4
Preparação de L-treonina com a cepa MG442AyigF
MG442AyjgF é multiplicada em meio mínimo com a seguinte composição: 3,5 g/L Na2HPO4.2H2O, 1,5 g/L KH2PO4, 1 g/L NH4Cl, 0,1 g/L MgSO4.7H2O, 2 g/L glicose, 20 g/L ágar. A formação de L-treonina é verificada em culturas de batelada de 10 mL contidas em frascos cônicos de 100 mL. Para isto, 10 mL de meio de pré-cultura da seguinte composição: 2 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de (NH4)2SO4, 1 g/L KH2PO4, 0,5 g/L MgSO4.7H2O,
15 g/L CaCO3, 20 g/L glicose são inoculados e a batelada é incubada por 16 horas a 37°C e 180 rpm sobre uma incubadora ESR de Kühner AG (Birsfel den, Switzerland). 250 pL desta pré-cultura são transinoculados em 10 mL de meio de produção (25 g/L (NH4)2SO4, 2 g/L KH2PO4, 1 g/L MgSO4.7H2O,
0,03 g/L FeSO4.7H2O, 0,018 g/L MnSO4.1H2O, 30 g/L CaCO3, 20 g/L glico25 se) e a batelada é incubada por 48 horas a 37°C. Após a incubação, a densidade ótica (OD) da suspensão de cultura é determinada com um fotômetro
LP2W de Dr. Lange (Düsseldorf, Germany) em um comprimento de onda de medição de 660 nm.
A concentração de L-treonina formada é então determinada em
um sobrenadante de cultura filtrado - estéril com um analisador de aminoácido de Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) através de cromatografia de troca de íons e reação pós-coluna com detecção de ninhidrina.
O resultado do experimento é mostrado na Tabela 1.
Tabela 1
Cepa OD (660 nm) L-treonina
MG442 6,0 1,5
MG442AyjgF 6,3 2,1
Breve descrição da figura:
• Figura 1: pMAK705AyjgF ( = pMAK705deltayjgF)
Os dados de comprimento são para serem entendidos como dados aproximados. As abreviaturas e designações usadas têm o seguinte significado:
• cat: gene de resistência a cloranfenicol • rep-ts: região de replicação sensível à temperatura do plasmídeo pSC101 • yjgF5’: parte da região 5’ do ORF yjgF e a região estando a mon- tante • yjgF3’: parte da região 3’ do ORF yjgF e a região estando a jusante. As abreviaturas para as enzimas de restrição têm o seguinte significado
• EcoRV: endonuclease de restrição de Escherichia coli RY13
• Ec113611: endonuclease de restrição de Escherichia coli
• Hincll: endonuclease de restrição de Haemophilus influenzae Rc
• Hindlll: endonuclease de restrição de Haemophilus influenzae Rd
• Pstl: endonuclease de restrição de Providencia stuartii
• Stul: endonuclease de restrição de Streptomyces tubercidicus
• Xbal: endonuclease de restrição de Xanthomonas badrii
REIVINDICAÇÕES

Claims (11)

1. Processo para preparação de L-treonina, ou aditivos de alimentos compreendendo este composto, caracterizado pelo fato de que compreende fermentar micro-organismos da família Enterobacteriaceae, que produzem L-treonina desejada, e nos quais a ORF yjgF, com a sequência de SEQ ID NO: 1, ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácidos, são atenuadas, em particular eliminadas.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a concentração da L-treonina desejada no meio ou nas células dos micro-organismos.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a L-treonina desejada é isolada.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que restam no produto constituintes do caldo de fermentação e/ou a biomassa em sua totalidade ou porções (> 0 a 100%) da mesma.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que, nos micro-organismos empregados no processo de produção, a atividade ou concentração do produto do gene ORF yjgF é reduzida para 0 a 75% da atividade ou concentração da proteína do tipo selvagem, ou no micro-organismo original, através de atenuação do ORF yjgF.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que, nos micro-organismos empregados no processo de produção, genes adicionais da via de biossíntese da L-treonina desejada são adicional mente aperfeiçoados.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que, nos micro-organismos empregados no processo de produção, as vias metabólicas que reduzem a formação da Ltreonina desejada são pelo menos parcial mente eliminadas.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que, nos micro-organismos empregados no
Petição 870160032352, de 29/06/2016, pág. 8/31 processo de produção, a expressão do polinucleotídeo que codifica o produto do quadro aberto de leitura yjgF é atenuada, em particular eliminada.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que, nos micro-organismos empregados no processo de produção, as propriedades reguladoras e/ou catalíticas do polipeptídeo (proteína enzima), para o qual o polinucleotídeo do quadro aberto de leitura yjgF codifica, são reduzidas.
10. Processo para preparação de L-treoninas, de acordo com a reivindicação 1, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que, nos microorganismos empregados no processo de produção, adicionalmente um ou mais dos genes escolhidos do grupo consistindo em:
a) o óperon thrABC que codifica aspartato cinase, homosserina desidrogenase, homosserina cinase e treonina sintase,
b) o gene pyc que codifica piruvato carboxilase,
c) o gene pps que codifica fosfoenol piruvato sintase,
d) o gene ppc que codifica fosfoenol piruvato carboxilase,
e) os genes pntA e pntB que codificam transidrogenase,
f) o gene rhtB que proporciona resistência à homosserina,
g) o gene mqo que codifica malato:quinona óxido redutase,
h) o gene rhtC que proporciona resistência à treonina,
i) o gene thrE que codifica a proteína de exportação de treonina,
j) o gene gdhA que codifica glutamato desidrogenase,
k) o gene hns que codifica a proteína de ligação de DNA HLP-II,
l) o gene pgm que codifica fosfo glucomutase,
m) o gene fba que codifica frutose bifosfato aldolase,
η) o gene ptsH que codifica a proteína fosfohistidina hexose fosfotransferase,
o) o gene ptsl que codifica enzima I do sistema fosfotransferase,
p) o gene crr que codifica o componente IIA específico de glicose,
q) o gene ptsG que codifica o componente IIBC específico de glicose,
r) o gene Irp que codifica o regulador do regulon leucina,
s) o gene csrA que codifica o regulador global Csr,
Petição 870160032352, de 29/06/2016, pág. 9/31
t) o gene fadR que codifica o regulador do regulon fad,
u) o gene icIR que codifica o regulador de metabolismo intermediário central,
v) o gene mopB que codifica o chaperone de 10 kd,
w) o gene ahpC que codifica a subunidade pequena de alquil hidroperóxido redutase,
x) o gene ahpF que codifica a subunidade grande de alquil hidroperóxido redutase,
y) o gene cysK que codifica cisteína sintase A,
z) o gene cysB que codifica o regulador do regulon cys, aa) o gene cysJ que codifica a flavoproteína de NADPH sulfito redutase, bb) o gene cysl que codifica a hemoproteína de NADPH sulfito redutase, cc) o gene cysH que codifica a adenilil sulfato redutase, dd) o gene phoB que codifica o regulador positivo PhoB do regulon pho, ee) o gene phoR que codifica a proteína sensora do regulon pho, ff) o gene phoE que codifica proteína E da membrana exterior de célula, gg) o gene pykF que codifica piruvato cinase-l estimulada - frutose, hh) o gene pfkB que codifica 6-fosfofrutocinase II, ii) o gene malE que codifica a proteína de ligação periplásmica de transporte de maltose, jj) o gene sodA que codifica superóxido dismutase, kk) o gene rseA do óperon rseABC que codifica uma proteína de membrana com atividade anti-sigmaE,
II) o gene rseC que codifica um regulador global do fator sigmaE, mm) o gene sucA do óperon sucABCD que codifica a subunidade descarboxilase de 2-cetoglutarato desidrogenase, nn) o gene sucB que codifica a subunidade diidrolipoil transsuccinase E2 de 2-ceto glutarato desidrogenase, oo) o gene sucC que codifica a subunidade-β de succinil-CoA sintetase, pp) o gene sucD que codifica a subunidade-α de succinil-CoA sintetase, qq) o gene adk que codifica adenilato cinase, rr) o gene hdeA que codifica uma proteína periplásmica com uma função
Petição 870160032352, de 29/06/2016, pág. 10/31 semelhante à chaperonina, ss) o gene hdeB que codifica uma proteína periplásmica com uma função semelhante à chaperonina, tt) o gene icd que codifica isocitrato desidrogenase, uu) o gene mglB que codifica a proteína de transporte de ligação de galactose, periplásmica,
w) o gene Ipd que codifica diidrolipoamida desidrogenase, ww) o gene aceE que codifica o componente E1 do complexo piruvato desidrogenase, xx) o gene aceF que codifica o componente E2 do complexo piruvato desidrogenase, yy) o gene pepB que codifica aminopeptidase B, zz) o gene aldH que codifica aldeído desidrogenase, aaa) o gene bfr que codifica a homoproteína de estocagem de ferro, bbb) o gene udp que codifica uridina fosforilase e ccc) o gene rseB que codifica o regulador de atividade de fator sigmaE, são aperfeiçoados, em particular superexpressos.
11. Processo para a preparação de L-treoninas, de acordo com a reivindicação 1, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que, nos microorganismos empregados no processo de produção, adicionalmente um ou mais dos genes escolhidos do grupo consistindo em:
a) o gene tdh que codifica para treonina desidrogenase,
b) o gene mdh que codifica malato desidrogenase,
c) o produto de gene do quadro aberto de leitura (orf) yjfA,
d) o produto de gene do quadro aberto de leitura (orf) ytfP,
e) o gene pckA que codifica fosfoenol piruvato carbóxi cinase,
f) o gene poxB que codifica piruvato oxidase,
g) o gene aceA que codifica isocitrato liase,
h) o gene dgsA que codifica o regulador DgsA do sistema fosfotransferase,
i) o gene fruR que codifica o repressor de frutose,
j) o gene rpoS que codifica o fator sigma38,
Petição 870160032352, de 29/06/2016, pág. 11/31
k) o gene aspA que codifica aspartato amônio liase (aspartase) e
l) o gene aceB que codifica malato sintase A são atenuados, em particular eliminados ou tem a expressão reduzida.
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