CN1733067A - 一种冬凌草有效成分提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药技术领域。本发明提供了一种冬凌草有效成分提取物定量化的制备方法。本发明的方法采用“过程化集成技术”，是现代提取分离技术领域中的最新成果，即在一个连续的分离纯化工艺流程中集中制备冬凌草活性成分的比例提取物。本发明的方法流程连续，工艺简单，设备集成化程度高，质量可控性好，溶剂残留量小，适于规模化生产。

Description

一种冬凌草有效成分提取物的制备方法

技术领域：

本发明属于中药技术领域。具体涉及一种冬凌草有效成份提取物定量化的制备方法。

背景技术：

冬凌草又名冰凌草，学名碎米亚Rabdosia rubescens(Hem sl.)，系唇形科香茶菜属多年生草本，广泛分布于我国的河南、河北以及山西等省地，收载于《中国药典》1977年版第一部。中医认为冬凌草味甘苦，性微寒，具有清热解表，活血止痛的作用。西医认为冬凌草具有抗菌消炎和抗肿瘤的作用，是一种天然的抗生素。目前市场上已经有复方冬凌草片，冬凌草糖浆制剂等药品，临床上主要用于治疗急慢性扁桃体炎、咽喉炎和口腔炎等疾病。

近年来的研究资料证实，中药材冬凌草还具有明显的抗肿瘤活性，经过化学成分和药理实验分析，其中含有冬凌草甲素(Oridonin)及衍生物、冬凌草乙素(Ponicidin)等二萜类化合物和熊果酸(Ursolic acid)和齐墩果酸等三萜类成分。其分子结构式如下图：

冬凌草甲素

冬凌草乙素

熊果酸

熊果酸(Ursolic acid)又名乌索酸、乌苏酸，是一种存在于天然植物中的三萜类化合物，具有杀灭和抑制变形链球菌组及牙周病原菌、抑制口腔舌癌细胞作用。近年来很多科研单位发现熊果酸具有一定的抗肿瘤活性作用。中国医学科学院肿瘤医院研究人员发现熊果酸具有抗致癌、抗促癌、诱导F9畸胎瘤细胞分化和抗血管生成作用，很有可能成为低毒高效的新型抗癌药物。

目前对于冬凌草进行的研究主要集中在冬凌草甲素以及衍生物、冬凌草乙素、贝壳杉烯类二萜的化学结构以及它们的抗癌作用。从专利信息的检索发现，涉及到冬凌草有效成分的专利主要有下列所示：

1.郑州大学申请了“冬凌草甲素衍生物及其制备方法”，申请号为99101179；通过改变冬凌草甲素的分子结构式达到寻找新型的抗肿瘤药物；

2.中国科学院武汉植物所申请了“一种冬凌草甲素的制备方法”，申请号为02139049.5，涉及到提取制备其中的冬凌草甲素成分；

3.北海国发海洋生物产业股份有限公司申请了“中药冬凌草有效部位抗肿瘤药物提取物及其制备方法”，申请号为03125250.8，涉及到中药冬凌草有效部位组合物以及制备方法，其冬凌草总萜含量在50％以上；

4.山西省医药研究所申请的“冬凌草提取物及其制备方法和应用”，申请号为02151503.4，内容涉及冬凌草提取物包括有粗提取物、有效部位和单一成分，单一成分是冬凌草甲素和乙素；

上述专利主要涉及冬凌草中的一种有效成分或是有效部位提取物，用于抗肿瘤方面的治疗作用等。

大量的药理研究表明，冬凌草具有抗菌消炎，止痛活血的作用。最近发现冬凌草具有明显的抗肿瘤作用，主要作用于食管癌、贲门癌以及肝癌等肿瘤。到目前为止，以冬凌草药材为原料，已经开发了冬凌草片、冬凌草糖浆以及冬凌草萜含片等药品，这些都是以冬凌草的粗提取为主要活性成分。

但是上述公开的内容中仅是用传统工艺制备得到冬凌草有效部位提取物，对其中的活性成份缺乏适合工业化规模的连续过程集成化提取工艺，对中成药的质量可控性差。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于应用中药提取和分析技术，制备冬凌草多个有效成份的定量化提取物。

本发明提供了一种冬凌草有效成份提取物的连续过程集成化制备方法。

本发明方法是应用了“过程化集成技术”原理。该过程化集成技术是利用一个连续的工艺流程中，按比例一次性连续制备多种有效成份。

本发明的方法包括下列步骤：

(1)取材：

选取1000g的冬凌草原料进行粉碎，加入5-8倍量80-95％的乙醇提取3-4次，每次提取时间2-4小时，合并冬凌草提取液，回收乙醇后得到冬凌草浸膏，加入4-6倍量无水乙醇进行溶解，后加入乙酸乙酯进行萃取，得到萃取液。

(2)过程化连续分离纯化：

取乙酸乙酯萃取物，加入3-5倍的石油醚进行沉淀，得到沉淀物，向其中加入100ml乙酸乙酯或乙醇进行溶解，溶解液上硅胶柱，在设备上采用了自制的中间可以连续取样的多柱系统，采用石油醚∶乙酸乙酯＝(10∶1)-(1∶5)混合溶剂以10-15ml/min的流速进行梯度洗脱，按照每份200ml收集，同时做TLC和HPLC在线跟踪，在不同部位分开收集洗脱液，在4∶1-1∶2的洗脱物中，第10-22份有部分白色结晶析出，对于需要的成分进行合并，收集得到洗脱液。

(3)集中得到成品

将各部位收集到的洗脱液，分别回收洗脱液至1/3～1/4体积，向其中加入粉状活性炭(原料∶活性炭＝40∶1-100∶1，质量比)脱色，抽滤，然后干燥，得到比例提取物。

(4)检验

经过TLC和HPLC的含量检测，和对照品做比较，分析出比例提取物的关系，其中含有冬凌草甲素(Oridonin)含量在5～75％之间，冬凌草乙素(Ponicidin)含量控制在5～10％范围内，而熊果酸(Ursolic acid)含量在5～10％之间。

本发明的方法工艺简单，可以得到冬凌草活性成分的比例提取物，即冬凌草甲素∶冬凌草乙素∶熊果酸＝(5～75)∶(5～10)∶(5～10)，该提取工艺，有机溶剂残留少，适用于规模化生产，可以有效的提高冬凌草中的活性成分含量。

本发明检测条件：

(1)冬凌草甲素的检测条件：

流动相：    甲醇∶水＝55∶45

检测波长：  242nm

流速：      0.8ml/min

色谱柱：    日本岛津C₁₈ ODS，柱规格250*4.6mm；5um

灵敏度：    0.005 AUFS

柱温：      25℃

(2)冬凌草乙素的检测条件：

流动相：    水∶乙睛＝75∶25

检测波长：  252nm

流速：      0.8ml/min

色谱柱：    日本岛津C₁₈ ODS 250*4.6mm；5um

灵敏度：    0.005 AUFS

柱温：      25℃

(3)熊果酸的检测条件：

流动相：    甲醇∶乙腈∶水∶磷酸＝30∶70∶10∶0.5

检测波长：  220nm

流速：      0.85ml/min

色谱柱：    Waters C₁₈ ODS 250*4.6mm；5um

灵敏度：    0.005 AUFS

柱温：      25℃

本发明与现有技术相比，具有突出的实质性特点和显著的进步如下：

1.使用一种新的提取方法-“过程化集成技术”，是现代提取分离技术领域中的最新成果，即在一个连续的分离纯化工艺流程中集中制备冬凌草活性成份的比例提取物。本发明的方法流程连续，工艺简单，设备集成化程度高，质量可控性好，溶剂残留量小，适于规模化生产。

2.生产工艺简便，使用的填料是硅胶，采用柱层析分离方法，适合于工业化生产。

3.目前首次利用比例制备方法生产得到冬凌草中有效成分，并且可以控制在一个合适的比例范围内，其生产回收率高于目前的0.2％。

4.本制备方法中采用的溶剂解决了溶剂残留和污染问题，可操作性强。

附图说明：

附图为本发明制备含有冬凌草活性成分比例提取物的流程图。

具体实施方式：

实施例1：

选取200g的冬凌草原料，粉碎，加入5倍量85％的乙醇提取3次，每次提取时间2小时，得到冬凌草提取液。回收乙醇得到绿褐色的冬凌草浸膏12.3g，加入50ml无水乙醇进行溶解，后加入乙酸乙酯进行萃取，得到萃取物。

取乙酸乙酯萃取物，加入4倍的石油醚进行沉淀，得到沉淀物，向其中加入50ml乙醇进行溶解，得溶解液上硅胶柱，采用石油醚∶乙酸乙酯＝(10∶1)-(1∶1)混合溶剂以12ml/min进行梯度洗脱，同时做TLC和HPLC在线跟踪，不同部位分开收集洗脱液，对于需要的成分进行合并，得到洗脱液。将各个部位收集到的洗脱液，分别回收洗脱液至1/3体积，向其中加入4g粉状活性炭脱色，抽滤，然后干燥，得到比例提取物成品0.49g。

经过TLC和HPLC的含量检测，和对照品做比较，分析出比例提取物的关系，其中含有冬凌草甲素(Oridonin)含量为40.8％，冬凌草乙素(Ponicidin)含量为8.2％，而熊果酸(Ursolic acid)含量为7.5％。

实施例2：

选取1000g的冬凌草原料，粉碎，加入6倍量90％的乙醇提取3次，每次提取时间3小时，得到冬凌草提取液。回收乙醇得到绿褐色的冬凌草浸膏62.8g，加入300ml无水乙醇进行溶解，后加入乙酸乙酯进行萃取，得到萃取物。

取乙酸乙酯萃取物，加入4倍的石油醚进行沉淀，得到沉淀物，向其中加入300ml乙醇进行溶解，得溶解液上硅胶柱，采用石油醚∶乙酸乙酯＝(8∶1)-(1∶4)混合溶剂以10ml/min进行梯度洗脱，同时做TLC和HPLC在线跟踪，在不同部位分开收集洗脱液，对于需要的成分进行合并，得到洗脱液。将各个部位收集到的洗脱液，分别回收洗脱液至1/3体积，向其中加入10g粉状活性炭脱色，抽滤，然后干燥，得到比例提取物成品2.86g。

经过TLC和HPLC的含量检测，其中含有冬凌草甲素(Oridonin)含量为70.6％，冬凌草乙素(Ponicidin)含量为8.2％，而熊果酸(Ursolic acid)含量为8.5％。

实施例3：

选取3000g的冬凌草原料，粉碎，加入5倍量95％的乙醇提取4次，每次提取时间3小时，得到冬凌草提取液。回收乙醇得到绿褐色的冬凌草浸膏192.6g，加入1000ml无水乙醇进行溶解，后加入乙酸乙酯进行萃取，得到萃取物。

取乙酸乙酯萃取物，加入5倍的石油醚进行沉淀，得到沉淀物，向其中加入800ml乙酸乙酯进行溶解，得溶解液上硅胶柱，采用石油醚∶乙酸乙酯＝(4∶1)-(1∶3)混合溶剂以15ml/min进行梯度洗脱，同时做TLC和HPLC在线跟踪，在不同部位分开收集洗脱液，得到洗脱液。将各部位收集到的洗脱液，分别回收洗脱液至1/4体积，向其中加入50g粉状活性炭脱色，抽滤，然后干燥，得到比例提取物成品8.21g。

经过TLC和HPLC的含量检测，其中含有冬凌草甲素(Oridonin)含量为60％，冬凌草乙素(Ponicidin)含量为7.5％，而熊果酸(Ursolic acid)含量为6.8％。

Claims (2)

1、一种冬凌草有效成份提取物的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)取材：

选取1000g的冬凌草原料进行粉碎，加入5-8倍量80-95％的乙醇提取3-4次，每次提取时间2-4小时，合并冬凌草提取液，回收乙醇后得到冬凌草浸膏，加入4-6倍量无水乙醇进行溶解，后加入乙酸乙酯进行萃取，得到萃取液；

(2)过程化连续分离纯化：

取乙酸乙酯萃取物，加入3-5倍的石油醚进行沉淀，得到沉淀物，向其中加入100ml乙酸乙酯或乙醇进行溶解，溶解液上硅胶柱，在设备上采用了自制的中间可以连续取样的多柱系统，采用石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1-1∶5混合溶剂以10-15ml/min的流速进行梯度洗脱，按照每份200ml收集，同时做TLC和HPLC的在线跟踪，在不同部位分开收集洗脱液，在4∶1-1∶2的洗脱物中，第10-22份有部分白色结晶析出，对于需要的成分进行合并，收集得到洗脱液；

(3)集中得到成品

将各个部位收集到的洗脱液，分别回收洗脱液至1/3～1/4体积，向其中加入粉状活性炭，原料∶活性炭＝40∶1-100∶1，质量比，脱色，抽滤，然后干燥，得到比例提取物；

(4)检验

经过TLC和HPLC的含量检测，和对照品做比较，分析出比例提取物的关系，其中含有冬凌草甲素Oridonin含量在5-75％之间，冬凌草乙素Ponicidin含量控制在5-10％范围内，而熊果酸Ursolicacid含量在5-10％之间。

2、根据权利要求1所述的一种冬凌草有效成份提取物的制备方法，其特征在于其中所述步骤(4)的检验中HPLC的含量检测条件为：

(1)冬凌草甲素的检测条件：

流动相：甲醇∶水＝55∶45

检测波长：242nm

流速：0.8ml/min

色谱柱：日本岛津C₁₈ ODS，柱规格250*4.6mm；5um

灵敏度：0.005 AUFS

柱温：25℃

(2)冬凌草乙素的检测条件：

流动相：水∶乙睛＝75∶25

检测波长：252nm

流速：0.8ml/min

色谱柱：日本岛津C₁₈ ODS 250*4.6mm；5um

灵敏度：0.005 AUFS

柱温：25℃

(3)熊果酸的检测条件：

流动相：甲醇∶乙腈∶水∶磷酸＝30∶70∶10∶0.5

检测波长：220nm

流速：0.85ml/min

色谱柱：Waters C₁₈ ODS 250*4.6mm；5um

灵敏度：0.005 AUFS

柱温：25℃