CN1723921A - 一种毛蚶糖肽类提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从海洋生物毛蚶中经提取、沉淀、层析、脱盐等一系列技术措施处理而制备得到一类具有高抗癌活性的毛蚶糖肽类化合物及其制备方法，它属于医药技术领域。本发明采用了生物技术提取、硫酸铵分级沉淀；采用了凝胶过滤层析分离、Sephade G－25脱盐柱脱盐来制备具有高抗癌活性的毛蚶糖肽类化合物。本发明创造性地筛选出的分子量为10000Dal以下糖肽类混合物具有最佳的药理效果和经济技术效果；本发明运用了生物澄清技术，采用了低温条件下分离以保证提取物的活性；使用本发明所形成的注射液具有广谱抗癌疗效，疗效显著，毒副作用小。

Description

一种毛蚶糖肽类提取物及其制备方法

                        技术领域

本发明涉及一种从海洋生物毛蚶中经提取、沉淀、层析、脱盐等一系列技术措施处理而制备得到一类具有高抗癌活性的毛蚶糖肽类化合物及其制备方法，它属于医药技术领域。

                        背景技术

从海洋生物中尤其是从毛蚶中经技术处理可以制备得到具有抗癌活性的提取物。经检索，中国专利申请号98110478.9公开了“一种能抗癌的海洋生物提取物”技术，内容涉及从毛蚶或魁蚶中经用水浸泡粉碎低温水解而得到糖蛋白等活性物质；中国专利申请号03139763.8公开了一种“魁蚶中多肽蛋白类活性物质的用途及提取方法”，该专利申请公开的提取方法是直接将提取物经离子交换柱层析脱盐后，再经凝胶柱层析分离；中国专利申请号03157458.0公开了一项“毛蚶中的多肽蛋白类活性物质及其制备方法和用途”，该专利申请公开的提取方法是直接将提取物经离子交换柱层析脱盐后，再经凝胶柱层析分离截取分子量3-150kDa成分。

经对比分析背景技术可以看出，已有技术存在这样一些缺点和不足：

①、已有技术的提取物为糖蛋白或多肽蛋白，即蛋白类成分，而非糖肽类混合物。

②、已有技术的提取方法为常规制备方法，常规制备方法工艺落后、效率低下、精度不高，无法进行分子量细小微分。

③、已有技术的分子量范围宽泛，在此范围内，小分子量的蛋白属性与大分子量的蛋白属性差别很大，以至于该范围内的部分分子量的蛋白无法制备成注射剂供临床使用。

④、已有技术采用一般条件下离心提取，故离心提取过程难以保证提取物的活性，效果较差。

⑤、已有技术的提取步骤较为粗放，提取物中含有多种杂质，不宜直接用于纯度要求高的领域。

⑥、已有技术多采用先脱盐后凝胶柱层析步骤，使洗脱液中的杂质包括盐份残留在最终的提取物中。

                        发明内容

本发明的目的就是为了克服和避免已有技术的缺点和不足，而发明一种从海洋生物毛蚶中经提取、沉淀、层析、脱盐等一系列技术措施处理而制备得到一类具有高抗癌活性的毛蚶糖肽类混合物及其制备方法。本发明采用了新颖先进的生物技术提取、硫酸铵分级沉淀；采用了Superdex 75凝胶过滤层析分离、Sephade G-25脱盐柱脱盐来制备具有高抗癌活性的毛蚶糖肽类提取物。本发明创造性地筛选出的分子量为10000Dal以下的糖肽类混合物成分具有最佳的药理效果和经济技术效果；为了能进一步制备出毛蚶糖肽类混合物注射剂，供临床静脉、介入用药，本发明运用了生物澄清技术，采用了低温条件下分离以保证提取物的活性；使用本发明所形成的注射液具有广谱抗癌疗效，临床可用于治疗肺癌、肾癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病等癌症的治疗，疗效显著，毒副作用小。经过发明人的大量研究试验，本发明取得了一系列的技术进步，本发明工艺先进、效率较高、精度准确、纯度较高。

本发明是采用以下技术方案来实现其发明目的的。

一种毛蚶糖肽类提取物，它是通过以下方法制备得到的提取物：将鲜活毛蚶软体组织洗净捣碎匀浆，经低温提取、离心去渣、生物澄清剂吸附、冷冻分离、冻干箱冻干后得到提取物冻干粉，再将提取物冻干粉经硫酸铵分级沉淀、Superdex75凝胶过滤层析、合并分子量为10000Dal以下的洗脱峰便得到糖肽类混合物洗脱液，最后冻干洗脱液、用注射用水溶解冻干粉、经Sephade G-25脱盐柱脱盐、脱盐后提取液经真空冻干机冻干得到毛蚶糖肽类提取物。

前述的一种毛蚶糖肽类提取物，其制备过程的匀浆粒度为20um-50um，冻干箱冻干的冻干温度在-30℃～-40℃、升华温度为30℃～40℃、冻干时间为25-35小时，该毛蚶糖肽类化合物的物质特性是分子量小于10000Dal，pH值为5.5～7.5，易溶解于水，280nm处有最大吸收。

一种毛蚶糖肽类提取物的制备方法，它是将鲜活毛蚶软体组织洗净捣碎匀浆，经低温提取、离心去渣、生物澄清剂吸附、冷冻分离、冻干箱冻干后得到提取物冻干粉，再将提取物冻干粉经硫酸铵分级沉淀、Superdex75凝胶过滤层析、合并分子量为10000Dal以下的洗脱峰便得到糖肽类混合物洗脱液，最后冻干洗脱液、用注射用水溶解冻干粉、经Sephade G-25脱盐柱脱盐、脱盐后提取液经真空冻干机冻干得到毛蚶糖肽类提取物。

前述的一种毛蚶糖肽类提取物的制备方法，其制备方法的具体工艺如下：

(1)、将鲜活毛蚶生物体洗净、去壳取软体组织洗净、捣碎后用胶体磨低温研磨匀浆，粒度为20um-50um，温度在4℃以下。

(2)、匀浆后的净料用冷至6℃以下的新鲜制取的注射用水以重量比1∶1提取1～2次，所用搅拌机应慢速提取3-5小时。

(3)、提取液经离心去渣后，按体积比加入生物澄清剂III型按先B后A的顺序加入搅拌混匀后，冷藏放置10-14小时充分吸附，其中B的加入量为1％～3％，A的加入量为B加入量的一半。

(4)、澄清液经冷冻离心机分离后，分离液入冻干箱进行冻干。冻干温度在-30℃～-40℃，升华温度为30℃～40℃。冻干时间为25-35小时，取出冻干粉。

(5)、称取一定量的毛蚶提取物冻干粉，溶解于缓冲液A(20mMTris.Cl，50mMNaCl，2mEDTA，pH8.0)中，冻干粉与缓冲液A的重量体积比为6∶1-10∶1(G/L)，然后进行硫酸铵分级沉淀，取20％～60％饱和度硫酸铵沉淀溶解在缓冲溶液A中，4℃ 10000g下离心8-12min，取上清液。

(6)、上清液上Superdex75凝胶过滤层析柱(16×60cm)，洗脱液为缓冲溶液A，流速为0.4-0.6ml/min，280nm处检测，分步收集，每管3ml。

(7)、合并每个洗脱峰中的洗脱液。

(8)、粗毛蚶提取物冻干粉经上述纯化可得到糖肽混合物洗脱峰。

(10)、对得到的糖肽混合物洗脱液进行冻干，得冻干粉。

(11)、用注射用水溶解糖肽类混合物冻干粉，采用Sephade G-25脱盐柱(2×20cm)脱盐。脱盐后提取液经真空冻干机冻干，冻干温度在-30℃～-40℃、升华温度为30℃～40℃、冻干时间为25-35小时，得毛蚶糖肽类提取物冻干粉，采用干燥后称重法进行定量。

实施本发明的技术，可以实现本发明的目的，克服和避免已有技术的缺点和不足，本发明创造性地筛选出的分子量为10000Dal以下糖肽类混合物成分具有最佳的药理效果和经济技术效果；本发明运用了生物澄清技术，采用了低温条件下分离以保证提取物的活性；本发明采用了先层析分离后脱盐的步骤，工艺先进、效率较高、精度准确、纯度较高。

经分析测得，该毛蚶糖肽类提取物的物质特性是分子量小于10000Dal的混合物，其中含有分子量在3000Dal以下的多糖、分子量在10000Dal以下的肽和分子量在10000Dal以下的糖肽，该毛蚶糖肽类提取物的pH值为5.5～7.5，易溶解于水，280nm处有最大吸收。

本发明还能进一步制备出毛蚶糖肽类混合物注射剂，供临床静脉、介入用药，使用本发明所形成的注射液具有广谱抗癌疗效，临床可用于治疗肺癌、肾癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病等癌症的治疗，疗效显著，毒副作用小。

制备毛蚶糖肽类混合物注射剂的具体工艺如下：

称取毛蚶糖肽类提取物冻干粉适量，溶解于适量新鲜制取冷至10℃以下的注射用水中，使其充分溶解混匀，按体积比加入生物澄清剂III型按先B后A的顺序加入搅拌混匀后，冷藏放置10-14小时充分吸附后离心，其中B的加入量为1％～3％，A的加入量为B加入量的一半，离心液经微孔滤膜除菌超滤灌装于2ml安瓿中，经热原、无菌、澄明度、澄清度、装量、含量等检验合格后，供临床静脉、介入用药，用于肺癌、肾癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病等多种癌症的治疗。

                        具体实施方式

下面结合所举实施例对本发明作进一步的描述。

称取新鲜海洋捕取的毛蚶原料600g，用自来水洗净污泥，移至万级洁净间(温控10℃以下)拨去贝壳取出软体部分，纯化用水洗至无血污后，新鲜制取的注射用水(要求冷至10℃以下)洗涤三次，沥干水分，将软体组织用捣碎机进行捣碎(粒度1mm)捣碎的净料经胶体磨研磨低温匀浆(粒经为20um-50um)，匀浆净料按1∶1(w/w)比例加入新鲜制取的注射用水(冷至10℃以下)低温条件下慢速搅拌4小时(60转/分保持提取液温度4℃左右)，冷冻离心机(2000转/分)离心去渣，收集分离液，分离液再经管式离心机(16000转/分)离心，分离液收集于不锈钢桶中，用1％盐酸(分析纯)适量调pH5.5，加入澄清剂III型，按先B后A的顺序加入[B加入量为3％(v/v)，A加入量为1.5％(v/v)]搅拌混合均匀，于冷藏箱(4℃)静置12小时，使之充分吸附大分子杂质蛋白、微生物及热原，澄清液经冷冻离心机分离后，分离液入冻干箱，经-30℃，冻干30小时后，升华温度为35℃，取出冻干粉。

称取毛蚶提取物冻干粉0.4g，溶解于50ml缓冲液A(20mMTris.Cl，50mMNaCl，2mEDTA，pH8.0)中然后进行硫酸铵分级沉淀，取20％～60％饱和度硫酸铵沉淀溶解在2ml缓冲溶液A中，4℃ 10000g离心10min，取上清液。上清液上Superdex75凝胶过滤层析柱(16×60cm)，洗脱液为缓冲溶液A，流速为0.5ml/min，280nm处检测，分步收集，每管3ml。合并每个洗脱峰中的洗脱液，取10ul进行SDS-PAGE分析。毛蚶提取物冻干粉经上述纯化可得到糖肽类混合物洗脱峰。对得到的糖肽类混合物洗脱液进行冻干，得到冻干粉。用注射用水溶解冻干粉，采用Sephade G-25脱盐柱(2×20cm)脱盐。脱盐后的溶液，经真空干燥技术冻干(冻干温度为-35℃，冻干时间30小时，升华温度为30℃)得到糖肽类混合物冻干粉。

称取毛蚶糖肽类混合物冻干粉100mg，溶解于100ml新鲜制取冷至10℃以下的注射用水中，使其充分溶解混匀，按体积比加入生物澄清剂III型按先B后A的顺序加入(B的加入量为1％～3％，A的加入量为B加入量的一半)搅拌混匀后，冷藏放置12小时充分吸附后离心，离心液经微孔滤膜除菌超滤灌装于2ml安瓿中，经含量测定(按含氮计0.9～1.1mg/ml)、热原实验、微生物检验及澄明度、澄清度、pH值检验合格，临床供静脉、介入用药。用于：肺癌、肾癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病等癌症的治疗。

本发明与已有技术相比有许多技术进步：

1、本发明前期提取工艺中采用生物澄清剂除去大分子杂蛋白，而且离心提取过程采用低温条件下分离提取，以保存活性；而已有技术采用一般条件下离心，保留了大分子量的成分。

2、本发明粗提液经冻干技术保存原料，使其在以后的分离纯化中，暴露溶液时间短，成分完整，也方便于以后的提取分离，而已有技术暴露溶液时间长，成分不完整。

3、本发明先经凝胶过滤层析分离后，再经Sephade G-25脱盐柱进行脱盐，故脱盐彻底，提取物的纯度高；采用真空冻干技术冻干保存原料，方便制剂，使提取物在低温下充分保存活性；而已有技术提取液经脱盐后，再进行凝胶柱层析分离，浓缩干燥，不方便制剂，纯度降低，且不利于提取物保存活性。

4、本项发明所得成分为糖肽类混合物，经分析进一步得到了该糖肽类混合物的物质具体特性：分子量小于10000Dal，pH值为5.5～7.5，易溶解于水，280nm处有最大吸收；而已有技术所得成分为多肽蛋白，分子量范围宽泛，无法实施。

5、本项发明进一步将毛蚶糖肽类混合物采用澄清技术除热原，超滤技术除菌制备成注射剂，供临床静脉、介入用药，并且明确了抗瘤谱以及疗效。

本项发明所制备成的注射剂抗瘤谱广，经各种试验及临床发现该发明抗肿瘤疗效显著、毒副作用小。本发明创造所用原料来源广、易得，提取、分离过程耗能低，且对环境不产生任何污染，制备方便。本发明确定了毛蚶提取物中的抗肿瘤活性物质，明确了其有效部位，确定了分子量(分子量小于10000Dal)、pH值范围(5.5～7.5)，而且分离得到的提取物易溶于水，280nm处有最大吸收。

Claims (4)

1、一种毛蚶糖肽类提取物，其特征在于它是通过以下方法制备得到的提取物：将鲜活毛蚶软体组织洗净捣碎匀浆，经低温提取、离心去渣、生物澄清剂吸附、冷冻分离、冻干箱冻干后得到提取物冻干粉，再将提取物冻干粉经硫酸铵分级沉淀、Superdex75凝胶过滤层析、合并分子量为10000Dal以下的洗脱峰便得到糖肽类混合物洗脱液，最后冻干洗脱液、用注射用水溶解冻干粉、经Sephade G-25脱盐柱脱盐、脱盐后提取液经真空冻干机冻于得到毛蚶糖肽类提取物。

2、根据权利要求1所述的一种毛蚶糖肽类提取物，其特征在于所述的匀浆粒度为20um-50um，冻干箱冻干的冻干温度在-30℃～-40℃、升华温度为30℃～40℃、冻干时间为25-35小时。

3、一种毛蚶糖肽类提取物的制备方法，其特征在于它是将鲜活毛蚶软体组织洗净捣碎匀浆，经低温提取、离心去渣、生物澄清剂吸附、冷冻分离、冻干箱冻干后得到提取物冻干粉，再将提取物冻干粉经硫酸铵分级沉淀、Superdex75凝胶过滤层析、合并分子量为10000Dal以下的洗脱峰便得到糖肽类混合物洗脱液，最后冻干洗脱液、用注射用水溶解冻干粉、经Sephade G-25脱盐柱脱盐、脱盐后提取液经真空冻干机冻干得到毛蚶糖肽类提取物。

4、根据权利要求3所述的一种毛蚶糖肽类提取物的制备方法，其特征在于所述的制备方法的具体工艺如下：

(1)、将鲜活毛蚶生物体洗净、去壳取软体组织洗净、捣碎后用胶体磨低温研磨匀浆，粒度为20um-50um，温度在4℃以下。

(2)、匀浆后的净料用冷至6℃以下的新鲜制取的注射用水以重量比1∶1提取1～2次，所用搅拌机应慢速提取3-5小时。

(3)、提取液经离心去渣后，按体积比加入生物澄清剂III型按先B后A的顺序加入搅拌混匀后，冷藏放置10-14小时充分吸附，其中B的加入量为1％～3％，A的加入量为B加入量的一半。

(4)、澄清液经冷冻离心机分离后，分离液入冻干箱进行冻干。冻干温度在-30℃～-40℃，升华温度为30℃～40℃。冻干时间为25-35小时，取出冻干粉。

(5)、称取一定量的毛蚶提取物冻干粉，溶解于缓冲液A(20mMTris.Cl，50mMNaCl，2mEDTA，pH8.0)中，冻干粉与缓冲液A的重量体积比为6∶1-10∶1(g/L)，然后进行硫酸铵分级沉淀，取20％～60％饱和度硫酸铵沉淀溶解在缓冲溶液A中，4℃ 10000g下离心8-12min，取上清液。

(6)、上清液上Superdex75凝胶过滤层析柱(16×60cm)，洗脱液为缓冲溶液A，流速为0.4-0.6ml/min，280nm处检测，分步收集，每管3ml。

(7)、合并每个洗脱峰中的洗脱液。

(8)、粗毛蚶提取物冻干粉经上述纯化可得到糖肽混合物洗脱峰。

(10)、对得到的糖肽类混合物洗脱液进行冻干，得冻干粉。

(11)、用注射用水溶解糖肽类混合物冻干粉，采用Sephade G-25脱盐柱(2×20cm)脱盐。脱盐后提取液经真空冻干机冻干，冻干温度在-30℃～-40℃，升华温度为30℃～40℃。冻干时间为25-35小时，得毛蚶糖肽类提取物冻干粉，采用干燥后称重法进行定量。