CN1714861A - 胸腺五肽缓释微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胸腺五肽缓释微球及其制备方法。该种微球由胸腺五肽、生物可降解药用高分子材料及乳化稳定剂组成，可采用乳化分散法、溶剂挥发法、喷雾干燥法或低温喷雾提取法制备。以生物可降解药用高分子材料为载体制备胸腺五肽缓释微球，可使胸腺五肽缓慢释放，缓释期长达数天或数月，明显减少服药次数，有利于临床治疗。

Description

胸腺五肽缓释微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种胸腺五肽(TP-5)的缓释微球。该种微球由药物胸腺五肽、生物可降解药用高分子材料及乳化稳定剂及乳化稳定剂组成，可采用乳化分散法、溶剂挥发法、喷雾干燥法或低温喷雾提取法制备。采用本专利方法制备的微球，可缓慢释放胸腺五肽，缓释期长达数天或数月，可明显减少服药次数，更有利于临床治疗。
背景技术
胸腺功能不全、慢性病毒感染、增生性变化等与自身免疫的发生有关。当胸腺本身功能不足或依赖胸腺的免疫系统出现明显的原发性或继发性缺陷，而自身的调节又不足以修复时，给予外源性胸腺激素就可以产生明显的疗效。如果机体免疫系统功能紊乱、低下或亢进，外源性胸腺激素可产生明显的双向调节作用。
胸腺五肽(TP-5)是胸腺生成素II(Thymopoietin II)结构中的5肽片段，具有与胸腺生成素II相同的生理功能和药效，由于TP-5的制备采用了国际上先进的多肽固相合成工艺，故具有纯度高、不含有大分子蛋白质，有效成份超过市售的胸腺素等优点。已有资料证明TP-5具有使血液中超氧化物岐化酶(SOD)含量升高、超氧负离子自由基含量显著下降的功能。本品还具有诱导T细胞分化作用，并与T细胞特异受体结合，使细胞内c AMP水平上升，从而诱导一系列胞内反应，达到调节免疫功能的作用。在多种免疫功能紊乱的状况下，无论是抑制还是超敏，TP-5都能通过促进或抑制的双向调节作用使免疫功能趋于正常。胸腺五肽已于1985年在意大利上市，商品名为Timunox。目前胸腺五肽已获FDA批准用于对HIV的临床研究。国内已于1997年批准了胸腺五肽及其冻干粉针的新药生产，其适应证为(1)慢性乙型肝炎；(2)各种原发性或继发性T细胞缺陷病(如儿童先天性免疫缺陷病)；(3)某些自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、儿童支气管哮喘和哮喘支气管炎等)；(4)各种细胞免疫功能低下的疾病(如病毒性肝炎、预防上呼吸道感染、顽固性口腔溃疡等)；(5)肿瘤的辅助治疗。
TP-5系人工合成的小肽化合物，结构明确，化学纯度高，不含致敏的大分子蛋白质，因此，无论是动物安全性评价还是临床观察结果，均显示本品无明显的毒副作用及不良反应。按WHO的有关标准要求，TP-5是一个较为理想的免疫增强剂，值得临床推广应用。
由于TP-5是一种肽类化合物，易被胃肠道酶破坏，因此不适于设计成口服给药剂型。目前市售制剂为注射用冻干粉针，规格为1mg，用前加灭菌注射用水1ml溶解后肌肉注射，或溶于250ml 0.9％氯化钠注射液静脉慢速滴注，一次1-2支，或隔日1次。TP-5治疗病症范围较广，用药时间为1-24个月不等，因此临床上需长期频繁注射给药，给患者带来诸多不便，顺应性差，临床使用和治疗极为不便，从某种意义上限制了该药的临床应用和市场开发。
发明内容
本发明目的，是通过药剂学研究，将TP-5制成可用于肌肉或皮下注射的缓释微球，延缓TP-5释药时间，使其缓释期长达数天或1个月以上，实现1次注射药效维持在2周以上或更长，减少注射次数，提高患者顺应性，方便临床使用。
本发明所述的TP-5缓释微球，直径为1-250μm，是由微球总重量2-20％(W/W)的TP-5、80-98％(w/w)的分子量在5000-75000道尔顿的可生物降解的药用高分子材料及0.25％-10％(w/w)的乳化稳定剂组成。其中，生物可降解药用高分子材料选自聚氰基丙烯酸烷酯、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚丙交酯-乙交酯(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚羟丁酸(PHB)、聚羟戊酸(PHV)、聚癸酸(PDA)、聚酸酐、聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯、聚乳酸-聚乙二醇、聚羟乙酸-聚乙二醇等，可使用其中一种或两种或两种以上混合物，最优选高分子材料为聚丙交酯-乙交酯(PLGA)，其聚合比例在50∶50-85∶15，分子量可在12000-75000道尔顿之间。乳化稳定剂选自聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚甲基丙烯酸钠、聚丙烯酸钠、羧甲基纤维素钠等，最优选PVA。
本发明所述的TP-5缓释微球，可通过乳化分散法、溶剂挥发法、喷雾干燥法或低温喷雾提取法制备。根据TP-5性质，最优选复乳化-溶剂挥发法。具体操作为：将生物可降解药用高分子材料先溶解于二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二氧六环、乙醚、丙酮或四氢呋喃等有机溶剂中，制成有机相，再把TP-5溶于水溶液中制成水相。将水相加入有机相中，采用匀化或超声振荡方法进行乳化，使形成W/O初乳。另制备含一定浓度乳化稳定剂的水溶液，将初乳倒入该溶液中，搅拌形成W/O/W复乳，再将复乳移入适量含乳化稳定剂的水溶液中，置于机械搅拌器上搅拌，离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，冷冻干燥，即得TP-5缓释微球。
精密称取TP-5缓释微球约40mg，置于容积为2ml的具盖塑料离心管中，加入pH7.4的磷酸盐等渗缓冲液1ml作释放介质，置于恒温水浴振荡器中，在37℃和60rpm的条件下恒温振荡，在0-60天内，定期取样。每次取样时将离心管取出，10000rpm离心10分钟，取上清液0.5ml作为供试液。弃去剩余的上清液，沉淀部分再加入新鲜的释放介质1ml，继续振荡。取供试液，照HPLC方法依法测定，按外标法计算累积释放度。测定结果显示，本发明方法制备的微球，体外释药可维持2周至60天。
附图说明
附图1：实施例1体外释药曲线
附图2：实施例2体外释药曲线
附图3：实施例3体外释药曲线
附图4：实施例4体外释药曲线
附图5：实施例4微球电镜照片
具体实施方式
本发明的实施例描述如下：
实验例1
称取1000mg PLGA(聚合比例＝50∶50，分子量18000)，溶于2ml二氯甲烷中，称取40mg-TP-5溶于400μl蒸馏水中。配制浓度为3％的PVA水溶液20ml和浓度为0.3％的PVA水溶液300ml。先将TP-5溶液移入溶有PLGA的二氯甲烷溶液中，在冰浴条件下置于乳化分散机上高速(22000rpm)乳匀20秒，然后将所制得的W/O型乳剂转移至20ml浓度为3％的PVA溶液中，置于乳化分散机上以6000rpm的转速，乳匀1分钟，得W/O/W型复乳，移入300ml 0.3％的PVA溶液中，置于机械搅拌器上以500rpm的转速搅拌3小时，离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，冷冻干燥即得。
所得微球粒径为1-60μm，平均粒径为40μm。微球外观圆整，粒径分布均匀。
实验例2
称取600mg PLGA(聚合比例＝50∶50，分子量18000)，溶于2ml二氯甲烷中，称取28mgTP-5溶于400μl蒸馏水中，配制浓度为3％的PVA水溶液20ml和浓度为0.3％的PVA水溶液300ml。先将TP-5溶液移入溶有PLGA的二氯甲烷溶液中，在冰浴条件下置于乳化分散机上高速(22000rpm)乳匀20秒，然后将所制得的W/O型乳剂转移至20ml浓度为3％的PVA溶液中，置于乳化分散机上以6000rpm的转速，乳匀1分钟，得W/O/W型复乳，移入300ml 0.5％的PVA溶液中，置于机械搅拌器上以500rpm的转速搅拌3小时，离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，冷冻干燥。
所得微球粒径为1-40μm，平均粒径为25μm。微球外观圆整，粒径分布均匀。
实施例3
称取1000mg PLGA(聚合比例＝50∶50，分子量18000)，溶于2ml二氯甲烷中，称取80mg TP-5溶于400μl蒸馏水中，配制浓度为2％的PVA水溶液20ml和浓度为0.5％的PVA水溶液300ml。先将TP-5溶液移入溶有PLGA的二氯甲烷溶液中，在冰浴条件下置于乳化分散机上高速(22000rpm)乳匀20秒，然后将所制得的W/O型乳剂转移至20ml浓度为3％PVA溶液中，置于乳化分散机上以6000rpm的转速，乳匀1分钟，然后将所得W/O/W型复乳移入300ml 0.5％的PVA溶液中，置于机械搅拌器上以500rpm的转速搅拌3小时，离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，冷冻干燥。
所得微球粒径为1-70μm，平均粒径为50μm。
实施例4
称取670mg PLGA(聚合比例＝50∶50，分子量40000-75000)，溶于3ml二氯甲烷中，称取40mg TP-5溶于400μl蒸馏水中，配制浓度为3％的PVA水溶液20ml和浓度为3％的PVA水溶液300ml。先将TP-5溶液移入溶有PLGA的二氯甲烷溶液中，在冰浴条件下置于乳化分散机上高速(22000rpm)乳匀20秒，然后将所制得的W/O型乳剂转移至20ml浓度为3％的PVA溶液中，置于乳化分散机上以6000rpm的转速，乳匀1分钟，然后将所得W/O/W型复乳移入300ml 0.5％的PVA溶液中，置于机械搅拌器上以500rpm的转速搅拌3小时，离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，冷冻干燥。
所得微球粒径为1-60μm，平均粒径为45μm。
实验例
对上述实施例样品进行体外释放度考察和外观形状测定，实验结果如下：
实验例1  胸腺五肽缓释微球体外释放试验
实验样品：根据实施例1、2、3所述方法制备的微球。
实验试剂：PH7.4的磷酸盐等渗缓冲液。
实验仪器：恒温水浴振荡器、离心机、高效液相色谱仪。
实验方法：精密称取实验样品约40mg，置于容积为2ml的具盖塑料离心管中，加入pH7.4的磷酸盐等渗缓冲液1ml，置于恒温水浴振荡器中，在37℃和60rmp的条件下恒温振荡，定期取样。
取样方法：将离心管取出，10000rpm离心10分钟，取上清液0.5ml作为供试液，弃去上清液，沉淀部分再加入新鲜的释放介质1ml，继续振荡。
取样时间：1、3、6、9、12、15、18、21、24天。
测定方法：照高效液相色谱法依法测定，按外标法计算累积释放度。
试验结果：见下表。
表1：实施例1、2、3样品体外释药测定结果
  样品   载药(μg/mg)                                      累积释放度(％)
实施例1 37.9   1天   3天   6天   9天   12天   15天   18天   21天   24天
  30.7   33.1   35.1   50.7   64.5   77.1   86.8   90.9   91.7
实施例2 26.4   1天   3天   6天   9天   12天   15天   18天   21天   24天
  35.0   39.2   43.7   45.8   62.5   78.2   88.4   93.0   94.2
实施例3 60.6   1天   3天   6天   9天   12天   15天   18天   21天   24天
  30.7   31.8   33   35   50.7   65.2   79.0   87.9   90
以累积释放度为纵坐标，释药时间为横坐标，绘制释药曲线，结果见附图1、2、3。
实验例2  胸腺五肽缓释微球体外释放试验
实验样品：根据实施例4方法制备的微球。
取样时间：1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、33、38、43、49、56、61、65天。
其他条件：同实验例1。
试验结果：见下表。
表2：实施例4样品体外释药测定结果
  样品   载药(μg/mg) 累积释放度(％)
实施例4 53.4   1天   4天   7天   10天   13天   16天   19天   22天   25天
  10.8  11.9   12.8   14.1   15.0   16.1   17.6   19.0   20.5
  28天   33天   38天   43天   49天   56天   61天   65天
  20.6   22.0   35.7   45.8   65.9   80.6   85.3   86.1
以累积释放度为纵坐标，释药时间为横坐标，绘制释药曲线，结果见附图4。
实验例3：胸腺五肽缓释微球形状扫描
实验样品：根据实施例4方法制备的微球。
实验仪器：JSM-3SCF型电子显微镜。
实验方法：略。
实验结果：电镜扫描结果显示，制备的TP-5微球外观圆整，粒径分布比较均匀，结果见附图5。

Claims (10)

1、一种胸腺五肽缓释微球及其制备方法。其特征在于：它由微球重量2-20％的胸腺五肽、98-80％的生物可降解药用高分子材料、0.25％-10％的乳化稳定剂组成。可采用乳化分散法、溶剂挥发法、喷雾干燥法或低温喷雾提取法制备。
2、根据权利要求1所述的缓释微球，其特征在于：活性成分胸腺五肽通用英文名为Thymopentin，其化学名称、结构式、分子式及分子量如下：
英文化学名为
N-(N-(N-(Nα-L-arginyl-l-lysyl)-l-α-aspartyl)-L-tyrosine；
中文化学名为N-[N-[N-(Nα-L-精氨酸-L-赖氨酰)-L-α-天门冬氨酰]-L-缬氨酰]-L-酪氨酸；
化学结构式：
缩写式为：H2N-Arg-Lys-Asp-Val-Thr-OH
分子式：C30H49N9O9，
分子量：679.8
简称TP-5。
3、根据权利要求1所述的缓释微球，其特征在于：生物可降解药用高分子材料可选自聚氰基丙烯酸烷酯、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚丙交酯-乙交酯(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚羟丁酸(PHB)、聚羟戊酸(PVA)、聚癸酸(PDA)、聚酸酐、聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯、聚乳酸-聚乙二醇、聚羟乙酸-聚乙二醇其中的一种或其中的两种或两种以上混合。
4、根据权利要求3所述的缓释微球，药用可降解高分子材料中优选的是聚丙交酯、聚乙交酯以及它们的共聚物聚丙交酯-乙交酯等脂肪簇聚酯类，其中最优选聚丙交酯-乙交酯(PLGA)。
5、根据权利要求4所述的缓释微球，PLGA聚合比例在50∶50-85∶15，分子量在5000-75000道尔顿之间。
6、根据权利要求5所述的缓释微球，PLGA在微球中的重量比为80-98％。
7、根据权利要求1所述的缓释微球，其特征在于：乳化稳定剂可选自聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚甲基丙烯酸钠、聚丙烯酸钠、羧甲基纤维素钠等。
8、根据权利要求7所述的缓释微球，聚乙烯醇为最优化乳化稳定剂，其用量范围为0.25％-10％。
9、根据权利要求1所述的缓释微球，其特征在于：可采用乳化分散法、溶剂挥发法、喷雾干燥法或低温喷雾提取法制备。其中溶剂挥发法为优选方法。
10、根据权利要求9所述的溶剂挥发法，其特征在于：将生物可降解药用高分子材料溶解在二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二氧六环、乙醚、丙酮或四氢呋喃等有机溶剂中，把TP-5溶于水溶液中。将水相加入上述有机相中，匀化或超声振荡成初乳(W/O)，再转入含乳化剂PVA的水溶液中，搅拌成复乳(W/O/W)，复乳移入适量含PVA的水溶液中，置于机械搅拌器上搅拌，离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，冷冻干燥，即得TP-5缓释微球。
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