CN112156183A - 一种CpG复合佐剂及作为新型冠状病毒疫苗佐剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种CpG复合佐剂及作为新型冠状病毒疫苗佐剂的用途，属于生物制品技术领域，该免疫佐剂包括聚乳酸类纳微球和免疫刺激剂，所述免疫刺激剂包括CPG ODN，所述CPG ODN偶联在聚乳酸类纳微球表面，所述CPG ODN偶联在聚乳酸类纳微球表面的方法包含：对聚乳酸类纳微球进行多巴胺修饰后悬浮于含有CpG ODN的PBS缓冲液中，所述PBS缓冲液中含有吡哆醇和甜菊糖A苷，室温混合，离心收集后进行洗涤。本发明提供的一种CpG复合佐剂作为新型冠状病毒疫苗佐剂能够有效增强抗原所诱导的细胞免疫及体液免疫应答，且制备成本较低、方便运输和储存。

Description

一种CpG复合佐剂及作为新型冠状病毒疫苗佐剂的用途

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种CpG复合佐剂及作为新型冠状病毒疫苗佐剂的用途。

背景技术

佐剂(Adjuvant)又称免疫调节剂或免疫增强剂(Immunepotentiator)，起源于拉丁文“Adjuvare”，是辅助或者增强的意思。佐剂是疫苗的一种添加剂，当它与抗原混合注入机体后，能够增强机体对抗原的免疫应答或者改变免疫反应的类型，属于非特异性的免疫增强剂，而其本身无抗原性。

可生物降解聚合物微球佐剂是新型佐剂的热门研究内容，微球药物递送系统广泛的用于抗肿瘤、蛋白多肽药物和疫苗等的研究中。可生物降解聚合物无毒无害，成本较低，同时具有可降解性，所以在药物递送系统的材料中引起学者广泛的关注。而微球的制备方法灵活多变，可以制备尺寸不一的粒径用于不同的给药方式。微球载体具有靶向递送，将药物聚集在靶点，减少系统分布，减小药物副作用等优点。可生物降解聚合物微球能够以吸附和包埋两种方式结合抗原，能够实现缓释抗原，免受体液中的酶降解失活，利用微球的靶向性可以使抗原更多的被APCs摄取，提高抗原利用率，结合免疫刺激剂能更好的增强机体的免疫应答效果，其可调控的粒径、电位、结构能够实现长效的体液免疫和细胞免疫。

现有技术如公开号为CN 106031794 A的中国发明专利，公开了一种胞内pH响应聚乳酸类纳微球及其制备方法，该发明的聚乳酸类纳微球是采用快速膜乳化法结合溶剂挥发/萃取法制得的；通过调整纳微球内水相与油相的比例，所制得的聚乳酸类纳微球具有“薄皮大腔”结构且粒径均一，并使其在胞内内体、溶酶体的酸性环境下具有响应释放所包埋物质的行为。该发明的聚乳酸类纳微球能在抗原提呈细胞内可控快速地释放抗原，更有效地激活抗原提呈细胞和T细胞，解决了传统方法制备的包埋抗原聚乳酸类纳微球释放抗原速度慢以及所制备的纳微球粒径不均一的问题，其对抗原装载量较高，制备简单，有望开发成为新型疫苗递送与佐剂系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够有效增强抗原所诱导的细胞免疫及体液免疫应答，且制备成本较低、方便运输和储存的复合免疫佐剂。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种复合免疫佐剂，包括聚乳酸类纳微球和免疫刺激剂，上述免疫刺激剂包括CPG ODN，上述CPG ODN偶联在聚乳酸类纳微球表面，上述CPG ODN偶联在聚乳酸类纳微球表面的方法包含：

对聚乳酸类纳微球进行多巴胺修饰，将得到的多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球悬浮于含有40-80μg/mL CpG ODN的PBS缓冲液中，室温混合3-4h，离心收集后进行洗涤，即得携载免疫刺激剂CpG ODN的多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球；

上述PBS缓冲液中含有0.04-0.08mg/mL吡哆醇和0.03-0.06mg/mL甜菊糖A苷。吡哆醇和甜菊糖A苷组合可能通过促进邻苯二酚基团与CPG ODN免疫刺激剂上的氨基发生反应，提高CPG ODN装载率，降低成本，在聚乳酸类纳微球的使用剂量相同的基础下，能够促进TLR9激动活化，提高促进DCs的活化与成熟的能力，为特异性免疫反应提供一个富含细胞因子和趋化因子的微环境，增强抗原所诱导的细胞免疫和体液免疫应答。

优选地，上述PBS缓冲液中多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球的初始浓度为0.8-1.8mg/mL。

优选地，上述CpG ODN的装载率可达72.3％以上。

本发明中，上述多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球的制备方法包括：将聚乳酸类纳微球悬浮在含有2-4mg/mL多巴胺盐酸盐的Tris缓冲液中，25-27℃下混合反应4-5h，离心收集纳微球，再次悬浮于2-4mg/mL含有多巴胺盐酸盐的Tris缓冲液中，25-27℃下混合反应4-5h，离心收集，得到多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球。

优选地，上述Tris缓冲液中聚乳酸类纳微球的初始浓度为0.8-1.8mg/mL。

优选地，上述聚乳酸类纳微球的制备方法包括：

以含1.8-2.2wt％的PVA水溶液为外水相W；

将含有28-36mg/mL PLGA的乙酸乙酯油相O₁加入到外水相W中，200-300rpm搅拌2-3min制得预乳液O₁/W；

将预乳液O₁/W倒入快速膜乳化器的储液罐中，0.55MPa氮气压力下过3μm膜3次，得到均一乳液；

在25-27℃下，将乳液倒入0.8-1.0wt％NaCl溶液中，300-400rpm搅拌3-4h，萃取乙酸乙酯固化纳微球，3500-4000rpm离心10-15min收集纳微球，用超纯水离心洗涤2-3次，得聚乳酸类纳微球。

本发明中，上述复合免疫佐剂的制剂为干粉形式。

优选地，上述复合免疫佐剂的干粉制剂采用冷冻干燥法制得。

优选地，上述冷冻干燥法所用冻干保护剂包括1-2.5wt％海藻糖、0.5-1.5wt％L-亮氨酸、0.08-0.15wt％肌醇六磷酸钠和0.03-0.05wt％烟酰胺。用肌醇六磷酸钠和烟酰胺复配制得的保护剂制得的微球干粉微球表面光滑、粒径均一且分散性良好，能够避免干燥过程中微球的失活，有利于抗原提呈细胞的识别和结合，提高抗原的摄取率，进而上调体液免疫应答和细胞免疫水平，同时本发明制备得到的干粉制剂具有良好的稳定性，方便运输和储存。

第二方面，提供上述的一种复合免疫佐剂在制备疫苗中的用途。

本发明的另一个目的在于提供一种抗原使用量较少、体液免疫应答和细胞免疫水平较高、稳定性好、方便运输和储存的疫苗组合物。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种疫苗组合物，其中，上述疫苗组合物包括复合免疫佐剂、抗原、冻干保护剂，上述复合免疫佐剂包括聚乳酸类纳微球和免疫刺激剂，上述免疫刺激剂包括CPG ODN，上述CPG ODN偶联在聚乳酸类纳微球表面，上述抗原被包埋在聚乳酸类纳微球中；

上述CPG ODN偶联在聚乳酸类纳微球表面的方法为：对包埋抗原后的聚乳酸类纳微球进行多巴胺修饰，后将多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球悬浮于含有40-80μg/mL CpG ODN的PBS缓冲液中，室温混合3-4h，离心收集后进行洗涤，即得携载免疫刺激剂CpG ODN的聚乳酸类纳微球；

上述PBS缓冲液中含有0.04-0.08mg/mL吡哆醇和0.03-0.06mg/mL甜菊糖A苷。吡哆醇和甜菊糖A苷组合可能通过促进邻苯二酚基团与CPG ODN免疫刺激剂上的氨基发生反应，提高CPG ODN装载率，降低成本，在聚乳酸类纳微球的使用剂量相同的基础下，能够促进TLR9激动活化，提高促进DCs的活化与成熟的能力，为特异性免疫反应提供一个富含细胞因子和趋化因子的微环境，增强抗原所诱导的细胞免疫和体液免疫应答。

本发明中，上述免疫刺激剂还包括咪喹莫特。

优选地，上述咪喹莫特与抗原共包埋在聚乳酸类纳微球中。

本发明中，上述聚乳酸类纳微球包埋抗原的具体步骤包括：

向2-3.5mg/mL碳酸氢铵水溶液中加入抗原，作为内水相W_内；

将W_内加入含有28-36mg/mL PLGA的乙酸乙酯油相O中，7200-7800rpm均质30-40s制得初乳液W_内/O；

将含1.8-2.2wt％的PVA水溶液为外水相W_外，将W_内/O加入到W_外中，400-500rpm搅拌2-3min制得预复乳液W_内/O/W_外；

将W_内/O/W_外倒入快速膜乳化器的储液罐中，0.2MPa氮气压力下过5μm膜1次，0.75MPa氮气压力下过2.5μm膜2次，得到均一复乳液；

在25-27℃下，将复乳液倒入0.8-1.0wt％NaCl溶液中，300-400rpm搅拌3-4h，萃取乙酸乙酯固化纳微球，3500-4000rpm离心10-15min收集纳微球，用超纯水离心洗涤2-3次，得包埋抗原的聚乳酸类纳微球。

优选地，上述咪喹莫特与PLGA共溶于乙酸乙酯油相O中。

优选地，上述PLGA的分子量为10000-20000。

优选地，上述PLGA由包括75wt％的乳酸单体和25wt％醇乙酸单体制得。更为优选地，上述乳酸单体中左旋乳酸和外消旋乳酸的质量比为3-4:1。

优选地，上述W_内与O的体积比为1:2-4。

优选地，上述W_外与O的体积比为5-9:1。

优选地，上述聚乳酸类纳微球在细胞内、溶酶体的pH5.0-6.5环境下，24h内所述抗原累积释放率达92.5％以上。

本发明中，上述抗原包括但不限于新型冠状病毒重组蛋白抗原、合成的多肽抗原或DNA疫苗。

本发明中，上述疫苗组合物的制备方法中，在CPG ODN偶联在聚乳酸类纳微球表面的步骤后还包括采用冷冻干燥法制得疫苗干粉的步骤。

优选地，上述冷冻干燥法所用冻干保护剂包括1-2.5wt％海藻糖、0.5-1.5wt％L-亮氨酸、0.08-0.15wt％肌醇六磷酸钠和0.03-0.05wt％烟酰胺。用肌醇六磷酸钠和烟酰胺复配制得的保护剂制得的疫苗干粉微球表面光滑、粒径均一且分散性良好，能够避免干燥过程中微球的失活，有利于抗原提呈细胞的识别和结合，提高抗原的摄取率，进而上调体液免疫应答和细胞免疫水平，同时本发明制备得到的干粉制剂具有良好的稳定性，方便运输和储存，降低疫苗对温度保存条件的要求，较液体疫苗节省了运输成本。

本发明由于在装载免疫刺激剂CpG ODN时采用了吡哆醇和甜菊糖A苷组合，因而具有如下有益效果：能够提高CPG ODN装载率，降低成本，在聚乳酸类纳微球的使用剂量相同的基础下，能够促进TLR9激动活化，提高促进DCs的活化与成熟的能力，为特异性免疫反应提供一个富含细胞因子和趋化因子的微环境，增强抗原所诱导的细胞免疫和体液免疫应答。

本发明由于在对复合免疫佐剂及疫苗进行冷冻干燥时采用了用肌醇六磷酸钠和烟酰胺复配制得的保护剂，因而具有如下有益效果：制得的干粉微球表面光滑、粒径均一且分散性良好，能够避免干燥过程中微球的失活，有利于抗原提呈细胞的识别和结合，提高抗原的摄取率，进而上调体液免疫应答和细胞免疫水平，同时本发明制备得到的干粉制剂具有良好的稳定性，方便运输和储存。

因而，本发明是一种能够有效增强抗原所诱导的细胞免疫及体液免疫应答，且制备成本较低、方便运输和储存的复合免疫佐剂。此外，本发明还是一种抗原使用量较少、体液免疫应答和细胞免疫水平较高、稳定性好、方便运输和储存的疫苗组合物。

附图说明

图1为本发明试验例1中细胞存活率的测定结果；

图2为本发明试验例1中AST、ALT、BUN、LDH、ALP的测定结果；

图3为本发明试验例2中CpG ODN的装载量和装载率的测定结果；

图4为本发明试验例2中疫苗干粉的扫描电镜图；

图5为本发明试验例3中TLR9的相对表达水平；

图6为本发明试验例3中CD80和MHCⅡ的表达水平；

图7为本发明试验例3中IL-6和IL-1β的浓度的测定结果；

图8为本发明试验例3中BMDCs对抗原的摄取情况；

图9为本发明试验例4中特异性IgG抗体滴度；

图10为本发明试验例4中脾细胞的増殖率；

图11为本发明试验例4中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6的分泌水平；

图12为本发明试验例4中脾细胞中CD8⁺T细胞表面CD107、FasL、Perforin的表达水平；

图13为本发明试验例4中CD44^hiCD62L^low和CD44^hiCD62L^hi的比例。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

1、一种免疫佐剂的制备方法，包括：

试验材料：PLGA，包括75wt％的乳酸单体和25wt％醇乙酸单体，左旋乳酸和外消旋乳酸的质量比为3:1，分子量14000，购自广州创赛生物医用材料有限公司；PVA，购自日本可乐丽，型号PVA217；CpG ODN序列如下：5’-TCCATGACGTTCCATGACGTT-3’。

PBS缓冲液的制备：0.24g KH₂PO₄，1.44g NaHPO₄，8g NaCl，0.2g KCl，0.056g吡哆醇，0.04g甜菊糖A苷，加入去离子水800mL，调节pH至8.5。

冻干保护剂的配制：包括2.5g海藻糖、1g L-亮氨酸、0.1g肌醇六磷酸钠和0.04g烟酰胺，96.36g去离子水。

1.1聚乳酸类纳微球的制备：

以含2.0wt％的PVA水溶液为外水相W，将15mL含有32mg/mL PLGA的乙酸乙酯油相O₁加入70mL外水相W中，200rpm搅拌3min制得预乳液O₁/W；

将预乳液O₁/W倒入快速膜乳化器的储液罐中，0.55MPa氮气压力下过3μm膜3次，得到均一乳液；

在26℃下，将乳液倒入0.9wt％NaCl溶液中，400rpm搅拌3h，萃取乙酸乙酯固化纳微球，4000rpm离心10min收集纳微球，用超纯水离心洗涤3次，得聚乳酸类纳微球。

1.2多巴胺修饰的纳微球的制备：将10mg聚乳酸类纳微球悬浮在10mL含有3mg/mL多巴胺盐酸盐的Tris缓冲液中，26℃下混合反应4h，离心收集纳微球，再次悬浮于3mg/mL含有多巴胺盐酸盐的Tris缓冲液中，26℃下混合反应4h，5000r/min离心10min后收集，得到多巴胺修饰的纳微球。

1.3携载免疫刺激剂CpG ODN的多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球的制备：将15mg多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球悬浮于10mL含有60μg/mL CpG ODN的PBS缓冲液中，室温混合3h，5000r/min离心10min后收集，用超纯水离心洗涤1次，即得携载免疫刺激剂CpG ODN的多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球；

1.4微球干粉的制备：将1.3制备好的携载免疫刺激剂CpG ODN的多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球与复配保护剂以1:1的比例混合，在磁力搅拌器上均匀混合10min后，通过冷冻干燥机进行制备。得到的干粉通过冷场发射扫描电镜观察干粉的形貌，将导电胶贴在样品台表面，取适量微球干粉黏附于导电胶上，设置真空离子溅射机对样品喷金，条件为20mA、120s，然后将样品台置于电镜样品室中进行观察。

实施例2：

PBS缓冲液的制备：0.24g KH₂PO₄，1.44g NaHPO₄，8g NaCl，0.2g KCl，0.056g吡哆醇，加入去离子水800mL，调节pH至8.5。其余部分和实施例1完全一致。

实施例3：

PBS缓冲液的制备：0.24g KH₂PO₄，1.44g NaHPO₄，8g NaCl，0.2g KCl，0.04mg/mL甜菊糖A苷，加入去离子水800mL，调节pH至8.5。其余部分和实施例1完全一致。

实施例4：

PBS缓冲液的制备：0.24g KH₂PO₄，1.44g NaHPO₄，8g NaCl，0.2g KCl，加入去离子水800mL，调节pH至8.5。其余部分和实施例1完全一致。

实施例5：

1、一种疫苗组合物的制备方法，包括：

试验材料：

PLGA，包括75wt％的乳酸单体和25wt％醇乙酸单体，左旋乳酸和外消旋乳酸的质量比为3:1，分子量14000，购自广州创赛生物医用材料有限公司；PVA，购自日本可乐丽，型号PVA217；CpG ODN序列如下：5’-TCCATGACGTTCCATGACGTT-3’。

PBS缓冲液的制备：0.24g KH₂PO₄，1.44g NaHPO₄，8g NaCl，0.2g KCl，0.056g吡哆醇，0.04mg/mL甜菊糖A苷，加入去离子水800mL，调节pH至8.5。

冻干保护剂的配制：2.5g海藻糖、1g L-亮氨酸、0.1g肌醇六磷酸钠和0.04g烟酰胺，96.36g去离子水。

Tris缓冲液的配制：先配制1M Tris缓冲液：称取121.1g Tris-Base，加入700mL双蒸水，溶解后加入浓盐酸调节pH，定容至1L，pH＝8.5。然后将1M Tris缓冲液稀释至10mM。

1.1新型冠状病毒COVID-19重组RBD-Fc蛋白抗原的制备：

合成RBD-Fc的编码核酸序列，如SEQ ID NO.1所示，使用ZY-CDMO载体进行质粒构建，将PmeI酶切位点和HindIII酶切位点位置互换，合成的RBD-Fc序列5’端带有EcoRI酶切位点，3’端带有HindIII酶切位点，将其插入到载体的EcoRI和HindIII之间，构建获得真核表达新型冠状病毒COVID-19疫苗载体质粒。于125ml细胞培养摇瓶中接种30ml密度0.5×10⁶cells/ml的HEK293细胞，当细胞密度生长至3×10⁶cells/ml以上，细胞存活率95％以上时，以1～2×10⁷vc/ml将细胞接种至摇瓶中备用，先使用转染缓冲液与质粒混合均匀，再使用转染缓冲液转染试剂混合均匀，将转染试剂混合液加入质粒混合液中混合均匀，室温静置10min，最后将转染复合物逐滴加入到放置有细胞悬液的摇瓶中，在37℃、5v/v％CO₂、转速125rpm的摇床中培养5-7天，收集培养液上清进行纯化。采用AKTA进行RBD-Fc蛋白的分离纯化。首先收集过Protein A亲和层析柱pH在3.4-3.6范围(用280nm进行监测)的洗脱液，调pH值至7.0，上样到分子筛层析柱，280nm进行监控和收集样品，超滤浓缩后获得RBD-FC蛋白。

1.2聚乳酸类纳微球包埋抗原：

向8mL 3mg/mL碳酸氢铵水溶液中加入100mg重组RBD-Fc蛋白抗原，作为内水相W_内；

将W_内加入18mL含有1.5mg/mL咪喹莫特和32mg/mL PLGA的乙酸乙酯油相O中，7500rpm均质40s制得初乳液W_内/O；

将含2.0wt％的PVA水溶液为外水相W_外，将W_内/O加入到130mL W_外中，400rpm搅拌3min制得预复乳液W_内/O/W_外；

将W_内/O/W_外倒入快速膜乳化器的储液罐中，0.2MPa氮气压力下过5μm膜1次，0.75MPa氮气压力下过2.5μm膜2次，得到均一复乳液；

在25-27℃下，将复乳液倒入1L 0.8-1.0wt％NaCl溶液中，300rpm搅拌4h，萃取乙酸乙酯固化纳微球，4000rpm离心10min收集纳微球，用超纯水离心洗涤3次，得包埋抗原的聚乳酸类纳微球。

1.3多巴胺修饰的纳微球的制备：将10mg包埋抗原的聚乳酸类纳微球悬浮在10mL含有3mg/mL多巴胺盐酸盐的Tris缓冲液中，26℃下混合反应4h，离心收集纳微球，再次悬浮于3mg/mL含有多巴胺盐酸盐的Tris缓冲液中，26℃下混合反应4h，4500r/min离心10min后收集，得到多巴胺修饰的纳微球。

1.4携载免疫刺激剂CpG ODN的多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球的制备：将15mg多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球悬浮于10mL含60μg/mL CpG ODN的PBS缓冲液中，室温混合3h，5000r/min离心10min后收集，用超纯水离心洗涤1次，即得携载免疫刺激剂CpG ODN的多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球；所得微球中抗原的包埋量为60μg/mg，咪喹莫特的包埋量为5μg/mg。

1.5疫苗干粉的制备：将1.4制备好的携载免疫刺激剂CpG ODN的多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球与复配保护剂以1:1的比例混合，在磁力搅拌器上均匀混合10min后，通过冷冻干燥机进行制备，得到疫苗干粉。在下述试验例中，使用的疫苗制剂为利用生理盐水对疫苗干粉进复溶所得。

实施例6：

PBS缓冲液的制备：0.24g KH₂PO₄，1.44g NaHPO₄，8g NaCl，0.2g KCl，0.056g吡哆醇，加入去离子水800mL，调节pH至8.5。其余部分和实施例5完全一致。

实施例7：

PBS缓冲液的制备：0.24g KH₂PO₄，1.44g NaHPO₄，8g NaCl，0.2g KCl，0.04mg/mL甜菊糖A苷，加入去离子水800mL，调节pH至8.5。其余部分和实施例5完全一致。

实施例8：

PBS缓冲液的制备：0.24g KH₂PO₄，1.44g NaHPO₄，8g NaCl，0.2g KCl，加入去离子水800mL，调节pH至8.5。其余部分和实施例5完全一致。

实施例9：

冻干保护剂的配制：2.5g海藻糖、1g L-亮氨酸、0.1g肌醇六磷酸钠，96.4g去离子水。其余部分和实施例5完全一致。

实施例10：

冻干保护剂的配制：2.5g海藻糖、1g L-亮氨酸、0.04g烟酰胺，96.46g去离子水。其余部分和实施例5完全一致。

实施例11：

冻干保护剂的配制：2.5g海藻糖、1g L-亮氨酸，96.5g去离子水。其余部分和实施例5完全一致。

试验例1：

1.1细胞毒性检测：采用CCK-8试剂盒进行检测，具体步骤如下：

a、在96孔板中每孔加入100μL细胞培养液，接种1×10⁵个J774巨噬细胞，在37℃，5v/v％CO₂的条件下预培养24h，使细胞贴壁生长；

培养24h后，向去除原有培养基，加入100μL含有不同浓度(0、50、100、200、400、600μg/mL)实施例1制得的纳微球的培养基，设置3个重复，在37℃，5v/v％CO₂的条件下培养30h；

向每孔中加入10μL CCK-8溶液，孵育1h；

用酶标仪测定450nm处的吸光度，参比波长设为620nm。

其中，阳性对照组为不含微球的单纯细胞组，设置微球与完全培养基(不接种细胞)组以去除微球本身对实验组吸光值的影响，并设置不接种细胞的空白组，细胞存活率的计算公式如下：

细胞存活率＝(OD_s-OD_b)/(OD_c-OD₀)×100％

式中，OD_s和OD_b分别表示实验组以及背景对照组的吸光值，OD_c和OD₀是分别值阳性对照组以及空白组的吸光值。细胞存活率的测定结果见图1。

由图1可以看出，实施例1制得的复合免疫佐剂的浓度在600μg/mL及以下时，细胞的增殖率均为90％以上，对细胞没有明显的毒性。

1.2安全性评价：

选用BALB/c小鼠共40只，雌雄各20只，分成2组，为给药组和对照组，每组雌雄各10只。给药组分别在第1天和第22天对雌雄小鼠股部进行肌肉注射给药，给药剂量为200μL/只，采用实施例5制得的疫苗制剂给药，抗原剂量为36μg/只，纳微球的剂量为600μg/只，IMQ剂量为3μg/只，对照组注射PBS，200μL/只。在第35d眼眶取血，使用东芝TBA-40FR生化分析仪测定相关血清生化指标，包括小鼠的心肌指标(天冬氨酸转氨酶AST)、肝功指标(丙氨酸转氨酶ALT)、肾功指标(尿素氮BUN)、主要器官指标(乳酸脱氢酶LDH)、肝胆指标(碱性磷酸酶ALP)。AST、ALT、BUN、LDH、ALP的测定结果见图2。

由图2可以看出，采用较高剂量对小鼠给药时，血液生化结果显示AST、ALT、BUN、LDH、ALP的测定结果与对照组比较无明显差异，生物安全性良好，没有产生明显的系统毒性。

试验例2：

2.1免疫刺激分子CpG ODN装载量及装载率的测定：

CpG ODN标准曲线的制作：配制浓度为80μg/mL的CpG ODN溶液，用Na₂SO₄溶液(0.01M)作为稀释液，制备以下6个浓度梯度的CpG ODN溶液：80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL。以Na₂SO₄溶液作为空白对照溶液，测260nm处的吸光度值。标准曲线方程为y＝24.168x+0.6312，R²＝0.9995。

上述实施例1中1.3中合成的携载免疫刺激剂CpG ODN的多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球悬液5000rpm离心10min后，取上清，根据CpG ODN标准曲线，计算上清液中CpG ODN的量，并计算CpG ODN的装载量和装载率：

装载量W＝W_总-W_清；

装载率(％)＝[(W_总-W_清)/W_总]×100％；

式中，W_总为加入CpG ODN的总量，W_清为上清中CpG ODN的总量。CpG ODN的装载量和装载率的测定结果见图3。

由图3可以看出，实施例1制得的复合免疫佐剂的CpG ODN的装载量和装载率明显大于实施例2、实施例3、实施例4，实施例5制得的疫苗组合物的CpG ODN的装载量和装载率明显大于实施例6、实施例7、实施例8，这说明，吡哆醇和甜菊糖A苷组合可能通过促进邻苯二酚基团与CPG ODN免疫刺激剂上的氨基发生反应，提高CPG ODN装载率，降低成本。

2.2疫苗制剂的表征：

上述实施例得到的疫苗干粉通过冷场发射扫描电镜观察干粉的形貌，将导电胶贴在样品台表面，取适量微球干粉黏附于导电胶上，设置真空离子溅射机对样品喷金，条件为20mA、120s，然后将样品台置于电镜样品室中进行观察。疫苗干粉的扫描电镜图见图4。干粉复溶后采用动态光散射粒度仪测定其粒径分布及均一性(PDI)，测定结果见表1。

表1纳微球的粒径分布及均一性(PDI)

由图4可以看出，实施例5制得的疫苗干粉微球表面光滑，分散性良好，实施例11制得的疫苗干粉微球皱缩现象较为严重，由表1可以看出，复溶后实施例5的粒径均一性较好，与原液粒径无显著差别，复溶后实施例9、实施例10、实施例11的粒径分布不均，且粒径均小于原液，这说明，用肌醇六磷酸钠和烟酰胺复配制得的保护剂制得的疫苗干粉微球表面光滑、粒径均一且分散性良好。

试验例3：

染色缓冲液的配制：135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO₄，8mM K₂HPO₄，2mMEDTA，0.5wt％BSA，pH7.2。

PBS缓冲液的制备：0.24g KH₂PO₄，1.44g NaHPO₄，8g NaCl，0.2g KCl，加入去离子水800mL，pH7.2。

3.1DCs胞内模式识别受体(PRRs)TLR9的活化情况：将纳微球复合疫苗佐剂加入培养至6d的小鼠骨髓来源的树突细胞(BMDCs)中，在37℃，5v/v％CO₂的条件下培养24h，采用细胞总RNA提取试剂盒提取细胞的总RNA，以提取的总RNA为模板，利用iScript^TM CdnaSynthesis Kit试剂盒进行反转录，合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：10μL SsoFast^TM SYBR Green Supermix，2μL上游引物，2μL下游引物，4μL Nuclease/DNase-free water，1μL DNA。反应条件：95℃30s，95℃5s，65℃30s，共循环40次，70℃延伸10min。TLR9的上游引物为：5’-GCTGTGACCATTTACCCGTG-3’；下游引物为：5’-ATCTCCGTTCCTTGCGTTAT-3’。参考基因β-actinde的上游引物为：GGCTGTATTCCCCTCCATCG；下游引物为：CCAGTTGGTAACAATGCCATGT。TLR9的相对表达水平见图5。

3.2DCs的体外活化与成熟：向培养至6d的BMDCs中加入上述实施例制得的疫苗制剂，其中所有制剂抗原剂量均为18μg/well，纳微球的剂量为300μg/well，IMQ剂量为1.5μg/well。继续在37℃，5v/v％CO₂的条件下培养24h，收集细胞，用1mL染色缓冲液清洗细胞2次，用含流式抗体(APC-anti-CD11c,PE-anti-CD80,eFluor 450-anti-MHCⅡ)的流式染色液重悬细胞，以进行流式抗体标记。染色标记30min后，再用1mL染色缓冲液清洗细胞2次，用0.5mL染色缓冲液重悬细胞于流式管中，过200目细胞筛，用流式细胞分析仪测定BMDCs表面共刺激因子CD80和抗原识别信号MHCⅡ的表达水平。CD80和MHCⅡ的表达水平见图6。

向培养至6d的BMDCs中加入上述实施例制得的疫苗组合物，其中所有制剂抗原剂量均为18μg/well，纳微球的剂量为300μg/well，IMQ剂量为1.5μg/well。继续在37℃，5v/v％CO₂的条件下培养24h，离心收集细胞，并收集上清，用ELISA试剂盒测定上清中细胞因子含量。结合标准曲线浓度计算得到细胞上清液中细胞因子(IL-6和IL-1β)的浓度。IL-6和IL-1β的浓度的测定结果见图7。

由图5、图6、图7可以看出，实施例5的TLR9的相对表达水平、CD80和MHCⅡ的表达水平、IL-6和IL-1β的浓度均明显大于实施例6、实施例7、实施例8，这说明吡哆醇和甜菊糖A苷组合能够提高CPG ODN装载率，在聚乳酸类纳微球剂量相同的基础上，能够促进TLR9激动活化，提高促进DCs的活化与成熟的能力。

3.3DCs对抗原的摄取：

用荧光染料FITC标记抗原，超滤除去未标记上蛋白的多余染料，然后分别按照上述实施例的方法制备疫苗组合物。

培养至6d的BMDCs中加入100μL疫苗制剂，其中所有制剂抗原剂量相同，剂量均为18μg/只，纳微球的剂量为300μg/只，IMQ剂量为1.5μg/只。每个样品设置3个副孔，作为平行，继续培养细胞0.5、1、2、4、12、24h后收集细胞，用1mL染色缓冲液清洗细胞2次，再用0.5mL染色缓冲液重悬细胞，使用流式细胞仪检测BMDCs对抗原的摄取情况。BMDCs对抗原的摄取情况见图8。

由图8可以看出，实施例5对抗原的摄取率明显高于实施例9、实施例10、实施例11，这说明，用肌醇六磷酸钠和烟酰胺复配制得的保护剂制得的疫苗干粉微球表面光滑、粒径均一且分散性良好，且能够避免干燥过程中微球的失活，有利于抗原提呈细胞的识别和结合，提高抗原的摄取率。

试验例4：

免疫方案：

将6周龄BALB/c小鼠共随机分为7组，每组8只，4只雌性，4只雄性。对雌雄小鼠股部进行肌肉注射给药，给药剂量为100μL疫苗制剂/只，阴性对照，每只注射100μL PBS。首免后22天进行加强免疫，免疫剂量同首免。其中所有制剂抗原剂量相同，剂量均为18μg/只，纳微球的剂量为300μg/只，IMQ剂量为1.5μg/只。

首免后第7d、21d、35d分别对小鼠进行眼眶采血，置于37℃恒温箱孵育20min；4℃放置2h；3500r/min，离心10min，分离血清，作为抗体检测分析样品。

在首免后35d处死小鼠，进行脾淋巴细胞增殖、细胞因子分泌、活化、杀伤性细胞(CTL)活化效应及记忆性T细胞反应情况的检测，

4.1检测血清中的抗原特异性抗体IgG，采用间接ELISA法进行测定：

取96孔酶标板，分别包被相应抗原蛋白，包被浓度1μg/ml，每孔50μl，4℃静置过夜；使用洗板机洗涤酶标板一次，拍干，加入3％BSA封闭液，每孔100μl。37℃静置1h；使用洗板机洗涤酶标板一次，拍干；另取一新96孔酶标板，对小鼠血清进行连续等比稀释；将稀释的血清加到步骤1中的三块酶标板中，每孔50μl；37℃静置45min；使用洗板机洗涤酶标板三次，拍干；加入稀释的山羊抗小鼠抗体(稀释度1：5000)，每孔50μl。37℃静置30min；使用洗板机洗涤酶标板三次，拍干；加入显色液，每孔50μl。显色约1min；加入终止液，每孔50μl；使用酶标仪读取OD450处吸光度。特异性IgG抗体滴度见图9。

4.2脾细胞增殖检测：将脾脏处理制得单细胞悬液，脾细胞悬液以2.5×10⁶cells/mL的浓度接种至96孔板中，每孔含细胞和培养基共150μL，每个细胞样品设置6个平行孔，其中3个孔含50μg/mL重组RBD-Fc蛋白抗原，另外3个不加，在细胞培养箱中培养48h后，向每孔中加入10nL的CCK-8试剂，继续培养4h，然后用酶标仪测定450nm处的吸光度值。脾细胞的増殖率PI的计算公式为：

PI＝(OD₁-OD_空白)/(OD₂-OD_空白)，

其中，OD₁为含有重组蛋白抗原和CCK-8溶液的脾细胞孔的吸光度；

OD₂为仅含有相同体积培养基和CCK-8溶液的脾细胞孔的吸光度；

OD_空白为不含细胞的培养基孔的吸光度。脾细胞的増殖率见图10。

4.3细胞因子分泌水平：将免疫小鼠的脾脏单细胞悬液以4×10⁶cells/mL的浓度接种至24孔板中，每孔1mL，用重组RBD-Fc蛋白抗原体外刺激脾细胞(50μg/mL)，在细胞培养箱中培养72h，收集细胞并离心，取上清液，采用ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6的分泌水平。IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6的分泌水平见图11。

4.4杀伤性T细胞活化效应：将免疫小鼠的脾脏单细胞悬液以5×10⁶cells/mL的浓度接种至24孔板中，每孔1mL，用重组RBD-Fc蛋白抗原体外刺激脾细胞(50μg/mL)，在细胞培养箱中培养72h，收集并洗涤脾细胞，离心，弃上清，用1mL浓度为10mmol/L PBS洗细胞2次，对其进行流式抗体标记(anti-CD4、anti-CD8、anti-CD107、anti-Perforin、anti-FasL)，标记结束后，加入1mL透膜缓冲液悬浮细胞，离心去上清，加入1mL染色缓冲液重悬细胞，离心，弃上清，加入800μL PBS重悬细胞，过200目细胞筛，使用流式细胞仪进行检测。脾细胞中CD8⁺T细胞表面CD107、FasL、Perforin的表达水平见图12。

4.5记忆性T细胞反应：将免疫小鼠的脾脏单细胞悬液以5×10⁶cells/mL的浓度接种至24孔板中，每孔1mL，用重组RBD-Fc蛋白抗原体外刺激脾细胞(50μg/mL)，在细胞培养箱中培养72h，收集并洗涤脾细胞，离心，弃上清，用1mL染色缓冲液清洗细胞2次，离心弃上清，对其进行流式抗体标记(anti-CD4、anti-CD8、anti-CD44、anti-CD62L)，用PBS清洗细胞2次，离心，弃上清，加入800μL PBS重悬细胞，过200目细胞筛，使用流式细胞仪检测脾细胞效应记忆性T细胞(CD44^hiCD62L^low)和中央记忆性T细胞(CD44^hiCD62L^hi)的比例。CD44^hiCD62L^low和CD44^hiCD62L^hi的比例见图13。

由图9可以看出，实施例5的特异性IgG抗体滴度明显高于实施例6、实施例7、实施例8，在诱导相同免疫应答水平的基础上能够有效节约抗原使用量；由图10-13可以看出，与实施例6、实施例7、实施例8相比，实施例5的脾细胞增殖率、Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α分泌，Th2型细胞因子IL-4、IL-6分泌水平明显增加，且更倾向于增强Th1型免疫反应，脾细胞中CD8⁺T细胞表面CD107、FasL、Perforin的表达水平更高，细胞杀伤能力增强，CD44^hiCD62L^low和CD44^hiCD62L^hi的比例较高，在二次病原体感染时能发挥更大的细胞免疫保护作用，这说明，吡哆醇和甜菊糖A苷组合能够提高CPG ODN装载率，在聚乳酸类纳微球剂量相同的基础上，能够提高促进DCs的活化与成熟的能力，为特异性免疫反应提供一个富含细胞因子和趋化因子的微环境，增强抗原所诱导的细胞免疫和体液免疫应答。

另由图9可以看出，实施例5的特异性IgG抗体滴度明显高于实施例9、实施例10、实施例11，在诱导相同免疫应答水平的基础上能够有效节约抗原使用量；由图10-13可以看出，与实施例9、实施例10、实施例11相比，实施例5的脾细胞增殖率、Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α分泌，Th2型细胞因子IL-4、IL-6分泌水平明显增加，且更倾向于增强Th1型免疫反应，脾细胞中CD8⁺T细胞表面CD107、FasL、Perforin的表达水平更高，细胞杀伤能力增强，CD44^hiCD62L^low和CD44^hiCD62L^hi的比例较高，在二次病原体感染时能发挥更大的细胞免疫保护作用，这说明，用肌醇六磷酸钠和烟酰胺复配制得的保护剂制得的疫苗干粉微球，能够提高抗原的摄取率，上调体液免疫应答和细胞免疫水平。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

序列表

<110> 浙江皇冠科技有限公司

<120> 一种CpG复合佐剂及作为新型冠状病毒疫苗佐剂的用途

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1287

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag gtgttcaacg ccaccaggtt cgccagcgtg 60

tacgcctgga acaggaaaag gatcagtaac tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac 120

tccgcctcct tctccacctt caaatgctat ggcgtgtccc ccaccaagct gaacgatctg 180

tgtttcacca acgtgtacgc cgactccttc gtgattaggg gcgacgaggt gcgccagatc 240

gcccctggtc agaccggcaa gatcgccgat tataactaca agctgcccga cgacttcacc 300

ggctgcgtga tcgcctggaa ctccaacaat ctggatagca aggtgggtgg aaactacaat 360

tacctgtaca gactgttccg caaatccaac ctgaagccct tcgaaaggga catctccaca 420

gagatctacc aggccggctc caccccctgc aacggagtgg agggcttcaa ctgctacttc 480

cccctgcagt cctacggctt ccagcccacc aacggcgtgg gataccagcc ctacagagtg 540

gtggtgctgt ccttcgagct gctgcacgcc cccgccaccg tggctgctgc tgaacctaaa 600

tcctgcgaca agacacacac ctgccccccc tgccctgccc ctgaactgct gggaggcccc 660

tccgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacacactga tgatctcccg gacccccgag 720

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccac gaagatcccg aagtgaaatt taattggtac 780

gtggacggcg tggaggtgca caatgcaaag acaaaaccca gggaggaaca gtacaatagt 840

acatacaggg tggtgagcgt gctgacagtg ctgcatcagg attggctgaa cgggaaggag 900

tataagtgca aggtgtccaa caaggccctg cccgccccca ttgagaagac catctccaaa 960

gccaagggcc agcccaggga gccccaggtg tacaccctgc cacccagcag agacgagctg 1020

accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaaaggct tctacccctc cgacatcgcc 1080

gtggaatggg aatcaaacgg ccagcctgag aacaactaca aaacaacacc ccccgtgctg 1140

gacagcgacg gcagcttctt cctgtactcc aagctgacag tggacaagtc caggtggcag 1200

cagggcaacg tgttcagttg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ttacacccag 1260

aagtccctgt ccctgtcccc cggcaag 1287

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccatgacgt tccatgacgt t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctgtgacca tttacccgtg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atctccgttc cttgcgttat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggctgtattc ccctccatcg 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagttggta acaatgccat gt 22

Claims (9)

1.一种复合免疫佐剂，其特征在于，包括聚乳酸类纳微球和免疫刺激剂，所述免疫刺激剂包括CPG ODN，所述CPG ODN偶联在聚乳酸类纳微球表面，所述CPG ODN偶联在聚乳酸类纳微球表面的方法包含：

对聚乳酸类纳微球进行多巴胺修饰，将得到的多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球悬浮于含有40-80μg/mL CpG ODN的PBS缓冲液中，室温混合3-4h，离心收集后进行洗涤，即得携载免疫刺激剂CpG ODN的多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球；

所述PBS缓冲液中含有0.04-0.08mg/mL吡哆醇和0.03-0.06mg/mL甜菊糖A苷。

2.根据权利要求1所述的一种复合免疫佐剂，其特征在于，所述多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球的制备方法包括：将聚乳酸类纳微球悬浮在含有2-4mg/mL多巴胺盐酸盐的Tris缓冲液中，25-27℃下混合反应4-5h，离心收集纳微球，再次悬浮于2-4mg/mL含有多巴胺盐酸盐的Tris缓冲液中，25-27℃下混合反应4-5h，离心收集，得到多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球。

3.根据权利要求1所述的一种复合免疫佐剂，其特征在于：所述复合免疫佐剂的制剂为干粉形式。

4.权利要求1-3任一项中所述的复合免疫佐剂在制备疫苗中的用途。

5.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括复合免疫佐剂、抗原、冻干保护剂，所述复合免疫佐剂包括聚乳酸类纳微球和免疫刺激剂，所述免疫刺激剂包括CPG ODN，所述CPGODN偶联在聚乳酸类纳微球表面，所述抗原被包埋在聚乳酸类纳微球中；

所述CPG ODN偶联在聚乳酸类纳微球表面的方法为：对包埋抗原后的聚乳酸类纳微球进行多巴胺修饰，后将多巴胺修饰的聚乳酸类纳微球悬浮于含有80-120μg/mL CpG ODN的PBS缓冲液中，室温混合3-4h，离心收集后进行洗涤，即得携载免疫刺激剂CpG ODN的聚乳酸类纳微球；

所述PBS缓冲液中还含有0.04-0.08mg/mL吡哆醇和0.03-0.06mg/mL甜菊糖A苷。

6.根据权利要求5所述的一种疫苗组合物，其特征在于：所述免疫刺激剂还包括咪喹莫特。

7.根据权利要求6所述的一种疫苗组合物，其特征在于：所述咪喹莫特与抗原共包埋在聚乳酸类纳微球中。

8.根据权利要求5所述的一种疫苗组合物，其特征在于：所述抗原包括但不限于新型冠状病毒的重组蛋白抗原、合成的多肽抗原或DNA疫苗，优选重组蛋白抗原。

9.根据权利要求5所述的一种疫苗组合物，其特征在于：所述疫苗组合物的制备方法中，在CPG ODN偶联在聚乳酸类纳微球表面的步骤后还包括采用冷冻干燥法制得疫苗干粉的步骤。

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