CN1876173A - 胸腺五肽注射用缓释微球制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是胸腺五肽的一种新剂型——胸腺五肽注射用缓释微球及其制备方法。该缓释微球包括以微球重量计，0.5％～30％(w/w)的胸腺五肽或其盐和70％～99.5％的可生物降解的分子量为5,000～500,000道尔顿的药用高分子辅料。它可以采用W/O/W法、S/O/O法、喷雾干燥法等方法制备。本发明的缓释微球平均粒径为5～40μm、包封率大于75％、突释小。该缓释微球能够延长药物作用时间、减少用药次数、提高胸腺五肽的生物利用度，降低药物的毒副作用。

Description

胸腺五肽注射用缓释微球制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及胸腺五肽注射用缓释微球及其制备方法。

背景技术

胸腺五肽(Thymopoietin 32-36，TP-5)是胸腺生成素的活性片段，由精氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、缬氨酸及酪氨酸五种氨基酸以酰胺键顺序结合而成，具有确定的分子式及分子量。

胸腺五肽的化学结构式如下：

缩写式：H₂N-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH

分子式：C₃₀H₄₉N₉O₉

分子量：679.8

国内外大量临床研究证明胸腺五肽具有诱导和促进T淋巴细胞及其亚群分化、成熟和活化的功能，调节T淋巴细胞的比例，使CD⁺ ₄/CD⁺ ₈趋于正常；调节和增强人体细胞免疫，能促使有丝分裂激活后的外周血中的T淋巴细胞成熟，增加T细胞在各种抗原或致有丝分裂原激活后各种淋巴因子(如：α、γ干扰素、白介素2和白介素3)的分泌，增加T细胞上淋巴因子受体的水平。它同时通过对T辅助细胞的激活作用来增强淋巴细胞反应。此外，胸腺五肽可能影响自然杀伤细胞(NK)前体细胞的趋化，该前体细胞在暴露于干扰素后细胞毒性增强，有利于发挥其治疗作用。它还能增强人体抗辐射的能力。因此，本品具有调节和增强人体细胞免疫功能的作用。主要用于治疗慢性乙型肝炎、各种原发性或继发性T细胞缺陷病(如儿童先天性免疫缺陷病)、某些自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、儿童支气管哮喘和哮喘支气管炎等)、各种细胞免疫功能低下的疾病(如病毒性肝炎、预防上呼吸道感染、顽固性口腔溃疡等)，以及肿瘤的辅助治疗。

现有的胸腺素制剂，由于胸腺素类物质的生物半衰期很短，故其在血液中的生物利用度很低且毒副作用较大(如：个别患者用后有嗜睡、倦怠，长期注射病人顺应性差)。而且需要频繁给药，市售的胸腺五肽粉针剂(剂量：1mg/支)(如：成都地奥九泓制药厂生产的注射用胸腺五肽，商品名为“替波定”)需要每天注射1次，1个月为1个疗程。因此，迫切需要开发一种新型制剂，从而降低胸腺素素类物质毒副作用，提高其生物利用度，同时减少给药次数，方便患者用药。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有胸腺五肽的缓释制剂，可以降低胸腺五肽的毒副作用，提高其生物利用度，同时减少给药次数，方便患者用药。

本发明的另一个目的是提供上述胸腺五肽缓释制剂的制备方法。

本发明的目的可以通过以下所述的胸腺五肽的缓释微球实现。

本发明所述的胸腺五肽缓释微球直径为1～80μm，平均粒径在5～40μm，是由占微球总重量0.5～30％的胸腺五肽或其盐和占微球重量70～99.5％的可生物降解药用高分子辅料，以及占微球重量0～10％的其它在药学上可接受的辅料组成。

以上所述的胸腺五肽，包括胸腺五肽及其可药用盐，是指通过从动物胸腺组织中提取、通过基因工程生物合成或者人工化学合成等任意方法获得的具有上述式(1)结构的物质。

所述胸腺五肽的可药用盐包括但不限于盐酸盐、醋酸盐、磷酸盐、硫酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐等。

上述可生物降解的药用高分子辅料，是指各种可以生物降解但不易溶于水的可药用的高分子材料，例如可以选自明胶、白蛋白、聚丙交酯-乙交酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚-3-羟基丁酸酯、聚乳酸-乙醇酸、聚乳酸-聚羟乙酸、聚邻酯、聚内酯、聚酐、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物、聚丙烯葡聚糖、羟基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇、聚羟乙酸-聚乙二醇中的一种或其中的两种或两种以上的混合物等。

采用上述可以生物降解的药用高分子辅料时，其分子量优选处于5,000～500,000道尔顿的范围。分子量大于500,000，分子量过大，进入体内后不容易降解，有可能难以实现适当的血药浓度，而且释放时间会变得过长。分子量低于5000，分子量过小，有可能难以实现缓释的目的。

上述可以生物降解的药用高分子辅料优选选自聚丙交酯-乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-聚羟乙酸、聚乳酸-乙醇酸、聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物中的一种物质或其中的两种或两种以上的混合物，最优选聚丙交酯-乙交酯。

此时，聚丙交酯-乙交酯的分子量可以在5,000～100,000道尔顿之间，丙交酯和乙交酯聚合比例在10∶90～90∶10之间。优选的聚丙交酯-乙交酯的分子量为10,000～50,000道尔顿，优选的丙交酯和乙交酯聚合比例25∶75～50∶50。

上述其它药学上可接受的辅料包括助溶剂、防腐剂、稳定剂的常见的制剂必需的药用赋形剂等。对此，本发明不拟作出限制。

本发明所述的胸腺五肽的缓释微球，从保持一定时效、生物降解性和注射入体内后不影响血液循环来看，粒径应当处于1～80μm之间，同时平均粒径为5～40μm。粒径小于1μm，突释过大，释放时间过短；粒径大于80μm，粒径变得过大，会影响到针头的大小，而且释放时间会变得过长。

所谓粒径应当处于1～80μm之间，是指占微球总数量90％以上，优选95％以上，再优选实际上所有的微球粒子的粒径处于1～80μm之间。“实际上所有”指的是粒径处于上述范围以外的微球在所有微球中仅占1％以下，优选在0.1％以下。

本发明的缓释微球中，只要能够实现缓释的目的，胸腺五肽的含量没有特别限制，但是从保证足够长时间的有效血药浓度的缓释效果和保证缓释效果的平衡角度来说，优选胸腺五肽占微球的0.5～30重量％，再优选不低于5重量％；可生物降解的药用高分子辅料占70～99.5重量％，优选不高于95重量％。如果胸腺五肽含量少于0.5重量％，不能保证足够高的血药浓度；反之，如果高于30重量％，则有可能不能保证药物平稳释放，可能造成副作用的发生。

本发明所述的微球可以采用微球的常规制备方法制得，如采用复乳-液中干燥两步成球法、喷雾干燥法等，优选复乳-液中干燥两步成球法。

当采用复乳-液中干燥两步成球法制备本发明的微球时，可以采用以下方式：第一步，首先用有机溶剂将可生物降解的辅料溶解形成油相，然后将另外溶有胸腺五肽的内水相加入其中，将油相和内水相置于搅拌器内，以每分钟5000～50000转高速搅拌0.5～5分钟，形成W/O乳液，之后将W/O乳液加入到3-8％PVA的外水相形成W/O/W复乳，搅拌3-8分钟；第二步，将上述W/O/W复乳再加入到含1-3％的PVA的水溶液中，在每分钟100～1000转的低速搅拌下挥发有机溶剂，微球固化后，离心、洗涤、干燥即得微球。在必要的情况下，也可以按照常规方法对微球进行水洗、分级等后处理，进行减压烘干或者冻干等干燥处理，然后分装。

其中形成油相的有机溶剂为具有足够挥发性、低残留的低沸点有机溶剂，例如可以选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、二氧六环、乙醚、丙酮、四氢呋喃、乙醇中的一种或其中的两种或两种以上的混合物。上述可降解辅料在有机溶剂中的浓度优选为10～1000mg/ml。

制备内水相时，用明胶、聚乙二醇、甘露醇、牛血清白蛋白等水溶液将胸腺五肽溶解，使得胸腺五肽或其盐在水相中的浓度达到10～500mg/ml。

外水相采用聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸钠、聚丙烯酸钠、聚甲基纤维素钠水溶液，浓度为0.5％～15％(w/v)。

本方法优选的制备工艺流程总结如图10所示。

当采用上述优选的工艺流程制备本发明的微球时，采用以下途径实现了微球制备和工艺的优化：对PLGA浓度、W/O体积比、PVA浓度三个因素进行了多水平的正交设计，然后对微球的平均粒径、包封率、突释的影响进行极差分析，最终确定了优选处方工艺。

最终优选的处方工艺制备的注射用胸腺五肽微球均为流动性良好的白色粉末，平均粒径在40μm左右，跨距在1.5～2.0之间，载药量＞10.0％、药物包封率＞80.0％、突释程度＜20.0％，加速释放曲线平稳。

当采用喷雾干燥法时，可以采用以下方法：用有机溶剂将可生物降解的辅料溶解形成油相，然后将另外溶有胸腺五肽的水相加入其中，将油相和水相置于搅拌器内，以每分钟5000～25000转高速搅拌0.5～5分钟，形成W/O乳液，采用喷雾干燥法制得微球。

其中形成油相的所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、二氧六环、乙醚、丙酮、四氢呋喃、乙醇其中的一种或其中的两种或两种以上的混合物。上述可生物降解药用辅料在有机溶剂中的浓度为10～1000mg/ml。

溶解胸腺五肽的时候，水相中最好含有明胶、聚乙二醇、甘露醇、牛血清白蛋白等。胸腺五肽在水相中的浓度为10～500mg/ml。

为了将本发明的胸腺五肽缓释微球制成成品注射剂，在制成微球后还应予以灭菌。本发明所述的胸腺五肽或其盐的缓释微球可以采用的灭菌方法可以是药学领域的任意灭菌法，例如各种物理灭菌法或者化学灭菌法，诸如湿热灭菌法、干热灭菌法、除菌滤过法、辐射灭菌法和环氧乙烷灭菌法等。优选辐射灭菌法，例如采用⁶⁰Co或者¹³⁷Cs的辐射灭菌法，优选⁶⁰Co辐射灭菌法。辐射灭菌时，可以采用能够用来灭菌的任意剂量，例如优选剂量为150万rad。

本发明所述的胸腺五肽或其盐的微球是将制备好的微球无菌粉末先在无菌的0.9％的生理盐水溶剂中混悬，均匀后肌注来给药的。例如，本发明产品可以一次给药为注射微球20mg，含药物约1.2～1.4mg(按含量计为约6％～6.9％)，1周注射1次；或者一次给药为注射微球60mg，含药物约7～9mg(按含量计为约12％～15％)，1.5～2月注射一次等。

附图简要说明

图1：实施例1的胸腺五肽缓释微球的粒径分布。

图2：实施例2的胸腺五肽缓释微球的粒径分布。

图3：试验例1的胸腺五肽缓释微球的体外加速释放曲线。

图4：试验例2的胸腺五肽缓释微球的体外加速释放曲线。

图5：试验例3的胸腺五肽缓释微球灭菌前后比较。

图6：试验例3的胸腺五肽缓释微球灭菌前后的体外加速释放曲线比较。

图7：试验例4的胸腺五肽缓释微球在兔体内释放曲线。

图8：试验例5的胸腺五肽缓释微球在加速稳定性实验前后比较。

图9：试验例5的胸腺五肽缓释微球在加速稳定性实验前后的体外加速释放曲线比较。

图10：本发明优选的制备方法的工艺流程图。

具体实施方式

以下将通过实施例和试验例来进一步说明本发明所述的胸腺五肽微球的制备方法、粒径控制、突释情况、缓释效果以及稳定性考察。

微球载药量和包封率的测定

实施例1、2中的微球载药量和包封率的测定

试验方法：精密称取制备的微球10mg到10ml容量瓶中，加入乙腈：0.1M磷酸-三乙胺(9∶1)，涡旋，离心后采用荧光分光光度法测定药物含量，并计算药物的含量和包封率。

微球粒径的测定

试验样品：实施例1、2制备的微球

试验仪器：倒置显微镜

试验方法：将制备的干燥微球粉末用含0.02％的Tween-80水溶液分散后，在带有刻度的400倍显微镜下观察微球，统计处理后得出微球的粒径分布图。

实施例1：复乳法制备胸腺五肽微球

将50mg胸腺五肽溶于0.5ml明胶水溶液中，500mg聚丙交酯-乙交酯(丙交酯∶乙交酯＝50∶50)(分子量为11000)溶于5ml二氯甲烷中，将二者合并，高速匀浆器每分钟10000转高速搅拌3分钟，形成W/O乳液，将W/O乳液倒入500ml含0.2％聚乙烯醇的外水相中，形成W/O/W复乳，在每分钟500转的低速搅拌下搅拌4h，挥发有机溶剂，离心分离，用蒸馏水洗涤3次，冷冻干燥20h，得到流动性良好的白色粉末，包封率76％，微球粒径范围5～80μm，平均粒径27.1μm，外观圆整，如图1所示。

实施例2：复乳法制备胸腺五肽微球

将100mg胸腺五肽溶于1.5ml明胶水溶液中，1.0g聚丙交酯-乙交酯(丙交酯∶乙交酯＝75∶25)(分子量为11000)溶于12ml二氯甲烷中，将二者合并，高速匀浆器每分钟10000转高速搅拌5分钟，形成W/O乳液，将W/O乳液倒入1000ml含0.2％聚乙烯醇的外水相中，形成W/O/W复乳，在每分钟500转的低速搅拌下搅拌4h，挥发有机溶剂，离心分离，用蒸馏水洗涤3次，冷冻干燥20h，得到流动性良好的白色粉末，包封率76％，测得粒径5～120μm，平均粒径32.5μm，如图2所示。

试验例1：胸腺五肽微球的体外加速释放试验。

试验样品：根据本发明实施例1所述的方法制备的微球。

试验试剂：0.02％的吐温80水溶液。

试验仪器：水浴恒温振荡器、离心机。

试验条件：温度：50℃，转速：160rpm。

试验方法：精密称取实验样品约10mg置于容积为100ml的具盖血清瓶中，加90ml释放介质(0.02％的Tween-80水溶液)，置于水浴恒温振荡器中，保持一定的温度和转速按时取样。

取样方法：精取5ml溶液，3000转条件下离心10min，再补加5ml的释放介质(0.02％的Tween-80水溶液)，取出液用荧光法检测。

取样时间点(小时)：1、4、7、20、30。

试验结果：本发明所制备的微球加速释放试验1小时的累积释放率为12.3％，30小时的累积释放率96.2％。微球加速释放试验效果图见图3。

试验例2：胸腺五肽微球的体外加速释放试验。

试验样品：根据本发明实施例2所述的方法制备的微球。

试验试剂：0.02％的吐温80水溶液。

试验仪器：水浴恒温振荡器、离心机。

试验条件：温度：50℃，转速：160rpm。

试验方法：精密称取实验样品约10mg置于容积为100ml的具盖血清瓶中，加90ml释放介质(0.02％的Tween-80水溶液)，置于水浴恒温振荡器中，保持一定的温度和转速按时取样。

取样方法：精取5ml溶液，3000转条件下离心10min，再补加5ml的释放介质(0.02％的Tween-80水溶液)，取出液用荧光法检测。

取样时间点(小时)：1、4、7、20、30。

试验结果：本发明所制备的微球加速释放试验1小时的累积释放率为16.7％，30小时的累积释放率97.5％。微球加速释放试验效果图见图4。

试验例3：胸腺五肽微球的灭菌实验。

试验样品：根据本发明所述的方法制备的微球。

试验辐射源：军事医学科学院放射医学研究所钴源组。

试验方法：取已制备的注射用胸腺五肽微球约50mg到10ml西林瓶中，压盖，采用150万rad的剂量进行辐射灭菌。

试验结果：本发明所制备的微球经过⁶⁰Co辐射灭菌后，微球仍为白色粉末，流动性良好，显微镜下观察，微球球形圆整，无聚集粘连现象，粒径分布无明显变化(见图5)；依照HPLC法检查注射用胸腺五肽微球中降解产物及含量的方法进行检测，结果表明经⁶⁰Co辐射灭菌后，注射用胸腺五肽微球含量稳定；比较灭菌前后微球的体外加速释放曲线，两者基本吻合，两条释放曲线间无显著性差异(见图6)。

试验例4：胸腺五肽微球的体内释放实验

将按本发明所制备的胸腺五肽微球冻干粉末60mg，经⁶⁰Co照射灭菌后，混悬于2ml无菌的0.9％的生理盐水溶剂中，均匀后对兔实施肌注，分别于第1.5h、3h、6h、10h、1d、2d、7d、14d、21d、28d、35d进行耳缘静脉取血，采用荧光分光光度法以外标法进行测定。所得结果如图7所示。从图中可见，在长达3周的时间内，血药浓度基本保持恒定。

试验例5：胸腺五肽微球的加速稳定性试验。

试验样品：根据本发明所述的方法制备的微球。

试验条件：温度：(25±2)℃，相对湿度60±10％，避光的条件下放置6个月。

试验方法：将胸腺五肽微球仿照上市包装，分装于10ml西林瓶中，压盖，参照药典规定，选择加速稳定试验在温度(25±2)℃，相对湿度60％±10％，避光的条件下放置6个月，分别在第0、1、2、3、6个月末取样。

试验结果：将制备的微球在加速稳定性试验的条件下，放置3个月后，与实验前相比较，注射用胸腺五肽微球的外观形态没有发生变化(见图8)；其药物含量均在标示量的90％～110％之间，稳定性良好，未见明显降解产物；体外加速释放曲线间无显著性差异(见图9)。

试验例6：胸腺五肽微球的长期稳定性试验。

试验样品：根据本发明所述的方法制备的微球。

试验条件：温度：(6±2)℃，避光的条件下放置12个月。

试验方法：将胸腺五肽微球仿照上市包装，分装于10ml西林瓶中，压盖，参照药典规定，长期稳定性试验条件在(6±2)℃，避光的条件下放置12个月，每3个月取样一次，分别于0、3、6、9、12个月取样。

试验结果：将制备的微球在长期稳定性试验的条件下，放置3个月后，与实验前相比较，注射用胸腺五肽微球的外观形态没有发生变化；其药物含量均在标示量的90～110％之间，稳定性良好，未见明显降解产物；体外加速释放曲线间无显著性差异。

Claims (10)

1.一种胸腺五肽注射用缓释微球，其特征在于它是由微球重量的0.5％～30％的胸腺五肽或其盐和微球重量70％～99.5％的可生物降解的分子量为5,000～500,000道尔顿的药用高分子辅料，以及占微球重量0％～10％的其它在药学上可接受的辅料组成，其粒径为1～80μm，平均粒径为10～40μm。

2.按照权利要求1所述的注射用缓释微球，其中所述胸腺五肽的盐是盐酸盐、醋酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乳酸盐或柠檬酸盐。

3.按照权利要求1所述的注射用缓释微球，其中所述药用高分子辅料选自明胶、白蛋白、聚丙交酯-乙交酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚-3-羟基丁酸酯、聚乳酸-乙醇酸、聚乳酸-聚羟乙酸、聚邻酯、聚内酯、聚酐、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物、聚丙烯葡聚糖、羟基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇、聚羟乙酸-聚乙二醇中的一种或其中的两种或两种以上的混合物。

4.按照权利要求3所述的注射用缓释微球，其中所述的药用高分子辅料优选选自聚丙交酯-乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-聚羟乙酸、聚乳酸-乙醇酸、聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物中的一种或其中的两种或两种以上的混合物，最优选聚丙交酯-乙交酯(聚乳酸-羟乙酸)。

5.按照权利要求3、4所述的注射用缓释微球，其中所述的药用高分子辅料聚丙交酯-乙交酯或聚乳酸-聚羟乙酸，其分子量为5,000～100,000道尔顿，丙交酯和乙交酯或乳酸和羟乙酸的比例在75∶25～40∶60之间。

6.按照权利要求1～6所述的注射用缓释微球的制备方法，其特征在于采用复乳-液中干燥两步成球法制备微球，其特征是：第一步，首先用有机溶剂将可生物降解的辅料溶解形成油相，然后将另外溶有胸腺五肽的内水相加入其中，将油相和内水相置于搅拌器内，以每分钟5000～50000转高速搅拌0.5～5分钟，形成W/O乳液，之后将W/O乳液加入到3-8％PVA的外水相形成W/O/W复乳，搅拌3-8分钟；第二步，将上述W/O/W复乳再加入到含1-3％的PVA的水溶液中，在每分钟100～1000转的低速搅拌下挥发有机溶剂，微球固化后，离心、洗涤、干燥即得微球。

7.按照权利要求1～6所述的注射用缓释微球的制备方法，其特征在于将可生物降解的辅料用有机溶剂溶解形成油相，然后将溶有胸腺五肽或其盐的水相加入其中，经处理后形成W/O乳液，然后采用喷雾干燥法制得微球。

8.按照权利要求1～6所述的注射用缓释微球胸腺五肽的降解产物及含量的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法，其色谱条件为：色谱柱为C18(5μm，4.6×150mm)；流动相是pH7.0磷酸缓冲液-甲醇(90∶10)；流速为1.0ml/min；检测波长为275nm；进样体积为20μl。

9.按照权利要求1～6所述的注射用缓释微球胸腺五肽的含量测定方法及体外释放度测定方法，其特征在于采用荧光分光光度法，其激发波长为266nm，发射波长为307nm。

10.按照权利要求1～6所述的注射用缓释微球的灭菌方法，其特征在于采用⁶⁰Coγ射线放射源进行辐射灭菌。

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