CN1732903A - 一种制备缓释微球的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改进的S/O/W方法，成功地制备了高载药量和包封率的PLGA缓释微球。多肽或小分子蛋白质溶解于DMSO中，将此溶液加入溶有PLGA的DCM中，利用反溶剂(anti－solvent)作用形成药物的微细颗粒，然后将形成的悬浊液加入到外水相，有机溶剂挥发后得到缓释微球。实验结果表明，改进的S/O/W方法在载药量高于15％的情况下，仍能很容易地实现90％以上的包封率，其突释也比W1/O/W2方法有明显的减小。与传统的W1/O/W2复乳化法相比，本方法不要求药物在水中有很大的溶解度；与通常的S/O/W方法相比，本方法不要求原料药物粉末的粒径很小。
Description
技术领域
本发明涉及一种将蛋白质、多肽类药物包封入聚合物中，从而得到能够持续释放药物的微球的方法。
背景技术
缓释微球是一种重要的缓释型药物输送系统(Drug DeliverySystem，DDS)。其通过将活性成分包封入聚合物中，使活性成分长期稳定地从微球中释放出来，从而达到缓释控释的目的。
已经报道的微球制备方法有多种，比如溶剂挥发法(solventevaporation)、凝聚法(coacervation)、喷雾干燥法以及喷雾冷冻干燥法等(Protein delivery from biodegradable microspheres，by J.L.Clelandin Protein Delivery，edited by L.Sanders and W.Hendren，Plenum Press，N.Y.1997)。其中使用最多的是水相中溶剂挥发法，它又可细分为单乳化法(Oil/Water，O/W)和复乳化法(Water/Oil/Water，W/O/W)。
单乳化法的大致过程为：将蛋白质、多肽药物和聚合物一起溶解在一种有机溶剂或多种有机溶剂的混合物中，然后将其分散在水相中。待有机溶剂挥发后，聚合物析出，得到包封了药物的微球。由于多肽一般溶于水，单乳化法的包封率一般较低。所以该方法更多见于水不溶性药物的包埋。
复乳化法的大致操作是：将蛋白质、多肽药物溶解在水溶液中，然后将得到的含有药物的水溶液(W1)分散在含有聚合物的有机溶剂(O)中，形成一级乳液(water in oil，W1/O)，再将其分散在另一个水相(W2)中，形成二级乳液(water in oil in water，W1/O/W2)。待有机溶剂挥发后，聚合物析出，得到包封了药物的微球。与单乳化法相比，复乳化法的包封率有了较大的提高。
影响复乳化法包封率的因素很多，其中最重要的一点就是部分内水相会穿透中间有机相，并扩散到外水相。从这一点出发，人们尝试各种方法来阻止或减弱这一扩散现象，从而提高包封率。常用的方法有：增大有机相和内水相两者的体积比(相当于内水相液滴大小相同的情况下，增大了中间有机相的厚度，从而减小扩散，提高包封率)以及增大有机相中聚合物浓度(增加了有机相粘度，从而减小扩散)。在聚合物量一定的情况下，提高有机相粘度就要求有机相体积小，这样聚合物浓度高；而要增大Vo/Vw1，就进一步要求内水相体积尽量小。当载药量较高的时候，内水相体积减小就要求其中药物的浓度很高，比如LHRH微球的制备过程中，微球设计载药量为22.5％(W/W)时，内水相多肽浓度高达450mg/ml。而一般蛋白质、多肽在水中很难有如此高的溶解度，而且，在如此高浓度下，蛋白质和多肽容易发生聚集、变性等不利现象。
有的研究者提出可以采用改进的复乳化方法，即一级乳液不采用油包水(W/O)，而直接将多肽粉末悬浮在有机相中，形成油包固(S/O)的悬浊液，然后将此悬浊液分散到水相中，形成S/O/W的复乳液。由于多肽粉末一般不溶于中间有机相溶剂，此方法可避免W1/O/W2复乳化方法中内水相向外水相的扩散，提高了包封率。
一般地说，缓释微球的粒径应控制在1-200μm，优选地，应该控制在10-100um。因为微球通常用于注射给药，粒径太大将导致必须用更大号的注射针头，患者的疼痛感更强；而粒径太小将导致聚合物无法很好地包裹药物，从而达不到良好的缓释效果。
通常得到的蛋白质、多肽冻干粉末平均粒径在10-100μm，比如，典型的蛋白质、多肽冷冻干燥粉末平均粒径约在10-50μm。如果直接用如此大粒径的粉末悬浮在有机溶剂中形成S/O悬浊液，然后应用S/O/W复乳化方法制备微球，药物将得不到很好的包封。导致的结果是或者包封率低，或者缓释结果不令人满意(前期药物突释(burst)较大而后期药物释放量不足)。因此，一般要采用某种方法预先将药物粉末平均粒径减小到1-10μm，然后将此粉末用于S/O/W复乳化法制备缓释微球(USP 6,270,700；Takada S，etal.Journal of Controlled Release.2003，88(2)：229-42)。
因此，本发明的目的在于，提供一种无需预先制备小粒径药物粉末，直接使用大粒径的蛋白质、多肽粉末，通过S/O/W复乳化法制备缓释微球，而且又能保证理想的包封率和缓释效果的方法。
发明简介
本发明涉及一种改进的S/O/W复乳化制备缓释微球的方法，包括以下步骤：
a)将活性成分粉末溶解于一种强极性溶剂O1中，其中，活性成分为一种蛋白质或多肽，或者它们的一段氨基酸序列，或其衍生物或类似物或盐，或其混合物；
b)将溶液加入到溶解了聚合物的一种弱极性溶剂O2中，并得到活性成分微细颗粒均匀分散的悬浊液，其中，活性成分不能溶解于O2，O2和O1能够互溶，O2与水不互溶，而且O2和O1的体积比为1-200；
c)将悬浊液加入到含有表面活性剂的水溶液中；
d)待有机溶剂进入水溶液或挥发后，得到包封了活性成分的微球。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，优选的蛋白质或多肽选自胰岛素、生长激素释放肽、黄体生成素释放激素、生长激素抑制素、胃泌素释放肽、降钙素、生长激素释放因子、甲状旁腺素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、Exendin-4或生长激素。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，更加优选的蛋白质或多肽为黄体生成素释放激素。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，更加优选的蛋白质或多肽为胰高血糖素样肽-1。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，优选的O2和O1的体积比为5-100，更加优选的体积比为10-50。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，优选的活性成分粉末平均粒径在5-1000μm之间。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，更优选的活性成分粉末平均粒径在10-100μm之间。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，更优选的活性成分粉末为冷冻干燥粉末，平均粒径为在10-50μm之间。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，优选的强极性溶剂O1选自乙酸或乙腈或二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的一种或其混合物。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，更优选的强极性溶剂O1为二甲基亚砜。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，优选的弱极性溶剂O2选自二氯甲烷或三氯甲烷或乙酸乙酯或丙酮中的一种或其混合物。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，优选的聚合物是聚乳酸或聚羟基乙酸或聚己酸内酯或聚酐，或者其共聚物或共混物。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，一个优选的实施方式为，聚合物以0.5％-30％W/V的浓度溶解在弱剂性溶剂O2中。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，一个更优选的实施方式为，聚合物以2％-15％W/V的浓度溶解在弱剂性溶剂O2中
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，优选的表面活性剂为选自油酸钠，硬脂酸钠，十二烷基磺酸钠，聚乙烯醇，羧甲基纤维素，卵磷脂，明胶，透明质酸，吐温，或司盘中的一种或其混合物。
本发明涉及的改进的S/O/W复乳化法，更优选的表面活性剂为聚乙烯醇。
本发明也涉及到应用改进的S/O/W方法制备的缓释微球。
附图说明
图1为常用溶剂的互溶性表。
图2(a)为购买得到的猪胰岛素冻干粉在显微镜下的照片(400倍)；图2(b)为反溶剂法得到的猪胰岛素颗粒在显微镜下的照片(400倍)。
图3为在扫描电镜(SEM)中观察到的PLGA微球图片。
图4为在扫描电镜(SEM)中观察到的PLGA微球剖面图片。
图5为PLGA缓释微球的粒径分布。
图6为包埋了猪胰岛素的PLGA缓释微球的体外释放实验结果。
图7为包埋了GLP-1的PLGA缓释微球的体外释放实验结果。
发明内容
本发明提供一种改进的S/O/W复乳化方法，直接将平均粒径在5-1000μm的蛋白质、多肽粉末应用于S/O/W复乳化法制备缓释微球。具体的步骤为，首先将该药物粉末溶解在强极性有机溶剂O1中，然后将该溶液按一定的体积比加入到溶解有聚合物的第二种有机溶剂O2中，其中，O2为弱极性有机溶剂，药物无法溶解在O2中，而且O1和O2可以互溶。这样，O1和O2混合后，丧失了对药物的溶解能力，蛋白质、多肽药物由于反溶剂(anti-solvent)作用而沉淀出来形成悬浊液均匀分散在O1/O2混合溶剂中。这种情况下形成的药物颗粒直径一般在0.1-10μm。之后，将形成的悬浊液分散到水相中，待有机溶剂挥发以后，得到包封了药物的缓释微球。
传统的W1/O/W2复乳化法中，内水相通常为溶解了蛋白质、多肽药物的缓冲溶液或不包含缓冲体系的水溶液，必要时可加一些其他添加剂，比如表面活性剂，稳定剂等。有机相通常采用二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)，乙酸乙酯(Ethyl Acetate)，丙酮(Acetone)等不能溶解被包封药物的溶剂，或者由它们混合形成的溶剂。外水相通常为聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)、吐温Tween)或司盘(Span)等表面活性剂的水溶液。
通常的S/O/W复乳化方法中，蛋白质、多肽粉末一般要经过特殊处理，预先将其平均粒径控制在1-10μm。其他如有机相和外水相与W1/O/W2相同。
本发明提供的改进S/O/W复乳化方法，第一个步骤是将蛋白质、多肽粉末溶解于强极性溶剂O1中。常用溶剂的极性指数和在水中的溶解度如表1所示，常用溶剂的互溶性如图1所示。本发明定义极性指数＞＝5.5的溶剂为强极性溶剂，极性指数＜5.5则为弱极性溶剂。因此，O1包括乙酸(HAc，极性指数6.2)、乙腈(ACN，极性指数5.8)、二甲基甲酰胺(DMF，极性指数6.4)和二甲基亚砜(DMSO，极性指数7.2)等，只要被包封药物可溶解于该溶剂中，该溶剂即可作为O1应用于本发明。另外，在实施本发明时，O1也可以是两种或某几种强极性溶剂的混合溶剂，或者以强极性溶剂为主，添加了少量(＜50％V/V)其他弱极性溶剂的混合溶剂。其中，由于二甲基亚砜几乎无毒，本发明优先选择DMSO作为O1用于溶解被包封药物。
本发明提供的改进S/O/W复乳化方法，第二个步骤是将前一步骤中得到的蛋白质、多肽溶液加入到溶解有聚合物的弱极性溶剂O2中，蛋白质、多肽药物因反溶剂作用而沉淀，得到蛋白质、多肽微细颗粒均匀分散的悬浊液。本发明中使用的弱极性溶剂O2为任何一种极性指数＜5.5、不能溶解被包封药物、可与强极性溶剂O1互溶且不能与水互溶的溶剂。作为代表而非限制性的例子，O2可以使用二氯甲烷(DCM)、三氯甲烷(Chloroform)、乙酸乙酯(Ethyl Acetate)、二氯乙烷(dichloroethane)、三氯乙烷(trichloroethane)、环己烷(cyclohexane)、苯(benzene)、甲苯(toluene)等中的一种，或由两种或多种弱极性溶剂混合而成的溶剂。在将溶解了蛋白质、多肽药物的O1溶剂加入到O2中时，为达到使药物沉淀的目的，两种溶剂的体积比Vo2/Vo1应该足够大，从而保证反溶剂现象的发生。一般地，Vo2/Vo1＝1-200，优选为5-100，更优选地，为10-50。同时，为保证能够得到微细的蛋白质、多肽颗粒，在将O1加入到O2的时候，O1应缓慢均匀加入，并伴以超声波、机械、磁力震荡或其他方式强化混合过程。
本发明提供的改进S/O/W复乳化方法，在得到蛋白质、多肽微细颗粒均匀分散的悬浊液后，其他步骤与传统的W1/O/W2或者S/O/W方法相同，即将悬浊液加入到外水相中，然后通过搅拌或其他方式，待有机相进入水溶液或挥发后，得到包封了药物的缓释微球。然后采用离心或过滤等方法收集微球，干燥后灭菌待用。
本发明涉及的缓释微球，是指用聚合物包封活性物质后形成的微粒。尽管除了微球(microsphere)这一名称外，有的文献也将其称为微囊(microcapsule)，本发明将其统称为微球(microsphere)。一般地说，微球不一定是严格的球形，微球形态可能很不规则，根据工艺不同，其表面有孔或无孔。微球的粒径通常为0.5-1000μm，优选为4-200μm，更优选为5-100μm。
表1：常用溶剂极性指数和水中溶解度
| 溶剂 | 性指数 | 水中溶解度(％V/V) |
| 乙酸 | 6.2 | 100 |
| 丙酮 | 5.1 | 100 |
| 乙腈 | 5.8 | 100 |
| 苯 | 2.7 | 0.18 |
| 正丁醇 | 4.0 | 0.43 |
| 四氯化碳 | 1.6 | 0.08 |
| 氯仿 | 4.1 | 0.815 |
| 环己烷 | 0.2 | 0.01 |
| 二氯乙烷 | 3.5 | 0.81 |
| 二氯甲烷 | 3.1 | 1.6 |
| 二甲基甲酰胺 | 6.4 | 100 |
| 二甲基亚砜 | 7.2 | 100 |
| 二氧六环 | 4.8 | 100 |
| 乙酸乙酯 | 4.4 | 8.7 |
| 乙醇 | 5.2 | 100 |
| 乙醚 | 2.8 | 6.89 |
| 正庚烷 | 0.0 | 0.0003 |
| 正己烷 | 0.0 | 0.001 |
| 甲醇 | 5.1 | 100 |
| 甲乙酮 | 4.7 | 24 |
| 戊烷 | 0.0 | 0.004 |
| 异丙醇 | 3.9 | 100 |
| 正丙醇 | 4.0 | 100 |
| 叔丁基甲基醚 | 2.5 | 4.8 |
| 四氢呋喃 | 4.0 | 100 |
| 二异丙醚 | 2.2 | - |
| 甲苯 | 2.4 | 0.051 |
| 三氯乙烷 | 1.0 | 0.11 |
| 水 | 9.0 | 100 |
| 二甲苯 | 2.5 | 0.018 |
本发明涉及的蛋白质、多肽，泛指由多个氨基酸以肽键连接而成的化合物，或者其与酸或碱作用而形成的盐。作为代表而非限制性的例子，这些蛋白质、多肽包括胰岛素(insulin)、生长激素释放肽(growth hormone releasing peptide，GHRP)、黄体生成素释放激素(luteinizing hormone-releasing hormone，LHRH)、生长激素抑制素(somatostatin)、胃泌素释放肽(gastrin releasing peptide，GRP)、降钙素(calcitonin)、生长激素释放因子(growth hormone releasing factor，GRF)、甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)、胰高血糖素(glucagons)、胰高血糖素样肽(glucagons like peptides，即GLPs，包括胰高血糖素样肽-1即GLP-1和胰高血糖素样肽-2即GLP-2)、Exendin-4、生长激素(growth hormone)等等，或者从它们的分子中截取的仍保留有生物活性的部分肽段，以及它们的可用作药物的衍生物、类似物或盐。多于一种蛋白质或多肽组成的混合物也可作为被包封药物用于本发明。只要该蛋白质、多肽具有一定的生物活性、能溶解于强极性溶剂、不溶解于弱极性溶剂，而且经历本发明所述的改进S/O/W复乳化过程时能保持其全部或大部分生物活性，即可作为被包封药物用于本发明。
很多多肽都参与人体的重要的生理活动，具有重要的医学价值。考虑到多肽，特别是包含3-50个氨基酸的多肽，通常不具备高级空间结构，因而往往能够耐受有机溶剂而很好地保持其生物活性。因此，本发明特别适用于这一类多肽。其中，本发明涉及到两类特别重要的多肽：黄体生成素释放激素(LHRH)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。其中，LHRH被广泛用于治疗乳腺癌和前列腺癌等疾病，代表性的已经用于临床治疗的例子如亮丙瑞林(Leuprorelin)、戈舍瑞林(Goserelin)。GLP-1是在人体中发现的具有促胰岛素分泌作用的多肽，天然的GLP-1以GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)OH两种形式存在，它们的很多类似物也被证明具有生物活性，GLP-1被认为是下一代的理想的II型糖尿病治疗药物。
本发明涉及的用于包封药物的聚合物，包括生物可降解聚合物(biodegradable polymers/bioerodible polymers)和生物不可降解聚合物(non-biodegadable polymers/non-bioerodible polymers)。作为代表而非限制性的例子，生物可降解聚合物包括聚酯(polyesters)(比如聚乳酸(polylactide)，聚羟基乙酸(polylycolide)，聚己酸内酯(polycaprolactone)，以及它们的共聚物或共混物[共混物即多于一种聚合物混和而成的聚合物混合体])，聚碳酸酯(polycarbonates)，聚缩醛(polyacetales)，聚酐(Polyanhydrides)，以及它们的共聚物或共混物；生物不可降解聚合物包括聚丙烯酸树脂(polyacrylates)，聚苯乙烯树脂(polystyrenes)，聚醋酸乙烯树脂(po1yvinylacetates)等等。两类聚合物的分子链都可以携带阴离子或阳离子基团，或者不携带这些基团。优选地，聚合物以1-20％W/V的浓度溶解于弱即性溶剂O2中，更优秀地，为5-15％W/V。
得到药物微细颗粒均匀分布的悬浊液后，将其加入到含有表面活性剂的外水相中，待有机溶剂挥发后，即可得到缓释微球。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于：阴离子表面活性剂，比如油酸钠(sodium oleate)，硬脂酸钠(sodium stearate)，十二烷基磺酸钠(sodiurn laurylsulphate)等；非离子表面活性剂，比如吐温(Tween)，聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)，羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose)，卵磷脂(lecithin)，明胶(gelatin)，透明质酸(hyaluronic acid)等；两性表面活性剂如卵磷脂等。外水相中表面活性剂浓度一般在0.01％-20％W/V之间，优选为0.05％到5％W/V之间。
可以选用γ射线或环氧乙烷中的一种来为制备好的微球灭菌。具体的灭菌方法属于本领域技术人员的一般知识和技术。对于γ射线灭菌来说，控制辐照剂量即能较好地保证灭菌效果，常用的剂量确定方法有25kGy法，公式法以及AAMI(美国医疗器械协会)法等。环氧乙烷灭菌的典型的操作条件为55～60℃，相对湿度60～80％，用量为每1升柜容积900～1000mg环氧乙烷，作用6h。
下面结合实施例对本发明进行进一步说明。但本发明的技术性范围并不局限于这些实施例。
具体实施方式
实施例1：典型的蛋白质、多肽粉末和由反溶剂法得到的蛋白质粉末粒径对比
1)取1ml eppendorf离心管，加入1ml酒精，再加入5mg猪胰岛素冻干粉(购自江苏万邦生化)，超声混合15s，然后取1滴悬浊液滴加到载玻片上，置于显微镜下观测。图
2(a)为观察到的图像。
2)将上述猪胰岛素冻干粉溶解在DMSO中，浓度为50mg/ml。取100μl溶液加入900μl酒精中，迅速震荡混合，然后取1滴悬浊液滴加到载玻片上，置于显微镜下观测。图2(b)为观察到的图像。
从图2的结果可以看出，胰岛素冻干粉平均粒径约为20-30μm，而反溶剂法能够显著减小其粒径，得到的颗粒直径一般在1-10μm。
实施例2：
传统W1/O/W2复乳化法、传统S/O/W复乳化法和改进S/O/W法制备微球的对比
本实施例中使用的聚合物为聚丙交脂-乙交脂(polylactide-co-glycolide)，其中，聚丙交脂/乙交脂(lactide/glycolide)＝50/50，即PLGA(50∶50)，特性粘度(即IV)为0.39，购自Birmingham Polymers公司，美国。
1)W1/O/W2法：配制25mg/ml和50mg/ml猪胰岛素水溶液，分别取一定体积的溶液加入2ml溶解有100mgPLGA(50∶50)的二氯甲烷(DCM)中，使用高速匀浆器(F6/10型号，Fluko，德国)10,000～15,000rpm匀浆1.5分钟。再将W1/O一级乳液加入200ml 1.0％(W/V)的聚乙烯醇(PVA，sigma，美国)溶液中，磁力搅拌器搅拌3小时(1000rpm)。之后离心收集微球，用800ml去离子水分数次冲洗，然后冷冻干燥。
2)传统S/O/W方法：将实施例1中的猪胰岛素冻干粉末直接加入到2ml溶解有100mg PLGA(50∶50)的DCM中，其它操作与1)相同。
3)改进S/O/W方法：将实施例1中的猪胰岛素溶解在DMSO中，分别配制成25mg/ml和50mg/ml溶液，然后分别取一定体积的溶液加入2ml溶解有100mg PLGA(50∶50)的DCM中，其它操作与1)相同。
4)胰岛素的高效液相色谱(HPLC)分析：使用Agilent 1100HPLC(Agilent Technologies，美国)，C-18反相色谱柱，流动相A为0.1％TFA，流动相B为0.1％TFA in 80％ACN，梯度为20-80％B/40分钟。
5)微球载药量分析：取5mg微球，溶于500μl乙腈(ACN)中，再加入0.1％TFA 500μl，充分混合后，离心，取上清液用HPLC分析其中的胰岛素浓度。所有微球中包封的药物总质量与投药量的比值即为药物的包封率。
6)微球的形态和粒径分析：微球的表面和内部形态使用扫描电镜观察(S-2150，Hitachi，日本)。微球的粒径分布使用粒度测定仪(MS-2000，Malvern，英国)进行测量。
7)微球的体外释放实验：称取PLGA微球20～30mg置于eppendorf离心管中，加入1ml PBS(pH＝7.4)，37℃温度下以100rpm恒温震荡，隔一定时间离心后取清液100μl，用HPLC分析其中的胰岛素含量，再补加100μl新鲜的PBS(pH＝7.4)，混合均匀后继续恒温震荡。实验测定了0-24h微球的药物释放情况。
载药量和包封率的实验结果如表2所示。所有的实验均重复3次以上，表2只列出了平均值。
表2：三种不同包封方法得到的包封率对比
| 编号 | 胰岛素浓度(mg/ml) | 加入体积(μl) | 理论载药量(％) | 实际载药量(％) | 包封率(％) | |
| 1 | 胰岛素水溶液 | 25 | 100 | 2.47 | 2.16 | 80.58 |
| 2 | 25 | 400 | 9.13 | 5.23 | 50.73 | |
| 3 | 50 | 100 | 4.61 | 3.5 | 74.2 | |
| 4 | 50 | 200 | 11.3 | 9.11 | 81.36 | |
| 5 | 50 | 400 | 16.13 | 10.11 | 55.6 | |
| 6 | 胰岛素DMSO溶液 | 25 | 100 | 2.48 | 2.56 | 100.43 |
| 7 | 25 | 400 | 8.75 | 8.32 | 89.24 | |
| 8 | 50 | 100 | 4.68 | 4.43 | 96.6 | |
| 9 | 50 | 200 | 10.18 | 9.27 | 91.36 | |
| 10 | 50 | 400 | 15.97 | 16.17 | 90.06 | |
| 11 | 胰岛素冻干粉 | - | - | 2.51 | 2.08 | 81.7 |
| 12 | - | - | 9.08 | 6.78 | 70.1 | |
| 13 | - | - | 4.72 | 3.48 | 73.7 | |
| 14 | - | - | 16.58 | 11.34 | 65.6 | |
从实验结果可以看出，W1/O/W2复乳化法要求有机相和内水相的体积比VO/VW1比较大，当VO/VW1＝20时，包封率可达到70-80％；而当VO/VW1＝5时，包封率急剧下降到50-55％。由于要求内水相体积小，在制备高载药量的微球时，必须要用到浓度高达数百mg/ml的药物水溶液，而这对大多数蛋白质或多肽来讲都是不可能的。以胰岛素为例，在pH＝7左右的水中溶解度不大，而在pH＝4或pH＝9的水溶液中浓度才能达到约100mg/ml。W1/O/W2复乳化法的这个特点使制备高载药量和高包封率的微球变得困难。改进的S/O/W方法则解决了则成功的解决了这个矛盾，利用多肽及小分子蛋白质能溶解在DMSO中的性质，并利用DCM的反溶剂作用，实现了高载药量和高包封率微球的制备。需要增大载药量时，只需增大DMSO溶液体积即可，药物包封率仍能保持在90％以上。对于传统的S/O/W方法来讲，如果胰岛素冻干粉不采取预处理手段将其粒径减小到1-10μm，包封率仍然不高(60-80％)。
图3(a)和3(b)分别是使用100μl和400μl猪胰岛素水溶液(25mg/ml)制备的PLGA微球(即表2中1号和2号样品)；图3(c)和3(d)分别是使用100μl和400μl猪胰岛素DMSO溶液(25mg/ml)制备的PLGA微球(即表2中6号和7号样品)。可以看到，在W1/O/W2复乳化方法中，VO/VW1＝20时微球形态较好，整体呈球形，而且表面光滑，孔很少；但VO/VW1＝5时，微球形态呈不规则形状，微球表面不光滑，孔很多，有的微球甚至发生了破碎，这些特点预示着该方法制备的微球突释(burst)会较大。而采用改进S/O/W方法制备的微球更圆整，表面更光滑且孔洞更少。
图4为表2中7号样品的剖面在SEM下的图片。可以看到，改进S/O/W方法制备的微球内部呈现紧密的实心结构，未发现通往表面的大孔。这种结构有利于减小突释(burst)，使药物持久稳定地释放。
粒径分布测定结果如图5所示。选取了载药量相似的8号(图5(b))和3号(图5(a))样品进行测定，两者的粒径分布没有明显的区别，都满足用于皮下注射的缓释微球对粒径的要求。
药物体外释放实验结果如图6所示(图示结果为3次实验的平均值，标准差通常在±5％以内，未显示在图中)。实验结果表明，当内相体积均为100或200μl时(图6(a))，改进S/O/W方法制备的微球的突释量比W1/O/W2方法制备的微球显著减小。而当内相体积为400μl时(图6(b))，前3hr内改进S/O/W方法优于W1/O/W2，但到第6hr时的释放总量两者就差不多了。这反映出，当VDCM/VDMSO≥10时，即可显著降低微球的突释；而VDCM/VDMSO≤5时，改进S/O/W方法与W1/O/W2方法制备的微球突释量相当。
实施例3：用改进S/O/W方法包封GLP-1(7-36)OH
按实施例2中实验3)所示的方法，选用不同内粘度(分子量)的PLGA，制备包封有GLP-1(7-36)OH的微球。结果如表3所示。
表3：改进S/O/W方法包封GLP-1(7-36)OH
| 编号 | PLGA内粘度(TV，dl/g） | 包封率(％) |
| 1 | 0.15 | 94.6±2.05 |
| 2 | 0.26 | 93.7±2.77 |
| 3 | 0.39 | 79.1±6.02 |
| 4 | 0.59 | 89.9±0.70 |
实施例4：GLP-1(7-36)OH缓释微球的体外释放实验
按实施例2中实验7)所示的方法，取表3中2号样品进行体外释放实验。结果如图7所示。
Claims (18)
1.一种制备缓释微球的方法，包括以下步骤：
a)将活性成分粉末溶解于一种强极性溶剂O1中，其中，活性成分为一种蛋白质或多肽，或者它们的一段氨基酸序列，或其衍生物或类似物或盐，或其混合物；
b)将溶液加入到溶解了聚合物的一种弱极性溶剂O2中，并得到活性成分微细颗粒均匀分散的悬浊液，其中，活性成分不能溶解于O2，O2和O1能够互溶，O2与水不互溶，而且O2和O1的体积比为1-200；
c)将悬浊液加入到含有表面活性剂的水溶液中；
d)待有机溶剂进入水溶液或挥发后，得到包封了活性成分的微球。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质或多肽选自胰岛素、生长激素释放肽、黄体生成素释放激素、生长激素抑制素、胃泌素释放肽、降钙素、生长激素释放因子、甲状旁腺素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、Exendin-4或生长激素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白质或多肽为黄体生成素释放激素。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白质或多肽为胰高血糖素样肽-1。
5.根据权利要求1所述的方法，其中O2和O1的体积比为5-100。
6.根据权利要求5所述的方法，其中O2和O1的体积比为10-50。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的活性成分粉末平均粒径在5-1000μm之间。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的活性成分粉末平均粒径为在10-100μm之间。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的活性成分粉末为冷冻干燥粉末，平均粒径为在10-50μm之间。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述强极性溶剂O1选自乙酸或乙腈或二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的一种或其混合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述强极性溶剂O1为二甲基亚砜。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述弱极性溶剂O2选自二氯甲烷或三氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或其混合物。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合物是聚乳酸或聚羟基乙酸或聚己酸内酯或聚酐，或者其共聚物或共混物。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合物以0.5％-30％W/V的浓度溶解在弱极性溶剂O2中。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述聚合物以2％-15％W/V的浓度溶解在弱极性溶剂O2中。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂为选自油酸钠，硬脂酸钠，十二烷基磺酸钠，聚乙烯醇，羧甲基纤维素，卵磷脂，明胶，透明质酸，吐温，或司盘中的一种或其混合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂为聚乙烯醇。
18.根据权利要求1所述的方法制备的缓释微球。
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