CN1686276A - 一种无花果果渣中抗癌活性部位的提取分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物中有效成分的开发利用领域，其采用超临界CO2萃取技术从提取果汁后的无花果果渣中萃取抗癌活性部位，再采用层析柱对抗癌活性部位进行纯化分离、用洗脱剂对层析柱进行洗脱的步骤；其中萃取压力为26～40MPa、温度为30～50℃、萃取时间为3～5h，无花果果渣经干燥后粉碎的粒度为30～0目；层析柱的分离介质为硅胶，上样液为石油醚，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂和乙醇或丙酮。本发明得到的无花果果渣超临界CO2萃取物品质高，可以直接作为原料用于提高免疫功能保健食品的制备。经过层析柱纯化以后，最终产物中有效部位含量得到提高，可以用于抗癌药物的制备。
Description
技术领域
本发明涉及植物中有效成分的开发利用领域，特指一种无花果果渣中抗癌活性部位的提取分离方法。
背景技术
无花果中含有丰富的蛋白质、果胶、SOD酶、多糖、黄酮等生理活性物质。近年来的研究发现，无花果中的苯甲醛、呋喃香豆素、补骨脂素、佛手苷内酯等成分具有显著的抗癌功效，具有重要的开发价值。
2002年杨霁初等人公开的发明专利“提高机体免疫功能药物及其制备方法”(公开号1507904)，以无花果、枸杞子、甘草、大豆提取物和淀粉等为原料，经过煎煮、过滤、浓缩、醇沉、喷雾干燥等工艺，制造出具有明显提高机体免疫功能的药物。2002年韩文轩等人公开的发明专利“一种具有润肠通便的果蔬保健食品及生产方法”(公开号1461606)，以香蕉、苹果、大枣、山楂、菠萝、无花果、胡萝卜、红薯、芦荟、番泻叶、决明子、枸杞、冬虫草菌丝粉等为原料，经过打浆、过筛、浓缩、成型、干燥等工艺加工方法，生产成可以提高人体免疫，调节人体胃肠环境，达到润肠通便的保健食品。2001年贾振平公开的发明专利“一种预防和治疗癌症的无花果复方制剂及其制备方法”(公开号1416850)，报道了以无花果的有机溶剂提取物和中药半枝莲、白花蛇舌草的提取物为原料，制备具有抑制癌细胞生长，提高机体免疫力保健食品的方法。另外，已经公开的专利“一种治疗胃肠癌的纯中药制剂及制备方法”(申请号01128204.5)、“一种治疗癌症的药物”(申请号01115156.0)和已授权“一种抗癌中药丸剂”(专利号00110197.8)均以无花果为复方配料。
以上公开的专利文献说明，无花果中含有一定的具有提高机体免疫力和抑制癌细胞生长的功能成分，但均为涉及从无花果取汁后果渣中提取与利用有效成分的问题。
现有从无花果全果中提取抗肿瘤活性部位的研究发表，主要方法是先采用75％乙醇水溶液提取得到粗提物浸膏，然后用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分步提取，得石油醚浸膏A组和乙酸乙酯浸膏B组。最后用层析柱对A组提纯；用乙醚萃取溶于40％饱和亚硫酸氢钠水溶液的B组，并进一步通过水解、乙醚萃取、减压蒸馏等步骤，进行纯化。该方法仅仅为用于进行单一活性部位筛选和结构鉴定研究，不能用于生产。
国内外公开的各类文献未见(1)从无花果取汁后得到的果渣中进行功效成分提取报道；(2)采用超临界CO2萃取技术进行无花果中抗癌活性部位提取的报道。已报道的无花果全果中抗癌活性部位提取方法也不适宜用于工业化生产。
发明内容
本发明的目的就是针对无花果果渣的利用问题，提供一种从无花果果渣中提取分离脂溶性抗癌活性部位的方法。
本发明是采用如下技术方案实现的：
采用超临界CO2萃取技术从提取果汁后的无花果果渣中萃取抗癌活性部位，再采用层析柱对抗癌活性部位进行纯化分离、用洗脱剂对层析柱进行洗脱的步骤；其中萃取压力为26～40MPa、温度为30～50℃、萃取时间为3～5h，无花果果渣经干燥后粉碎的粒度为30～0目；层析柱的分离介质为硅胶，上样液为石油醚，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂和乙醇或丙酮，石油醚∶乙酸乙酯＝100∶(20～30)。
本发明洗脱层析柱中吸附的活性部位的步骤为：先用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂将黄色部分的吸附物洗去，待颜色显著加深后用乙醇或丙酮洗脱出其余的吸附物，后者为无花果果渣中的主要抗癌活性部位。
因为超临界CO2萃取技术具有萃取温度低、无溶剂残留的优点，所以本发明得到的无花果果渣超临界CO2萃取物品质高，可以直接作为原料用于提高免疫功能保健食品的制备。经过层析柱纯化以后，最终产物中有效部位含量得到提高，可以用于抗癌药物的制备。
本发明以无花果取汁后得到的果渣为原料，进行抗癌功效成分的提取分离，对于延长无花果加工的产业链，实现无花果的二次增值加工，开发具有创新意义的健康食品或天然药物，有着重要的意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述：
实施例1：
称取1000g的无花果果渣，经过干燥至含水5％以下，并粉碎至80目后，在26MPa/40℃的条件下，采用超临界CO2萃取技术，对无花果果渣中的脂溶性成分进行萃取，萃取时间为3h，得到萃取物26g。
称取无花果果渣的超临界CO2萃取物20g，溶解在25mL的石油醚中，在5×120cm的硅胶柱上样，硅胶细度为100～140目，采用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂，石油醚∶乙酸乙酯＝100∶20，流速为5mL/min。洗脱液颜色变化的顺序是先为黄色，后显著加深。待黄色洗脱液排完以后，证明主要杂质已经除去；随后改用乙醇洗脱，至洗脱液无色，收集洗脱液并浓缩制成浸膏，即为无花果果渣中主要的活性部位，浸膏重8.9g。
无花果果渣超临界CO2萃取物在50μg/mL的浓度时对U937细胞的抑制率为20.2％，经过以上浓缩后，抑制率提高到44.1％。
实施例2：
称取1000g的无花果果渣，经过干燥至含水5％以下，并粉碎至60目后，装入超临界CO2萃取釜中进行萃取。萃取压力为30MPa，温度为30℃。动物试验证明，该提取物给药剂量为25.00mg/kg时，抑瘤率达49.30％；给药剂量为200mg/kg时，抑瘤率达66.23％。
称取无花果果渣的超临界CO2萃取物20g，溶解在25mL的石油醚中，在5×120cm的硅胶柱上样，硅胶细度为100～140目，采用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂，石油醚∶乙酸乙酯＝100∶25，流速为6mL/min。待黄色洗脱液排完以后，证明主要杂质已经除去；随后改用乙醇洗脱，至洗脱液无色，收集洗脱液并浓缩制成浸膏，即为无花果果渣中主要的活性部位，浸膏重7.9g。
实施例3：
称取1000g的无花果果渣，经过干燥至含水5％以下，并粉碎至90目后，在40MPa/50℃的条件下，采用超临界CO2萃取技术，对无花果果渣中的脂溶性成分进行萃取，萃取时间为3h，得到萃取物32g。
称取无花果果渣的超临界CO2萃取物20g，溶解在25mL的石油醚中，在5×120cm的硅胶柱上样，硅胶细度为100～140目，采用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂，石油醚∶乙酸乙酯＝100∶30，流速为6mL/min。待黄色洗脱液排完以后，证明主要杂质已经除去；随后改用丙酮洗脱，至洗脱液无色，收集洗脱液并浓缩制成浸膏，即为无花果果渣中主要的活性部位，浸膏重8.6g。
针对实施例，开展功效成分试验、抗癌活性部位筛选试验如下：
(1)无花果果渣中有无抗癌功效成分试验
无花果果渣10g，粉碎度为40目，用石油醚热回流提取，提取时间90min，回收溶剂，得到浸膏。称取无花果果渣1000g，粉碎至100目，在萃取压力30MPa、萃取温度45℃，分离压力6MPa，分离温度38℃，气体流量12L/h的条件下，进行超临界CO2萃取，得到浸膏。然后利用MTT法进行体外抗肿瘤试验，结果示于表1。
MTT法体外抗肿瘤试验：取对数期生长的U937(人白血病细胞株)，将细胞数调整为2×105个/mL，加入96孔板中，每孔90μL。细胞在培养箱中放置4h待贴壁后再加待测样品。将上述浸膏用丙酮溶解，配制成不同浓度(见表1)的样品，每孔加入10μL。阴性对照为等体积的丙酮。在37℃，5％CO2培养箱中孵育72h后，分别加入5mg/mL MTT(四甲基偶氮唑)，每孔10μL。继续培养4h后，加入DMSO(二甲亚砜)，每孔100μL，放置1h后，用酶标仪在570nm波长下测定各孔的OD值。实验重复3次。抑瘤率计算公式为：
表1不同浓度无花果果渣和果干提取物对U937细胞的抑制率(％)的比较
| 提取方法 | 提取物浓度(μg/mL) | ||||
| 200 | 100 | 50 | 25 | ||
| 超临界CO2萃取 | 果渣 | 84.6 | 32.4 | 24.2 | 23.5 |
| 果干 | 83.8 | 35.0 | 24.9 | 26.0 | |
| 石油醚浸提 | 果渣 | 83.0 | 35.2 | 26.1 | 25.2 |
| 果干 | 85.1 | 33.1 | 22.6 | 22.2 | |
体外抗肿瘤试验(见表1)表明，无花果果渣的石油醚萃取物与果干的石油醚萃取物、无花果果渣超临界萃取物和果干萃取物体外抗肿瘤活性没有显著的差别。这一结果说明，无花果中的主要抗癌活性功效成分仍然保留在无花果果渣中，在取汁的过程中流失和破坏的程度不显著，因此无花果果渣有重要的开发价值。
(2)无花果果渣中抗癌活性部位筛选试验
称取无花果果渣的超临界CO2萃取物20g，溶解在25mL的石油醚中，在5×120cm的硅胶柱上样，硅胶细度为100～140目，采用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱液，石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1，流速为5mL/min，每50mL收集1管，根据薄板层析分析，合并相同的管，并回收溶剂后，得到A部分11.2g(1管到56管)，B部分1.2g(第57管到91管)，C部分1.8g(92管到119管)，D部分1.5(120管到156管)，E部分1.1g(第157管到193管)，F部分1.2g(第194管到211管)，G部分(第211管到243管)。
每部分脱去溶剂，得到浸膏，采用MTT法进行抗肿瘤试验，试验结果如表2所示。
表2无花果果渣超临界CO2萃取物的不同有效部分不同浓度时对U937细胞的抑制率(％)
| 部分 | 洗脱物浓度(μg/mL) | IC50(μg/mL) | ||||
| 代码 | 重量(g) | 50 | 30 | 10 | 5 | |
| ABCDEFG | 11.21.21.81.51.11.22 | 2.3830.45**87.37**23.38**63.25**27.37**27.58** | 8.0018.78**43.83*21.16**46.00*17.52**19.56** | 9.8813.70*20.186.0228.589.9315.51 | 2.46-3.448.8404.898.80-5.57 | ＞50＞5030.41＞5036.17＞50＞50 |
注：**p＝0.01，*p＝0.05；IC50指抑制率为50％时洗脱物丙酮溶液的浓度。
表2表明，占上样量56％的A部分对U937细胞的抑制率很低，抑瘤活性部位主要分布在B～G部分。试验中发现A部分的颜色为黄色，从B部分开始，洗脱液的颜色发生明显的变化。
Claims (2)
1.一种无花果果渣中抗癌活性部位的提取分离方法，其特征在于：采用超临界CO2萃取技术从提取果汁后的无花果果渣中萃取抗癌活性部位，再采用层析柱对抗癌活性部位进行纯化分离、用洗脱剂对层析柱进行洗脱；其中无花果果渣经干燥后粉碎的粒度为30～80目，萃取压力为26～40MPa、温度为30～50℃、萃取时间为3～5h；层析柱的分离介质为硅胶，上样液为石油醚，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂和乙醇或丙酮，石油醚∶乙酸乙酯＝100∶(20～30)。
2.根据权利要求1所述一种无花果果渣中抗癌活性部位的提取分离方法，其特征在于洗脱层析柱中吸附的活性部位的步骤为：先用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂将黄色部分的吸附物洗去，待颜色显著加深后用乙醇或丙酮洗脱出其余的吸附物，后者为无花果果渣中的主要抗癌活性部位。
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