CN101461842B - 夏枯草抗肿瘤有效部位的提取方法及其提取物在制备抗肿瘤药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

夏枯草抗肿瘤有效部位的提取方法，取夏枯草花穗，用乙醇浸泡于提取器内，加热、回流、提取；将所得提取液浓缩至干得浸膏，用氯仿和水或乙酸乙酯和水对所得浸膏进行萃取，分别收集有机相和水相，浓缩至干；取有机相，用氯仿、甲醇、水进行溶解，待静置后，分出上层，将上层溶液浓缩至干；取上层残留物加流动相溶解，进行反相柱层析，洗脱，收集30％～80％甲醇洗脱液，将各个相的洗脱液浓缩至干，即得抗肿瘤有效部位。采用本发明方案确定的夏枯草有效部位体外实验可明显抑制Raji细胞、Jurkat细胞、K562细胞和435S细胞增殖；体内实验对荷T淋巴瘤EL-4细胞小鼠具有抑瘤效应，并可延长其生存期；抗肿瘤作用肯定，毒性低。

Description

夏枯草抗肿瘤有效部位的提取方法及其提取物在制备抗肿瘤药物方面的应用

技术领域

本发明涉及一种夏枯草抗肿瘤有效部位提取方法及其在抗肿瘤方面的作用。

背景技术

夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L的干燥成熟果穗，主要产于河南省确山县等地，具有清热解毒、散结消肿之功效，可用于治疗瘰疠瘿瘤、乳痈肿痛等病症。夏枯草治疗恶性淋巴瘤由来已久，许多偏方、验方都把夏枯草作为治疗恶性淋巴瘤的主药。本专利申请人根据多年应用以夏枯草为主药的复方中药制剂治疗恶性淋巴瘤的临床观察，发现其可使恶性淋巴瘤瘤体消退。现代药理学研究证明，夏枯草煎剂在体外实验中能诱导SGC-7901癌细胞的凋亡，在体内实验中对小鼠艾氏腹水瘤及肉瘤S180均有抑制作用。夏枯草提取物对小鼠白血病P388细胞及人肺腺癌A549细胞具有细胞毒样作用。经文献检索及专利检索尚没有关于夏枯草有效提取部位抗恶性淋巴瘤的实验研究报告。

以下是与本申请专利最接近的技术现状。

(1)许多偏方、验方应用夏枯草治疗恶性淋巴瘤，均是简单的水煮煎剂。例如李学源等应用夏枯草、半枝莲、昆布、海藻、乌骨藤等草药用水将药材浸没、浸泡，按照常规的中药口服煎制方法加热煎熬后过滤得滤液，通常将药份煎熬2次，再将2次滤液进行混合勾兑，口服制成治疗癌症的药物(申请号：02109997.9授权公告号：CN1169556C)

(2)武汉理工大学楼一层发明提出了一种治疗高血压的复方夏枯草胶囊及其制备方法。该复方夏枯草胶囊以夏枯草、曼陀罗花、罗布麻、香蕉皮或者还有钩藤、山楂、决明子、菊花为原料，运用超临界CO₂萃取技术提取浸膏，经喷雾干燥制成细粒，再用公知制胶囊技术制成胶囊颗粒。本复方夏枯草胶囊含有效成分齐墩果酸≥0.2mg/粒(0.33g)，还含金丝桃甙及槲皮素，经毒性检验和临床应用表明，未见明显毒性反应，治疗高血压疗效显著(专利号ZL03118626.2授权公告号：CN1212854C)。

(3)江苏康缘药业股份有限公司肖伟等人发明涉及一种夏枯草提取物。所述提取物的活性成分总酚酸的含量为60％-70％，迷迭香酸的含量为14％-21％。本发明夏枯草提取物的酚酸部位具有抗炎、镇痛作用，对类风湿性关节炎具有确切的治疗作用，且其酚酸部位具有增强免疫抑制作用(专利号：ZL200410014142.X公告号：CN1331488C)。本发明还公开了该种方法与新用途。其夏枯草提取物的具体制备方法为：①取夏枯草药材，分别以药材4～12倍量的40％～85％乙醇回流提取2～4次，每次1～2.5小时，滤过，合并醇提液，回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度至1.0～1.15，静置冷藏12～36小时，倾出上清液，加醇至含醇量达60％～75％，加入浓氨水使PH等于7-8，回收乙醇，浓缩液加5-15％的HCL调PH为3-4，用乙酸乙酯萃取5-7次，每次用量为浓缩液的2-4倍，回收乙酸乙酯至密度为1.30-1.40的稠膏，真空干燥，粉碎即得。②第2种制备方法：取夏枯草药材，分别以药材4～12倍量的40％～85％乙醇回流提取2～4次，每次1～2.5小时，滤过，水煎液浓缩至密度至1.0～1.15，上大孔树脂柱，用8-10倍柱体积水洗脱，水洗液弃去，再用12-14倍柱体积的50％-70％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至密度为1.30-1.40的稠膏，真空干燥，粉碎即得。③第3种制备方法：取夏枯草药材，分别以药材4～12倍量的40％～85％乙酸乙酯回流提取2～4次，每次1～2.5小时，滤过，回收乙酸乙酯液并浓缩至密度至1.3～1.4的稠膏，加药材0.5-1.0倍量的0.1％-0.5％的NaOH溶解，再用10％-20％的HCL调PH至3-4，加乙酸乙酯萃取5-7次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯至密度为1.30-1.40的稠膏，真空干燥，粉碎即得。上述提取物的干膏得率为1.5％-3.5％.

(4)杨孟君发明公开了一种纳米复方夏枯草制剂药物(中药饮片、胶囊、注射剂或膜剂)，它是以纳米夏枯草、纳米香附、纳米甘草、纳米僵蚕、纳米白芍、纳米当归、纳米陈皮、纳米桔梗、纳米川芎、纳米红花、纳米昆布、纳米浙贝母、纳米玄参、纳米乌药为原料，按比例配制，制成新的药物制剂，其颗粒细度达1200-1500目，粒径为0.1-200nm，其中绝大部分粒径小于100nm，并具有新的物性。采用微波萃取、减压浓缩、超音速射流技术喷雾干燥等步骤制成。该药物生物利用度高，主治瘿瘤瘰疬、结核作痛，治疗效果显著。(申请号：01100229.8  公开号：CN1363306)

现有的专利技术表明，夏枯草多是作为治疗高血压，抗炎、镇痛作用提取制作的。

发明内容

本发明的目的是确定夏枯草的抗肿瘤有效部位，提供一种低毒高效的抗肿瘤新药的提取方法，以提高肿瘤的治愈率。

本发明采用的技术方案是：一种夏枯草抗肿瘤有效部位的提取方法，取夏枯草花穗，用85％～96％的乙醇浸泡于提取器内，加热、回流、提取；将所得提取液浓缩至干得浸膏，用容积比为1∶0.5～1.2的氯仿和水或乙酸乙酯和水对所得浸膏进行萃取，分别收集有机相和水相，浓缩至干；取有机相，用容积比为5～10∶2～5∶2～6的氯仿、甲醇、水进行溶解，待静置后，分出上层，将上层溶液浓缩至干；取上层残留物加流动相溶解，比例按每毫克上层残留物加0.5～5毫升的流动相，进行反相柱层析，以甲醇-水流动相洗脱，收集30％～80％甲醇洗脱液，将各个相的洗脱液浓缩至干，即得抗肿瘤有效部位。

所述夏枯草花穗为干燥花穗，用85％～96％的乙醇浸泡于多功能提取器内，24～36小时后加热、回流3～6个小时得提取液；将提取液减压浓缩至干得浸膏，用容积比为1∶0.5～1.2的氯仿和水或乙酸乙酯和水对所得浸膏进行萃取，分别收集有机相和水相，减压浓缩至干；取有机相，用容积比为5～10∶2～5∶2～6的氯仿、甲醇、水进行溶解，待静置3～6小时后，分出上层，将上层溶液减压浓缩至干；取上层残留物加水或甲醇溶解，比例按每毫克上层残留物加0.5～5毫升的水，用大孔吸附树脂或ODS柱吸附，以甲醇-水溶液洗脱，收集30％～80％甲醇洗脱液，将各个相的洗脱液减压浓缩至干，即得抗肿瘤有效部位。

所述的夏枯草抗肿瘤有效部位在制备抗肿瘤药物方面的应用。

国外将夏枯草作为自愈性和保健性产品，国内将夏枯草作为蔬菜食用，说明夏枯草安全、毒性小。临床观察研究表明：单用夏枯草治疗淋巴瘤近期有效率为12％，夏枯草与化疗药物合用治疗复发性淋巴瘤有效率提高18％，患者生存期延长。采用本发明所述技术方案确定的夏枯草有效部位在体外实验中可明显抑制人B淋巴瘤Raji细胞、人T淋巴瘤Jurkat细胞、人白血病K562细胞和人乳腺癌435S细胞增殖；体内初步的实验研究表明，夏枯草有效部位对接种荷T淋巴瘤EL-4细胞的小鼠具有明显的抑瘤效应，并可明显延长其生存期。夏枯草有效部位抗肿瘤作用肯定，毒性相对较低，一旦开发成功，将产生良好的经济效益和社会效益。

夏枯草主要产于河南，作为一传统中药，具有药理作用广泛、疗效显著、无明显毒副作用、资源丰富、价廉易得、可长期使用等优点，因其抗肿瘤作用明确，若从中开发出低毒高效的抗淋巴造血系统肿瘤的药物，必将大大提高淋巴造血系统肿瘤的治疗效果，为国家节约大量的经济资源，并可将河南省丰富的夏枯草资源推向国际市场，为其进一步的开发利用提供广阔的空间。

具体实施方式

实施例1：

一、提取步骤

a、河南确山县采集的6月底7月初夏枯草花穗，用95％的乙醇浸泡于多功能提取器内，30小时后加热、回流5个小时得提取液，减压浓缩提取液得浸膏，将所得浸膏一部分进行体外肿瘤细胞抑制率实验，另一部分进行下步提取。

b、将提取液减压浓缩至干得浸膏，用1∶1的乙酸乙酯和水对所得浸膏进行萃取，分别收集有机相和水相，减压浓缩至干，进行体外肿瘤细胞抑制率实验。

c、根据体外肿瘤细胞抑制率实验结果，取有机相，用容积比为8∶5∶3的氯仿、甲醇、水进行溶解，待静置5小时后，分别收集上、下层液，减压浓缩至干，进行体外肿瘤细胞抑制率实验。

d、根据体外肿瘤细胞实验结果，取上层残留物，按1∶3比例(重量mg：容积ml)加水溶解，ODS柱吸附后，用60％甲醇洗脱，将洗脱液减压浓缩至干，即得抗肿瘤有效部位。

e、所述的体外检测肿瘤细胞抑制率实验采用常规的MTT法。

f、最终所得的有效部位进行体内外抗肿瘤实验。

二、夏枯草有效部位体外抗肿瘤实验结果如下：

从上表体外实验结果可以看出：

1.夏枯草有效部位可明显抑制人B淋巴瘤Raji细胞、人T淋巴瘤Jurkat细胞、人白血病K562细胞和人乳腺癌435S细胞增殖。

2.夏枯草有效部位对人B淋巴瘤Raji细胞、人T淋巴瘤Jurkat细胞、人白血病K562细胞和人乳腺癌435S细胞的抑制作用呈明显的剂量依赖关系。

三、夏枯草有效部位体内初步实验表明：

1.夏枯草有效部位对接种荷T淋巴瘤EL-4细胞的C57小鼠具有明显的抑瘤效应。夏枯草有效部位高剂量组(500mg/kg/d)、中剂量组(300mg/kg/d)、低剂量组(100mg/kg/d)和环磷酰胺组(20mg/kg/d)抑瘤率分别为39.54％、65.26％、22.30％和89.39％。与阴性对照组平均瘤体积相比，夏枯草中剂量组和高剂量组差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.夏枯草有效部位高剂量组(500mg/kg/d)、中剂量组(300mg/kg/d)、低剂量组(100mg/kg/d)与阴性对照组相比可明显延长接种荷T淋巴瘤EL-4细胞的C57小鼠的生存期。

实施例2：

一、提取步骤

a、河南确山县采集的6月底7月初夏枯草花穗，用85％的乙醇浸泡于多功能提取器内，24小时后加热、回流3个小时得提取液，减压浓缩提取液得浸膏，将所得浸膏一部分进行体外肿瘤细胞抑制率实验，另一部分进行下步提取。

b、将提取液减压浓缩至干得浸膏，用1∶0.5的氯仿和水对所得浸膏进行萃取，分别收集有机相和水相，减压浓缩至干，进行体外肿瘤细胞抑制率实验。

c、根据体外肿瘤细胞抑制率实验结果，取有机相，用容积比为5∶2∶2的氯仿、甲醇、水进行溶解，待静置3小时后，分别收集上、下层液，减压浓缩至干，进行体外肿瘤细胞抑制率实验。

d、根据体外肿瘤细胞实验结果，取上层残留物，按1∶0.5比例(重量mg：容积ml)加水溶解，大孔吸附树脂柱吸附后，用30％甲醇洗脱，将洗脱液减压浓缩至干，即得抗肿瘤有效部位。

e、所述的体外检测肿瘤细胞抑制率实验采用常规的MTT法。

f、最终所得的夏枯草有效部位进行体内外抗肿瘤实验。

二、夏枯草有效部位体外抗肿瘤实验结果如下：

从上表体外实验结果可以看出：

1.夏枯草有效部位可明显抑制人B淋巴瘤Raji细胞、人T淋巴瘤Jurkat细胞和人白血病K562细胞增殖。

2.夏枯草有效部位对人B淋巴瘤Raji细胞、人T淋巴瘤Jurkat细胞和人白血病K562细胞的抑制作用呈明显的剂量依赖关系。

三、夏枯草有效部位体内初步实验表明：

1.夏枯草有效部位对接种荷T淋巴瘤EL-4细胞的BALB/C小鼠具有明显的抑瘤效应。夏枯草有效部位高剂量组(400mg/kg/d)、中剂量组(200mg/kg/d)、低剂量组(100mg/kg/d)和环磷酰胺组(30mg/kg/d)抑瘤率分别为28.44％、67.75％、22.70％和68.90％。与阴性对照组平均瘤体积相比，夏枯草中剂量组和高剂量组差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.夏枯草有效部位高剂量组(400mg/kg/d)、中剂量组(200mg/kg/d)、低剂量组(100mg/kg/d)与阴性对照组相比可明显延长接种荷T淋巴瘤EL-4细胞的BALB/C小鼠的生存期。

实施例3：

一、提取步骤

a、河南确山县采集的6月底7月初夏枯草花穗，用96％的乙醇浸泡于多功能提取器内，36小时后加热、回流6个小时得提取液，减压浓缩提取液得浸膏，将所得浸膏一部分进行体外肿瘤细胞抑制率实验，另一部分进行下步提取。

b、将提取液减压浓缩至干得浸膏，用1∶1.2的乙酸乙酯和水对所得浸膏进行萃取，分别收集有机相和水相，减压浓缩至干，进行体外肿瘤细胞抑制率实验。

c、根据体外肿瘤细胞抑制率实验结果，取有机相，用容积比为10∶5∶6的氯仿、甲醇、水进行溶解，待静置6小时后，分别收集上、下层液，减压浓缩至干，进行体外肿瘤细胞抑制率实验。

d、根据体外肿瘤细胞实验结果，取上层残留物，按1∶5比例(重量mg：容积ml)加水溶解，ODS柱吸附后，用80％甲醇洗脱，将洗脱液减压浓缩至干，即得抗肿瘤有效部位。

e、所述的体外检测肿瘤细胞抑制率实验采用常规的MTT法。

f、最终所得的夏枯草有效部位进行体内外抗肿瘤实验。

二、夏枯草有效部位体外抗肿瘤实验结果如下：

从上表体外实验结果可以看出：

1.夏枯草有效部位可明显抑制人B淋巴瘤Raji细胞、人T淋巴瘤Jurkat细胞、人白血病K562细胞、人乳腺癌435S细胞和小鼠T淋巴瘤EL-4细胞增殖。

2.夏枯草有效部位对人B淋巴瘤Raji细胞、人T淋巴瘤Jurkat细胞、人白血病K562细胞、人乳腺癌435S细胞和小鼠T淋巴瘤EL-4细胞的抑制作用呈明显的剂量依赖关系。

三、夏枯草有效部位体内初步实验表明：

1.夏枯草有效部位对接种荷T淋巴瘤EL-4细胞的C57小鼠具有明显的抑瘤效应。夏枯草有效部位组(300mg/kg/d)、环磷酰胺组(20mg/kg/d)及夏枯草有效部位和环磷酰胺联合组抑瘤率分别为76.10％、90.48％、91.08％。与阴性对照组平均瘤体积相比，夏枯草组和联合组差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.夏枯草有效部位组(300mg/kg/d)和联合组与阴性对照组相比可明显延长接种荷T淋巴瘤EL-4细胞的C57小鼠的生存期。

实施例4：

一、提取步骤

a、河南确山县采集的6月底7月初夏枯草花穗，用90％的乙醇浸泡于多功能提取器内，32小时后加热、回流4个小时得提取液，减压浓缩提取液得浸膏，将所得浸膏一部分进行体外肿瘤细胞抑制率实验，另一部分进行下步提取。

b、将提取液减压浓缩至干得浸膏，用1∶0.8的乙酸乙酯和水对所得浸膏进行萃取，分别收集有机相和水相，减压浓缩至干，进行体外肿瘤细胞抑制率实验。

c、根据体外肿瘤细胞抑制率实验结果，取有机相，用容积比为7∶4∶5的氯仿、甲醇、水进行溶解，待静置4小时后，分别收集上、下层液，减压浓缩至干，进行体外肿瘤细胞抑制率实验。

d、根据体外肿瘤细胞实验结果，取上层残留物，按1∶2比例(重量mg∶容积ml)加甲醇溶解，ODS柱吸附后，用50％甲醇洗脱，将洗脱液减压浓缩至干，即得抗肿瘤有效部位。

e、所述的体外检测肿瘤细胞抑制率实验采用常规的MTT法。

f、最终所得的有效部位进行体内外抗肿瘤实验。

二、夏枯草有效部位体外抗肿瘤实验结果如下：

从上表体外实验结果可以看出：

1.夏枯草有效部位可明显抑制人B淋巴瘤Raji细胞、人T淋巴瘤Jurkat细胞、人白血病K562细胞和人乳腺癌231细胞增殖。

2.夏枯草有效部位对人B淋巴瘤Raji细胞、人T淋巴瘤Jurkat细胞、人白血病K562细胞和人乳腺癌231细胞的抑制作用呈明显的剂量依赖关系。

三、夏枯草有效部位体内初步实验表明：

1.夏枯草有效部位对接种荷T淋巴瘤EL-4细胞的C57小鼠具有明显的抑瘤效应。夏枯草有效部位高剂量组(500mg/kg/d)、中剂量组(300mg/kg/d)、低剂量组(100mg/kg/d)和环磷酰胺组(20mg/kg/d)抑瘤率分别为34.65％、60.96％、19.65％和83.86％。与阴性对照组平均瘤体积相比，夏枯草中剂量组和高剂量组差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.夏枯草有效部位高剂量组(500mg/kg/d)、中剂量组(300mg/kg/d)、低剂量组(100mg/kg/d)与阴性对照组相比可明显延长接种荷T淋巴瘤EL-4细胞的C57小鼠的生存期。

Claims (3)

1.一种夏枯草抗肿瘤有效部位的提取方法，其特征是取夏枯草花穗，用85％～96％的乙醇浸泡于提取器内，加热、回流、提取；将所得提取液浓缩至干得浸膏，用容积比为1∶0.5～1.2的氯仿和水或乙酸乙酯和水对所得浸膏进行萃取，分别收集有机相和水相，浓缩至干；取有机相，用容积比为5～10∶2～5∶2～6的氯仿、甲醇、水进行溶解，待静置后，分出上层，将上层溶液浓缩至干；取上层残留物加流动相溶解，比例按每毫克上层残留物加0.5～5毫升的流动相，进行ODS反相柱层析，以甲醇-水溶液洗脱，收集30％～80％甲醇洗脱液，将各部分洗脱液浓缩至干，即得抗肿瘤有效部位。

2.如权利要求1所述的夏枯草抗肿瘤有效部位的提取方法，其特征是所述夏枯草花穗为干燥花穗，用85％～96％的乙醇浸泡于多功能提取器内，24～36小时后加热、回流3～6个小时得提取液；将提取液减压浓缩至干得浸膏，用容积比为1∶0.5～1.2的氯仿和水或乙酸乙酯和水对所得浸膏进行萃取，分别收集有机相和水相，减压浓缩至干；取有机相，用容积比为5～10∶2～5∶2～6的氯仿、甲醇、水进行溶解，待静置3～6小时后，分出上层，将上层溶液减压浓缩至干；取上层残留物加水或甲醇溶解，比例按每毫克上层残留物加0.5～5毫升的水或2毫升的甲醇，用ODS柱吸附，以甲醇-水溶液洗脱，收集30％～80％甲醇洗脱液，将各部分洗脱液减压浓缩至干，即得抗肿瘤有效部位。

3.根据权利要求1或2所述的夏枯草抗肿瘤有效部位在制备抗肿瘤药物方面的应用。