CN1684973A - 结合白细胞的化合物以及含有标记状态的该化合物作为有效成分的药用组合物 - Google Patents

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Abstract

一种结合白细胞的化合物，包含：Met或Nle－Leu－Phe作为白细胞甲酰基肽受体(FPR)结合位点、结合部分包含Ser或Thr，可提高与全体白细胞中的单核细胞和淋巴细胞的结合率、可用放射性金属或顺磁性金属标记的基团、以及联结它们的间隔物，其在体内和体外均呈现与所有白细胞即嗜中性白细胞，单核细胞和淋巴细胞特异性结合的性质，可用放射性金属或顺磁性金属标记。由于这些特点，该化合物对于SPECT成像诊断，PET成像诊断，MRI成像诊断等等非常有用，其中成像在伴有个体免疫反应的剧烈白细胞浸润部位进行。

Description

结合白细胞的化合物以及含有标记状态的 该化合物作为有效成份的药用组合物
技术领域
本发明涉及一种结合白细胞的化合物，以及含有该标记的化合物作为有效成份的药用组合物，当要诊断和/或治疗与免疫反应相关的患病个体的疾病时，其用于靶向异常部位和精确把握疾病的活性状态。更具体而言，本发明涉及一种新的化合物，其具有在体内和体外均特异的白细胞结合活性，并可用放射性金属或顺磁性金属标记，其用于哺乳动物体内包括感染性疾病、炎症、肿瘤和动脉粥样硬化的病灶的病理学成像。本发明还涉及含有标记状态的该化合物作为有效成份的药用组合物，其可用于放射性同位素诊断，SPECT成像诊断，PET成像诊断，MRI成像诊断或放射治疗。
现有技术
包括人在内的动物经常受到周围环境中可能影响个体生命维持体系的因素的影响。它们包括，例如，具有正效应的因素，例如空气、阳光和食物，和负效应的因素，如微生物侵袭，危险的化学物质、热和放射。为对抗这些负效应因素，个体采取多种防御体系来维持其生命。
这种自我防御体系在生物学上定义为免疫，与免疫相关的生物反应称为免疫反应。已知引起这些反应的因素，例如微生物诸如细菌、支原体、病毒、组织或器官的异种移植物，有害的化学物质、高温加热，过度冷却、高能核辐射，以及组织的电或物理损伤。包括炎症反应在内的免疫反应，是一种个体应答  “自我”或“非我”识别的生物反应，是一种广义上的防御体系反应，如发热、白细胞激活和迁移，以及对“自我”以外所有因素的清除。炎症反应是免疫反应的部分表现结果，如清除渗入个体的外来物质、破坏侵袭组织和修复受损组织。
白细胞是免疫反应包含的重要因素之一。组织产生多种介质，指定浸润白细胞的种类，控制其水平和持续时间，而且，在细胞膜表面上有多种受体，可通过与存在于体液包括血液中的介质及其它的分子相结合而产生应答。通过与相应的介质结合，受体激活白细胞，不同类型受体的特异性表达取决于白细胞的种类。所以浸润组织的白细胞种类取决于存在的介质。
通常，在局部的免疫反应如炎症中，当受到某些破坏组织的刺激后，与免疫相关的蛋白质例如补体，出现数小时以除去刺激物。然后，像分解的补体和/或细胞因子类的介质由破坏的组织释放到体液例如血液中，主要由嗜中性粒细胞组成的粒性白细胞通过受体被激活，因此组织中的白细胞浸润按照介质的浓度梯度出现。在此情况下介质通常称为趋化因子。通常，粒性白细胞的组织浸润在刺激开始十几个小时后达到峰值。同时，主要由单核细胞组成的巨噬细胞逐渐增加，与粒性白细胞共同除去引起刺激的物质。细胞因子等由激活的粒性白细胞和巨噬细胞以及受损组织释放出来，从而促进由T细胞和B细胞组成的淋巴细胞的组织浸润，淋巴细胞可有效地执行免疫反应例如产生抗体、修复破坏组织或调节免疫应答反应。淋巴细胞浸润在刺激开始数十小时后达到峰值。
免疫反应是维持个体生命相当重要的行为。然而，出于维持其生命的目的，由于对个体反应的调节不完善，反应有时可能会导致严重的负效应。这种负效应的典型表现是出现被称为自身免疫性疾病病症。已知一类这种病症，例如特应性皮炎、类风湿性关节炎、白塞氏综合征、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、慢性甲状腺炎及已知的其它胶原疾病。在导致炎症的情况下，例如由外来物质侵入，如感染，或由于组织破坏如烧伤，导致炎症的原因是可以确定的。然而，就自身免疫性疾病而言，没有特定的引发因素，或其因素尚未确定。因此自身免疫性疾病是一种病因未知的难治疾病。然而众所周知，在这类病症中普遍观察到白细胞，特别是由淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞对组织的疾病-特异性浸润现象。
因此，在自身免疫性疾病和慢性炎症和感染中，通过白细胞浸润，淋巴细胞和单核细胞在免疫反应中通常发挥重要的作用。所以，查找或检测淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞的白细胞浸润，并确定它们的精确水平，对施行有效的治疗非常重要，可以使病人避免不当的药物治疗，减少精神痛苦和治疗费用，并可能有助于降低健康保险的成本。
因此，由于诊断成像是查找和检测白细胞浸润并测定其精确水平的有用工具，在核医学领域已开展了多种放射活性试剂及其应用的研究。
长期以来镓-67(67Ga)的柠檬酸盐被用作炎症闪烁试剂(参见例如：Ebright，Jr等人，Arch.Int.Med.，142，246-254(1982))。然而，该试剂对感染部位或炎症部位没有特异性。而且，67Ga的γ射线辐射能不足，不适于用普通γ射线照相仪获取良好的图像。而且从注射试剂到完成成像大约需要72小时的等待时间。
后来，作为核医学感染部位成像方法，开始使用铟-111标记的白细胞(以下指定为111In-白细胞)(参考例如：Peters，AM.等人，J.Nucl.Med.，33，65-67(1992))。Thakur等人报导了在体外用放射性核素标记嗜中性粒细胞，广泛分析并论述了其应用(Thakur等人，Sem.Nucl.Med.，14，10-17(1984))。在该方法中，个体的嗜中性粒细胞在体外用铟-111(以下指定为In-111)标记，标记的嗜中性粒细胞用于体外动力学研究。同时，标记的嗜中性粒细胞可用于个体急性期的炎症性病灶成像。
然而，使用111In-白细胞时，放射性标记的化合物的制备需要经过多个步骤：自体血液的无菌分离、从血液中无菌分离白细胞、白细胞的无菌标记、放射性核素标记的白细胞回注给患者，并需要2小时以上的可观时间。同样，认为从标记白细胞回输到得到最佳图像成像需要12-48小时的等候时间。另外使用In-111时，由于其高辐射能，通常用于成像研究的每1×107白细胞200μCi的放射活性，对白细胞是危险的。在上述条件下，主要由白细胞中的嗜中性粒细胞组成的粒性白细胞，经标记后可存活，而淋巴细胞等在标记后立即死亡(Chianelli，M.等人，Nucl.Med.Comm.18，437-455(1997))。所以，利用In-111标记的白细胞很难监控淋巴细胞和单核细胞的动态。此外，从辐射剂量安全性出发，要限制给予的放射性剂量，大多数情况下会导致图像质量的损坏。
后来发展的用锝-99m(Tc-99m)标记白细胞，可缩短成像的等待时间——使用111In-白细胞时就存在的难题，并可监控淋巴细胞和单核细胞的动态，而且可给予比In-111大得多的放射性剂量(见，例如vorne，M.等人，J.Nucl.Med.，30，1332-1336(1989))。然而，由于Tc-99m的标记稳定性不够好，因而在非-靶向代谢器官的累积成为难题。至于制备时间长和血样处理问题，该方法与111In-白细胞相似(Chianelli，M.等人，Nucl.Med.Comm.，18，437-455(1997))。
已经进行用放射性核素标记、可与人白细胞包括单核细胞、嗜中性粒细胞、粒性白细胞等结合的单克隆和多克隆抗体的研制试验。例如：已研制了99mTc-标记的抗-粒性白细胞单克隆抗体(参考例如：LindP.等人，J.Nucl.Med.31，417-473(1990))及111In-标记的非特异性人免疫球蛋白(111In-HIG，参考例如LaMuraglia，GM.等人，J.Vasc.Surg.，10，20-28(1989))，用于检测由感染所引起的炎症部位。然而，要得到最佳图像造影，就其给药开始24-48小时的等候时间而言，111In-HIG有相似的缺陷。
此外，认为111In-HIG累积于炎症部位并能描绘该部位(参考例如，Rubin，R.等人，J.Nucl.Med.，29，651-656(1988))，但在这点上存在两种累积机制的假设。一种观念是111In-HIG在炎症部位的累积通过与浸润炎症部位的白细胞表面的Fc-受体结合来进行(Fischman，A.等人，J，Nucl.Med.，31，1199-1205)1990))，而另一种观念是，除白细胞浸润外，还通过提高血管通透性，发生111In-HIG白细胞局部的血管渗出，类似于像白蛋白那样的蛋白质中所观察到的(Morrel，E.等人，J.Nucl.Med.，30，1538-1545(1989))。
迄今，有关使用其它蛋白质对具有白细胞结合活性的生物分子的研究已有报导。
Van der Laken，CJ.等人报导了用放射性碘标记炎性细胞因子白细胞介素1的研究(van der Laken，CJ.等人，European J.Nucl.Med.，22，1249-1255(1995))。
Signore等人报导了使用放射性碘标记的炎性细胞因子白细胞介素2进行的慢性炎性疾病研究(Signore等人，Nucl.Med.Comm.，13，713-722(1992))。
Hay，RV.等人报导了使用放射性碘标记的炎性细胞因子白细胞介素8进行的化学诱发炎症的研究(Hay，RV.等人，Nucl.Med.Comm.，18，367-378(1997))。
这些放射性标记的化合物已成功地描绘了急性炎症例如感染，或慢性炎症例如自身免疫性疾病的图像。
然而，考虑这些蛋白质包括抗体的分子量较大，在血管通透性增加的急性炎症中，这些蛋白质与血液组分的血细胞渗出可能会导致问题(RoittI.等人，Essential Immunology，8th Oxford，BlackwellScientific(1994))。分子量2000左右的分子即使渗出，也不会在血细胞渗出的同一部位停留很长时间，但蛋白质如白蛋白(分子量：大约64000)由于分子较大，与分子量较低的化合物相比，倾向于停留在同一部位。因而很难判断累积是否是炎症特异性的(Morrel E.等人，J.Nucl.Med.，30，1538-1545(1989))。
放射医学试剂通常首选易合成的小分子。用放射性核素标记的肽，被认为适宜作为合成的低分子量化合物，其可选择性地与全血中的白细胞结合，并可直接给患者注射，使通过确定白细胞累积的部位对感染和炎症的病灶部位进行成像成为可能。
例如，Moyer等人报导了Tc-99m标记的，来源于血小板因子4(PF-4)C-末端序列的肽化合物的累积特征，其具有与硫酸多聚糖例如肝素的结合活性(Moyer，BR.等人，J.Nucl.Med.，37，673-679(1996))。该复合物(PF-4肽-肝素)为包含Tc-99m螯合的氨基酸序列的23个氨基酸残基的肽(分子量：大约2600)和肝素(分子量：大约7000到25000)的复合物，构成一个分子量约10000到30000的单一分子。
由于像蛋白质一样分子量较大，肝素结合的PF-4肽单独不能作为指示白细胞浸润累积部位的试剂。因此，需要指示真正的白细胞浸润的试剂，其由很少显示毛细血管通透性增强导致的非特异性累积的低分子量化合物组成。此外，由于其生理活性，肝素的使用有时会受到限制。
Dahlman T.等人和Ringe，JD.等人报导了肝素副作用的危险性，给予肝素可能引起骨密度的降低，长期给药可能导致骨质疏松症(Dahlman，T.等人，Br.J.Obsted GynaeGol.，Mar，97，3，221-228(1990)；Ringe JD.等人，Geburtshilfe Frauenheilkd.，52，7，426-429(1992))。除此以外，由于肝素的生理功能导致的副作用可能存在危险性，包括例如抗凝血酶活性，抑制促凝血酶原激酶的产生，抑制血小板凝聚，或当患者有出血性疾病或可能发生出血性疾病或严重的肝病和肾病时，需要慎重处理。综上所述，使用肝素有许多需要审慎之处。
至于其它用放射性核素标记的肽，现有技术中已经报导了含甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰(fMLF)的肽。
Day等人报导了125I标记的趋化性甲酰化肽(fMLF)(Day，AR.等人，FEBS Lett.，77，291-294(1977))。
Jiang等人报导了用125I-标记的趋化性甲酰化肽(fMLF)在体内炎症部位的累积情况(见，例如：Jiang，MS.等人，Nuklearmedizin，21，110-113(1982))。
Fisherman等人公开了111In标记的通过DTPA连接的趋化性甲酰化肽(fMLF)(见JP 2931097)。
Verbeke等人报导了Tc-99m标记的通过巯基乙酰-甘氨酰-甘氨酸连接的趋化性甲酰化肽(fMLF)(见，例如：Verbeke K.等人，NuclearMedicine & Biology，27，769-779(2000))。
Baidoo等人报导了Tc-99m标记的通过二氨基二硫基(diaminodithiol)化合物连接的趋化性甲酰化肽(fMLF)(参见Baidoo，K.E.等人，Bioconjugate Chemistry，9，208-217(1998))。
另外，还有关于通过其光亲合性，使用放射性核素标记的趋化性甲酰化肽(fMLF)进行体外白细胞放射性核素标记的报导(见，例如，USP4,986,979)。
同样也有关于趋化性甲酰化肽(fMLF)能够用放射性核素标记的报导(参考例如：USP5,792,444)。
认为趋化性甲酰化肽(fMLF)通过甲酰化肽受体(以下指定为受体FPR)与白细胞结合(Niedel J.E.等人，Science，205，4413，1412-1414(1979))，表达受体FPR的白细胞为嗜中性粒细胞和单核细胞(Lewi s，SL.等人，炎症，4，363-375(1983))。
人血液中的白细胞正常组成为含有约50％的嗜中性粒细胞和10％的单核细胞。有报导大多数结合某些已知趋化性甲酰化肽类似物的白细胞为嗜中性粒细胞，因为血液中的单核细胞群只有嗜中性粒细胞的五分之一或更少，而且肽与淋巴细胞和单核细胞的结合不牢固(Verbeke，K.等人，Nucl.Med.Biol.，27，769-779(2000))。
同样，在急性炎症例如伴有嗜中性粒细胞浸润的细菌感染性疾病中，观察到放射性核素标记的甲酰化肽的累积(见Babich，JW.等人，J.Nucl.Med.，34，2176-2181(1993))，但没有关于该肽在诊断为慢性炎症疾病中累积的报导。
另外，在临床诊断中，疾病需要的成像诊断包括核医学检验或MRI(核磁共振成像)检验，通常用于初步诊断如体外试验识别病区有困难的疾病或是慢性疾病。在此情况下，经常采用通过给予固醇类药物抑制免疫反应和白细胞浸润的治疗以及白细胞减少的治疗。因此，为使免疫反应和白细胞浸润能够显像，对伴有免疫反应性炎症包括慢性炎症的疾病进行成像诊断，需要有不会增强血管通透性的低分子量试剂。
用Tc-99m标记肽和多肽的方法本领域众所周知(参考例如JP-A-8-231587)。
发明概述
鉴于现有技术环境，本发明的一个目的在于提供一种化合物，其体内和体外均具有特异性结合白细胞即嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的性质，可用放射性金属或顺磁性金属标记，提供含有标记状态的该化合物作为有效成份的药用组合物，其可用于SPECT成像诊断、PET成像诊断、MRI成像诊断、放射治疗等等，其中成像在个体中伴有免疫反应的剧烈白细胞浸润部位进行。
即，本发明涉及一种结合白细胞的化合物，其以下列通式(1)代表：Z-Y-Leu-Phe-(X)n-Lys(NH2)m-ε(-R-(T)1-U)         (1)其中，在通式(1)中，Z代表氨基基团的保护基团；Y代表Met或Nle；在(X)n中，X代表由一个或多个氨基酸和/或合成有机化合物组成的间隔物，n代表1或0；在(NH2)m中，NH2代表酰胺基，作为Lysα位的羧基保护基团，m代表1或0；在ε(-R-(T)l-U)中，R代表通过酰胺键与Lys的ε-氨基结合的Ser或Thr，T代表由一个或多个氨基酸和/或合成有机化合物组成的间隔物，l代表1或0，U代表可用金属标记的基团；条件是所述的X和T可能彼此相同或不同。
此外，本发明涉及一种药用组合物，其含有以上述通式(1)代表的，以放射性金属或顺磁性金属标记的结合白细胞的化合物作为其有效成份。
附图简述
图1显示Tc-99m-肽4的HPLC色谱图。
图2显示Tc-99m-肽6的HPLC色谱图。
图3显示Tc-99m-肽在兔血液中的分布。
图4显示Tc-99m-肽3在兔感染性疾病模型中的成像。左侧为给药2小时后成像；右侧为给药22小时后成像。
图5显示Tc-99m-肽4在兔感染性疾病模型中的成像。左侧为给药2小时后成像；右侧为给药22小时后成像。
图6显示Tc-99m-肽6在兔感染性疾病模型中的成像。左侧为给药2小时后成像；右侧为给药22小时后成像。
图7显示Tc-99m-肽8在兔感染性疾病模型中的成像。左侧为给药2小时后成像；右侧为给药5小时后成像。
图8显示Tc-99m-肽9在兔感染性疾病模型中的成像。左侧为给药2小时后成像；右侧为给药5小时后成像。
图9显示Tc-99m-肽12在兔感染性疾病模型中的成像。左侧为给药2小时后成像；右侧为给药22小时后成像。
图10显示Tc-99m-肽13在兔感染性疾病模型中的成像。左侧为给药2小时后成像；右侧为给药5小时后成像。
图11显示Tc-99m-肽14在兔感染性疾病模型中的成像。左侧为给药2小时后成像；右侧为给药5小时后成像。
图12显示Tc-99m-肽15在兔感染性疾病模型中的成像。左侧为给药2小时后成像；右侧为给药5小时后成像。
图13显示Tc-99m-肽16在兔感染性疾病模型中的成像。左侧为给药2小时后成像；右侧为给药5小时后成像。
图14显示Tc-99m-肽17在兔感染性疾病模型中的成像。左侧为给药2小时后成像；右侧为给药5小时后成像。
图15显示Tc-99m-肽18在兔感染性的疾病模型中的成像。左侧为给药2小时后成像；右侧为给药5小时后成像。
图16显示Tc-99m-肽在正常大鼠中，尿排泄物的时程变化。
图17显示Tc-99m-肽在正常大鼠小肠中累积的时程变化。
图18显示Tc-99m-肽在人血液中的分布。
图19显示Tc-99m-标记肽在结肠炎大鼠模型中的分布。
图20显示Tc-99m-肽3在结肠炎大鼠模型中的成像。左侧为给药30分钟后的成像；右侧为给药120分钟后的成像。
图21显示Tc-99m-肽6在结肠炎大鼠模型中的成像。左侧为给药30分钟后的成像；右侧为给药120分钟后的成像。
图22显示Tc-99m-标记的白细胞在结肠炎大鼠模型中的成像。左侧为给药30分钟后成像；右边为给药120分钟后成像。
图23显示Tc-99m-标记肽在结肠炎大鼠模型中的炎症/器官的比。
图24显示肽6在结肠炎大鼠中的放射自显影和免疫染色。左侧为放射自显影；中间为用抗-粒性白细胞抗体进行的免疫染色；右侧为用抗-单核细胞抗体进行的免疫染色。
图25显示肽14在结肠炎大鼠中的放射自显影和免疫染色。左侧为放射自显影；中间为用抗-粒性白细胞抗体进行的免疫染色；右侧为用抗-单核细胞抗体进行的免疫染色。
图26显示Tc-99m-标记的白细胞在结肠炎大鼠中的放射自显影和免疫染色。左侧为放射自显影；中间为用抗-粒性白细胞抗体进行的免疫染色；右边为用抗-单核细胞抗体进行的免疫染色。
图27显示在结肠炎大鼠中，使用Tc-99m-标记肽和Tc-99m-标记白细胞进行放射自显影的炎症/正常组织的比。
图28显示肽对于重组人受体和[3H]-FMLP之间的结合的抑制率。
图29显示在兔感染性疾病模型中，没有FMLP抑制时Tc-99m-标记肽6的成像。左侧为给药2小时后成像；右侧为给药5小时后成像。
图30显示在兔感染性疾病模型中，有FMLP抑制时Tc-99m-标记肽6的成像。
执行本发明的最佳方式
在下文中，将描述执行本发明的方式。用于本说明书的氨基酸均以单字符或三字符表示，且除非另作说明，左手显示N-末端一侧，右手显示C末端一侧。除非另作说明，括号内的氨基酸表示与侧链结合的肽或有机化合物。同样，括号内的氨基酸序列用右手方式表示N-末端一侧，左手为C-末端一侧，以便使整个结构易懂。另外，本说明书中D-构型氨基酸指定为D-氨基酸。
本发明与白细胞结合的化合物以下列通式(1)代表：
Z-Y-Leu-Phe-(X)n-Lys(NH2)m-ε(-R-(T)1-U)       (1)
即，所述通式(1)包含：白细胞受体FPR的结合部位Z-Y-Leu-Phe-；结合部分-R-，由Ser或Thr组成，可提高与全体白细胞中单核细胞和淋巴细胞的结合率；结构-U-，可用放射性金属或顺磁性金属标记；间隔物-(X)n-、-Lys(NH2)m-和-(T)1-，使这些基团结合在一起。
更具体而言，下列白细胞结合化合物作为优选实施方案的示范。
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Gly-Asn)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Asp-Asp)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Gly-Asp)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-1，4，8，11-四氮杂环
十四烷(tetraazacyclotetradecane)-1，4，8，11-四乙酸(tetraaceticacid))；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Ser-Asn-D-Arg-Cys-Asp-Asp)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-二亚乙基三胺
五乙酸(diethylenetriamine pentaacetic acid))；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-1，4，8，11-四氮杂环
十四烷-丁酸(teraazacyclotetradecane-butyrica cid))；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-1，4，8，11-四氮杂环十四烷丁酸)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Ser-Asn-1，4，8，11-四氮杂环十四烷丁酸)；
乙酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；
氨基甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；
和
甲基-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)。
就通式(1)代表的结合白细胞的化合物而言，在受体FPR的结合部位Z-Y-Leu-Phe-中，Z为氨基酸保护基团，包括例如有1-9个碳原子的酰基基团，例如甲酰基和乙酰基，有2-9个碳原子的酰氧基基团，例如t-Boc基团，有1-6个碳原子的低级烷基基团，例如甲基、乙基和丙基基团，以及氨甲酰基基团。当Y中Met或Nle的N-末端为甲酰基时，复合物显示与识别甲酰化肽的白细胞受体FPR的结合活性，为乙酰基和t-Boc基团时同样也显示受体结合活性。
在上述通式(1)Z-Y-Leu-Phe-中，作为氨基酸Y代表Met或Nle。FPR受体为通常表达于白细胞中的嗜中性粒细胞和单核细胞细胞膜上的受体之一，具有很强的甲酰化肽结合特性，并因此显示与Met的结合活性。受体对同Met具有类似空间结构的Nle也显示结合活性。
Leu和Phe对嗜中性粒细胞和单核细胞具有很高的结合活性。与甲酰化肽具有较强结合活性的FPR受体，与肽，例如甲酰基-Met、甲酰-Met-Met、甲酰-Met-Met-Leu和甲酰基-Met-Leu-Leu，也具有结合活性，与甲酰-Met-Leu-Phe的结合活性最强。
本发明最显著的特征在于R，其通过间隔物X和-Lys(NH2)-m的ε-氨基基团与上述通式(1)中的Z-Y-Leu-Phe-相结合。
R选自Ser和Thr，为侧链具有羟基的氨基酸。通过利用具有Ser或Thr这种可被金属标记的结构，获得了与淋巴细胞和单核细胞的显著结合活性，这在传统的低分子量白细胞结合化合物中没有出现过。传统的仅由受体FPR的结合部位Z-Y-Leu-Phe-组成的肽，显示与嗜中性粒细胞和单核细胞结合活性，但几乎不显示与淋巴细胞的结合活性。将可通过Lys的ε-氨基结合的Ser或Thr进行金属标记的结构，与受体FPR的结合部位Z-Y-Leu-Phe-联结，使肽对单核细胞和淋巴细胞的结合率显著提高。因此，使得本发明以通式(1)代表的结合白细胞的化合物，具有与所有种类的白细胞，即嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的结合能力。例如，在传统的血细胞结合复合物中，结合淋巴细胞和单核细胞的化合物与结合全体白细胞的化合物的比率，约为12％-35％，而在本发明的血细胞结合化合物中，结合淋巴细胞和单核细胞的化合物与结合全体白细胞的化合物的比率提高至约18％-65％。这表明有强烈白细胞浸润的病区可以被靶向，本发明化合物可用作诊断或治疗伴有白细胞浸润的疾病的试剂。
本发明的结合白细胞的化合物中，在FPR受体结合部位Z-Y-Leu-Phe-，具体而言，淋巴细胞和单核细胞的受体结合部位R的Ser或Thr，与可用放射性金属或顺磁性金属标记的结构U之间的距离，均可由连接这些部位的间隔物X、-Lys(NH2)m-的ε-氨基和间隔物T充分进行调整。因此，当需要保持显著受空间结构影响的受体结合活性时，这些部分可彼此相连接。换言之，为使R的Ser或Thr的C末端与Z-Y-Leu-Phe-的C末端相结合，优选在Z-Y-Leu-Phe-的C末端基团上加上具有4个碳原子侧链和一个氨基的Lys，然后Ser或Thr与Lys的ε-氨基相连。当需要更多的空间距离时，可增加间隔物X。
X和T都是由一个或多个氨基酸和/或合成有机化合物组成的间隔物，必要时可作为本发明白细胞结合复合物的一个组成部分。X和Y彼此可能相同或不同。然而，Cys残基不宜用作组成X或T的氨基酸，因为巯基基团可能形成分子内或分子间的二硫键，导致形成多聚体例如二聚体，这种结构改变可能显著影响与受体的结合活性。Pro也较不适宜与受体结合，因为如果X或T含有Pro，其空间结构将受到限制从而限制其空间自由度。因此，最好从构成X或T的氨基酸序列中排除Cys和Pro。
更具体而言，要用作X的氨基酸对受体结合活性没有影响，包括例如，无电荷的氨基酸如Gly、Ala、Val、Leu和Ile，Nle、Tyr和Nle-Tyr。对T的氨基酸而言，为提供受体结合部位与被放射性金属或顺磁性金属标记的结构间的距离，或控制生物体的体内动态，或提供体内对新陈代谢的抵抗性，与上述相同的氨基酸，非氨基酸化合物或其组合均可使用。除上述氨基酸外，还可使用L-和D-形式的氨基酸、疏水性氨基酸如Gly、极性和带电荷的氨基酸(酸或碱性的)如Arg、Asp、Glu和Lys。
构成间隔物的合成有机化合物包括，例如，化合物如1，5-己二烯、反式-2-甲基-1，3-戊二烯和4-甲基-3-硝基乙酰苯，各具有疏水性官能团如甲基、乙基和苄基；化合物如(±)-2-甲基-2，4-戊二醇(己二醇)和3-甲基-1，3，5-戊硫醇具有极性官能团如羟基和氨基基团；化合物如亚甲基丁二酸、4-顺丁烯二酰亚胺丁酸和6-顺丁烯二酰亚胺己酸，具有带电荷官能团如羧基，氨基和亚氨基。
就可用金属标记的基团U而言，可使用由一个或多个氨基酸组成的基团，或由非氨基酸化合物组成的基团。对于由一个或多个氨基酸组成的基团，可使用以-Cys-A1-A2代表的肽(条件是A1和A2为Cys和Pro以外的氨基酸)。这些肽包括，例如，-Cys-Gly-Asp，-Cys-Asp-Asp，-Cys-Asp-Gly，-Cys-Gly-Glu，-Cys-Glu-Glu，-Cys-Glu-Gly，-Cys-Gly-Asn，-Cys-Asn-Asn，-Cys-Asn-Gly，-Cys-Gly-Gln，-Cys-Gln-Gln，-Cys-Gln-Gly，-Cys-Gly-Lys，-Cys-Lys-Lys，-Cys-Lys-Gly，-Cys-Gly-Arg，-Cys-Arg-Arg和-Cys-Arg-Gly。
由非氨基酸化合物组成的可用金属标记的基团包括，例如，有8-20个碳原子的含氮环状化合物如1，4，7，10-四氮杂环十二烷(1，4，7，10-tetraazacyclododecane)(Cyclen)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷(1，4，8，11-tetraazacyclotetradecane)(Cyclam)、1，4，8，12-四氮杂环十五烷(1，4，8，12-tetraazacyclopentadecane和1，4，8，11-四氮杂环十四烷-5，7-二酮(1，4，8，11-tetraazacyclotetradecane-5，7-dione)(Dioxocycam)；有8-20个碳原子的含氮环状羧酸化合物如1，4，8，11-四氮杂环十四烷1，4，8，11-四乙酸(1，4，8，11-tetraazacyclotetradecane-1，4，8，11-tetraaceticacid)(TETA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N四乙酸(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-N，N′，N″，N-tetraaceticacid)(DOTA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷5，7-二酮-N，N′，N″，N四乙酸(1，4，8，11-tetraazacyclotetradecane-5，7-dione-N，N′，N″，N-tetraaceticacid)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-丁酸(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-butyric acid)和1，4，8，10-四氮杂环十二烷-丁酸(1，4，8，10-tetraazacyclododecane-butyric acid)；有8-20个碳原子的含氮环状羧酸化合物衍生物如1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-氨乙基-甲氨酰甲基-4，7，10-三(R，S)-甲基乙酸(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1-aminoethyl carbamoylmethyl-4，7，10-tris[R，S]-methylaceticacid)(DO3MA)和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-α，α′，α″，α-四甲基乙酸(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7，10-α，α′，α″，α，-tetramethylacetic acid)(DOTMA)；和有4-10个碳原子的亚烷基氨羧酸(alkyleneamine carboxylic acid)例如乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，三亚乙基四胺六乙酸(triethylenetetraaminehexaaceticacid)和乙二醇-(2-氨基乙基)-N，N，N′，N′-四乙酸(ethyleneglycol-(2-aminoethyl)-N，N，N′，N′-tetraaceti cacid)(EGTA)。
本发明结合白细胞的化合物作为药用组合物用于诊断成像时，取决于诊断目的或治疗病区，对诊断区域的成像可在短时间内完成，利用通过控制运动状态使体内非必要代谢物顺利排出，减少对生物体不必要的辐射和减低诊断成像的背景效应。例如，就用于构成间隔物X和T的氨基酸等等而言，可通过使用脂肪族氨基酸如Gly、Ala、Ile、Leu和Val，芳香族胺基酸如Phe、Trp和Tyr，含硫氨基酸如Met，或含疏水性官能团如甲基，乙基和苯甲基的化合物，调节间隔物的代谢转向胃肠道。要调节间隔物的代谢转向尿和肾，可使用具有电荷官能基的带电荷的氨基酸或化合物，选择羟基氨基酸如Ser和Thr，酸性的氨基酰胺如Asn和Gln，带电荷的(酸和碱性的)氨基酸如Arg、Asp、Glu和Lys，或含极性官能团的如羟基和酰胺基合成有机化合物，含带电荷官能团如羧基，氨基和亚氨基的化合物。此外，当需要在受体结合部位与用金属标记的结构之间存在间隔时，可使用一个或多个氨基酸或含有直链例如烷基的合成有机化合物。
就包含在可用金属标记的基团U内的氨基酸而言，可按同上所述考虑。例如，选择Asp或Lys，或选择含羧基或氨基的化合物时，给予放射性金属标记的化合物后，可控制最终代谢物的主要排出途径转向肾。同样，选择疏水性氨基酸如Gly，可控制最终代谢物的主要排出途径转至胃肠道。
另外，就用作组成X和T间隔物的氨基酸等等而言，为提供对体内新陈代谢的抵抗力，可使用D-氨基酸或人工氨基酸和非氨基酸。更具体而言，组成间隔物的D-氨基酸，包括例如，氨基酸序列如D-Arg-Asp，Arg-D-Asp，D-Arg-D-Asp，D-Asp-Arg，Asp-D-Arg，D-Asp-D-Arg，Ser-D-Arg，D-Ser-Arg，D-Ser-D-Arg，D-Arg-Ser，Arg-D-Ser，D-Arg-D-Ser，Ser-D-Asp，D-Ser-Asp，D-Ser-D-Asp，D-Asp-Ser，Asp-D-Ser和D-Asp-D-Ser。
本发明的结合白细胞的化合物可按照如下所述方法合成。
(1)当所述化合物仅由氨基酸组成时，可使用常见的肽自动合成仪如Applied Biosystems(USA)制造的肽自动合成仪，按照例如Boc-方法和Fmoc-方法合成该化合物。合成的复合物，可通过同时进行脱保护和从固相树脂载体上结合状态切离，继而使用反相柱，经高效液相色谱法(以下指定为HPLC)进行纯化。或者，所述化合物可通过液相肽合成，或从动物来源等等得到。
(2)当所述化合物包含非氨基酸时，大多数情况下，可用与上述相同的方法合成该化合物。例如：所述复合物可按如下合成。即，赖氨酸残基或其保护性衍生物与固相树脂载体结合，其N-末端依次结合X氨基酸残基或其保护衍生物，或充当间隔物的化合物或其保护衍生物，Phe或其保护衍生物、Leu或其保护衍生物，以及Y氨基酸及其保护衍生物。然后，与固相树脂载体结合的Lys侧链的ε-氨基被激活，R中的Ser或Thr或其保护衍生物与之结合，随后再结合间隔物T的氨基酸或其保护衍生物，或充当间隔物的化合物或其保护衍生物，以及可作为金属标记基团的化合物U或其保护衍生物，然后将上述通式(1)中的合成化合物从树脂载体上切离。
药用组合物包含标记的化合物作为其有效成份，通过用放射性金属或顺磁性金属标记本发明的结合白细胞的化合物制备，其可能用于，例如，作为放射性同位素诊断试剂或放射治疗试剂，特别用于伴有个体免疫反应的白细胞剧烈浸润病变部位的成像诊断和治疗。即，当疾病有嗜中性粒细胞、单核细胞或淋巴细胞或两种以上的白细胞浸润剧烈的活跃病区时，可使用特定的检测物测定白细胞的累积部位和累积水平。
伴有个体免疫反应的疾病包括哺乳动物体内的感染、炎症和aterosclerosis组成的一类病症。即该类病症包括病毒感染、细菌传染、真菌感染、原生虫疾病、线虫病、胶原性疾病和除胶原性疾病之外的自身免疫性疾病。在日本，约80％的肝炎患者为病毒感染所致的病毒性肝炎，其它的大多是自身免疫性肝炎，因此，与嗜中性粒细胞侵润相比，大部分肝脏炎性疾病为具有淋巴细胞和单核细胞浸润的疾病。就像这种具有相对低水平嗜中性粒细胞浸润的疾病而言，有人指出，如果使用传统的fMLF类似物，因其与淋巴细胞和单核细胞的结合比嗜中性粒细胞弱，病区的白细胞浸润可能被低估。然而，本发明的结合白细胞的化合物能够恰当地识别嗜中性粒细胞浸润较少的疾病，例如大部分自身免疫性疾病和利什曼病(leishmaniasis)中的白细胞浸润，因为该化合物与嗜中性粒细胞和淋巴细胞和单核细胞都具有较高的结合活性。
与嗜中性粒细胞相比，呈现大量淋巴细胞和单核细胞浸润的病症，或浸润白细胞中呈现大量淋巴细胞和单核细胞群的病症，包括病毒感染、原生动物疾病、线虫病、胶原性疾病和除胶原性疾病之外的自身免疫性疾病。认为本发明对伴有免疫反应如白细胞浸润的病症有效；对于与嗜中性粒细胞相比呈现大量淋巴细胞和单核细胞浸润的病症，或浸润白细胞中呈现大量淋巴细胞和单核细胞群的病症特别有效。
此外，由于本发明化合物同样具有现有技术描述的特异的嗜中性粒细胞结合活性，与淋巴细胞和单核细胞浸润相比，对呈现大量嗜中性粒细胞浸润的病症，或浸润白细胞中呈现大量嗜中性粒细胞的病症，本发明化合物同样有效。这类病症包括，例如，细菌性心内膜炎、心肌梗塞、支气管性肺炎、大叶性肺炎、渗透性的肺结核、急性胃炎、假膜性结肠炎、耶尔森氏菌属感染、溃疡性结肠炎、急性阑尾炎、急性胆管炎、胆囊炎、小管增生性肾小球肾炎、渗透性的肾小球肾炎、急性肾盂肾炎、急性输卵管炎、急性子宫颈炎、急性乳腺炎、急性睾丸炎、急性前列腺炎、变应性脉管炎、急性化脓性炎、结核性megingitis、急性化脓性骨髓炎、急性淋巴结炎和结核性动脉周炎。
当本发明的结合白细胞的化合物被用作放射性同位素诊断试剂时，所述化合物的优选实施方案为用适于SPECT成像诊断的放射性金属如Tc-99m、In-111、Ga-67，Sn-117m，Sm-153和Re-186，或用适于PET成像诊断的放射性金属如Cu-64或Ga-68进行标记的化合物。
本发明的结合白细胞的化合物用作放射治疗试剂时，所述化合物的优选实施方案为用放射性金属如Y-90，Re-186或Re-188标记的一种化合物。本发明的化合物用作MRI成像诊断的造影剂时，所述化合物的优选实施方案为用配位状态的顺磁性金属如Cu、Fe或Gd标记的复合物。
用Tc-99m、Re-186和Re-188标记本发明的结合白细胞的化合物，可按普通方法进行。换言之，将该化合物溶解于盐或缓冲溶液等中，随后加入还原剂如氯化亚锡，然后与高锝酸钠溶液或高铼酸钠溶液混合以制备标记化合物。对于用Cu、Cu-64、Fe、Mn、Gd或In-111进行标记，可将化合物与含Cu、Cu-64、Fe、Mn、Gd或In-111离子的弱酸性水溶液混合，以制备标记的本发明结合白细胞的化合物。用Ga-67、Ga-68或Y-90标记时，可将该化合物与含有Ga-67、Ga-68或Y-90离子的弱酸或弱碱性水溶液混合，以制备标记的结合白细胞的化合物。
当用放射性金属标记的化合物用作放射性同位素诊断或放射治疗试剂，或用顺磁性金属标记的化合物用作MRI造影剂时，标记化合物可按上述方法制备，经HPLC纯化除去杂质和未反应的过锝酸盐离子、高铼酸盐离子、In-111离子、Cu离子、Cu-64离子、Ga-67离子、Ga-68离子、Fe离子、Mn离子、Gd离子和Y-90离子后使用。
用放射性金属或顺磁性金属标记的化合物，可与药物可接受的添加剂混合，以制备放射性同位素诊断试剂、放射治疗试剂或MRI造影剂。这些添加剂包括，例如，药物可接受的稳定剂，如抗坏血酸和p-氨基苯甲酸，pH调节剂如缓冲溶液，赋形剂如D-甘露醇，用于改善放射化学纯度的试剂如柠檬酸、酒石酸、丙二酸、葡萄糖酸钠和葡庚糖酸钠。此外，药用组合物可以试剂盒的形式提供，以便使特别用于本发明放射性同位素诊断试剂的冻干干粉与添加剂混合而现场制备。
含有放射性金属标记的本发明结合白细胞的化合物的放射性同位素诊断试剂、放射治疗试剂或MRI造影剂，可通过常用的肠胃外途径给药如静脉内给药。认为能够成像和治疗的组合物，衡量多种条件，如体重和患者的年龄、适当的放射成象仪、MRI测量仪和疾病的状态来确定其剂量和放射活性。
对于人类使用，含有Tc-99m标记的化合物的诊断试剂剂量为Tc-99m放射活性37-1110MBq，优选185-1110MBq。治疗试剂含Re-186或Re-188标记的化合物时，其剂量为放射活性37-18500MBq，优选放射活性370-7400MBq。治疗试剂含Y-90标记的化合物时，其剂量为放射活性37-3700MBq，优选放射活性37-1110MBq。其它放射性金属标记的化合物剂量基本相同。诊断试剂含顺磁性金属，如Gd、Fe、Mn和Cu标记的化合物时，其剂量相应于处理的对象、MR成像仪器的敏感性、成像实验的靶组织、给药的特定方式及预定使用目的疗效而不同。然而，对于特定患者的特定药物治疗，取决于多种因素包括所用特定试剂的活性(诱导释放(induced relaxation))、年龄、体重、一般的健康状况、性别、膳食、给药时间、排出速度，试剂联用以及出诊医生所作的判断。
标记复合物剂量的有效水平大约为每日0.1-1000μmol/kg体重，优选每日约0.5-300μmol/kg体重。典型的制备物中含有标记化合物约为1-1000mM，优选约10-500mM。
下文实施例用于更详细地描述本发明，但并不因此限定本发明的范围。
所得化合物的测定方法及实施例中使用的试剂描述如下。
(1)γ粒子计数器：使用Auto-Well Gamma Counter(ALOKA公司制造，日本)对血液中标记化合物的分布进行测定，使用NaISingle Channel Analyzer(OHYO KOKEN KOGYO CO.，LTD.制造，日本)对标记化合物在全身的分布进行测定。
(2)γ射线照相仪：使用GMS-550U(TOSHIBA MEDICAL SYSTEMSCORPORATION制造，日本)。
(3)反相高效液相层析：使用反相Millipore Puresil 5μmC18柱(4.6×150毫米)(Millipore Corporation制造，美国)。
(4)所有肽化合物通过固相肽合成法合成。
(5)99mTcO4 -：使用来自99Mo/99mTc发生器的洗脱液的盐溶液(NIHON MEDI-PHYSICS CO.，LTD.，日本)。
(6)使用的所有试剂均为超级纯。
(7)在使用前，所有实验动物均在间隔12小时的明-暗条件下饲养一周。在此期间，饲料和水的摄取保持自由。
实施例
实施例1
肽的合成
采用固相肽合成法合成下列肽，并用于下文实施例中。
本发明的结合白细胞的化合物
肽3：甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Gly-Asn)；
肽4：甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Asp-Asp)；
肽5：甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Gly-Asp)；
肽6：甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；
肽7：甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-cyclam四羧酸)；
肽8：甲酰-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Ser-Asn-D-Arg-Cys-Asp-Asp)；
肽9：甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-DTPA)；
肽13：甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cyclam丁酸)；
肽14：甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-cyclam丁酸)；
肽15：甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Ser-Asn-cyclam丁酸)；
肽16：乙酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；
肽17：氨基甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；和
肽18：甲基-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)。
上述肽中，cyclam四羧酸，DTPA和cyclam丁酸分别指1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸和1，4，8，11-四氮杂环十四烷丁酸。
对照肽
肽1：甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-Glu-Cys；
肽2：甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Cys-Asn-Asp)；
肽10：甲酰-Met-Leu-Phe-Lys-ε-(-Gly-Gly-Cys)；
肽11：甲酰-Met-Leu-Phe-Lys-ε-(-Gly-Gly-Ac-S-Bzl)；和
肽12：甲酰-Met-Leu-Phe-Lys-ε-(-Gly-Asp-Ac-S-Bzl)。
肽3的合成
肽的合成，采用Boc方法，MBHA树脂(盐酸p-甲氧基-二苯甲基胺树脂，1％二乙烯基苯-聚苯乙烯共聚物)，使用肽合成仪(430A型，AppliedBiosystems)，在0.5mM规模条件下进行。C末端的Lys残基的侧链用Fmoc基团保护。经肽链延伸和N-末端氨基甲酰化后，Lys残基侧链的Fmoc基团用20％的哌啶/DMF裂解，以使肽链向侧链方向延伸。于-2至-5℃，在反应混合物氟氢酸酐：p-甲酚(80∶20)中处理1.0小时以截取肽。
使用层析柱：YMC-Pack ODS-A SH-365-5(30×250mm)在液相色谱(HPLC)上进行纯化，洗脱液A：0.1％TFA/纯水，洗脱液B：0.1％TFA/乙腈，按从A到B的梯度条件洗脱，洗脱速度20ml/min。收集主要峰的级分并冻干以得到目的肽。采用反相高效液相层析法测定由此得到的肽的纯度。
也可使用预装树脂代替MBHA树脂进行合成。
肽在6M盐酸中，于110℃水解22小时后，测定与所得主峰相应的氨基酸组成并确认其为目标肽3，然后将与氨基酸组成相符的峰冻干，以得到目标肽3。通过质谱分析法(以下指定为ESI-MS)测定分子量以确认肽的分子量与理论值相同。所得肽3的氨基酸组成(分子中每种氨基酸的数目)分析结果如下文所示。括号内显示目标肽的氨基酸组成(分子中每种氨基酸的数目)的理论值。
肽3：Asp：(1)1.02； Ser：(1)0.93；Gly：(1)1.03；Tyr：(1)1.00；Phe：(1)1.01；Lys：(1)1.00，NH3(2)2.10；Cys：(1)0.86；Leu：(1)+Nle(2)2.88
此外，通过ESI-MS得到的肽3分子量如下文所示。括号内数值表明目标肽的分子量理论值。ESI-MS：MW＝1183.9(1184.4)。
其它的肽的合成
用相似方法合成和鉴定其它的肽。因为肽1、肽10、肽11和肽12为C末端没有氨基化的肽，这些肽的合成，通过用HMP树脂(4-羟甲基-苯氧基甲基-聚苯乙烯-1％二乙烯基苯-共聚物树脂)代替MBHA树脂，采用与合成肽3相似的方法进行。氨基酸组成的分析值和用于鉴定各种肽的ESI-MS如下文所示。对于肽1和肽10，只显示了氨基酸组成。
肽1＝Glu：(1)1.04，Leu：(1)0.99，Tyr：(1)0.98，Phe：(1)0.99，Lys：(1)1.00，Cys：(1)0.97，Nle：(2)2.03.
肽2＝Asp：(2)2.00，Leu：(1)0.86，Tyr：(1)1.00，Phe：(1)1.01，Lys：(1)1.00，NH3：(2)1.94，Cys：(1)0.88，Nle：(2)2.10，ESI-MS：MW＝1，155.0(1，155.4).
肽4＝Asp：(2)2.00，Ser：(1)0.90，Tyr：(1)0.99，Phe：(1)1.01，Lys：(1)1.00，NH3：(1)1.10，Leu：(1)+Nle：(2)2.84，Cys：(1)0.92，ESI-MS：MW＝1，243.0(1，243.4).
肽5＝Asp：(1)1.00，Ser：(1)0.90，Gly：(1)1.01，Tyr：(1)0.97，Phe：(1)1.00，Lys：(1)1.03，NH3：(1)1.18，Leu：(1)+Nle：(2)2.86，Cys：(1)0.91，ESI-MS：MW＝1，185.1(1，185.4).
肽6＝Asp：(3)3.19，Ser：(1)0.97，Tyr：(1)0.97，Phe：(1)0.98，Lys：(1)1.00，NH3：(1)1.20，Leu：(1)+Nle：(2)2.80，Arg：(1)1.06，Cys：(1)0.92，ESI-MS：MW＝1，514.4(1，514.7).
肽7＝Ser：(1)0.92，Tyr：(1)1.00，Phe：(1)1.02，Lys：(1)1.00，NH3：(1)1.15，Leu：(1)+Nle：(2)2.89，ESI-MS：MW＝1，324.3(1，324.6).
肽8＝Asp：(3)2.94，Ser：(2)1.80，Leu：(1)1.01，Phe：(1)1.00，Lys：(1)1.01，NH3：(2)2.10，Nle：(1)0.95，Cys：(1)1.01 ESI-MS：MW＝1，324.1(1，324.5).
肽9＝Ser：(1)0.91，Tyr：(1)1.00，Phe：(1)0.99，Lys：(1)1.00，NH3：(1)1.23，Leu：(1)+Nle：(2)2.87，Arg：(1)1.00，ESI-MS：MW＝1，441.4(1，441.6).
肽10＝Gly：(2)1.88，Met：(1)0.98，Phe：(1)1.00，Lys：(1)1.02，Leu：(1)1.04.
肽11＝Gly：(2)1.94，Met：(1)0.91，Phe：(1)1.00，Lys：(1)1.02，Leu：(1)1.01，ESI-MS：MW＝842.5(842.4).
肽12＝Asp：(1)0.94，Gly：(1)0.92，Met：(1)0.96，Phe：(1)1.00，Lys：(1)1.01，Leu(1)1.00，ESI-MS：MW＝901.5(902.1).
肽13＝Ser：(1)0.92，Tyr：(1)1.00，Phe：(1)1.01，Lys：(1)1.01，NH3：(1)1.11，Leu：(1)+Nle：(2)2.88，ESI-MS：MW＝1，178.3(1，178.5).
肽14＝Asp：(1)1.01，Ser：(1)0.91，Tyr：(1)1.00，Phe：(1)1.00，Lys：(1)1.01，NH3：(1)1.06，Leu：(1)+Nle：(2)2.89，Arg：(1)1.00，ESI-MS：MW＝1，449.6(1，449.8).
肽15＝Asp：(1)1.01，Ser：(2)1.77，Tyr：(1)0.98，Phe：(1)1.00，Lys：(1)1.01，NH3：(2)2.09，Leu：(1)+Nle：(2)2.87，ESI-MS：MW＝1，379.5(1，379.7).
肽16＝Asp：(3)3.02，Ser：(1)0.93，Tyr：(1)1.00，Phe：(1)1.00，Lys：(1)1.00，NH3：(1)1.10，Leu：(1)+Nle：(2)2.86，Arg：(1)1.01，Cys：(1)1.07，ESI-MS：MW＝1，528.3(1，528.7).
肽17＝Asp：(3)2.95，Ser：(1)0.91，Tyr：(1)1.00，Phe：(1)1.00，Lys：(1)1.00，NH3：(1)1.79，Leu：(1)+Nle：(2)2.58，Arg：(1)1.00，Cys：(1)1.00 ESI-MS：MW＝1，529.4(1，529.7).
肽18＝Asp：(3)2.99，Ser：(1)0.92，Tyr：(1)0.88，Phe：(1)0.97，Lys：(1)0.97，NH3：(1)1.12，Leu：(1)+Nle：(1)1.85，Arg：(1)1.00，Cys：(1)1.03，MeNle：(1)0.95ESI-MS：MW＝1，500.5(1，500.7).
实施例2
Tc-99m标记肽1、肽2、肽3、肽4、肽5、肽6、肽7、肽8、 肽9、肽10、肽13、肽14、肽15、肽16、肽17和肽18
(1)方法
Tc-99m-高锝酸钠溶液(以下指定为99mTcO4-)，1.1-3.0GBq，加至含40.3μmol/300μl葡庚糖酸和130nmol/50μl氯化亚锡溶液混合物的试管中，至总体积为1.35毫升。搅拌并不时颠倒混合物，于室温下反应30分钟。收集其部分，以确认Tc-99m葡庚糖酸中的Tc-99m标记率95％或更高。
实施例1中得到的十六种肽的每一种均溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，用超纯水、含0.9％NaCl的10mM，pH7.4的磷酸盐缓冲液(以下指定为PBS)或10mM，pH8.0的碳酸盐缓冲液(以下指定为CB)，调整各溶液浓度至0.25-12.5nmol/200μl。向各溶液中加入Tc-99m葡庚糖酸溶液200μl，搅拌混匀并于100℃-120℃反应10分钟。标记完成后，收集部分反应混合物，使用HPLC测定Tc-99m标记率。HPLC条件如下。层析柱：Millipore puresil 5μm C18(4.6×150毫米)；流速：1ml/min.；检测波长：220nm；放射活性检测仪：NaI单信道分析仪；洗脱液A：0.1％三氟乙酸(以下指定为TFA)/纯水；洗脱液B：0.1％TFA/乙腈；浓度梯度：0分钟(20％B)→20分钟(50％B)
(2)结果
表1显示16种Tc-99m标记肽的标记率。肽4和肽6代表的所得标记化合物的HPLC分析色谱图分别如图1和图2所示。每一肽中可见单一的标记产物。表1所示标记率的结果表明，Tc-99m的标记可以80％或更高。
表1.Tc-99m标记肽的标记率
  标记的化合物   放射化学纯度(％)
  Tc-99m-肽1   94.4％
  Tc-99m-肽2   92.3％
  Tc-99m-肽3   97.6％
  Tc-99m-肽4   99.6％
  Tc-99m-肽5   100％
  Tc-99m-肽6   100％
  Tc-99m-肽7   100％
  Tc-99m-肽8   98.5％
  Tc-99m-肽9   97.7％
  Tc-99m-肽10   91.7％
  Tc-99m-肽13   82.0％
  Tc-99m-肽14   81.0％
  Tc-99m-肽15   96.0％
  Tc-99m-肽16   94.5％
  Tc-99m-肽17   97.2％
  Tc-99m-肽18   98.9％
实施例3
兔血液中的分布
(1)在实施例2中Tc-99m标记肽(肽3、肽4、肽6、肽8、肽9、肽12、肽13、肽14、肽15、肽16、肽17和肽18)通过反相HPLC，在与实施例2相同的HPLC条件下将未标记的肽和标记的肽分离而纯化。梯度洗脱在20％→50％(0.1％TFA乙腈/0.1％TFA水)条件下进行：0→20分钟。随后制备Percoll密度-梯度溶液。向90毫升未稀释的Percoll溶液(Pharmacia Biotech Inc.)(比重1.130g/ml)中加入10ml 1.5M NaCl，制备等同于生理盐水的等渗溶液。加入生理盐水稀释该溶液，制备1.096、1.077和1.063g/ml的Percoll溶液。如此制备的1.096、1.077和1.063g/ml的Percoll溶液各1毫升，在15ml的试管中分层。使用密度标记珠(红：1.062；蓝色：1.075；橙色：1.087；绿色：1.098)确认其具有目的密度。雄性，体重约2kg，无特定病原体(SPF)的健康的新西兰白(NZW)品系兔，耳静脉采集血液用于本试验。
为检测在作为急性炎症模型的感染的兔血液中的分布，使用由金黄葡萄球菌引起发炎的兔血液代替健康的兔血液。约108活菌计数的金黄葡萄球菌悬浮于1毫升生理盐水中，100μl细菌悬液肌肉注射给雄性、体重约2kg的新西兰白(NZW)品系兔的右侧腓肠中。约24小时后耳静脉采集兔血液用于检测。
为检测在作为慢性炎症模型的溃疡性结肠炎兔血液中的分布，使用由2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)引起发炎的兔血液代替健康的兔血液。溃疡性结肠炎兔模型按照Anthony等的方法制备(Anthony等Int.J.Exp.Path.，76，215-224，1995)。360mg TNBS溶于4ml超纯水中，向其中加入3.2ml乙醇，制备50.0mg/ml，46％的乙醇/生理盐水。向7周龄，重1.3-1.4kg，雄性，1天前禁食，戊巴比妥麻醉的新西兰白(NZW)品系兔，将管子经肛门插入肠约15cm深，注入3ml空气。接着注入0.8ml TNBS/46％乙醇/生理盐水溶液，按摩并倾侧其体位2分钟。4-5天后，耳静脉采集兔血液用于检测。
兔血液各2ml，在37℃温水浴中温育5分钟。向其中加入经HPLC纯化的四种Tc-99m-肽，各3μl(111MBq/ml，Tc-99m-肽，1.8×10-11mol/ml)，孵育30分钟。小心地将血样在预先制备的Percoll密度梯度溶液中分层。分层样品以2000rpm(800×g)离心15分钟。离心后，冰冻试管，用切刀切下每一级分，然后使用Auto-Wellγ粒子计数器测量每一级分的放射活性，以测定每一血液组分中4种Tc-99m-肽的放射活性分布。
(2)结果
根据兔血液学参数中，白细胞计数1000-8000个细胞/μl，受体FPR数目100,000-120,000/细胞，计算兔血液中FPR受体的估计数目为0.17-1.6×10-12mol/ml，兔肽/受体的比率为0.01-0.11。显示各血液组分放射活性在全血放射活性中所占百分比的结果如图3所示。显示粒性白细胞级分放射活性占白细胞总数，以及淋巴细胞和单核细胞级分放射活性占白细胞总数的百分比的结果如表2和表3所示。
在健康的SPF兔血液中，Tc-99m-肽3和Tc-99m-肽12在粒性白细胞级分和淋巴细胞与单核细胞级分中的分布为全血放射活性的5％或更少，且未观察到较强的结合。
由金黄葡萄球菌所致患感染性疾病的兔血液，孵育30分钟后，Tc-99m-肽4在粒性白细胞级分的放射活性分布为全血放射活性的10.78％，Tc-99m-肽4在淋巴细胞和单核细胞级分的放射活性分布为全血放射活性的10.22％。粒性白细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的50.22％，淋巴细胞和单核细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的49.78％。孵育30分钟后，Tc-99m-肽6在粒性白细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的18.27％，Tc-99m-肽6在淋巴细胞与单核细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的20.21％。粒性白细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的47.65％，淋巴细胞与单核细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的52.35％。Tc-99m标记的化合物肽8、肽9、肽13、肽14、肽15、肽16、肽17与肽18中，10％或更多的全血放射活性分布于白细胞中，约27％-77％的全血放射活性分布于淋巴细胞与单核细胞级分中。
孵育30分钟后，对照Tc-99m-肽12在粒性白细胞级分的放射活性分布为全血放射活性的39.73％，Tc-99m-肽12在淋巴细胞与单核细胞级分的放射活性分布为全血放射活性的8.89％。粒性白细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的81.58％，淋巴细胞与单核细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的18.42％。根据这些结果，在金黄葡萄球菌所致感染性疾病的兔血液中，作为本发明一部分的肽4、肽6、肽8、肽9、肽13、肽14、肽15、肽16、肽17与肽18Tc-99m标记的化合物，在淋巴细胞与单核细胞级分的分布显然比传统肽Tc-99m-肽12多。
如图3所示，用TNBS制备的溃疡性结肠炎模型的兔血液孵育30分钟后，Tc-99m-肽3在粒性白细胞级分的放射活性分布为全血放射活性的18.44％，Tc-99m-肽3在淋巴细胞和单核细胞级分的放射活性分布为全血放射活性的15.94％。如表3所示，粒性白细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的53.72％，淋巴细胞和单核细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的46.28％。孵育30分钟后，Tc-99m-肽6在粒性白细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的45.44％，Tc-99m-肽6在淋巴细胞和单核细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的12.60％。粒性白细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的78.27％，淋巴细胞和单核细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的21.73％。孵育30分钟后，对照Tc-99m-肽12在粒性白细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的15.10％，Tc-99m-肽12在淋巴细胞和单核细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的8.34％。粒性白细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的64.66％，淋巴细胞和单核细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的35.34％。
根据这些结果，很明显，在溃疡性结肠炎模型的兔血液中，作为本发明一部分的Tc-99m肽3、Tc-99m-肽6在淋巴细胞和单核细胞级分的分布比传统肽Tc-99m-肽12多。
从上可知，同传统的Tc-99m-肽12相比，本发明的肽与淋巴细胞和单核细胞的结合比粒性白细胞更强，且证实了本发明的肽对于治疗经常被淋巴细胞和单核细胞浸润的慢性炎症有效。
表2.Tc-99m标记的肽与兔白细胞的结合率(对全体白细胞的结合率(％)，n＝3，平均值±SD)
  标记的化合物   感染性疾病模型
  粒性白细胞   淋巴细胞和单核细胞
  Tc-99m-肽4   50.22±10.31   49.78±10.31
  Tc-99m-肽6   47.65±2.47   52.35±2.47
  Tc-99m-肽8   51.41±6.39   48.59±6.39
  Tc-99m-肽9   58.51±2.90   41.49±2.90
  Tc-99m-肽12   81.58±3.58   18.42±3.58
  Tc-99m-肽13   33.45±3.69   66.55±3.69
  Tc-99m-肽14   58.77±5.64   41.23±5.64
  Tc-99m-肽15   58.94±6.47   41.06±6.47
  Tc-99m-肽16   23.28±0.73   76.72±0.73
  Tc-99m-肽17   50.98±0.44   49.02±0.44
  Tc-99m-肽18   72.35±4.24   27.65±4.24
表3.Tc-99m标记的肽与兔白细胞的结合率(对全体白细胞的结合率(％)，n＝3，平均值±SD)
  标记的化合物   溃疡性结肠炎模型
  粒性白细胞   淋巴细胞和单核细胞
  Tc-99m-肽3   53.72±10.74   46.28±10.74
  Tc-99m-肽6   78.27±3.16   21.73±3.16
  Tc-99m-肽12   64.66±4.05   35.34±4.05
实施例4
Tc-99m标记的化合物肽3、肽4、肽5和肽12在感染性疾病模型 兔中的成像，以及时急性期和亚急性期炎症的有效性
(1)方法
约108计数的活金黄葡萄球菌，悬浮于1ml生理盐水中，取悬浮液100μl肌肉注射入约2kg的新西兰白(NZW)品系兔的右侧腓肠。24小时后，呈现明显炎症的模型兔用戊巴比妥麻醉，每种37-74MBq的Tc-99m标记肽3、肽4、肽5、肽6、肽7、肽8、肽9、肽12、肽13、肽14、肽15、肽16、肽17和肽18，耳静脉给药。给药5分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时和22小时后，使用γ射线照相仪记录影像。给药5分钟-5小时后的时间点为炎症开始24-29小时的时期，对应于急性期炎症。22小时后的时间点为炎症开始约46小时的时期，对应于亚急性期炎症。
(2)结果
所得结果的示意图如图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13、图14和图15所示。在图像中定位目标区域，1000像素目标区域计数与整体计数的比率(％注射剂量(ID)/千像素)如表4所示。根据上述比值确定的，表示[炎症]/[正常肌肉]的比值([A]/[M]的比值)如表5所示。
在现今已知的Tc-99m-肽12中，给药2小时后(炎症开始26小时后，急性期炎症)[A]/[M]的比值为10.34±3.34(平均数±标准误差)(n＝3)，22小时后(炎症开始46小时后，亚急性期炎症)[A]/[M]的比值为33.94±20.76(n＝3)，炎性区域的累积从给药2小时后(炎症开始26小时后)的1.66±0.63％ID/千像素减少到给药22小时后(炎症开始46小时后)的0.90±0.29％ID/千像素。
在本发明的Tc-99m-肽3中，给药2小时后(炎症开始26小时后)[A]/[M]的比值为6.55±2.06(n＝5)，给药22小时后(炎症开始46小时后)[A]/[M]的比值为54.16±32.86(n＝5)，炎性区域的累积从给药2小时后(炎症开始26小时后)的0.93±0.31％ID/千像素增加到给药22小时后(炎症开始46小时后)的3.70±2.67％ID/千像素。在本发明的Tc-99m-肽4中，给药2小时后(炎症开始26小时后)[A]/[M]的比值为6.75±2.71(n＝3)，22小时后(炎症开始46小时后)[A]/[M]的比值为29.07±19.97(n＝3)，其值低于现在已知的Tc-99m-肽12的值，炎性区域的累积从给药2小时后(炎症开始26小时后)的1.09±0.22％ID/千像素增加到给药22小时后(炎症开始46小时后)的1.85±0.34％ID/千像素。在本发明的Tc-99m-肽6中，给药2小时后(炎症开始26小时后)[A]/[M]的比值为14.25±0.31(n＝3)，22小时后(炎症开始46小时后)[A]/[M]的比值为43.84±12.58(n＝3)，炎性区域的累积从给药2小时后(炎症开始26小时后)的1.22±0.05％ID/千像素增加到给药22小时后(炎症开始46小时后)的1.77±0.07％ID/千像素。
通常，感染24小时后大部分炎性区域的浸润白细胞主要由嗜中性粒细胞(占粒性白细胞大部分)组成，其后嗜中性粒细胞逐渐减少，大多数浸润白细胞转变为包括巨噬细胞和淋巴细胞在内的单核细胞。从临床观点出发，需要核医学检测的大部分炎症，为亚急性期炎症，呈现显著的单核细胞和淋巴细胞浸润。以上结果可以表明，本发明的肽，对诊断炎症开始26小时后的急性期炎症(给药2小时后)和炎症开始46小时后的亚急性期炎症(给药22小时后)，都非常有用。
表4.Tc-99m标记的肽在兔传染病模型炎症中的累积
(％ID/千像素)(n＝3，Tc-99m-肽3：n＝5，平均值±标准误差)
  标记的化合物   给药后经过的时间
  5min.   1hr   2hrs   3hrs   4hrs   5hrs   22hrs
  Tc-99m-肽3   0.39±0.14   0.66±0.18   0.93±0.31   1.08±0.31   1.39±0.55   1.63±0.72   3.70±2.67
  Tc-99m-肽4   0.95±0.24   0.91±0.14   1.09±0.22   1.52±0.27   1.76±0.39   1.84±0.27   1.85±0.34
  Tc-99m-肽6   0.93±0.10   0.94±0.10   1.22±0.05   1.49±0.14   1.59±0.09   1.64±0.08   1.77±0.07
  Tc-99m-肽8   1.59±0.38   0.97±0.34   0.73±0.16   0.60±0.10   0.60±0.14   0.62±0.11 未进行
  Tc-99m-肽9   1.39±0.22   0.65±0.11   0.47±0.10   0.41±0.10   0.42±0.06   0.43±0.03   未进行
  Tc-99m-肽12   0.86±0.14   1.31±0.38   1.66±0.63   1.62±0.63   1.64±0.66   1.59±0.71   0.90±0.29
  Tc-99m-肽13 1.40±0.37 1.09±0.23 0.68±0.12 0.52±0.10 0.54±0.07 0.54±0.08 未进行
  Tc-99m-肽14   1.30±0.20   0.82±0.18   0.58±0.04   0.44±0.03   0.49±0.00   0.51±0.02   未进行
  Tc-99m-肽15 1.36±0.30 0.83±0.02 0.76±0.07 0.81±0.32 0.90±0.33 1.04±0.28 未进行
  Tc-99m-肽16 2.93±0.21 0.85±0.21 0.38±0.05 0.23±0.05 0.16±0.06 0.13±0.03 未进行
  Tc-99m-肽17 2.59±0.70 1.13±0.07 0.62±0.03 0.47±0.04 0.38±0.07 0.36±0.12 未进行
  Tc-99m-肽18 2.14±0.16 0.75±0.26 0.34±0.09 0.19±0.11 0.14±0.06 0.13±0.04 未进行
表5.Tc-99m标记的肽在兔传染病模型中的炎症/肌肉的比值
(n＝3，Tc-99m-肽3：n＝5，平均值±标准误差)
  标记的化合物   给药后经过的时间
  5min.   1hr   2hrs   3hrs   4hrs   5hrs   22hrs
  Tc-99m-肽3   1.64±0.57   3.56±1.03   6.55±2.06   8.68±2.89   11.48±2.88   13.11±3.37   54.16±32.86
  Tc-99m-肽4   1.94±0.49   4.08±1.34   6.75±2.71   10.65±5.53   13.02±5.76   14.81±6.77   29.07±19.97
  Tc-99m-肽6   2.08±0.46   6.16±0.59   14.25±0.31   24.31±4.55   30.20±7.49   29.67±7.66   43.84±12.58
  Tc-99m-肽8   1.31±0.56   4.27±2.15   9.22±3.81   13.33±5.30   18.51±1.88   19.30±2.18   未进行
  Tc-99m-肽9   1.83±0.38   3.91±0.52   5.30±2.08   5.79±1.48   8.87±3.02   8.84±3.03 未进行
  Tc-99m-肽12   2.96±0.63   7.06±1.43   10.34±3.34   13.81±2.94   16.88±2.80   19.64±1.24   33.94±20.76
  Tc-99m-肽13   1.60±0.22   2.84±0.46   6.21±1.25   5.60±2.00   9.25±1.63   11.26±2.77 未进行
  Tc-99m-肽14   1.63±0.21   3.88±0.88   12.23±3.30   11.20±3.73   18.93±3.08   27.79±9.32   未进行
  Tc-99m-肽15 2.41±0.09 5.94±1.82 8.84±4.41 11.86±6.02 12.88±9.40 13.32±8.76 未进行
  Tc-99m-肽16   2.10±0.31   2.67±0.49   4.02±1.27   5.52±0.13   4.14±0.83   4.56±0.53   未进行
  Tc-99m肽17 2.02±0.36 3.16±0.97 4.63±1.90 7.29±4.74 7.80±6.33 10.71±0.32 未进行
  Tc-99m-肽18   1.58±0.01   2.21±0.98   3.76±0.11   3.60±2.71   4.18±3.09   4.20±2.67   未进行
实施例5。
Tc-99m标记的肽3、肽4、肽6和肽12的药物动力学
(1)方法
在正常大鼠中，检测了实施例2中得到的4种Tc-99m标记化合物Tc-99m-肽3、Tc-99m-肽4、Tc-99m-肽6和Tc-99m-肽12的生物分布。生物分布试验按照本领域技术人员的常规方法进行。未禁食的SD(Sprague-Dawley)系大鼠(体重140-200g)用ravonal麻醉，尾静脉给予各为3.0-3.7MBq的样品。给药5分钟、30分钟、60分钟和180分钟后，从大鼠腹主动脉放血。用NaI单信道分析仪测定各摘除器官与注射剂量的放射活性计数。测量各器官的重量以计算生物分布。各器官放射活性与注射剂量的比率，以每器官值(％ID/器官)或每克器官值(％ID/g器官)表示。
(2)结果
结果如表6、表7、表8和表9所示。在尿和小肠中的时程变化如来自表6，表7，表8和表9结果的图16和图17所示。
根据表6、表7、表8、表9、图16和图17的结果，发现Tc-99m标记肽在正常大鼠中的生物分布彼此非常不同，取决于权利要求1描述的通式中的氨基酸残基Z和W。即，常规的Tc-99m-肽12的代谢途径可能主要通过肝胆途径排出，因为同其它的肽相比，给药5分钟后其在肝脏有高累积，各时间点上在胃内有高累积，各时间点上在小肠内有高累积，180分钟时高累积从肠转至阑尾(图17)。此外，由于在小肠内的高累积，很难对腹部炎症如炎症性肠病进行显像。
与之相反，本发明的肽中，Tc-99m标记的化合物肽3、肽4和肽6，其在权力要求1描述的通式中，T和U变为或加入亲水性氨基酸，如带电荷的氨基酸和酸性氨基酸，其生物分布不同于Tc-99m-肽12，并被促使由尿排出(图16)。特别地，Tc-99m-肽6的趋向性非常显著。这些特征对于腹部炎症如炎症性肠病的显像相当重要。因此，这表明本发明的肽可有效地用于观察腹部的白细胞浸润区域，因为同传统的已知肽12相比，其在腹部区域特别是小肠内的分布较低。
表6.Tc-99m-肽3在正常大鼠中的生物分布
上行：％ID/器官；下行：％ID/g(n＝3，平均值±标准误差)
  器官   5min.   30min.   60min.   180min.
  血液   5.345±0.824(0.719±0.067)   1.759±0.769(0.212±0.073)   0.657±0.150(0.082±0.008)   0.318±0.225(0.038±0.025)
  心脏   0.182±0.014(0.315±0.014)   0.054±0.012(0.094±0.024)   0.020±0.003(0.034±0.002)   0.004±0.000(0.007±0.000)
  肺   0.805±0.150(0.868±0.116)   0.395±0.186(0.383±0.155)   0.117±0.011(0.128±0.010)   0.040±0.005(0.045±0.007)
肝   21.912±0.529(3.287±0.215)   16.435±3.821(2.475±0.543)   7.339±0.595(1.105±0.089)   1.239±0.132(0.206±0.026)
脾   0.169±0.012(0.471±0.022)   0.102±0.003(0.239±0.020)   0.065±0.013(0.155±0.026)   0.042±0.004(0.102±0.014)
  肾   15.350±1.803(11.297±1.970)   19.142±1.543(13.953±2.124)   14.223±1.091(10.679±0.785)   6.016±1.089(4.508±1.013)
胃   0.500±0.060(0.131±0.031)   0.354±0.196(0.090±0.037)   0.160±0.177(0.044±0.043)   0.058±0.049(0.018±0.012)
  小肠   21.307±1.479(2.691±0.329)   33.762±5.276(4.504±0.939)   37.742±2.889(5.165±0.506)   40.273±1.263(5.787±0.208)
阑尾   0.431±0.048(0.086±0.010)   0.125±0.035(0.024±0.008)   0.057±0.013(0.013±0.004)   1.636±0.993(0.308±0.171)
  结肠   0.131±0.052(0.335±0.030)   0.050±0.024(0.117±0.016)   0.017±0.006(0.040±0.001)   0.022±0.026(0.049±0.060)
  直肠   0.486±0.059(0.465±0.042)   0.164±0.010(0.176±0.053)   0.063±0.005(0.062±0.004)   0.050±0.020(0.051±0.018)
  肾上腺   0.024±0.005(0.605±0.131)   0.008±0.001(0.194±0.024)   0.004±0.002(0.095±0.043)   0.001±0.000(0.001±0.000)
  卵巢   0.059±0.003(0.735±0.034)   0.020±0.003(0.255±0.034)   0.008±0.002(0.106±0.019)   0.001±0.002(0.013±0.022)
  下肢骨   0.408±0.042(0.332±0.035)   0.165±0.035(0.139±0.030)   0.073±0.008(0.060±0.009)   0.035±0.006(0.029±0.006)
  皮肤   1.033±0.405(0.371±0.019)   0.362±0.067(0.154±0.046)   0.114±0.037(0.052±0.004)   0.026±0.010(0.011±0.001)
  肌肉   1.115±0.236(0.146±0.018)   0.366±0.115(0.047±0.013)   0.110±0.021(0.016±0.002)   0.026±0.006(0.004±0.001)
  尿   0.230±0.126   15.575±3.638   34.936±2.443   48.414±2.048
  粪便   0.025±0.013   0.014±0.009   0.012±0.013   0.618±1.032
  尸体   30.489±1.877(0.265±0.011)   11.147±2.812(0.099±0.027)   4.283±0.300(0.037±0.002)   1.183±0.362(0.010±0.003)
表7.Tc-99m-肽4在正常大鼠中的生物分布
上行：％ID/器官；下行：％ID/g(n＝3，平均值±标准误差)
  器官   5min.   30min.   60min.   180min.
  血液   6.189±1.270(0.846±0.167)   1.922±0.560(0.252±0.022)   0.823±0.350(0.109±0.031)   0.126±0.021(0.017±0.003)
心脏   0.163±0.036(0.306±0.077)   0.043±0.006(0.086±0.010)   0.026±0.013(0.039±0.010)   0.004±0.001(0.007±0.001)
  肺   0.652±0.096(0.726±0.107)   0.243±0.027(0.279±0.057)   0.147±0.016(0.160±0.021)   0.068±0.017(0.075±0.023)
肝   18.159±2.621(2.810±0.295)   11.820±1.257(1.889±0.186)   6.583±0.266(1.032±0.061)   1.358±0.284(0.232±0.065)
脾   0.144±0.010(0.367±0.064)   0.110±0.014(0.275±0.032)   0.076±0.015(0.192±0.031)   0.059±0.009(0.160±0.027)
  肾   5.643±2.131(4.354±1.312)   4.671±0.594(3.806±0.604)   3.938±0.323(3.365±0.433)   3.433±1.054(2.814±0.926)
胃   4.484±4.613(0.905±0.747)   0.340±0.145(0.115±0.042)   0.391±0.293(0.118±0.085)   0.178±0.092(0.050±0.025)
  小肠   28.887±3.569(3.862±0.976)   41.173±0.337(5.648±0.657)   44.035±4.359(5.876±0.659)   13.553±1.591(1.997±0.239)
  阑尾   0.358±0.029(0.089±0.019)   0.116±0.011(0.029±0.003)   0.077±0.032(0.018±0.004)   36.011±2.291(6.306±0.610)
  结肠   0.244±0.120(0.395±0.046)   0.072±0.024(0.172±0.089)   0.032±0.016(0.071±0.031)   0.115±0.014(0.289±0.115)
  直肠   0.476±0.241(0.565±0.124)   0.125±0.004(0.166±0.019)   0.083±0.037(0.100±0.057)   0.060±0.022(0.061±0.013)
  肾上腺   0.024±0.003(0.604±0.253)   0.010±0.001(0.242±0.067)   0.004±0.001(0.092±0.009)   0.001±0.001(0.037±0.014)
  卵巢   0.069±0.026(0.861±0.327)   0.016±0.005(0.204±0.062)   0.008±0.001(0.101±0.011)   0.003±0.001(0.035±0.017)
  下肢骨   0.342±0.017(0.304±0.019)   0.167±0.020(0.150±0.022)   0.0160±0.026(0.095±0.002)   0.044±0.015(0.039±0.012)
  皮肤   0.506±0.217(0.321±0.039)   0.414±0.189(0.168±0.016)   0.099±0.017(0.062±0.018)   0.022±0.006(0.015±0.001)
  肌肉   0.850±0.112(0.132±0.014)   0.296±0.060(0.054±0.016)   0.115±0.037(0.019±0.006)   0.023±0.003(0.004±0.000)
  尿   5.258±2.993   26.706±0.900   37.798±2.759   42.009±0.925
  粪便   0.027±0.002   0.095±0.101   0.097±0.079   1.485±2.389
  尸体   27.525±2.159(0.260±0.042)   11.661±0.196(0.111±0.008)   5.563±1.766(0.052±0.017)   1.448±0.256(0.014±0.002)
表8.Tc-99m-肽6在正常大鼠中的生物分布
上行：％ID/器官；下行：％ID/g(n＝3，平均值±标准误差)
  器官   5min.   30min.   60min.   180min.
血液   11.205±0.809(1.414±0.176)   3.657±1.074(0.451±0.052)   0.936±0.364(0.123±0.020)   0.532±0.421(0.062±0.044)
心脏   0.275±0.050(0.494±0.083)   0.097±0.026(0.161±0.029)   0.029±0.008(0.056±0.017)   0.014±0.006(0.024±0.009)
肺 1.770±0.274(1.770±0.263) 0.715±0.037(0.752±0.062) 0.369±0.029(0.390±0.054) 0.159±0.023(0.167±0.017)
  肝   6.374±0.900(1.003±0.162)   4.097±0.758(0.607±0.113)   2.713±0.379(0.465±0.072)   2.167±0.369(0.353±0.042)
脾 0.229±0.050(0.548±0.092) 0.140±0.040(0.198±0.083) 0.105±0.028(0.284±0.054) 0.090±0.014(0.210±0.011)
  肾   10.176±2.359(7.546±1.996)   5.916±2.411(3.971±1.559)   3.867±1.501(2.975±1.020)   2.634±1.172(1.838±0.732)
  胃   0.658±0.196(0.297±0.022)   0.443±0.204(0.166±0.090)   0.166±0.037(0.049±0.003)   0.104±0.067(0.028±0.011)
  小肠   3.680±0.549(0.592±0.073)   3.385±0.898(0.472±0.117)   3.858±0.753(0.596±0.120)   0.996±0.574(0.163±0.099)
  阑尾   0.662±0.009(0.165±0.020)   0.237±0.039(0.049±0.007)   0.097±0.009(0.022±0.008)   2.202±0.468(0.396±0.115)
  结肠   0.311±0.110(0.625±0.094)   0.140±0.087(0.223±0.057)   0.047±0.009(0.094±0.010)   0.031±0.021(0.069±0.037)
  直肠   0.895±0.245(0.913±0.169)   0.424±0.151(0.503±0.372)   0.260±0.130(0.329±0.245)   0.051±0.010(0.052±0.009)
  肾上腺   0.027±0.003(0.668±0.077)   0.011±0.001(0.276±0.033)   0.005±0.001(0.117±0.029)   0.002±0.001(0.061±0.035)
  卵巢   0.096±0.004(1.195±0.048)   0.044±0.003(0.546±0.040)   0.020±0.003(0.251±0.044)   0.013±0.009(0.160±0.117)
  下肢骨   0.578±0.044(0.489±0.065)   0.264±0.014(0.221±0.014)   0.122±0.030(0.101±0.023)   0.067±0.008(0.053±0.005)
  皮肤   1.756±0.161(0.652±0.069)   0.640±0.214(0.273±0.008)   0.238±0.051(0.088±0.011)   0.044±0.014(0.024±0.006)
  肌肉   1.632±0.201(0.236±0.021)   0.688±0.279(0.094±0.026)   0.180±0.036(0.027±0.004)   0.066±0.009(0.009±0.000)
  尿   7.770±2.348   56.342±5.430   78.567±2.774   87.408±1.020
  粪便   0.048±0.016   0.056±0.033   0.025±0.011   0.646±0.636
  尸体   51.858±1.751(0.465±0.026)   22.704±3.734(0.199±0.024)   8.397±1.185(0.079±0.014)   2.772±0.661(0.025±0.007)
表9.Tc-99m-肽12在正常大鼠中的生物分布
上行：％ID/器官；下行：％ID/g(n＝3，平均值±标准误差)
  器官   5min.   30min.   60min.   180min.
  血液   4.615±0.611(0.683±0.074)   0.880±0.059(0.146±0.019)   0.613±0.185(0.112±0.038)   0.332±0.205(0.054±0.035)
心脏   0.110±0.016(0.205±0.030)   0.021±0.004(0.040±0.008)   0.016±0.006(0.031±0.009)   0.009±0.007(0.018±0.014)
肺   0.221±0.021(0.259±0.013)   0.065±0.008(0.073±0.005)   0.052±0.011(0.061±0.012)   0.030±0.019(0.036±0.025)
肝   32.141±1.082(4.547±0.226)   1.527±0.301(0.235±0.028)   0.696±0.083(0.107±0.019)   0.320±0.221(0.054±0.036)
脾   0.055±0.005(0.135±0.013)   0.019±0.003(0.046±0.008)   0.014±0.002(0.039±0.003)   0.013±0.010(0.035±0.023)
  肾   1.380±0.161(1.055±0.152)   1.080±0.125(0.876±0.145)   1.043±0.167(0.830±0.123)   1.017±0.639(0.822±0.525)
  胃   0.802±0.643(0.219±0.167)   1.884±1.594(0.516±0.446)   1.748±0.191(0.586±0.076)   1.953±1.069(0.596±0.178)
  小肠   44.145±2.931(5.915±0.448)   86.860±2.200(12.285±0.316)   86.308±1.540(12.392±0.927)   11.574±15.140(1.888±2.411)
阑尾   0.161±0.22(0.043±0.004)   0.076±0.003(0.020±0.002)   0.169±0.047(0.043±0.007)   73.702±24.073(15.226±6.088)
  结肠   0.080±0.006(0.167±0.007)   0.023±0.005(0.048±0.006)   0.026±0.009(0.046±0.011)   0.048±0.016(0.112±0.052)
  直肠   0.162±0.038(0.175±0.003)   0.041±0.011(0.053±0.005)   0.037±0.010(0.045±0.011)   0.019±0.011(0.022±0.016)
  肾上腺   0.009±0.001(0.223±0.031)   0.002±0.000(0.057±0.009)   0.002±0.000(0.054±0.011)   0.001±0.001(0.235±0.032)
  卵巢   0.29±0.008(0.368±0.100)   0.008±0.001(0.098±0.015)   0.007±0.001(0.088±0.014)   0.008±0.001(0.038±0.016)
  下肢骨   0.165±0.026(0.140±0.016)   0.057±0.005(0.050±0.005)   0.049±0.006(0.043±0.008)   0.029±0.021(0.025±0.017)
  皮肤   0.374±0.040(0.165±0.027)   0.091±0.016(0.073±0.008)   0.104±0.025(0.036±0.002)   0.042±0.047(0.0018±0.019)
  肌肉   0.374±0.040(0.165±0.027)   0.137±0.031(0.021±0.004)   0.105±0.027(0.016±0.004)   0.047±0.023(0.007±0.004)
  尿   0.400±0.154   2.687±0.285   5.493±0.833   8.767±5.591
  粪便   0.025±0.002   0.049±0.005   0.105±0.019   0.373±0.122
  尸体   14.537±1.466(0.134±0.015)   4.493±0.616(0.041±0.006)   3.411±0.465(0.031±0.004)   1.720±1.276(0.016±0.012)
实施例6
在大鼠溃疡性结肠炎模型中的生物分布及在慢性炎症中的有效性
(1)方法
炎症模型的制备：按照Anthony等的方法制备溃疡性结肠炎的大鼠模型(Anthony等Int.J.Exp.Path.，76，215-224，1995)。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)360mg溶于4ml超纯水中，向其中加入3.2ml乙醇制备50.0mg/ml 46％的乙醇/生理盐溶液。体重164-177g，雌性，7周龄，24小时前禁食，乙醚麻醉的SD品系大鼠(SpragueDawley，无特定病原体)，将管子经肛门插入肠约7-8cm深，注入0.1ml空气。接着注入0.2ml TNBS/46％乙醇/生理盐水溶液，按摩并倾侧体位2分钟。5天后大鼠用于检测。
Tc-99m-肽3、Tc-99m-肽4、Tc-99m-肽6和作为对照的现今已知的传统Tc-99m-肽12，每只大鼠约7.4MBq，经尾静脉给药。给药5分钟、30分钟、60分钟和180分钟后，大鼠放血，使用NaI单信道分析仪测定每种器官的放射活性分布，以获得％ID/每器官和％ID/克器官的值。有炎症区域的直肠定为炎症区域，根据％ID/克器官的值，得到[直肠(炎症)]/[肌肉]的比值([A]/[M]的比值)和[直肠(炎症)]/[血液]的比值([A]/[B]的比值)。
(2)结果
结果如表10、表11、表12和表13所示。
Tc-99m-肽3显示[A]/[M]的比值给药5分钟后为3.36±0.58，给药180分钟后为7.91±1.16。同非炎症区域的肌肉相比，炎症区域呈现高水平的放射活性以及时程依赖性的[A]/[M]比值增加趋势。此外，给药60分钟及其后，[A]/[B]的比值超过1，给药180分钟后呈现为2.00±1.50，显示出增加趋势。这不可能由反映血流增加的非特异性累积所致，而被认为是由特异性的炎症累积所致。
Tc-99m-肽4显示给药5分钟后的[A]/[M]比值为4.37±0.68，给药180分钟后为9.29±2.82。同非炎症区域肌肉相比，炎症区域呈现高水平的放射活性和时程依赖性的[A]/[M]比值增加趋势。此外，给药60分钟及其后，[A]/[B]的比值超过1，给药180分钟后呈现为1.51±0.41，显示出增加趋势。这不可能由反映血流增加的非特异性累积所致，而被认为是由特异性的炎症累积所致。
Tc-99m-肽6显示给药5分钟后[A]/[M]比值为4.41±0.97，给药180分钟后为16.50±11.08。同非炎症区域肌肉相比，炎症区域呈现高水平的放射活性和时程依赖性的[A]/[M]比值增加趋势。此外，给药30分钟及其后，[A]/[B]的比值超过1，给药180分钟后呈现为2.74±1.72，显示出增加趋势。这不可能由反映血流增加的非特异性累积所致，而被认为是由特异性的炎症累积所致。
Tc-99m-肽12显示给药5分钟后[A]/[M]的比值为4.66±3.13，给药180分钟后为6.22±4.61。这显示同本发明的肽相比，[A]/[M]的比值偏低。
虽然给药60分钟后[A]/[M]的比值呈现最大值为11.10±12.33，但其后降低。虽然给药60分钟后[A]/[B]的比值呈现为1.89±2.39，但其后降低，给药180分钟后为1.00±0.89。
根据本试验，对于淋巴细胞和单核细胞高度浸润的慢性炎性区域，本发明的肽在累积和保持方面优于现今已知的肽12，并被证明对慢性炎症如溃疡性结肠炎有效。
表10.Tc-99m-肽3在大鼠IBD模型中的生物分布
上行：％ID/器官；下行：％ID/g(n＝3，平均值±标准误差)
  器官   5min.   30min.   60min.   180min.
  血液   6.145±1.475(0.912±0.084)   2.397±1.066(0.341±0.097)   0.763±0.238(0.108±0.025)   0.164±0.120(0.023±0.013)
  心脏   0.0167±0.004(0.345±0.006)   0.045±0.006(0.101±0.009)   0.020±0.001(0.042±0.004)   0.004±0.000(0.008±0.001)
  肺   0.840±0.027(1.031±0.058)   0.248±0.004(0.308±0.016)   0.151±0.020(0.177±0.029)   0.053±0.016(0.068±0.025)
肝   24.382±2.015(4.146±0.528)   16.240±2.633(2.872±0.793)   7.993±1.993(1.310±0.313)   1.249±0.250(0.234±0.053)
  脾   0.211±0.008(0.597±0.046)   0.075±0.023(0.212±0.070)   0.074±0.018(0.207±0.037)   0.053±0.016(0.136±0.043)
  肾   13.030±1.588(11.263±1.648)   18.869±6.719(15.816±5.386)   16.068±1.238(13.353±1.426)   6.248±0.746(5.333±0.482)
胃   1.428±0.982(0.402±0.242)   0.181±0.072(0.058±0.034)   0.082±0.013(0.025±0.005)   0.035±0.016(0.013±0.006)
  小肠   20.876±4.511(3.056±0.970)   34.286±8.601(5.520±2.262)   37.506±2.672(5.249±0.446)   25.538±19.634(4.165±3.176)
  阑尾   0.405±0.085(0.110±0.031)   0.192±0.134(0.030±0.003)   0.080±0.024(0.015±0.004)   14.113±13.789(3.030±2.871)
  结肠   0.228±0.044(0.484±0.028)   0.052±0.033(0.140±0.012)   0.046±0.026(0.083±0.044)   0.087±0.110(0.229±0.315)
  直肠(炎症)   0.590±0.118(0.573±0.047)   0.286±0.210(0.203±0.036)   0.110±0.062(0.097±0.035)   0.089±0.024(0.041±0.021)
  肾上腺   0.026±0.003(0.294±0.360)   0.008±0.001(0.097±0.065)   0.003±0.001(0.067±0.019)   0.001±0.001(0.082±0.084)
  卵巢   0.062±0.046(0.779±0.572)   0.011±0.000(0.135±0.003)   0.005±0.002(0.069±0.020)   0.005±0.005(0.069±0.057)
  下肢骨   0.225±0.047(0.211±0.047)   0.087±0.019(0.086±0.032)   0.049±0.018(0.050±0.023)   0.035±0.022(0.036±0.023)
  皮肤   0.378±0.114(0.220±0.017)   0.191±0.211(0.102±0.049)   0.103±0.018(0.062±0.041)   0.069±0.047(0.040±0.034)
肌肉   0.537±0.180(0.104±0.008)   0.181±0.101(0.032±0.015)   0.094±0.014(0.018±0.009)   0.068±0.049(0.014±0.012)
  尿   0.681±0.234   4.094±0.769   6.071±0.796   8.305±2.667
  粪便   0.656±1.023   0.073±0.031   0.073±0.002   0.430±0.391
  尸体   16.159±2.511(0.197±0.056)   5.820±1.595(0.065±0.027)   3.392±1.387(0.040±0.024)   2.661±2.059(0.036±0.035)
  直肠(炎症)/血液 0.64±0.04 0.63±0.10 1.09±0.70 2.00±1.50
  直肠(炎症)/肌肉 3.36±0.58 4.00±0.95 4.78±1.57 7.91±1.16
表11.Tc-99m-肽4在大鼠IBD模型中的生物分布
下行：％ID/器官；下行：％ID/g(n＝3，平均值±标准误差)
  器官   5min.   30min.   60min.   180min.
  血液   5.232±1.667(0.625±0.114)   1.764±0.087(0.213±0.055)   0.821±0.308(0.092±0.016)   0.146±0.029(0.019±0.002)
  心脏   0.132±0.032(0.229±0.058)   0.041±0.006(0.080±0.019)   0.017±0.004(0.031±0.008)   0.004±0.002(0.007±0.002)
  肺   0.571±0.230(0.640±0.236)   0.373±0.074(0.390±0.086)   0.171±0.040(0.182±0.035)   0.069±0.025(0.075±0.023)
肝   18.757±3.225(2.617±0.132)   13.932±3.695(1.922±0.413)   7.344±0.694(1.072±0.231)   1.219±0.163(0.200±0.024)
  脾   0.175±0.088(0.362±0.051)   0.170±0.055(0.416±0.168)   0.081±0.008(0.176±0.046)   0.069±0.031(0.171±0.053)
  肾   4.564±0.850(3.131±0.507)   5.646±0.919(4.276±0.533)   5.439±1.647(4.262±1.522)   6.237±1.026(4.490±0.638)
胃   1.304±1.206(0.323±0.206)   0.209±0.097(0.057±0.032)   0.149±0.024(0.039±0.011)   0.090±0.062(0.035±0.019)
  小肠   33.890±4.651(4.095±0.762)   41.709±7.462(5.413±1.168)   45.378±2.739(6.383±0.486)   30.633±19.329(4.459±2.611)
  阑尾   0.294±0.074(0.060±0.012)   0.094±0.023(0.022±0.002)   0.078±0.061(0.016±0.010)   18.242±20.821(4.248±4.880)
  结肠   0.181±0.171(0.289±0.072)   0.048±0.015(0.114±0.047)   0.019±0.014(0.046±0.010)   0.053±0.066(0.112±0.135)
  直肠(炎症)   0.410±0.157(0.468±0.127)   0.410±0.398(0.216±0.150)   0.133±0.092(0.115±0.076)   0.032±0.011(0.028±0.008)
  肾上腺   0.015±0.005(0.376±0.119)   0.005±0.002(0.129±0.061)   0.004±0.000(0.095±0.008)   0.001±0.000(0.023±0.008)
  卵巢   0.042±0.012(0.529±0.150)   0.025±0.011(0.309±0.133)   0.006±0.002(0.080±0.020)   0.002±0.000(0.022±0.003)
  下肢骨   0.377±0.054(0.289±0.033)   0.218±0.052(0.174±0.053)   0.121±0.008(0.097±0.009)   0.078±0.023(0.061±0.017)
  皮肤   0.773±0.276(0.268±0.050)   0.327±0.233(0.131±0.047)   0.112±0.048(0.044±0.007)   0.025±0.011(0.009±0.002)
  肌肉   0.757±0.118(0.106±0.014)   0.310±0.157(0.047±0.026)   0.101±0.012(0.013±0.001)   0.022±0.008(0.03±0.001)
  尿   9.976±3.195   23.885±2.560   35.648±1.482   41.509±2.049
  粪便   0.104±0.139   0.032±0.034   0.024±0.023   0.215±0.305
  尸体   22.375±2.165(0.192±0.029)   10.901±4.459(0.101±0.058)   4.354±0.670(0.037±0.005)   1.353±0.323(0.011±0.002)
  直肠(炎症)/血液 0.74±0.10 0.95±0.42 1.26±0.82 1.51±0.41
  直肠(炎症)/肌肉 4.37±0.68 4.46±1.00 8.81±6.35 9.29±2.82
表12.Tc-99m-肽6在大鼠IBD模型中的生物分布
上行：％ID/器官；下行：％ID/g(n＝3，平均值±标准误差)
  器官   5min.   30min.   60min.   180min.
  血液   5.232±1.667(0.625±0.114)   1.770±0.092(0.214±0.057)   0.818±0.304(0.092±0.016)   0.146±0.029(0.019±0.002)
  心脏   0.132±0.032(0.229±0.058)   0.42±0.006(0.080±0.020)   0.017±0.004(0.031±0.008)   0.004±0.002(0.007±0.002)
  肺   0.571±0.230(0.640±0.236)   0.374±0.076(0.391±0.088)   0.170±0.040(0.181±0.035)   0.069±0.025(0.075±0.023)
肝   18.757±3.225(2.617±0.132)   13.991±3.796(1.930±0.126)   7.322±0.720(1.069±0.235)   1.219±0.163(0.200±0.024)
  脾   0.175±0.088(0.362±0.051)   0.171±0.055(0.418±0.170)   0.081±0.008(0.176±0.046)   0.069±0.031(0.171±0.053)
  肾   4.564±0.850(3.131±0.507)   5.664±0.917(4.291±0.548)   5.427±1.667(4.254±1.536)   6.237±1.026(4.490±0.638)
胃   1.304±1.206(0.323±0.206)   0.210±0.098(0.057±0.033)   0.519±0.649(0.107±0.109)   0.090±0.062(0.035±0.019)
  小肠   33.890±4.651(4.095±0.762)   41.389±7.985(5.371±1.225)   45.175±2.447(6.357±0.498)   30.633±19.329(4.459±2.611)
阑尾   0.294±0.074(0.060±0.012)   0.198±0.166(0.049±0.044)   0.078±0.061(0.016±0.010)   18.242±20.821(4.248±4.880)
  结肠   0.181±0.171(0.289±0.072)   0.048±0.014(0.115±0.048)   0.019±0.014(0.046±0.010)   0.053±0.066(0.112±0.135)
  直肠(炎症)   0.410±0.157(0.468±0.127)   0.413±0.402(0.217±0.152)   0.132±0.091(0.114±0.075)   0.032±0.011(0.028±0.008)
  肾上腺   0.015±0.005(0.376±0.119)   0.005±0.002(0.130±0.062)   0.004±0.000(0.094±0.008)   0.001±0.000(0.023±0.008)
  卵巢   0.042±0.012(0.529±0.150)   0.025±0.011(0.311±0.136)   0.006±0.002(0.080±0.021)   0.002±0.000(0.022±0.003)
  下肢骨   0.377±0.054(0.289±0.033)   0.219±0.054(0.174±0.054)   0.120±0.008(0.097±0.010)   0.078±0.023(0.061±0.017)
  皮肤   0.773±0.276(0.268±0.050)   0.328±0.237(0.131±0.048)   0.112±0.048(0.044±0.007)   0.025±0.011(0.009±0.002)
  肌肉   0.757±0.118(0.106±0.014)   0.311±0.160(0.047±0.026)   0.101±0.012(0.013±0.001)   0.022±0.008(0.03±0.001)
  尿   9.976±3.195   23.955±2.467   35.537±1.650   41.509±2.049
  粪便   0.104±0.139   0.032±0.034   0.024±0.023   0.215±0.305
  尸体   22.375±2.165(0.192±0.029)   10.953±4.550(0.101±0.058)   4.338±0.643(0.037±0.005)   1.353±0.323(0.011±0.002)
  直肠(炎症)/血液 0.75±0.13 1.27±1.04 1.88±1.44 2.74±1.72
  直肠(炎症)/肌肉 4.41±0.97 5.54±2.99 13.16±11.07 16.50±11.08
表13.Tc-99m-肽12在大鼠IBD模型中的生物分布
上行：％ID/器官；下行：％ID/g(n＝3，平均值±标准误差)
  器官     5min.     30min.     60min.     180min.
  血液     10.140±9.197(2.016±0.074)     1.122±0.291(0.179±0.036)     0.954±0.447(0.170±0.068)   0.308±0.193(0.069±0.055)
心脏     0.111±0.045(0.269±0.082)     0.027±0.001(0.061±0.014)     0.020±0.011(0.049±0.026)   0.007±0.002(0.018±0.009)
  肺     0.280±0.049(0.382±0.067)     0.086±0.017(0.107±0.032)     0.071±0.032(0.096±0.049)   0.038±0.029(0.054±0.050)
肝     21.311±7.503(3.326±0.361)     2.012±0.397(0.322±0.075)     0.972±0.399(0.162±0.074)   0.345±0.235(0.059±0.042)
脾     0.072±0.020(0.189±0.029)     0.024±0.006(0.064±0.019)     0.018±0.006(0.053±0.018)   0.009±0.004(0.031±0.024)
  肾     1.440±0.326(1.369±0.302)     1.077±0.192(0.977±0.383)     1.486±1.002(1.377±0.996)   0.598±0.056(0.506±0.065)
胃     2.461±2.801(0.631±0.414)     3.446±4.540(1.050±1.309)     1.990±0.778(0.659±0.263)   3.500±4.830(1.245±1.129)
  小肠     43.689±4.685(6.289±0.568)     82.028±4.176(12.654±1.252)     80.691±9.250(13.503±2.964)   82.578±1.469(13.121±2.433)
  阑尾     0.447±0.366(0.061±0.008)     0.116±0.019(0.030±0.008)     0.203±0.070(0.061±0.025)   2.703±3.959(0.783±1.253)
  结肠     0.194±0.152(0.423±0.333)     0.021±0.001(0.061±0.009)     0.046±0.032(0.103±0.077)   0.026±0.024(0.057±0.054)
  直肠(炎症)     1.149±1.318(0.486±0.319)     0.117±0.060(0.124±0.044)     0.637±0.947(0.398±0.557)   0.203±0.328(0.098±0.142)
  肾上腺     0.018±0.002(0.441±0.044)     0.004±0.002(0.091±0.047)     0.017±0.024(0.420±0.610)   0.002±0.003(0.059±0.072)
  卵巢     0.052±0.027(0.646±0.334)     0.011±0.000(0.137±0.004)     0.015±0.016(0.182±0.197)   0.004±0.004(0.052±0.050)
  下肢骨     0.225±0.047(0.211±0.047)     0.066±0.032(0.078±0.026)     0.066±0.032(0.062±0.027)   0.28±0.020(0.028±0.021)
  皮肤     0.378±0.114(0.220±0.017)     0.191±0.149(0.096±0.037)     0.130±0.048(0.103±0.076)   0.052±0.044(0.030±0.029)
  肌肉     0.537±0.180(0.104±0.008)     0.174±0.073(0.030±0.011)     0.120±0.045(0.026±0.015)   0.052±0.044(0.011±0.010)
  尿     0.681±0.234     3.690±0.886     6.171±0.589   7.135±2.769
  粪便     0.656±1.023     0.070±0.023     0.356±0.490   0.331±0.325
  尸体     16.159±2.511(0.197±0.056)     5.702±1.146(0.062±0.020)     6.036±4.684(0.070±0.056)   2.081±1.769(0.027±0.029)
  直肠(炎症)/血液     0.43±0.16     0.72±0.33     1.89±2.39   1.00±0.89
  直肠(炎症)/肌肉     4.66±3.13     4.21±1.15     11.10±12.33   6.22±4.61
实施例7
Tc-99m标记的肽3和肽6在人血液中的分布
(1)方法
为确认本发明的肽在人体内的临床效果，使用人血液研究了本发明的两种肽对白细胞的亲合力。将实施例2中Tc-99m标记的肽3和肽6分离成未标记的肽和标记的肽，按与实施例2相同的HPLC条件，通过反相HPLC进行纯化。按下列条件进行梯度洗脱：20％→80％(0.1％TFA乙腈/0.1％TFA水)；0→20分钟(纯化后肽6的放射活性为111MBq/ml)。
制备传统已知的肽Tc-99m-肽11和Tc-99m-肽12。肽11和肽12各溶于二甲基甲酰胺中，制备浓度为0.1mg/500μl的溶液。50μl的SnCl2/10mM盐酸(5mg/10ml)溶液加入酒石酸/PBS溶液(5mg/200μl)中，向其中加入肽溶液。其后立即注入0.25μl99mTcO4 -溶液(2738MBq/ml)，摇动数秒，于120℃反应10分钟进行标记。最终浓度约855.6MBq/125mg/ml。使用制备型HPLC纯化和测定放射化学纯度。在与实施例2相同的条件下进行分析，即梯度：20％→50％(0.1％TFA乙腈/0.1％TFA水；0→20分钟。纯化后放射活性浓度为287-311MBq/ml。
随后，根据实施例3描述方法制备Percoll密度梯度溶液。
从40岁或低于40岁的成年志愿者中采集20-30毫升血液。向其中加入Tc-99m标记的肽各30μl(111MBq/ml，1.8×10-11mol/mlTc-肽)，孵育30分钟。小心地将2-3ml血样在制备好的Percoll密度梯度溶液中分层。经2000rpm(800×g)离心15分钟后，冰冻试管，用切刀切下每一级分，然后使用Auto-Wellγ粒子计数器测定每一级分的放射活性，以确定Tc-99m标记的肽在血液组分中的放射活性分布。
(2)结果
根据人血液学参数中，白细胞计数4100-6100个细胞/μl，参考文献中认为受体FPR数目100,000-120,000/细胞，计算人血液中受体FPR的估计数目为0.68-1.2×10-12mol/ml，人血液中肽/受体的比率为0.03-0.01。显示4种Tc-99m-肽和阴性对照(Tc-99m-葡庚糖酸)在人血液中分布的结果如图18所示。显示粒性白细胞级分放射活性占总白细胞数的放射活性的百分比，以及淋巴细胞和单核细胞级分放射活性占总白细胞数的放射活性的百分比的结果如表14所示。在Tc-99m-肽3、Tc-99m-肽11、Tc-99m-肽12中，n为1，在Tc-99m-肽6中，n为3。
孵育30分钟后，Tc-99m-肽3在粒性白细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的21.91％，在淋巴细胞和单核细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的39.98％。粒性白细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的35.41％，淋巴细胞和单核细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的64.59％。此结果表明，在健康人血液中，本发明的Tc-99m-肽3在淋巴细胞和单核细胞中的分布远远超过传统已知的Tc-99m-肽11和Tc-99m-肽12。
孵育30分钟后，Tc-99m-肽6在粒性白细胞级分中的分布为全血放射活性的29.45％，在淋巴细胞和单核细胞级分中的分布为全血放射活性的6.59％。粒性白细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的81.94±8.67％，淋巴细胞和单核细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的18.07±8.67％。此结果表明，在健康人血液中，本发明的Tc-99m-肽6在淋巴细胞和单核细胞中的分布远远超过传统已知的Tc-99m-肽11。
孵育30分钟后，Tc-99m-葡庚糖酸在粒性白细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的1.11％，在淋巴细胞与单核细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的2.52％。在血浆级分中，其分布为95.39％。由于阴性对照不能结合白细胞，没有计算其粒性白细胞级分占白细胞总数百分比，以及淋巴细胞和单核细胞级分占白细胞总数百分比。
在人血中，孵育30分钟后，对照Tc-99m-肽11在粒性白细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的58.70％，Tc-99m-肽11在淋巴细胞和单核细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的8.02％。粒性白细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的87.98％，淋巴细胞和单核细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的12.03％。
在人血液中孵育30分钟后，对照Tc-99m-肽12在粒性白细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的25.09％，Tc-99m-肽12在淋巴细胞和单核细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的13.77％。粒性白细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的64.57％，淋巴细胞和单核细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的35.43％。
以上结果表明，本发明的肽与阴性对照Tc-99m-葡庚糖酸和传统已知的Tc-99m-肽11或Tc-99m-肽12相比，与淋巴细胞和单核细胞的结合比粒性白细胞更强。鉴于实施例4和实施例6的结果，同时证明本发明的肽对于淋巴细胞和单核细胞浸润的慢性炎症有效。
表14.Tc-99m标记的肽与人白细胞的结合率
      (n＝3，平均值±标准误差)
  标记的复合物   白细胞结合率(％)
  粒性白细胞   淋巴细胞和单核细胞
  Tc-99m-肽3   35.41(n＝1)   64.59(n＝1)
  Tc-99m-肽6   81.94±8.67   18.07±8.67
  Tc-99m-肽11   87.98(n＝1)   12.03(n＝2)
  Tc-99m-肽12   64.57(n＝1)   35.43(n＝1)
实施例8
Tc-99m标记的肽3和肽6在大鼠血液中的分布
(1)方法
炎症模型的制备：
按照Anthony等的方法制备溃疡性结肠炎的大鼠模型(Anthony等Int.J.Exp.Path.，76，215-224，1995)。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)360mg溶于4ml超纯水中，向其中加入3.2ml乙醇制备50.0mg/ml 46％的乙醇/生理盐溶液。体重164-184g，雄性，7周龄，24小时前禁食，乙醚麻醉的SD大鼠(Sprague Dawley，无特定病原体)，将管子经肛门插入肠约7-8cm深，注入0.1ml空气。接着注入0.2ml TNBS/46％乙醇/生理盐水溶液，按摩并倾侧体位2分钟。这些步骤重复3天。最终给药4天后，大鼠供给实验使用，采集其血液。2ml采集的血液于37℃温水浴中温育5分钟。向每份样品中加入经HPLC纯化的Tc-99m-肽3和Tc-99m-肽6(111MBq/ml，Tc-99-m肽1.8×10-11mol/ml)各3μl，孵育30分钟。小心地将血样在预先制备的Percoll密度梯度溶液中分层。分层的样品在2000rpm(800×g)离心15分钟。离心后冰冻试管，用切刀切下每一级分，然后使用Auto-Wellγ粒子计数器测定每一级分的放射活性，以确定Tc-99m-肽3和Tc-99m-肽6在每种血液组分中的放射活性分布。
(2)结果
根据雌性大鼠的血液学参数，白细胞计数6600-12600细胞/μl，参考文献报导的受体FPR数目为100,000-120,000/细胞，计算大鼠血液中受体FPR的估计数目为1.1-2.5×10-12mol/ml，大鼠肽/受体的比率为0.02-0.05。显示每种血液组分放射活性在全血放射活性中所占百分比的结果如图19所示。显示粒性白细胞级分放射活性占白细胞总数放射活性的百分比，以及淋巴细胞和单核细胞级分放射活性占白细胞总数的放射活性的百分比的结果如表15所示。
孵育30分钟后，由TNBS所致患溃疡性结肠炎的大鼠血液中Tc-99m-肽3在粒性白细胞级分的放射活性分布为全血放射活性的7.82％，Tc-99m-肽3在淋巴细胞和单核细胞级分的放射活性分布为全血放射活性的10.00％。粒性白细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的43.69％，淋巴细胞和单核细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的56.31％。孵育30分钟后，Tc-99m-肽6在粒性白细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的18.34％，Tc-99m-肽6在淋巴细胞和单核细胞级分中的放射活性分布为全血放射活性的6.57％。粒性白细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的74.08％，淋巴细胞和单核细胞级分放射活性为全体白细胞放射活性的25.92％。
根据这些结果，很明显在溃疡性结肠炎模型大鼠血液中，作为本发明一部分的Tc-99m-肽3和Tc-99m-肽6，大量分布在淋巴细胞和单核细胞级分内。
以上可证明本发明的肽，对诊断经常有淋巴细胞和单核细胞浸润的慢性炎症有效。
表15.Tc-99m标记的肽与大鼠白细胞的结合率
(对总白细胞的结合率(％)n＝2，平均值±标准差
  标记的化合物   与白细胞的结合率(％)
  粒性白细胞   淋巴细胞和单核细胞
  Tc-99m-肽3   43.69±2.74   56.31±2.74
  Tc-99m-肽6   74.08±8.37   25.92±8.37
实施例9
Tc-99m标记的化合物肽3和肽6在大鼠溃疡性结肠炎模型中的成 像，及其对慢性期炎症的有效性
(1)方法
炎症模型的制备：
按照Anthony等的方法制备溃疡性结肠炎的大鼠模型(Anthony等Int.J.Exp.Path.，76，215-224，1995)。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)360mg溶于4ml超纯水中，向其中加入3.2ml乙醇制备50.0mg/ml 46％的乙醇/生理盐溶液。体重164-184g，雌性，7周龄，24小时前禁食，乙醚麻醉的SD大鼠(Sprague Dawley，无特定病原体的)，将管子经肛门插入肠约7-8cm深，注入0.1ml空气。接着注入0.2ml TNBS/46％乙醇/生理盐水溶液，按摩并倾侧其体位2分钟。这些步骤重复3天。最后给药4天后，大鼠供给实验使用。实施例2中获得的Tc-99m-肽3或Tc-99m-肽6，每只大鼠约37MBq放射活性，经尾静脉给药。5分钟、30分钟、60分钟和120分钟后，用γ射线照相仪记录影像。作为对照，用于诊断人溃疡性结肠炎的Tc-99m标记的白细胞，按照Roca等的方法制备(M.Roca等。Eur.J.Nucl.Med.25，797-799，1998)，并经大鼠尾静脉给予每只大鼠约37MBq的放射活性，5分钟、30分钟、60分钟和120分钟以后，用γ射线照相仪记录图像。Tc-99m标记的白细胞制备成含所有种类的白细胞，如粒性白细胞、淋巴细胞和单核细胞。成像结束后，即给药130分钟后，将大鼠从腹主动脉放血，摘除各个器官。测量摘除器官的重量和放射活性，以计算每克组织放射活性(％ID/g)。再使用算出的数值，确定[炎症]/[肌肉]的比值([A]/[M]的比值)、[炎症]/[血液]的比值([A]/[BL]的比值)、[炎症]/[骨]的比值([A]/[BO]的比值)、[炎症]/[阑尾]的比值([A]/[AP]的比值)、[炎症]/[结肠]的比值([A]/[C]的比值)及[炎症]/[直肠]的比值([A]/[R]的比值)。
(2)结果
所得结果的示意图如图20，图21和图22所示。目标区域定位于图像中，1像素目标区域的计数与整体计数的比率(％注射剂量(ID)/像素)如表16所示。根据上述比值确定的，表明[炎症]/[腹背部]的比值([A]/[BG]的比值)如表17所示。此外，从摘除物的结果获得的炎症％ID/g值、[A]/[M]的比值、[A]/[BL]的比值、[A]/[BO]的比值、[A]/[AP]的比值、[A]/[C]的比值和[A]/[R]的比值如表18和图23所示。结果，在对照Tc-99m标记的白细胞中，30分钟后的％ID/像素为0.11±0.025(平均数±标准偏差)(n＝5)，[A]/[BG]的比值为3.21±1.96(n＝5)。另外，给药130分钟后，放血和摘除得到的每克炎症组织的放射活性(％ID/g)为0.71±0.33，[A]/[BO]的比值为2.08±1.37，[A]/[BL]的比值为0.25±0.17。这些结果表明其在炎症中的分布比在血液中多。
与之相反，本发明的Tc-99m-肽3，30分钟后的给药剂量％/像素的值为0.043±0.015(n＝5)，[A]/[BG]的比值为2.23±0.77(n＝5)。另外，给药130分钟后放血和摘除得到的每克炎症组织的放射活性(％ID/g)为0.13±0.12，[A]/BO]的比值为3.40±2.78，[A]/[BL]的比值为2.33±2.22。这些结果表明其在炎症中的放射活性分布比在血液中多。而且，在Tc-99m肽6中，30分钟后的％ID/像素为0.093±0.048(n＝5)，[A]/[BG]的比值为2.15±0.53(n＝5)。另外，给药130分钟后，放血和摘除得到的每克炎症组织的放射活性(％ID/g)为0.55±0.51。[A]/[BO]的比值为4.44±2.74，[A]/[BL]的比值为2.88±1.61。这些结果显示与肽3一样，其在炎症中的放射活性分布比在血液中多。以上结果可表明，本发明Tc-99m标记的肽，对于描绘血流量大、易受血液影响的器官，如肝脏、脾脏、心脏、肾脏、脑和骨中的炎症具有优越性。更具体而言，在[A]/[M]比值、[A]/[BL]比值、[A]/[BO]比值、[A/[AP]比值、[A]/[C]比值和[A]/[R]比值中，肽6的数值优于对照Tc-99m标记的白细胞，结果，可证明本发明的肽对于描绘慢性炎症，溃疡性结肠炎是极好的。
表16.有或没有FMLP抑制时，Tc-99m标记的肽在大鼠结肠炎模型炎症中的累积
           (％ID/像素)(n＝5，平均值±标准误差)
  给药后经过的时间
  5min.   30min.   1hr   2hrs
  Tc-99m-肽3   0.057±0.011   0.043±0.015   0.035±0.014   0.031±0.016
  Tc-99m-肽6   0.165±0.066   0.093±0.048   0.071±0.050   0.069±0.055
  Tc-99m-白细胞   0.120±0.032   0.111±0.025   0.102±0.031   0.111±0.043
表17.有或没有FMLP抑制时，Tc-99m标记的肽和Tc-99m-白细胞在大鼠溃 疡性结肠炎模型中  炎症/腹背部的比值(n＝5，平均值±标准误差)
  给药后经过的时间
  5min.   30min.   1hr   2hrs
  Tc-99m-肽3   1.84±0.41   2.23±0.77   3.67±1.68   5.87±3.20
  Tc-99m-肽6   2.64±0.42   2.15±0.53   1.90±0.33   2.73±0.52
  Tc-99m-白细胞   3.23±1.50   3.21±1.96   3.23±1.73   3.71±2.17
表18.Tc-99m标记的肽和Tc-99m-白细胞在大鼠溃疡性结肠炎模型摘除物中的分析结果
                  (n＝5，平均值±标准误差)
  炎症/器官的比值   Tc-99m-肽3   Tc-99m-肽6   Tc-99m-白细胞
  炎症/肌肉的比值   10.37±9.54   15.66±11.17   12.12±5.97
  炎症/血液的比值   2.33±2.22   2.88±1.61   0.25±0.17
  炎症/骨的比值   3.40±2.78   4.44±2.74   2.08±1.37
  炎症/阑尾的比值   8.75±8.09   13.49±7.75   11.99±4.18
  炎症/结肠的比值   2.10±0.83   3.53±2.06   3.03±2.03
  炎症/直肠的比值   1.68±0.87   2.79±1.99   2.73±1.50
  炎症(％ID/g)   0.13±0.12   0.55±0.51   0.71±0.33
实施例10
Tc-99m-肽6和Tc-99m-肽14在大鼠溃疡性结肠炎模型中的放 射自显影，及其对慢性炎症上的有效性
(1)方法
按照Anthony等的方法制备溃疡性结肠炎的大鼠模型(Anthony等Int.J.Exp.Path.，76，215-224，1995)。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)360mg溶于4ml超纯水中，向其中加入3.2ml乙醇制备50.0mg/ml 46％的乙醇/生理盐溶液。体重164-184g，雌性，7周龄，雄性，24小时前禁食，乙醚麻醉的SD大鼠(SpragueDawley，无特定病原体)，将管子经肛门插入肠约7-8cm深，注入0.1ml空气。接着注入0.2ml TNBS/46％乙醇/生理盐水溶液，按摩并并倾侧体位2分钟。这些步骤重复3天。最后给药4天后，大鼠供给实验使用。实施例2中获得的Tc-99m-肽6或Tc-99m-肽14，每只大鼠约74MBq放射活性，经尾静脉给药，120分钟后放血并处死大鼠。立即摘除大肠并除去肠内容物后，经肉眼观测判断为炎症区域的部位，包埋于介质中以制备冰冻切片。其后立即将包埋样品与载玻片一起浸入液氮中数十秒，冰冻含有大肠切除部位的介质。使样品在冰箱中于-20℃直立数十秒后，使用恒冷切片机制备冰冻切片。制备好切片后，将切片与显像底片接触，放射自显影(Fuji Photo Film Co.Ltd.)12小时-19小时。随后，使用图像分析仪BAS 2500(Fuji Photo Film Co.Ltd.)对放射活性分布进行造影。另外，以同样方式制备的冰冻切片，经抗粒性白细胞抗体和抗单核细胞抗体免疫组织化学染色，以确认组织中的粒性白细胞和单核细胞浸润。
(2)结果
所得结果的典型图如图24、图25和图26所示。在放射自显影所得图像上定位目标区域，计算目标区域的每像素计数，并确定[炎症]/[正常组织]的比值([A]/[N]的比值)。结果如图27所示。
在感染大鼠的直肠区，在整个肠道环形面积形成2-4厘米的炎症区，观测了所有大鼠的炎症性区域。作为免疫组织化学染色结果，在炎症性区域观察到显著的粒性白细胞和单核细胞浸润，且观察到粒性白细胞和单核细胞被分配在相应于炎症的区域。
免疫染色显示，与Tc-99m-标记白细胞相似，Tc-99m-肽6和Tc-99m-肽14的放射活性分布，均与粒性白细胞和单核细胞分布一致。比较来自相同切片的对照Tc-99m-标记白细胞、Tc-99m-肽6和Tc-99m-肽14的[A]/[N]的比值，Tc-99m-肽6和Tc-99m-肽14显示高于Tc-99m-标记白细胞的[A]/[N]比值。结果同时证实本发明的肽在慢性炎症如溃疡性结肠炎中具有优势。
实施例11
结合重组人受体的肽3、肽4、肽6、肽8、肽9、肽16、肽17和 肽18的活性抑制试验
(1)方法
使用来源于CHO细胞的重组受体FPR(6.24pmol/ml，50mM Tris-HCl，pH7.4，10％甘油，1％牛血清白蛋白，BioSignal Packard Inc.，Amersham Bioscience s)和[3H]-FMLP(fMLF，9.25MBq/2.88-6.25nmol，Dailchi Pure Chemicals Co.Ltd.)进行实验。向一定量的受体FPR(0.05nM，200μl/孔)中加入各肽，浓度为10-4M-10-14M后，加入一定量的[3H]-FMLP(0.3nM，25μl/孔)。反应完成后，使用GF/C过滤器分离未结合受体FPR的[3H]-FMLP与结合受体FPR的[3H]-FMLP。通过测定结合受体FPR的[3H]-FMLP放射活性，确定结合受体FPR的[3H]-FMLP的数量。使用分析软件″Xlfit ver3.0.3(CTC Laboratory Systems K.K.)″确定抑制50％[3H]-FMLP(IC50)结合的各肽的浓度，再由[3H]-FMLP的Kd值确定抑制常数(Ki)。重复试验三次，每次试验重复分析三次以确定平均值。
(2)结果
结果如图28所示。计算出的IC50值和Ki值如表19所示。计算出对照FMLP的Ki值为(2.33±0.45)×10e-10M。每种肽的Ki值计算如下：肽3：Ki＝(6.50±1.84)×10e-9M；  肽4：Ki＝(8.36±3.74)×10e-10M；肽6：Ki＝(2.83±1.07)×10e-10M；肽8：Ki＝(2.33±0.91)×10e-9M；和肽9：Ki＝(1.28±0.69)×10e-10M。肽16，其甲酰基由乙酰基代替，肽17，其甲酰基由氨基甲酰基代替，肽18，其甲酰基由甲基代替，Ki值分别为(3.74±3.53)×10e-6M，(4.24±3.60)×10e-7M和(3.83±1.12)×10e-5M。结果可证明本发明的肽与受体FPR具有亲合性，且可用于诊断表达该受体FPR的白细胞所介导的炎症。
表19.各肽的50％抑制浓度(IC 50 )和抑制常数(Ki)
        (n＝9，平均值±标准误差)
  IC50M)   Ki(M)
  FMLP   (5.67±1.10)×10e-10   (2.33±0.45)×10e-10
  肽3   (1.58±0.45)×10e-8   (6.50±1.84)×10e-9
  肽4   (2.03±0.91)×10e-9   (8.36±3.74)×10e-10
  肽6   (6.87±2.59)×10e-10   (2.83±1.07)×10e-10
  肽8   (5.65±2.21)×10e-9   (2.33±0.91)×10e-9
  肽9   (3.10±1.69)×10e-10   (1.28±0.69)×10e-10
  肽12   (7.40±5.03)×10e-11   (3.05±2.07)×10e-11
  肽16   (9.08±8.58)×10e-6   (3.74±3.53)×10e-6
  肽17   (1.03±0.88)×10e-6   (4.24±3.60)×10e-7
  肽18   (9.29±2.71)×10e-5   (3.83±1.12)×10e-5
实施例12
在兔感染性疾病模型中Tc-99m-肽6的抑制及结合白细胞的成像确 认
(1)方法
活菌计数大约108金黄葡萄球菌悬浮于1ml生理盐水中。100μl悬液经肌肉注射入体重约2kg的新西兰白(NZW)品系兔的右侧腓肠内。24小时后，呈现明显炎症的兔模型用戊巴比妥麻醉。实施例2得到的Tc-99m-肽6，耳静脉给药，给予约74MBq的放射活性。5分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、和5小时后，通过使用γ射线照相仪记录图像。通过溶解1毫克的FMLP于5％DMSO/生理盐中制备FMLP溶液，其大约相当于估计的受体最大量0.1nmol/kg的10,000倍。在为确认FMLP抑制而建立的FMLP预给药组中，耳静脉给予FMLP溶液，5分钟后给予Tc-99m-肽6。与未给予FMLP组相似，在5分钟、1小时、2小时、3小时、4小时和5小时后，使用γ射线照相仪记录图像。
(2)结果
所得结果的典型图如图29和图30所示。在图像上定位目标区域，1000像素目标区域的计数与整体计数的比率(％ID/千像素)如表20所示。根据上述比值确定的、表明[炎症]/[正常肌肉]的比值([A]/[M]比值)如表21所示。结果，在没有FMLP抑制的Tc-99m-肽6中，给药2小时后炎症区域的累积为1.77±0.25％ID/千像素(平均数±标准误差)(n＝3)，给药5小时后增加到2.62±0.25％ID/千像素。[A]/[M]的比值从给药2小时后的12.78±6.14增加到给药5小时后的21.39±5.39。与之相反，在用FMLP抑制的Tc-99m-肽6中，给药2小时后，[A]/[M]的比值为3.93±0.60，低于没有FMLP抑制的情况，给药5小时后[A]/[M]的比值增加至9.05±3.10。然而，炎症区域的累积从给药2小时后的0.41±0.10％ID/千像素减少到给药5小时后的0.30±0.04％ID/千像素。
这些结果表明，证明本发明的肽6，可通过与存在于白细胞中的受体FPR结合来描绘炎症区域。认为本发明的肽的累积，可指示有白细胞浸润的炎症的发生。
表 20.有或没有FMLP抑制时，Tc-99m-肽6在兔感染性疾病模型炎症中的累积
             (％ID/千像素)(n＝3，平均值±标准误差)
  给药后经过的时间
  5min.   1hr   2hrs   3hrs   4hrs   5hrs
  没有FMLP抑制   1.74±0.22   1.59±0.32   1.77±0.25   2.01±0.29   2.32±0.56   2.62±0.55
  有FMLP抑制   2.01±0.43   0.75±0.18   0.41±0.10   0.31±0.06   0.30±0.03   0.30±0.04
表21.有或没有FMLP抑制时，Tc-99m-肽6在兔感染性疾病模型中炎症/肌肉的 比值
               (n＝3，平均值±标准误差)
  给药后经过的时间
  5min.   1hr   2hrs   3hrs   4hrs   5hrs
  没有FMLP抑制   2.25±0.46   6.18±2.99   12.78±6.14   14.53±5.07   17.87±5.46   21.39±5.39
  有FMLP抑制   1.81±0.19   2.62±0.43   3.93±0.60   6.42±1.03   8.58±2.60   9.05±3.10
产业实用性
根据本发明可提供，在体内和体外均呈现与所有种类的白细胞，即嗜中性白细胞、单核细胞和淋巴细胞特异性结合活性，可用放射性金属或顺磁性金属标记的化合物，以及含有该标记化合物作为有效成份，可用于SPECT成像诊断、PET成像诊断、MRI成像诊断的药用组合物，而且通过对伴有个体免疫反应的剧烈白细胞浸润部位的成像可进行成像诊断。
                    序列表
<110>Nihon Medi-Physics Corporation Limited
<120>白细胞结合化合物和含有标记的白细胞结合化合物的药用组合物
<130>W1229-00
<160>13
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>甲酰化
<222>1
<200>
<221>酰胺化
<222>6
<223>白细胞结合肽
<400>1
Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Cys Gly Asn
  1               5                  10
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>甲酰化
<222>1
<200>
<221>酰胺化
<222>6
<223>白细胞结合肽
<400>2
Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Cys Asp Asp
 1                5                  10
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>甲酰化
<222>1
<200>
<221>酰胺化
<222>6
<223>白细胞结合肽
<400>3
Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Cys Gly Asp
  1               5                  10
<210>4
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>甲酰化
<222>1
<200>
<221>酰胺化
<222>6
<223>白细胞结合肽
<400>4
Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp Asp
  1               5                  10
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>甲酰化
<222>1
<200>
<221>酰胺化
<222>6
<200>
<221>阻断的
<222>7
<223>白细胞结合肽
<400>5
Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser
  1               5
<210>6
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>甲酰化
<222>1
<200>
<221>酰胺化
<222>6
<220>
<221>阻断的
<222>11
<223>白细胞结合肽
<400>6
Nle Leu Phe Lys Ser Ser Asn Arg Cys Asp Asp
  1               5                  10
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>甲酰化
<222>1
<200>
<221>酰胺化
<222>6
<220>
<221>阻断的
<222>8
<223>白细胞结合肽
<400>7
Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg
  1               5
<210>8
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>甲酰化
<222>1
<200>
<221>酰胺化
<222>6
<220>
<221>阻断的
<222>7
<223>白细胞结合肽
<400>8
Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser
  1               5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>甲酰化
<222>1
<200>
<221>酰胺化
<222>6
<200>
<221>阻断的
<222>9
<223>白细胞结合肽
<400>9
Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp
  1               5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>甲酰化
<222>1
<200>
<221>酰胺化
<222>6
<220>
<221>阻断的
<222>9
<223>白细胞结合肽
<400>10
Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Ser Asn
  1               5
<210>11
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>1
<200>
<221>酰胺化
<222>6
<223>白细胞结合肽
<400>11
Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp Asp
  1               5                  10
<210>12
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>阻断的
<222>1
<200>
<221>酰胺化
<222>6
<223>白细胞结合肽
<400>12
Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp Asp
  1               5                  10
<210>13
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>甲基化
<222>1
<200>
<221>酰胺化
<222>6
<223>白细胞结合肽
<400>13
Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp Asp
  1               5                  10

Claims (13)

1.结合白细胞的化合物，以通式(1)代表：
Z-Y-Leu-Phe-(X)n-Lys(NH2)m-ε(-R-(T)1-U)           (1)
(其中，在通式(1)中，Z代表氨基基团的保护基团；Y代表Met或Nle；在(X)n中，X代表由一个或多个氨基酸和/或合成有机化合物组成的间隔物，n代表1或0；在(NH2)m中，NH2代表酰胺基，作为Lys α位羧基的保护基团，m代表1或0；在ε(-R-(T)1-U)中，R代表通过酰胺键与Lys的ε-氨基结合的Ser或Thr，T代表由一个或多个氨基酸和/或合成有机化合物组成的间隔物，l代表1或0，U代表能用金属标记的基团；条件是所述的X和T可能彼此相同或不同。)
2.根据权利要求1的结合白细胞的化合物，其中通式(1)中的U是由-Cys-A1-A2(A1和A2分别为除Cys和Pro以外的氨基酸)代表的肽组成，能用金属标记的基团。
3.根据权利要求1的结合白细胞的化合物，其中通式(1)中的U为选自能用金属标记的，有8-20个碳原子的含氮环状化合物、有8-20个碳原子的含氮环状羧酸化合物、有8-20个碳原子的含氮环状羧酸化合物的衍生物和有4-10个碳原子的亚烷基胺羧酸的基团。
4.根据权利要求1或2的结合白细胞的化合物，其中以通式(1)代表的所述化合物选自：
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Gly-Asn)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Asp-Asp)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Gly-Asp)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四乙酸)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Ser-Asn-D-Arg-Cys-Asp-Asp)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-二亚乙基三胺五乙酸)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-1，4，8，11-四氮杂环十四烷丁酸)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-1，4，8，11-四氮杂环十四烷丁酸)；
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Ser-Asn-1，4，8，11-四氮杂环十四烷丁酸)；
乙酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；
氨甲酰基-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；及
甲基-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)。
5.一种药用组合物，其含有用放射性金属或顺磁性金属标记的权利要求1-4的任一项所述的结合白细胞化合物作为有效成份。
6.根据权利要求5的药用组合物，其中该放射性金属是Tc-99m，In-111或Ga-67。
7.根据权利要求6的药用组合物，其中所述组合物用于SPECT成像诊断，用于伴有个体免疫反应的剧烈白细胞浸润部位的成像。
8.根据权利要求5的药用组合物，其中放射性金属为Cu-64或Ga-68。
9.根据权利要求8的药用组合物，其中所述组合物用于PET成像诊断，用于伴有个体免疫反应的剧烈白细胞浸润部位的成像。
10.根据权利要求5的药用组合物，其中顺磁性金属为Gd、Fe、Mn或Cu。
11.根据权利要求10的药用组合物，其中所述组合物用于MRI成像诊断，用于伴有个体免疫反应的剧烈白细胞浸润部位的成像。
12.根据权利要求5的药用组合物，其中放射性金属为Y-90、Sn-117m、Sm-153、Re-186或Re-188。
13.根据权利要求12的药用组合物，其中组合物用于放射治疗。
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