KR100900178B1

KR100900178B1 - 백혈구 결합성 화합물 및 그 표지 화합물을 유효 성분으로하는 의약 조성물

Info

Publication number: KR100900178B1
Application number: KR1020057005128A
Authority: KR
Inventors: 이쿠야 세키; 다카요시 가와구치; 요시후미 시라카미
Original assignee: 니혼 메디피직스 가부시키가이샤
Priority date: 2002-09-27
Filing date: 2003-09-26
Publication date: 2009-06-02
Also published as: NO20051948L; NZ538869A; CN1684973A; DE60318466T2; CA2498826A1; JPWO2004029080A1; AU2003266655A1; US20060057064A1; IL167518A; KR20050053691A; DK1548027T3; ES2297268T3; TW200418880A; AU2003266655B2; ATE382632T1; JP4279781B2; DE60318466D1; EP1548027B1; WO2004029080A1; EP1548027A4

Abstract

백혈구의 포르밀 펩티드 수용체 (FPR) 와의 결합부위인 Met 또는 Nle-Leu-Phe-, 전체 백혈구 중의 단구 및 림프구로의 결합률을 향상시키는 Ser 또는 Thr 를 포함하는 결합부분, 방사성 금속 또는 상자성 금속으로 표지 가능한 기, 및 이들을 결합하는 역할을 하는 스페이서를 포함하는 백혈구 결합성 화합물은, 생체 내외에서 모든 백혈구, 즉 호중구, 단구 및 림프구에 대하여 특이적인 결합성을 나타내고, 또한 방사성 금속 또는 상자성 금속으로 표지 가능하다. 상기 특성에 따라서, 상기 화합물은 개체의 면역 반응에 의해 수반되는 백혈구 침윤이 활발한 부위를 이미지화하는 SPECT 화상 진단, PET 화상 진단, MRI 화상 진단 등에 매우 유용하다.

Description

백혈구 결합성 화합물 및 그 표지 화합물을 유효 성분으로 하는 의약 조성물 {COMPOUND BINDING TO LEUKOCYTES AND MEDICINAL COMPOSITION CONTAINING THE COMPOUND IN LABELED STATE AS THE ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은, 개체의 면역 반응을 수반하는 질환을 진단 또는 치료할 때, 이상 부위를 표적화함과 함께 그 활동성 상태를 정확하게 파악하기 위한 백혈구 결합성 화합물과 그 표지 화합물을 유효 성분으로 하는 의약 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 생체 내 및 생체 외 모두에서 백혈구에 대하여 특이적인 결합성을 나타내는 신규 화합물에 관한 것이며, 방사성 금속 또는 상자성 금속에 의해 표지 가능하고, 이것은 포유동물 체내의 감염증, 염증, 암 및 아테롬성 동맥 경화증을 포함하는 병소 부위의 병리학적 이미지화에 유용하다. 또한, 본 발명은 신규 백혈구 결합성 화합물 및 그 표지 화합물을 유효 성분으로 하는, 방사성동위원소 진단, SPECT 화상 진단, PET 화상 진단, MRI 화상 진단 또는 방사성 요법에 유용한 의약 조성물에 관한 것이다.

인간을 포함한 동물은, 그 개체를 둘러싼 환경으로부터 생명유지 활동에 영향을 미칠 수 있는 인자의 작용을 끊임없이 받고 있다. 그 영향을 미치는 인자에는, 대기나 태양광, 음식물과 같은 플러스 작용을 가져오는 것 외에, 미생물의 침습, 유해 화학물질, 열, 방사선 등의 마이너스 작용을 가져오는 인자도 있다. 그 마이너스 작용을 갖는 인자의 영향에 대하여 개체는 생명활동을 유지하기 위해 여러 가지 방어기구를 작용시켜 대처하고 있다.

상기 방어기구는 생물학적으로는 면역이라고 정의되며, 면역에 관한 생물학적 반응을 면역 반응이라 한다. 상기 반응을 야기하는 인자로는, 세균 및 마이코플라즈마 등의 미생물, 바이러스, 생체조직 또는 기관의 이종 이식편, 유해 화학적 화합물, 고온의 열, 과도한 냉각, 고에너지의 핵 방사선 및 전기적 또는 물리적인 조직장애 등이 알려져 있다. 염증 반응을 포함한 면역 반응은 개체의 「자기」및 「비자기」의 인식 결과에서 일어나는 생물학적 반응이고, 발열, 백혈구 활성화 및 이동, 「자기」이외의 모든 인자의 제거반응 등 광의의 방어기구의 작용이다. 염증 반응은 개체에 침윤한 이물의 제거, 침범된 조직의 파괴, 파괴된 조직의 복구라고 하는 면역 반응의 일부 결과에서 일어나는 현상이다.

면역 반응에서의 중요한 인자 중 하나로서 백혈구를 들 수 있다. 조직은 침윤하는 백혈구 종을 특정화하고, 그 정도나 기간을 조절하거나 하는 여러 가지 메디에이터 (mediator) 를 산출하고, 또 혈액을 포함하는 체액 중에 존재하는 메디에이터 및 다른 분자와 결합하여 응답할 수 있는 여러 가지 수용체를 그들 세포막 표면 상에 갖는다. 수용체는 대응하는 메디에이터와 결합함으로써 그 백혈구를 활성화하여 백혈구의 종에 따라 여러 다른 유형의 수용체가 특이적으로 발현된다. 그 결과, 조직에 침윤하는 백혈구의 종은 존재하는 메디에이터에 의해 규정된다.

일반적으로 염증 등의 국부 면역 응답은, 조직을 파괴하는 어떠한 자극을 받은 후, 몇 시간 정도는 보체(補體) 등의 면역성 관련 단백질이 그 자극의 제거에 대처한다. 그 후 보체의 분해물 및/또는 사이토카인 등과 같은 메디에이터가 파괴된 조직으로부터 혈액 등의 체액 내로 방출되고, 주로 호중구로 구성된 과립구가 수용체를 통해 활성화되어, 조직으로의 백혈구 침윤이 메디에이터의 밀도 구배에 따라 개시된다. 이 때의 메디에이터는 일반적으로 주화성 인자라 불린다. 과립구의 조직 침윤은 최초의 자극을 받고 나서 통상 10 여 시간에 피크에 도달한다. 계속해서 주로 단구로 구성된 대식세포에 의한 침윤이 서서히 증가하여, 과립구와 함께, 자극을 일으키는 물질을 제거한다. 사이토카인 등은 상해를 받은 조직 외에, 활성화된 과립구 및 대식세포로부터 방출되어, 항체 생성 등의 면역 반응을 효율적으로 실시할 수 있고, 또는 파괴된 조직을 회복시킬 수 있거나 면역 응답 반응을 제어할 수 있는 T 세포 및 B 세포로 이루어진 림프구에 의한 조직의 침윤이 향상된다. 림프구에 의한 침윤은 최초의 자극을 받고 나서 수 십 시간 내에 피크에 도달한다.

상기 면역 반응은 개체의 생명활동을 유지해 가는 데 있어서 매우 중요한 작용이다. 그러나, 생명활동의 유지를 목적으로 한 경우, 개체에서의 반응의 제어가 불완전하다는 점에서, 때로는 치명적인 마이너스 작용을 불러올 수 있다. 그러한 마이너스 작용의 대표적인 사상이 자가면역 질환이라 불리는 질환의 발증이다. 이 질환군에는, 아토피성 피부염, 류마티스 관절염, 베체트병, 전신성 홍반성 루푸스, 궤양성 대장염, 크론병, 만성 갑상선병 및 그 외에 교원증 등의 질환이 알려져 있다. 감염과 같은 이물의 침습이나 화상 등의 조직파괴와 같은 염증의 경우에는 염증의 원인을 각각 확인할 수 있다. 그러나, 이들 자가면역 질환의 경우 특정된 원인 인자가 없거나 또는 아직 확인되지 않았다. 그러므로, 자가면역 질환은 원인불명인 난치병이다. 그러나, 이들 질환군에 공통적으로 관찰되는 현상은 백혈구에 의한, 특히 림프구, 단구 및 대식세포에 의한 조직의 질환-특이적 침윤이라는 것이 주지의 사실이다.

이와 같이 자가면역 질환이나 만성 상태의 염증 및 감염증에서는, 림프구 및 단구가 백혈구 침윤을 통한 면역 반응에서 보편적으로 중요한 역할을 한다. 따라서, 림프구, 단구 및 호중구에 의한 백혈구 침윤의 유무를 검색 또는 검출하여 그 정도를 정확하게 파악하는 것이, 효과적인 치료를 행하고, 불필요한 투약 등을 피하여 환자의 정신적 고통이나 치료 비용 부담의 경감이 가능하고, 의료보험에서의 비용 경감에 기여할 수 있다.

그래서, 백혈구 침윤의 유무를 검색 또는 검출하여 그 정도를 정확하게 파악하기 위해서는 화상 진단이 유용한 도구이므로, 핵의학 분야에서는 여러 가지 방사성 작용제 및 그 사용이 연구되었다.

갈륨-67 (⁶⁷Ga)시트르산염은 염증 신티그래피 작용제로서 예전부터 사용되고 있다 (예를 들어 Ebright, JR. 등, Arch. Int. Med., 142, 246-254(1982) 참조). 그러나 상기 작용제는 감염증 부위 또는 염증 부위에 특이적이지 않다. 또한, ⁶⁷Ga 의 감마선 방사 에너지가 불충분하여, 통상의 감마 카메라에서 양호한 사진 화상을 수득하기에 적합하지 않다. 또한, 상기 작용제의 주사로부터 이미지화를 완료하기까지 72시간 정도의 대기시간이 필요하다.

다음, 감염 부위를 이미지화하는 핵의학적 방법으로서, 인듐-111 표지 백혈구 (이하 ¹¹¹In-백혈구) (예를 들어 Peters, AM. 등, J. Nucl. Med., 33, 65-67(1992) 참조) 가 사용되었다. Thakur 등은, 생체 외에서의 호중구의 방사성 핵종 표지와 그 이용을 광범위하게 분석하여 논하고 있다 (Thakur 등. Sem. Nucl. Med., 14, 10-17(1984)). 이 방법에서는, 개체의 호중구를 생체 외에서 인듐-111 (이하 In-111) 로 표지하고 그 표지 호중구를 생체 외에서의 동력학적 연구에 사용하였다. 또한 표지 호중구를 개체에서의 급성기의 염증성 병소의 이미지화에 사용할 수 있었다.

그러나, ¹¹¹In-백혈구를 사용할 때 방사성 표지 화합물의 조제가 자기혈액의 무균 취출, 백혈구의 혈액으로부터의 무균 단리, 백혈구의 무균 표지 및 방사성 핵종 표지 백혈구를 환자에게 재주사하는 각 단계를 요하고, 이 조제에는 2시간 이상이라는 상당한 시간이 필요하다. 또한 최적 화상을 얻기 위해서는, 이 표지 백혈구의 재주사로부터 12 내지 48시간의 대기 기간이 필요하다고 생각되고 있다. 그리고, 통상 이미지화 연구에 의해 실시되는 백혈구 세포 1×10⁷개당 200μCi 라는 방사능량에 있어서, In-111 은 방사능 에너지가 강하기 때문에 이를 사용하는 경우 백혈구에 유해하다. 상기 조건하에서 백혈구 종 중 호중구로 주로 구성되는 과립구는 표지에 견딜 수 있지만, 림프구 등은 표지 후 즉시 사멸된다 (Chianelli, M. 등, Nucl. Med. Comm., 18, 437-455(1997)). 그러므로, In-111 표지 백혈구를 사용하여 림프구 및 단구의 동태를 모니터하는 것이 곤란하다. 그리고 또 피폭선량의 견지에서 투여할 수 있는 방사능량의 투여량이 제한된 결과, 화상의 질이 나빠지는 경우가 많다.

다음에 개발된 테크네튬-99m (Tc-99m) 표지 백혈구는 상기 ¹¹¹In-백혈구에서 문제였던 촬상까지의 대기시간을 단축할 수 있고, 또 림프구 및 단구의 동태를 모니터하는 것이 가능하며, 나아가 In-111 보다도 상당히 많은 방사능량을 투여할 수 있다 (예를 들어 Vorne, M. 등, J. Nucl. Med., 30, 1332-1336(1989) 참조). 그러나, Tc-99m 의 표지 안정성이 떨어지기 때문에 비표적인 대사 장기에 대한 축적이 문제가 된다. 또한 긴 조제시간과 혈액 취급의 문제는 ¹¹¹In-백혈구와 다름없다 (Chianelli, M. 등 Nucl. Med. Comm., 18, 437-455(1997)).

단구, 호중구, 과립구 등을 포함한 인간 백혈구에 대하여 결합성을 나타내는 방사성 핵종으로 표지된 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체에 대해서도 개발 시도가 이루어지고 있다. 예를 들어, ^99mTc-표지 항과립구 모노클로날 항체 (예를 들어 Lind, P. 등, J. Nucl. Med., 31, 417∼473(1990) 참조) 및 ¹¹¹In-표지 비특이적 인간 면역 글로불린 (¹¹¹In-HIG, 예를 들어 LaMuraglia, GM. 등, J. Vasc. Surg., 10, 20∼28(1989) 참조) 은 감염에 의해서 일어난 염증의 검출에 대하여 검토하고 있다. 그러나, ¹¹¹In-HIG 는 최적 화상을 수득하기 위해 투여로부터 24∼48시간의 대기 기간을 요하는 점에서 유사한 단점을 갖는다.

또한 ¹¹¹In-HIG 는 염증 부위에 집적하여 부위를 묘출하는 것이 가능하다고 생각되나 (예를 들어 Rubin, R. 등, J. Nucl. Med., 29, 651-656(1988)), 이와 관련해, 그 집적 기전에는 2 가지 가설이 있다. 염증부위로 침윤하는 백혈구 표면 상의 Fc 수용체에 결합함으로써 ¹¹¹In-HIG 가 염증 부위로 집적한다는 생각 (Fischman, A. 등, J. Nucl. Med., 31, 1199-1205(1990)) 과, 백혈구 침윤과는 별도로 알부민 등의 단백질 등과 유사하게 관찰된, 혈관 투과성 항진에 의한 ¹¹¹In-HIG 의 혈관으로부터 국부적 누출에 의한 것이라는 생각 (Morrel, E. 등, J. Nucl. Med., 30, 1538-1545(1989)) 이 있다.

그 밖의 단백질을 사용하여 백혈구에 대해 결합 특성을 나타내는 생체분자에 대한 검토도 지금까지 보고되어 있다.

van der Laken, CJ. 등은 방사성 요오드로 표지한 염증성 사이토카인인 인터루킨 1 을 보고하고 있다 (van der Laken, CJ. 등, European J. Nucl. Med., 22, 1249-1255(1995)).

Signore 등은 방사성 요오드로 표지한 염증성 사이토카인인 인터루킨 2 를 사용한 만성 염증질환에 대한 검토를 보고하고 있다 (Signore, A. 등, Nucl. Med. Comm., 13, 713-722(1992)).

Hay RV. 등은 방사성 요오드로 표지한 염증성 사이토카인인 인터루킨 8 을 사용한 화학적 유도 염증에 대한 검토를 보고하고 있다 (Hay RV. 등, Nucl. Med. Comm., 18, 367-378(1997)).

이들 방사성 표지 화합물은, 감염증 등의 급성 염증 또는 자가면역질환 등의 만성 염증의 이미지를 성공적으로 묘출하였다.

그러나 항체를 포함하는 이러한 단백질은 분자량이 크다는 점에서, 급성 염증에서 볼 수 있는 혈관 투과성 항진에 의한 혈액성분의 혈관외 누출이 문제가 된다 (Roitt. I. 등, Essential Immunology, 8^th edn. Oxford, Blackwell Scientific(1994)). 분자량 2000 정도의 분자는 혈관외로 누출되더라도 그 자리에 길게 머무는 일은 없지만, 알부민 (분자량 약 64000) 등의 단백질은 그 분자의 큰 크기 때문에 저분자량 화합물보다도 머물기 쉬운 경향이 있다. 그러므로, 염증 특이적인 집적인지의 판단이 어렵다 (Morrel, E. 등, J. Nucl. Med., 30, 1538-1545(1989)).

작고 용이하게 합성할 수 있는 분자가, 일상적으로 사용하는 방사성 약제로서 바람직하다. 전혈 중의 백혈구에 대하여 선택적으로 결합하는 것이 가능하고, 환자에게 직접 주사할 수 있으며, 또한 백혈구가 축적되는 부위를 위치 결정함으로써 감염증 및 염증의 병소 부위를 이미지화하는 것이 가능해지는 저분자량의 합성 화합물로서 방사성 핵종 표지 펩티드가 적당하다고 생각된다.

예를 들어, Moyer 들은 헤파린 등의 다황산화 글리칸과 결합하는 혈소판 제 4 인자 (PF-4) 카르복실 말단 서열 유래의 Tc-99m 표지 펩티드 화합물의 집적성에 대하여 보고하고 있다 (Moyer, BR. 등, J. Nucl. Med., 37, 673-679(1996)). 이 화합물 (PF-4 펩티드-헤파린) 은 Tc-99m 킬레이트 아미노산 서열을 포함하는 23 아미노산 잔기의 펩티드 (분자량 약 2600) 에 헤파린 (분자량 약 7,000 내지 25,000) 이 결합한 양식으로 되어 있으며, 하나의 분자로서 그 분자량이 약 1만 내지 3만 정도가 된다.

PF-4 펩티드 결합 헤파린도 단백질과 마찬가지로 분자량이 크다는 점에서 백혈구 침윤 부위에 대한 집적만을 나타내는 제제라고는 할 수 없다. 그러므로, 모세혈관 투과성 항진에 의한 비특이적 집적이 적은 저분자량의 화합물로 이루어진, 순수하게 백혈구 침윤만을 나타내는 제제가 필요로 되어 있었다. 또한 헤파린의 사용은, 헤파린이 갖는 생리적 활성에 의해 그 사용이 제한되는 경우가 있을 수 있다.

Dahlman, T. 등 또는 Ringe, JD. 등은, 헤파린의 부작용으로서 헤파린 투여에 의한 골밀도 저하 및 장기투여에 의한 골다공증의 발증 위험성을 보고하고 있다 (Dahlman, T. 등, Br. J. Obsted Gynaecol., Mar, 97, 3, 221-228(1990); 및 Ringe, JD. 등, Geburtshilfe Frauenheilkd., 52, 7, 426-429(1992)). 그 외에도 항트롬빈 활성, 트롬보플라스틴의 생성억제, 및 혈소판의 응집억제 등 헤파린이 갖는 생리적 작용에 의해 부작용의 우려가 있으며, 또는 출혈 질환이 있는 경우나 출혈할 가능성이 있는 환자, 또는 중증의 간장애ㆍ신장애가 있는 환자의 경우에는 신중한 처치가 필요하다. 상기 언급된 바와 같이, 헤파린은 사용상 주의점이 많다.

그 밖의 방사성 핵종 표지 펩티드에 의한 검토에서는, 포르밀-메티오닐-류실-페닐알라닐(fMLF)-함유 펩티드가 종래 기술에서 보고되어 있다.

Day 등은, ¹²⁵I 표지 주화성 포르밀화 펩티드(fMLF)를 보고하고 있다 (Day, AR. 등, FEBS Lett. 77, 291-294(1977)).

Jiang 등은, ¹²⁵I 표지 주화성 포르밀화 펩티드(fMLF)가 생체 내에서 염증 부위에 집적하는 것을 보고하고 있다 (예를 들어 Jiang, MS. 등, Nuklearmedizin, 21, 110-113(1982)).

Fisherman 등은, DTPA 를 통해 연결된 ¹¹¹In 표지 주화성 포르밀화 펩티드(fMLF)를 개시하고 있다 (일본 특허 제2931097호 명세서 참조).

Verbeke 등은, 메르캅토아세틸-글리실-글리신을 통해 연결된 Tc-99m 표지 주화성 포르밀화 펩티드(fMLF)에 관해 보고하고 있다 (예를 들어 Verbeke, K. 등, Nuclear Medicine & Biology, 27, 769-779(2000) 참조).

Baidoo 등은, 디아미노디티올 화합물을 통해 연결된 Tc-99m 표지 주화성 포르밀화 펩티드(fMLF)에 관해 보고하고 있다 (Baidoo, K. E. 등, Bioconjugate Chemistry, 9, 208-217(1998) 참조).

또한 방사성 핵종 표지 주화성 포르밀화 펩티드(fMLF)의 광친화성을 통해 신체 외에서 백혈구를 방사성 핵종 표지하기 위한 사용에 관한 보고도 있다 (예를 들어 미국 특허 제4,986,979호 명세서 참조).

그리고 또, 방사성 핵종 표지 가능한 주화성 포르밀화 펩티드(fMLF)에 관한 보고도 있다 (예를 들어 미국 특허 제5,792,444호 명세서 참조).

주화성 포르밀화 펩티드(fMLF)는 포르밀화 펩티드 수용체 (이하 수용체 FPR) 를 통하여 백혈구에 결합하고 (Niedel, J. E. 등, Science, 205, 4413, 1412-1414(1979)), 수용체 FPR 를 발현한 백혈구는 호중구 및 단구라고 생각된다 (Lewis, SL. 등, Inflammation, 4, 363-375(1983)).

인간의 혈액 중에 존재하는 백혈구의 정상적인 조성은 약 50% 가 호중구, 10% 가 단구로 되어 있다. 혈액 중의 단구는 호중구의 1/5 이하밖에 없기 때문에 지금까지 알려진 주화성 포르밀화 펩티드의 아날로그체 몇 종이 결합되는 대부분의 백혈구는 중성구이며, 림프구 및 단구에 대한 펩티드 결합은 강하지 않다고 보고되어 있다 (Verbeke, K. 등, Nucl. Med. Biol., 27, 769-779(2000)).

또한 호중구의 침윤이 활발한 균의 감염증 등의 급성 염증에는, 방사성 핵종 표지 포르밀화 펩티드는 집적이 관찰되지만 (Babich, JW. 등, J. Nucl. Med., 34, 2176-2181(1993) 참조), 만성 염증으로 진단된 질환에 대한 상기 펩티드의 집적을 밝힌 보고는 지금까지 없다.

또한 임상상의 진단에서, 핵의학 검사나 MRI (자기 공명 영상법) 검사를 포함한 화상 진단이 필요해지는 것은 생체 외 검사 등의 초기진단에서 판단이 어려운 증례나 만성화된 병변을 수반한 증례에서 많이 사용되고 있다. 또한 이러한 증례에서는 종종 스테로이드제 투여 및 백혈구 제거요법 등의 면역 반응 및 백혈구 침윤을 억제하는 치료법이 실시되고 있다. 그러므로, 만성 염증을 포함한 면역 반응의 염증을 수반하는 질환의 화상 진단이 가능한, 혈관 투과성 항진의 영향을 받지 않는 면역 반응을 수행하기 위해, 백혈구 침윤을 시각화할 수 있는 저분자량 제제가 요망되고 있다.

펩티드 및 폴리펩티드를 Tc-99m 로 표지하는 방법은 이미 알려져 있다 (예를 들어 일본 공개특허공보 평8-231587호 참조).

발명의 개시

본 발명은 이러한 종래 기술의 상황을 감안하여 생체 내외에서 백혈구, 즉 호중구, 단구, 림프구 등에 대하여 특이적인 결합성을 나타내고, 또한 방사성 금속 또는 상자성 금속으로 표지 가능한 화합물, 및 그 표지 화합물을 유효 성분으로 하는, 개체의 면역 반응을 수반하는 백혈구 침윤이 활발한 부위를 이미징하는 SPECT 화상 진단, PET 화상 진단, MRI 화상 진단 또는 방사성 치료 등에 유용한 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명은 하기 식 (1)

Z-Y-Leu-Phe-(X)_n-Lys(NH₂)_m-ε(-R-(T)_l-U) (1)

(식 (1) 중 Z 는 아미노기의 보호기를 나타내고;

Y 는 Met 또는 Nle 를 나타내고;

(X)_n 에서 X 는 1개 또는 그 이상의 아미노산 및/또는 유기 합성 가능한 화합물로 이루어지는 스페이서, n 은 1 또는 0 을 나타내고;

(NH₂)_m 에서 NH₂ 는 Lys 의 α위치의 카르복시기의 보호기로서의 아미드기, m 은 1 또는 0 을 나타내고;

ε(-R-(T)_l-U) 에서 R 은 Lys 의 ε-아미노기에 아미드 결합한 Ser 또는 Thr, T 는 1개 또는 그 이상의 아미노산 및/또는 유기 합성 가능한 화합물로 이루어지는 스페이서, l 은 1 또는 0, U 는 금속 표지 가능한 기를 나타내고;

단, 상기 X 와 T 는 동일하거나 상이해도 된다)

로 나타내는 백혈구 결합성 화합물에 관한 것이다.

그리고, 본 발명은 상기 식 (1) 로 나타내는 백혈구 결합성 화합물을 방사성 금속 또는 상자성 금속으로 표지된 상태를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.

도 1 은 Tc-99m-펩티드 4 의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

도 2 는 Tc-99m-펩티드 6 의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

도 3 은 Tc-99m-펩티드의 토끼 혈액내 분포를 나타낸다.

도 4 는 Tc-99m-펩티드 3 의 토끼 감염증 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 2시간, 우측이 투여 후 22시간의 이미지이다.

도 5 는 Tc-99m-펩티드 4 의 토끼 감염증 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 2시간, 우측이 투여 후 22시간의 이미지이다.

도 6 은 Tc-99m-펩티드 6 의 토끼 감염증 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 2시간, 우측이 투여 후 22시간의 이미지이다.

도 7 은 Tc-99m-펩티드 8 의 토끼 감염증 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 2시간, 우측이 투여 후 5시간의 이미지이다.

도 8 은 Tc-99m-펩티드 9 의 토끼 감염증 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 2시간, 우측이 투여 후 5시간의 이미지이다.

도 9 는 Tc-99m-펩티드 12 의 토끼 감염증 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 2시간, 우측이 투여 후 22시간의 이미지이다.

도 10 은 Tc-99m-펩티드 13 의 토끼 감염증 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 2시간, 우측이 투여 후 5시간의 이미지이다.

도 11 은 Tc-99m-펩티드 14 의 토끼 감염증 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 2시간, 우측이 투여 후 5시간의 이미지이다.

도 12 는 Tc-99m-펩티드 15 의 토끼 감염증 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 2시간, 우측이 투여 후 5시간의 이미지이다.

도 13 은 Tc-99m-펩티드 16 의 토끼 감염증 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 2시간, 우측이 투여 후 5시간의 이미지이다.

도 14 는 Tc-99m-펩티드 17 의 토끼 감염증 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 2시간, 우측이 투여 후 5시간의 이미지이다.

도 15 는 Tc-99m-펩티드 18 의 토끼 감염증 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 2시간, 우측이 투여 후 5시간의 이미지이다.

도 16 은 각 Tc-99m-펩티드의 정상 래트에서 요배설률의 경시변화를 나타낸다.

도 17 은 각 Tc-99m-펩티드의 정상 래트에서 소장으로의 집적의 경시변화를 나타낸다.

도 18 은 Tc-99m-펩티드의 인간 혈액내 분포를 나타낸다.

도 19 는 Tc-99m 표지 펩티드의 래트 대장염 모델 혈액내 분포를 나타낸다.

도 20 은 Tc-99m 표지 펩티드 3 의 래트 대장염 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 30분, 우측이 투여 후 120분의 이미지이다.

도 21 은 Tc-99m 표지 펩티드 6 의 래트 대장염 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 30분, 우측이 투여 후 120분의 이미지이다.

도 22 는 Tc-99m 표지 백혈구의 래트 대장염 모델에서의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 30분, 우측이 투여 후 120분의 이미지이다.

도 23 은 Tc-99m 표지 펩티드의 래트 대장염 모델에서의 염증/장기비를 나타낸다.

도 24 는 래트 대장염에서의 펩티드 6 의 오토라디오그래피와 면역 염색의 이미지를 나타낸다. 좌측이 오토라디오그래피, 중앙이 과립구 항체 면역 염색, 우측이 단구 항체 면역 염색이다.

도 25 는 래트 대장염에서의 펩티드 14 의 오토라디오그래피와 면역 염색의 이미지를 나타낸다. 좌측이 오토라디오그래피, 중앙이 과립구 항체 면역 염색, 우측이 단구 항체 면역 염색이다.

도 26 은 래트 대장염에서의 Tc-99m 표지 백혈구의 오토라디오그래피와 면역 염색의 이미지를 나타낸다. 좌측이 오토라디오그래피, 중앙이 과립구 항체 면역 염색, 우측이 단구 항체 면역 염색이다.

도 27 은 래트 대장염에서의 Tc-99m 표지 펩티드와 Tc-99m 표지 백혈구의 오토라디오그래피의 염증/정상조직비를 나타낸다.

도 28 은 재조합 인간 수용체와 [³H]-FMLP 의 결합에 대한 펩티드의 저해율을 나타낸다.

도 29 는 FMLP 저해가 없는 토끼 감염증 모델에서의 Tc-99m 표지 펩티드 6 의 이미지를 나타낸다. 좌측이 투여 후 2시간, 우측이 투여 후 5시간의 이미지이다.

도 30 은 FMLP 저해가 있는 토끼 감염증 모델에서의 Tc-99m 표지 펩티드 6 의 이미지를 나타낸다.

발명의 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명의 실시형태에 대하여 설명한다. 또, 본 명세서에서 사용하는 아미노산은 모두 1 문자 기호 또는 3 문자 기호로 적고, 특별한 기재가 없는 한 좌측을 N 말단측, 우측을 C 말단측으로 하여 표기하였다. 아미노산에 이어지는 괄호 안은 특별한 기재가 없는 한 측쇄에 결합된 펩티드 및 유기 화합물을 나타내는 것이다. 또한 괄호 안의 아미노산 서열은 전체 구조를 파악하기 쉽게 하기 위해 우측을 N 말단측, 좌측을 C 말단측으로 하여 표기하였다. 그리고, 본 명세서에서 D 체의 아미노산은 D-아미노산이라 기재하였다.

본 발명의 백혈구 결합성 화합물은, 하기 식 (1)

Z-Y-Leu-Phe-(X)_n-Lys(NH₂)_m-ε(-R-(T)_l-U) (1)

로 나타낸다. 즉, 백혈구의 수용체 FPR 와의 결합부위 Z-Y-Leu-Phe-, 전체 백혈구 중 단구, 림프구에 대한 결합률을 향상시키는 Ser 또는 Thr 로 이루어지는 결합부분 -R-, 방사성 금속 또는 상자성 금속으로 표지 가능한 구조 -U- 및 이들을 결합하는 스페이서 -(X)_n-, -Lys(NH₂)_m- 및 -(T)_l- 로 되어 있다.

구체적으로는, 하기와 같은 백혈구 결합성 화합물을 바람직한 양태로 예시할 수 있다.

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-Cys-Gly-Asn);

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-Cys-Asp-Asp);

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-Cys-Gly-Asp);

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp);

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산);

포르밀-Nle-Leu-Phe-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Ser-Asn-D-Arg-Cys-Asp-Asp);

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-디에틸렌트리아민펜타아세트산);

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-부티르산);

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-부티르산);

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Ser-Asn-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-부티르산);

아세틸-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp);

카르바밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp);

메틸-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)

를 예시할 수 있다.

상기 식 (1) 로 나타내는 백혈구 결합성 화합물에서의 수용체 FPR 과의 결합부위인 Z-Y-Leu-Phe- 에서, Z 는 아미노산의 보호기이고, 예를 들어 포르밀기 및 아세틸기 등의 탄소수 1 내지 9 의 아실기, t-Boc 기 등의 탄소수 2 내지 9 의 아실옥시기, 메틸, 에틸 및 프로필 등의 탄소수 1 내지 6 의 저급 알킬기, 및 카르바밀기 등이 사용된다. Y 의 Met 나 Nle 의 N 말단이 포르밀기인 경우, 포르밀화 펩티드를 인식하는 백혈구의 수용체 FPR 에 대하여 결합성을 나타내고, 아세틸기 및 t-Boc 기도 마찬가지로 수용체에 대한 결합성을 나타낸다.

상기 식 (1) 의 Z-Y-Leu-Phe- 에서, Y 는 아미노산인 Met 또는 Nle 를 나타낸다. 백혈구 중 호중구 및 단구의 세포막 상에 항상적으로 발현하고 있는 수용체 중 하나에 포르밀화 펩티드와 강한 결합성을 나타내는 수용체 FPR 가 존재하며, Met 에 대하여 결합성을 나타낸다. Met 와 공간적 구조가 매우 닮은 Nle 도 Met 와 동일한 결합성을 나타낸다.

Leu 및 Phe 는 호중구 및 단구에 대한 높은 결합성을 나타낸다. 포르밀화 펩티드와 강한 결합성을 나타내는 수용체 FPR 은 포르밀-Met, 포르밀-Met-Met, 포르밀-Met-Met-Leu, 포르밀-Met-Leu-Leu 등의 펩티드에 대해서도 결합성을 나타내지만 포르밀-Met-Leu-Phe 가 가장 강한 결합성을 나타낸다.

본 발명에서의 최대 특징은, 상기 식 (1) 에서의 Z-Y-Leu-Phe- 에 스페이서인 X, 및 -Lys(NH₂)_m- 의 ε아미노기를 통해 결합한 R 이다. R 은 히드록시기를 측쇄에 갖는 아미노산인 Ser 및 Thr 에서 선택된다. 이 Ser 또는 Thr 가 부가된 금속 표지 가능한 구조를 이용함으로써, 종래의 저분자량 백혈구 결합성 화합물에서는 볼 수 없었던, 림프구 및 단구에 대한 확실한 결합이 처음으로 가능하게 되었다. 수용체 FPR 과의 결합부위 Z-Y-Leu-Phe- 단독으로 이루어지는 종래의 펩티드는, 호중구 및 단구에 대한 결합은 보이지만 림프구에 대한 결합은 거의 보이지 않았다. 이 수용체 FPR 과의 결합부위 Z-Y-Leu-Phe- 와 금속 표지 가능한 구조가 Lys 의 ε아미노기에 결합한 Ser 또는 Thr 을 통하여 결합함으로써 단구 및 림프구에 대한 펩티드의 결합률이 현저하게 향상되었다. 이 결과, 본 발명의 상기 식 (1) 로 나타내는 백혈구 결합성 화합물은 모든 백혈구, 즉 호중구, 단구 및 림프구에 결합하는 것이 가능해진 것이다. 예를 들어 종래의 혈구 결합성 화합물의, 전체 백혈구에 대한 림프구 및 단구에 대한 결합 비율은 약 12% 내지 35% 의 범위인 데 반하여, 본 발명의 혈구 결합성 화합물의 전체 백혈구에 대한 림프구 및 단구에 대한 결합의 비율은 약 18% 내지 65% 로까지 상승한다. 이는, 백혈구 침윤이 활발한 부위를 표적화하는 것이 가능하게 된 것을 나타내고 있으며, 본 발명의 화합물이 백혈구 침윤을 수반하는 질환의 진단용 또는 치료용 의약으로서 유용하다는 것을 나타내는 것이다.

본 발명의 백혈구 결합성 화합물에서, 수용체 FPR 과의 결합부위 Z-Y-Leu-Phe-, 특히 림프구 및 단구의 수용체와의 결합부위 R 의 Ser 또는 Thr 및 방사성 금속이나 상자성 금속의 표지 부위 U 각 사이의 거리를, 스페이서인 X, -Lys(NH₂)_m- 의 ε아미노기 및 스페이서인 T 를 통해 각각 결합함으로써 적절히 조정할 수 있다. 이로써, 공간적 구조가 큰 영향을 미치는 수용체와의 결합성을 유지하면서 각각을 결합할 수 있다. 즉 Z-Y-Leu-Phe- 의 C 말단에 R 의 Ser 또는 Thr 의 C 말단을 결합시키기 위해서는, Z-Y-Leu-Phe- 의 C 말단기에, 탄소수 4 의 측쇄 및 아미노기를 갖는 Lys 를 부가하고, Lys 의 ε아미노기에 Ser 또는 Thr 를 결합하는 것이 바람직하다. 그리고 보다 공간적 거리를 필요로 하는 경우는, 스페이서 X 를 부가하면 된다.

X 및 T 는 각각 1 또는 그 이상의 아미노산 및/또는 유기 합성 가능한 화합물로 이루어지는 스페이서이며, 필요에 따라 본 발명의 백혈구 결합성 화합물의 분자의 구성 성분일 수 있다. X 와 Y 는 동일하거나 상이해도 된다. 그러나 Cys 잔기는 술파닐기가 분자 내 또는 분자 사이에서 디술피드 결합을 형성할 수 있기 때문에 이량체 등의 다량체를 형성하기 쉽고, 그 구조 변화로부터 수용체에 대한 결합성에 크게 영향을 주기 때문에, X 또는 T 의 성분으로서 사용하기에 적당하지 않은 아미노산이다. 그리고 X 또는 T 가 Pro 를 포함하는 경우는, 입체 구조가 한정되기 때문에 공간 자유도가 적어 수용체에 대한 결합성에 바람직하지 못하다. 따라서, X 또는 T 를 구성하는 배열 구조에 포함되는 아미노산으로부터 Cys 및 Pro 는 제외하는 것이 바람직하다.

구체적으로는, X 에 사용하는 아미노산으로는 수용체에 대한 결합성에 영향을 주기 어려운 Gly, Ala, Val, Leu, Ile 등의 비하전성 아미노산이나 Nle, Tyr, Nle-Tyr 등이 예시된다. T 로는 수용체와의 결합부분으로부터 방사성 금속이나 상자성 금속을 표지한 구조와의 거리를 정하는 경우나, 생체 내에서의 체내 동태를 제어하는 경우나, 생체 내에서의 대사에 대한 저항성을 갖게 하는 등의 목적으로 상기와 동일한 아미노산이나 비아미노산 화합물, 또는 그 조합을 사용할 수 있다. 또, 상기 아미노산 이외의 L 체 및 D 체 아미노산, Gly 등의 소수성 아미노산, Arg, Asp, Glu, Lys 등의 극성 아미노산 및 하전성 아미노산 (산성 또는 염기성) 모두 적용이 가능하다.

스페이서를 구성하는 유기 합성 가능한 화합물로는, 메틸기, 에틸기, 벤질기 등의 소수성 관능기를 포함하는, 1,5-헥사디엔, 트랜스-2-메틸-1,3-펜타디엔, 4-메틸-3-니트로아세토페논 등의 화합물; 히드록시기, 아미드기 등의 극성 관능기를 포함하는, (±)-2-메틸-2,4-펜탄디올(헥실렌글리콜), 3-메틸-1,3,5-펜탄트리올 등의 화합물; 카르복시기, 아미노기, 이미노기 등의 하전성 관능기를 포함하는, 메틸렌숙신산, 4-말레이미드부티르산, 6-말레이미드카프론산 등의 화합물 등을 들 수 있다.

금속 표지가 가능한 기인 U 로는, 1개 또는 그 이상의 아미노산으로 이루어지는 기 또는 비아미노산 화합물로 이루어지는 금속 표지 가능한 기를 사용할 수 있다. 1개 또는 그 이상의 아미노산으로 이루어지는 기로는, -Cys-A1-A2 로 나타내는 펩티드 (단, A1 및 A2 는 Cys 및 Pro 를 제외한 아미노산) 가 사용된다. 상기 펩티드로는 예를 들어 -Cys-Gly-Asp, -Cys-Asp-Asp, -Cys-Asp-Gly, -Cys-Gly-Glu, -Cys-Glu-G1u, -Cys-Glu-Gly, -Cys-Gly-Asn, -Cys-Asn-Asn, -Cys-Asn-Gly, -Cys-Gly-Gln, -Cys-Gln-Gln, -Cys-Gln-Gly, -Cys-Gly-Lys, -Cys-Lys-Lys, -Cys-Lys-Gly, -Cys-Gly-Arg, -Cys-Arg-Arg, -Cys-Arg-Gly 등을 예시할 수 있다.

비아미노산으로 이루어지는 금속 표지 가능한 기로는, 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 (Cyclen), 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸(Cyclam), 1,4,8,12-테트라아자시클로펜타데칸, 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-5,7-디온 (Dioxocycam) 등의 탄소수 8 내지 20 의 질소함유 환형 화합물; 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산 (TETA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-5,7-디온-N,N',N'',N'''-테트라아세트산, 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-부티르산, 1,4,8,10-테트라아자시클로도데칸-부티르산 등의 탄소수 8 내지 20 의 질소함유 환형 카르복실산 화합물; 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-아미노에틸카르바모일메틸-4,7,10-트리스〔R,S〕-메틸아세트산 (DO3MA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-α,α',α'',α'''-테트라메틸아세트산 (DOTMA) 등의 탄소수 8 내지 20 의 질소함유 환형 카르복실산 화합물의 유도체; 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 트리에틸렌테트라아민헥사아세트산, 에틸렌글리콜-(2-아미노에틸)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA) 등의 탄소수 4 내지 10 의 알킬렌아민카르복실산 등의 화합물로 구성되는 기 등을 들 수 있다.

본 발명의 백혈구 결합성 화합물을 화상 진단용의 의약 조성물로서 사용할 때, 목적으로 하는 진단 또는 치료 부위에 따라서 체내 동태를 제어하여 불필요 대사물의 배설을 빠르게 실시하여, 생체에 대한 무용한 피폭의 경감, 화상 진단을 실시하는 경우의 백그라운드의 영향을 적게 하여 진단 부위의 이미징을 빠르게 실시할 수 있다. 예를 들어, 스페이서 X, T 의 구성에 사용하는 아미노산 등에 관해서, 소화관으로의 대사로 이행시키기 위해서는 Gly, Ala, Ile, Leu, Val 등의 지방족 아미노산, Phe, Trp, Tyr 등의 방향족 아미노산, Met 등의 황함유 아미노산, 또는 메틸기, 에틸기, 벤질기 등의 소수성 관능기를 함유하는 화합물의 이용이 가능하다. 뇨 및 신장으로의 대사로 이행시키기 위해서는 Ser, Thr 등의 히드록시아미노산, Asn, Gln 등의 산성 아미노산아미드, Arg, Asp, Glu, Lys 등의 하전성 아미노산 (산성, 염기성) 을 선택하거나, 유기 합성가능한 화합물로서, 히드록시기, 아미드기 등의 극성 관능기를 함유하는 화합물, 카르복시기, 아미노기, 이미노기 등의 하전성 관능기를 함유하는 화합물을 선택하거나 함으로써, 하전성 아미노산 또는 하전성 관능기를 갖는 화합물의 이용이 가능하다. 기타, 수용체와의 결합부분과 금속 표지된 구조와의 거리를 취할 필요가 있는 경우는, 1 개 이상의 아미노산, 또는 알킬기 등의 직쇄의 유기 합성가능한 화합물을 이용할 수 있다.

금속 표지 가능한 기 U 에 함유되는 아미노산에 관해서도, 상기와 동일한 것을 말할 수 있다. 예를 들어, Asp 또는 Lys 를 선택한 경우, 또는 카르복시기 또는 아미노기를 함유하는 화합물을 선택한 경우에는, 최종적으로 얻어지는 방사성 금속 표지물의 투여 후의 대사물의 주요한 배설 경로를 신장으로 제어할 수 있다. 또한, 아미노산으로서 Gly 등의 소수성 아미노산을 선택한 경우에는, 최종 대사물의 주요한 배설 경로를 소화관으로 제어할 수 있다.

그리고 스페이서 X, T 의 구성에 사용하는 아미노산 등에 관해서, 생체 내에서의 대사에 대한 저항성을 갖게 하기 위해서는, D 체 아미노산 또는 인공 아미노산 그리고 비아미노산의 이용을 생각할 수 있다. D 체 아미노산으로 이루어지는 스페이서로는, 구체적으로는, D-Arg-Asp, Arg-D-Asp, D-Arg-D-Asp, D-Asp-Arg, Asp-D-Arg, D-Asp-D-Arg, Ser-D-Arg, D-Ser-Arg, D-Ser-D-Arg, D-Arg-Ser, Arg-D-Ser, D-Arg-D-Ser, Ser-D-Asp, D-Ser-Asp, D-Ser-D-Asp, D-Asp-Ser, Asp-D-Ser, D-Asp-D-Ser 등의 아미노산 서열을 들 수 있다.

본 발명의 백혈구 결합성 화합물은, 이하에 설명하는 방법에 의해 합성할 수 있다.

(1) 모두 아미노산으로 이루어지는 경우는, Applied Biosystems (USA) 사의 펩티드 자동 합성기 등의 범용적으로 사용되고 있는 펩티드 자동 합성장치에 의해 Boc 법, 및 Fmoc 법 등에 의해 합성할 수 있다. 합성된 복합체는, 고상용 수지 담체에 결합된 상태로부터 탈보호기와 수지 담체의 절단 분리를 동시에 실시하고, 그 후, 역상계 칼럼 등을 사용한 고성능 액체 크로마토그래프법 (이하, HPLC 법이라고 한다) 에 의해 정제할 수 있다. 기타, 펩티드 액상 합성법에 의해 조제할 수도 있고, 또한, 동물 등으로부터 채취해도 된다.

(2) 비아미노산을 함유하고 있는 경우는, 많은 경우, 상기한 동일한 방법에 의해 합성할 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물을 하기와 같이 합성할 수 있다. 즉, 고상용 수지 담체에 Lys 잔기 또는 그 보호 유도체를 결합시키고, 그 N 말단에 X 의 아미노산 잔기 또는 그 보호 유도체, 또는 스페이서로서의 기능을 갖는 화합물 또는 그 보호 유도체, Phe 또는 그 보호 유도체, Leu 또는 그 보호 유도체, Y 의 아미노산 또는 그 보호 유도체를 순차 결합시킨다. 그 다음 고상용 수지 담체에 결합한 Lys 의 측쇄인 ε 아미노기를 활성화시키고, R 의 Ser 또는 Thr 또는 그 보호 유도체를 결합시키고, 거기에 스페이서 T 의 아미노산 또는 그 보호 유도체, 또는 스페이서로서의 기능을 갖는 화합물 또는 그 보호 유도체, 이어서, U 의 금속 표지 가능한 기가 될 수 있는 화합물 또는 그 보호 유도체를 결합시키고, 그 후에 수지 담체로부터 합성된 상기 식 (1) 의 합성물을 절단 분리시킴으로써 합성한다.

본 발명의 백혈구 결합성 화합물에 방사성 금속 또는 상자성 금속을 표지함으로써 얻어지는 표지 화합물을 유효 성분으로 함유하는 의약 조성물은, 방사성 진단제 또는 방사성 치료제 등에 사용되고, 특히 개체의 면역 반응을 수반하는 백혈구 침윤이 왕성한 부위의 화상 진단 및 치료에 바람직하게 사용된다. 즉, 호중구, 단구 또는 림프구 혹은 2 종류 이상의 백혈구계 세포의 침윤이 왕성한 활동성 부위를 갖는 질환에 대하여, 그 백혈구 집적 부위의 검출 및 집적 정도를 소정 검출기를 사용하여 검출할 수 있다.

개체의 면역 반응을 수반하는 질환으로는, 포유 동물체 내의 감염증, 염증, 및 아테롬성 동맥 경화증으로 이루어지는 질환군을 들 수 있다. 즉 상기 질환군에는, 바이러스 감염증, 세균 감염증, 진균 감염증, 원충 감염증, 연충 감염증, 교원(膠原)병, 교원병 이외의 자가면역 질환이 포함된다. 또한, 일본인의 간염의 8 할은 바이러스 감염에 의한 바이러스성 간염이고, 그 밖의 다수는 자가면역성 간염이기 때문에, 간장에서의 염증성 질환의 다수는 호중구의 침윤량에 대하여 림프구ㆍ단구 침윤이 많은 질환이다. 이러한 호중구의 침윤이 비교적 적은 질환 등의 경우에 있어서, 종래의 fMLF 의 아날로그체에서는, 림프구ㆍ단구에 대한 결합성이 호중구에 대한 결합성과 비교하여 약하기 때문에, 병변의 백혈구 침윤을 과소 평가할 가능성이 지적된다. 그러나, 본 발명의 백혈구 결합성 화합물은, 호중구에 대한 결합성 뿐만 아니라 림프구나 단구에 대한 결합성이 높기 때문에, 많은 자가면역 질환이나 리슈마니아증 등의 호중구 침윤이 거의 관찰되지 않는 질환에 대해서도 백혈구 침윤을 정확하게 파악하는 것이 가능하다.

이러한 호중구의 침윤량에 대하여 림프구ㆍ단구 침윤이 많은 질환군, 또는 림프구ㆍ단구 침윤이 백혈구 침윤의 다수를 차지하는 질환군은, 바이러스 감염증, 원충 감염증, 연충 감염증, 교원병, 교원병 이외의 자가면역 질환이 포함된다. 본 발명은 백혈구 침윤 등의 면역 반응을 수반하는 질환군에 대하여 유효하다고 생각되지만, 호중구의 침윤량에 대하여 림프구ㆍ단구 침윤이 많은 질환군, 또는 림프구ㆍ단구 침윤이 백혈구 침윤의 다수를 차지하는 질환군에 대하여 특히 유효한 것으로 생각된다.

또 본 발명은, 종래 기술에서 나타낸, 호중구에 대한 특이적 결합성을 겸비하기 때문에, 림프구ㆍ단구의 침윤량에 대하여 호중구 침윤이 많은 질환군, 또는 호중구 침윤이 백혈구 침윤의 다수를 차지하는 질환군에 대해서도 또한 유효하다. 이러한 질환군으로는, 세균성 심내막염, 심근 경색, 기관지 폐렴, 대엽성 폐렴, 침출성 결핵, 급성 위염, 위막성 대장염, 여시니아 감염증, 궤양성 대장염, 급성 충수염, 급성 담관염, 담낭염, 관내 증식성 사구체 신염, 침출성 사구체 신염, 급성 신우신염, 급성 난관염, 급성 자궁경부염, 급성 유선염, 급성 고환염, 급성 전립선염, 앨러지성 혈관염, 급성 화농성염, 결핵성 수막염, 급성 화농성 골수염, 급성 림프절염, 결핵성 동맥 주위염 등을 들 수 있다.

방사성 진단제로서 사용하는 경우에는, 본 발명의 백혈구 결합성 화합물을 Tc-99m, In-111, Ga-67, Sn-117m, Sm-153, Re-186 등의 SPECT 화상 진단에 적합한 방사성 금속 또는, Cu-64 또는 Ga-68 등의 PET 화상 진단에 적합한 방사성 금속으로 표지한 방사성 금속 표지 화합물이 바람직한 양태이다. 본 발명의 화합물을 방사성 치료제로서 사용하는 경우에는, 그 백혈구 결합성 화합물에 Y-90, Re-186 또는 Re-188 등의 방사성 금속으로 표지한 방사성 금속 표지 화합물이 바람직한 양태이다. 본 발명의 화합물을 MRI 화상 진단용 조영제로서 사용하는 경우에는, 그 백혈구 결합성 화합물에 Cu, Fe 또는 Gd 등의 상자성 금속을 배위시킨 상자성 금속 표지 화합물이 바람직한 양태이다.

본 발명의 백혈구 결합성 화합물을 Tc-99m, Re-186 및 Re-188 로 표지하는 것은 통상의 방법에 따라 수행할 수 있다. 즉, 상기 화합물을 생리 식염수 및 수성 완충액 등에 용해하고, 염화 제 1 주석 등의 환원제를 가하여, 과(過)테크네튬산나트륨(sodium pertechnetate) 용액, 또는 과레늄산나트륨 용액과 혼합하여 표지 화합물을 조제할 수 있다. Cu, Cu-64, Fe, Mn, Gd, In-111 로 표지된 표지 화합물의 경우는, 본 발명의 백혈구 결합성 화합물과 Cu, Cu-64, Fe, Mn, Gd, In-111 이온을 함유하는 약산성 수용성 용액을 혼합함으로써 조제할 수 있다. Ga-67, Ga-68 또는 Y-90 으로 표지된 표지 화합물은, 그 백혈구 결합성 화합물과 Ga-67, Ga-68 또는 Y-90 이온을 함유하는 약산성 내지 약알칼리성 수용성 용액을 혼합함으로써 조제가 가능하다.

방사성 금속 표지 화합물을 방사성동위원소 진단제 또는 방사성 치료제로서 제공하는 경우, 또는 상자성 금속 표지 화합물을 MRI 조영제로서 제공하는 경우는, 상기 서술한 방법에 의해 조제되는 표지 화합물을 추가로 HPLC 법에 의해 정제하여 불순물 및 미반응의 과테크네튬산 이온, 과레늄산 이온, In-111 이온, Cu 이온, Cu-64 이온, Ga-67 이온, Ga-68 이온, Fe 이온, Mn 이온, Gd 이온 및 Y-90 이온을 제거한 후에 사용해도 된다.

방사성 금속 또는 상자성 금속으로 표지된 표지 화합물은 약학적으로 허용되는 첨가물과 혼합함으로써, 방사성동위원소 진단제, 방사성 치료제 또는 MRI 조영제로 조제할 수 있다. 이러한 첨가물로는, 약학적으로 허용되는 아스코르브산 및 p-아미노벤조산 등의 안정화제, 수성 완충액 등의 pH 조정제, D-만니톨 등의 부형제, 및 방사 화학적 순도를 개량하는 데 도움이 되는 시트르산, 타르타르산, 말론산, 글루콘산나트륨 및 글루코헵톤산나트륨 등을 들 수 있다. 또한, 이들 첨가물을 첨가한 동결 건조품인 용시(用時)조제용 키트의 형태로도 제공이 가능하며, 본 발명의 방사성동위원소 진단제에 특히 유용하다.

본 발명의 백혈구 결합성 화합물을 방사성 금속으로 표지한 표지 화합물을 함유하는 방사성동위원소 진단제, 방사성 치료제 또는 MRI 조영제는, 정맥내 투여 등과 같은 일반적으로 사용되는 비경구 경로를 통해 투여할 수 있다. 이미징 및 치료가 가능하다고 생각되는 조성물의 투여량 및 방사능은 환자의 체중 및 연령, 적당한 방사선 이미징 장치, MRI 측정 장치 및 대상 질환 상태 등의 여러 조건을 고려하여 결정된다.

인간을 대상으로 하는 경우, Tc-99m 표지 화합물을 함유하는 진단제의 투여량은, Tc-99m 의 방사능량으로서 37MBq∼1110MBq 의 범위이고, 바람직하게는 185MBq∼1110MBq 이다. Re-186 또는 Re-188 표지 화합물을 함유하는 치료제의 경우는, 투여량은 방사능량으로서 37MBq∼18500MBq 의 범위이고, 바람직하게는 370MBq∼7400MBq 이다. Y-90 표지 화합물을 함유하는 치료제의 경우는, 투여량은 방사능량으로서 37MBq∼3700MBq 의 범위이고, 바람직하게는 37MBq∼1110MBq 의 범위이다. 다른 방사성 금속으로 표지한 표지 화합물의 투여량도 거의 동일하다. 또한, Gd, Fe, Mn, Cu 등의 상자성 금속으로 표지한 표지 화합물을 함유하는 진단제의 투여량은, 처치되는 숙주, MR 화상화 장치의 감도, 화상 실험의 표적 조직, 투여의 특정한 양식 및 사용의 의도되는 효과에 따라서 변화한다. 그러나, 특정한 환자에 대한 특정한 투약 처방은, 사용되는 특정한 시약의 활성 (유도된 완화성), 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식사, 투여 시간, 배설 속도, 약제의 조합 및 담당의의 판단을 포함하는 여러 가지 인자에 의존한다.

표지 화합물은 1일당 약 0.1μ㏖/㎏ 체중과 약 1000μ㏖/㎏ 체중 사이, 바람직하게는 1일당 약 0.5μ㏖/㎏ 체중과 약 300μ㏖/㎏ 체중 사이인 투약 레벨이 유용하다. 대표적인 조제물은, 약 1mM∼1000mM 사이, 바람직하게는, 약 10mM∼500mM 사이의 양으로 표지 화합물을 함유한다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 범주가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 이하의 실시예에 있어서, 얻어진 화합물의 측정방법, 사용한 시약 등을 하기에 나타낸다.

(1) 감마 카운터: 혈액내 표지 화합물의 분포의 측정용으로서 Auto-well Gamma Counter (ALOKA Corporation, Japan) 를 사용하여 측정하였고, 체내 표지 화합물의 분포 측정용으로서, NaI Single Channel Analyzer (OHYO KOKEN KOGYO CO., LTD., Japan) 를 사용하여 측정하였다.

(2) 감마 카메라: GMS-550U (TOSHIBA MEDICAL SYSTEMS CORPORATION, Japan) 를 사용하였다.

(3) 역상 HPLC: 역상 칼럼 Millipore puresil 5㎛ C18 (4.6×150㎜) (Millipore Corporation, USA) 를 사용하였다.

(4) 펩티드 화합물은 전부 고상 펩티드 합성법에 의해 합성하였다.

(5) ^99mTcO₄ ^-:⁹⁹Mo/^99mTc 제네레이터 (NIHON MEDI-PHYSICS CO., LTD., Japan) 를 사용하여, 생리 식염수로서 용출된 것을 사용하였다.

(6) 시약은 전부 특급 시약 이상의 제품을 사용하였다.

(7) 모든 실험 동물은 실험에 앞서 1 주간 12 시간마다 명암 사이클 조건하에서 사육하였다. 그 기간, 모이 및 물은 자유롭게 섭취시켰다.

실시예 1

펩티드의 합성

하기 펩티드를 고상 펩티드 합성법에 의해 합성하여, 이하의 실시예에 사용하였다.

본 발명의 백혈구 결합성 화합물

펩티드 3: 포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-Cys-Gly-Asn)

펩티드 4: 포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-Cys-Asp-Asp)

펩티드 5: 포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-Cys-Gly-Asp)

펩티드 6: 포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)

펩티드 7: 포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-시크람테트라카르복실산체)

펩티드 8: 포르밀-Nle-Leu-Phe-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Ser-Asn-D-Arg-Cys-Asp-Asp)

펩티드 9: 포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-DTPA)

펩티드 13: 포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-시크람부티르산)

펩티드 14: 포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-시크람부티르산)

펩티드 15: 포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Ser-Asn-시크람부티르산)

펩티드 16: 아세틸-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)

펩티드 17: 카르바밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)

펩티드 18: 메틸-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)

상기 펩티드 에 있어서, 시크람테트라카르복실산체는 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산, DTPA 는 디에틸렌트리아민펜타아세트산, 시크람부티르산은 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-부티르산을 의미한다.

대조 펩티드

펩티드 1: 포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-Glu-Cys

펩티드 2: 포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Cys-Asn-Asp)

펩티드 10: 포르밀-Met-Leu-Phe-Lys-ε(-Gly-Gly-Cys)

펩티드 11: 포르밀-Met-Leu-Phe-Lys-ε(-Gly-Gly-Ac-S-Bzl)

펩티드 12: 포르밀-Met-Leu-Phe-Lys-ε(-Gly-Asp-Ac-S-Bzl)

펩티드 3 의 합성

펩티드 합성기 (모델 430A, Applied biosystems) 를 사용하고, Boc 법에 의해 MBHA 수지 (p-메톡시-벤즈히드릴아민 수지 히드로클로라이드, 1% 디비닐벤젠-폴리스티렌 공중합체) 를 사용하여 0.5mM 스케일의 조건으로 합성하였다. 이 때 C 말단, Lys 잔기의 측쇄는 Fmoc 기로 보호하였다. 펩티드쇄를 신장, N 말단 아미노기를 포르밀화한 후, Lys 잔기의 측쇄 Fmoc 기를 20% 피페리딘/DMF 으로 절단하고, 측쇄측으로 펩티드쇄를 신장하였다. 펩티드의 절단은, 무수불화수소: p-크레졸(80:20) 중, -2℃ 내지 -5℃ 에 있어서 1.0시간 반응시켜 실시하였다.

정제는, 칼럼: YMC-Pack ODS-A SH-365-5 (30×250㎜), 용출 속도: 20㎖/분, 용출액 A: 0.1% TFA/정제수, 용출액 B: 0.1% TFA/아세토니트릴, A 에서 B 로의 농도 구배 조건하, 액체 크로마토그래프법 (HPLC 법)을 사용하여 실시하였다. 주피크 획분을 모아 동결건조시켜 목적하는 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드의 순도는 역상 HPLC 로 검정하였다.

또, MBHA 수지 대신에 프리로드 수지를 사용해도 동일하게 합성이 가능하였다.

그리고, 6M 염산 내에서 110℃, 22시간 가수분해한 후, 얻어진 주피크에 대한 아미노산 조성을 구하여 목적하는 펩티드 3 인 것을 확인한 후, 아미노산 조성이 일치한 피크를 동결건조시켜, 목적하는 펩티드 3 을 얻었다. 또한, 펩티드의 분자량이 분자량을 구하기 위한 매스 스펙트럼 질량분석 (이하, ESI-MS) 에 의해 이론치와 일치하는 것을 확인하였다. 이하에 얻어진 펩티드 3 의 아미노산 조성의 분석치 (분자당 개수) 를 나타낸다. 둥근 괄호 안은 목적 펩티드의 아미노산 조성의 이론치 (분자당 개수) 를 나타낸다.

또, ESI-MS 에 의해 얻어진 펩티드 3 의 분자량을 나타낸다. 둥근 괄호 안은, 목적 펩티드의 분자량의 이론치를 나타낸다.

ESI-MS:MW = 1183.9 (1184.4)

기타 펩티드의 합성

기타 펩티드도 동일한 방법으로 합성하여 동정했다. 펩티드 1, 펩티드 10, 펩티드 11 및 펩티드 12 는 C 말단이 아미드화되어 있지 않은 펩티드이기 때문에, MBHA 수지 대신에 HMP (4-히드록시-메틸-페녹시 메틸-코폴리스티렌-1% 디비닐-벤젠 수지) 수지를 사용하여 펩티드 3 의 합성에서 나타낸 유사한 방법으로 합성하였다. 각각의 펩티드의 동정을 위한 아미노산 조성 분석치 및 ESI-MS 분석치를 이하에 나타내었다. 펩티드 1 및 펩티드 10 은 아미노산 조성만 기재하였다.

삭제

실시예 2

펩티드 1, 펩티드 2, 펩티드 3, 펩티드 4, 펩티드 5, 펩티드 6, 펩티드 7, 펩티드 8, 펩티드 9, 펩티드 10, 펩티드 13, 펩티드 14, 펩티드 15, 펩티드 16, 펩티드 17, 펩티드 18 의 Tc-99m 표지

(1) 방법

글루코헵톤산 40.3μ㏖/300㎕ 와 염화 제 1 주석 용액 130n㏖/50㎕ 의 혼합액을 함유하는 바이알 중에 Tc-99m-과테크네튬산나트륨 (이하 ^99mTcO₄ ^-) 용액 1.1∼3.0GBq 를 가하여, 전량을 1.35㎖ 로 하였다. 때때로 전도시키고 교반하면서 혼합물을 실온에서 30분간 반응시켰다. 그 일부를 취하여, Tc-99m-글루코헵톤산의 Tc-99m 표지율이 95% 이상인 것을 확인하였다.

다음으로, 실시예 1 에서 얻은 16 종의 펩티드를 각각 디메틸포름아미드 (DMF) 에 용해하고, 이어서 순수 또는 0.9% NaCl 을 함유하는 10mM 인산 완충액 pH 7.4 (이하 PBS), 또는 10mM 탄산 완충액 pH 8.0 (이하 CB) 을 사용하여 0.25∼12.5n㏖/200㎕ 의 농도로 조제하였다. 이 용액에, Tc-99m 글루코헵톤산 용액 200㎕ 를 각각 가하여, 혼합교반하고, 100℃ ~ 120℃ 에서 10분간 반응시켰다. 표지 완료 후, 반응 혼합물의 일부를 취하여, HPLC 에 의해 각 Tc-99m 표지율을 구하였다. HPLC 조건은 다음과 같다. 칼럼: Millipore puresil 5㎛ C18 (4.6×150㎜), 용출 속도: 1㎖/min, 검출 파장: 220㎚, 방사능 검출기: NaI 싱글 채널 애널라이저, 용출액 A: 0.1% 트리플루오로아세트산 (이하 TFA)/정제수, 용출액 B: 0.1% TFA/아세토니트릴, 농도 구배: 0분 (20% B) →20분 (50% B).

(2) 결과

표 1 에 16 종의 Tc-99m 표지 펩티드의 표지율을 나타낸다. 얻어진 표지 화합물의 HPLC 분석의 대표적 크로마토그램으로서 도 1 에 펩티드 4, 도 2 에 펩티드 6 의 결과를 나타낸다. 어느 펩티드도 단일한 표지 생성물을 인정하였다. 표 1 에 나타낸 표지율의 결과로부터 상기에 따른 표지 조건으로, 80% 이상의 높은 Tc-99m 표지가 가능하다는 것이 나타났다.

실시예 3

토끼 혈액내 분포

(1) 실시예 2 에 있어서 Tc-99m 표지한 펩티드 (펩티드 3, 펩티드 4, 펩티드 6, 펩티드 8, 펩티드 9, 펩티드 12, 펩티드 13, 펩티드 14, 펩티드 15, 펩티드 16, 펩티드 17 및 펩티드 18) 를, 실시예 2 와 동일한 HPLC 조건의 역상 HPLC 로 미표지 펩티드와 표지 펩티드를 분리 정제하였다. 구배 용리는 20% →50% (0.1% TFA 아세토니트릴/0.1% TFA 수): 0 →20분 조건하에서 수행하였다. 계속해서 Percoll 밀도-구배액을 제작하였다. Percoll (Pharmacia Biotech Inc.) 원액 (비중 1.130g/㎖) 90㎖ 에 1.5M NaCl 10㎖ 를 첨가하고, 생리 식염수와 같은 등장성 용액을 제조하였다. 이 용액에 생리 식염수를 첨가하여 희석하고, 1.096, 1.077, 1.063g/㎖ 의 Percoll 용액을 조제하였다. 조제한 1.096, 1.077, 1.063g/㎖ 의 Percoll 용액을 15㎖ 관에 각각 1㎖ 씩 중층하였다. 밀도 마커 비드 (적색: 1.062, 청색: 1.075, 오렌지색: 1.087, 녹색: 1.098) 에 의해 목적하는 밀도임을 확인하였다. 시험에 사용하는 혈액은, 병원균의 접촉이 없는 SPF (Specific Pathogen Free) 이면서 건강한 뉴질랜드 화이트 (NZW) 계 토끼 (수컷, 체중 2㎏ 전후) 의 귀정맥으로부터 채혈하였다.

급성 염증 모델로서 감염증을 수반한 토끼의 혈액에서의 혈액내 분포를 확인하기 위해, 건강한 토끼의 혈액 대신에, 황색 포도상 구균 (Staphylococcus aureus) 으로 염증을 일으킨 토끼 혈액을 사용하였다. 황색 포도상 구균의 약 1O⁸ 개의 생균을 생리 식염수 1㎖ 에 현탁시키고, 박테리아 현탁액 100㎕ 를 뉴질랜드 화이트 (NZW) 계 토끼 (수컷, 체중 2㎏ 전후) 의 오른쪽 장딴지에 근육내 투여하였다. 약 24시간 후에 토끼의 귀정맥으로부터 혈액을 채혈하여, 검토에 사용하였다.

그리고 만성 염증 모델로서 궤양성 대장염을 수반한 토끼의 혈액에서의 혈액내 분포를 확인하기 위해, 건강한 토끼의 혈액 대신에, 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 으로 염증을 일으킨 토끼의 혈액을 사용하였다. 안소니 등의 방법 (Anthony 등. Int. J. Exp. Path., 76, 215-224(1995)) 에 기초하여, 토끼 궤양성 대장염 모델을 제작하였다. TNBS 360㎎ 을 초순수 4㎖ 에 용해하고, 그 후 에탄올 3.2㎖ 를 가하여, 50.0㎎/㎖ 46% 에탄올/생리 식염수를 제조하였다. 1일 전에 절식시킨 넴부탈 (Nembutal) 마취하의 뉴질랜드 화이트 (NZW) 토끼 7주령 (1.3∼1.4㎏) 수컷의 항문부로부터 튜브를 약 15㎝ 삽입하여, 공기를 3㎖ 주입하였다. 다음에, TNBS/46% 에탄올/생리 식염수를 0.8㎖ 주입하고, 2분간 마사지 및 체위 변경을 실시하였다. 4∼5일 후에 토끼의 귀정맥으로부터 혈액을 채혈하여, 검토에 사용하였다.

토끼 혈액 각 2㎖ 를 37℃ 탕욕 중에서 5분 가온하였다. 계속해서 HPLC 정제한 Tc-99m-펩티드 4 종의 시료액 3㎕ (111MBq/㎖, Tc-99m-펩티드로서 1.8×10^-11㏖/㎖) 를 가한 후, 30분 인큐베이션하였다. 그 혈액 시료는 Percoll 밀도 구배액이었다. 중층된 시료를 2000rpm (800×g) 으로 15분간 원심분리하였다. 원심분리 후 튜브를 동결시킨 후, 각 획분을 커터로 절단하고, 각각을 오토웰 감마 카운터에서 방사능량을 측정하여, Tc-99m-펩티드 4 종의 혈액에서 차지하는 각 성분의 방사능 분포를 구하였다.

(2) 결과

토끼의 혈액학적 파라미터로부터 백혈구수 1000∼8000세포/㎕, 문헌에서 보이는 수용체 FPR 수 100,000∼120,000/세포 의 수치를 토대로, 토끼 혈액의 수용체 FPR 의 추정량은 0.17∼1.6×10^-12㏖/㎖ 로 계산되어, 토끼에 있어서의 펩티드/수용체비는 0.01∼0.11 이었다. 전체 혈액 중의 방사능량에 대한 각 혈액 성분의 방사능량의 백분율을 나타낸 결과를 도 3 에 나타낸다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대한 과립구 획분의 방사능량과 림프구 및 단구 획분의 방사능량의 백분율을 나타낸 결과를 표 2 및 표 3 에 나타낸다.

건강한 SPF 토끼 혈액에 있어서, Tc-99m-펩티드 3 및 Tc-99m-펩티드 12 는, 과립구 획분 및 림프구 및 단구 획분에 대한 분포가 모두 전체 혈액 중의 방사능의 5% 이하로, 강한 결합은 보이지 않았다.

황색 포도상 구균에 의한 감염증을 수반한 토끼 혈액에 있어서는, Tc-99m-펩티드 4 는, 30분의 인큐베이션 후 과립구 획분에 전체 혈액 중의 방사능량의 10.78% 가 분포하고, 림프구 및 단구 획분에는 10.22% 분포하였다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대하여 과립구 획분의 방사능량은 50.22% 이고, 림프구 및 단구 획분의 방사능량은 49.78% 였다. Tc-99m-펩티드 6 은, 30분의 인큐베이션 후 과립구 획분에 전체 혈액 중의 방사능량의 18.27% 가 분포하고, 림프구 및 단구 획분에는 20.21% 분포하였다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대하여 과립구 획분의 방사능량은 47.65% 이고, 림프구 및 단구 획분의 방사능량은 52.35% 였다. 펩티드 8, 펩티드 9, 펩티드 13, 펩티드 14, 펩티드 15, 펩티드 16, 펩티드 17 및 펩티드 18 의 각 Tc-99m 표지 화합물은, 전체 혈액 중의 방사능량의 10% 이상이 백혈구에 분포하고, 또한 림프구 및 단구 획분에는 전체 백혈구의 방사능량에 대하여 약 27% 내지 약 77% 의 범위로 분포하고 있었다.

비교 대조의 Tc-99m-펩티드 12 는, 30분의 인큐베이션 후 과립구 획분에 전체 혈액 중의 방사능의 39.73% 가 분포하고, 림프구 및 단구 획분에는 8.89% 분포하였다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대하여 과립구 획분의 방사능량은 81.58% 이고, 림프구 및 단구 획분의 방사능량은 18.42% 였다. 이들 결과로부터, 본 발명의 일부인 펩티드 4, 펩티드 6, 펩티드 8, 펩티드 9, 펩티드 13, 펩티드 14, 펩티드 15, 펩티드 16, 펩티드 17 및 펩티드 18 의 각 Tc-99m 표지 화합물은, 황색 포도상 구균에 의한 감염증을 수반한 토끼 혈액에 있어서 종래 기술의 펩티드 Tc-99m-펩티드 12 보다도 림프구 및 단구 획분에 보다 많이 분포하고 있는 것이 분명해졌다.

한편, TNBS 에 의한 궤양성 대장염 모델의 토끼 혈액에 있어서는, 도 3 에 나타낸 바와 같이, Tc-99m-펩티드 3 은, 30분의 인큐베이션 후 과립구 획분에 전체 혈액 중의 방사능의 18.44% 가 분포하고, 림프구 및 단구 획분에는 15.94% 분포하였다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대하여 과립구 획분의 방사능량은 표 3 에 나타낸 바와 같이 53.72% 이고, 림프구 및 단구 획분의 방사능량은 46.28% 였다. Tc-99m-펩티드 6 은, 30분의 인큐베이션 후 과립구 획분에 전체 혈액 중의 방사능의 45.44% 가 분포하고, 림프구 및 단구 획분에는 12.60% 분포하였다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대하여 과립구 획분의 방사능량은 78.27% 이고, 림프구 및 단구 획분의 방사능량은 21.73% 였다. 비교 대조의 Tc-99m 표지 펩티드 12 는, 30분의 인큐베이션 후 과립구 획분에 전체 혈액 중의 방사능의 15.10% 가 분포하고, 림프구 및 단구 획분에는 8.34% 분포하였다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대해 과립구 획분의 방사능량은 64.66% 이고, 림프구 및 단구 획분의 방사능량은 35.34% 이었다.

이들 결과로부터, 본 발명의 일부인 Tc-99m-펩티드 3 및 Tc-99m-펩티드 6 은 궤양성 대장염 모델의 토끼 혈액에 있어서 종래 기술의 펩티드 Tc-99m-펩티드 12 보다 림프구 및 단구 획분에 더 많이 분포하고 있는 것이 분명해졌다.

이상과 같은 점에서, 본 발명의 펩티드가, 종래 기술의 Tc-99m-펩티드 12 에 비해, 과립구로의 결합보다 림프구 및 단구에 보다 강하게 결합하는 것이 나타났고, 림프구 및 단구가 많이 침윤하는 만성 염증에 본 발명의 펩티드가 유효한 것이 확인되었다.

실시예 4

펩티드 3, 펩티드 4 펩티드 5, 펩티드 12 의 Tc-99m 표지 화합물의 토끼 감염증 모델에 의한 이미징, 급성기 및 아급성기 염증에 대한 유용성

(1) 방법

황색 포도상 구균의 약 10⁸개의 생균을 생리 식염수 1㎖ 에 현탁시키고, 현탁액 100㎕ 를 뉴질랜드 화이트 (NZW) 계 토끼 (2㎏ 전후) 의 오른쪽 장딴지에 근육 내 투여하였다. 24시간 경과 후, 분명히 염증이 인정된 모델 토끼에 펜토바르비탈 마취를 실시하고, Tc-99m 로 표지한 펩티드 3, 펩티드 4, 펩티드 5, 펩티드 6, 펩티드 7, 펩티드 8, 펩티드 9, 펩티드 12, 펩티드 13, 펩티드 14, 펩티드 15, 펩티드 16, 펩티드 17, 및 펩티드 18 의 37∼74MBq 를 귀정맥 내 투여하였다. 투여 후 5분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 및 22시간에 감마 카메라로 이미지를 촬상하였다. 투여 후 5분에서 5시간까지의 시간점은 기염 개시 후 약 24시간∼29시간이고, 급성기 염증에 상당한다. 또한 투여 후 22시간은 기염 개시 후 약 46시간이고, 아급성기 염증에 상당한다.

(2) 결과

얻어진 결과의 대표도를, 도 4, 도 5, 도 6, 도 7, 도 8, 도 9, 도 10, 도 11, 도 12, 도 13, 도 14, 및 도 15 에 나타낸다. 이미지 상에 관심 영역을 설정하고, 전신 카운트에 대한 각 관심 영역 1000화소당 카운트의 비율 (% 투여량 (ID)/K pixel) 을 구한 결과를 표 4 에 나타낸다. 또한, 그 비율로부터〔염증〕/〔정상 근육〕 비 ([A]/[M] 비) 를 구한 결과를 표 5 에 나타낸다.

그 결과, 종래 기술의 Tc-99m-펩티드 12 는 투여 후 2시간 (기염 후 26시간, 급성기 염증) 의 [A]/[M] 비는 10.34±3.34 (이하 평균치±표준 오차의 순으로 나타낸다) (n=3), 투여 후 22시간 (기염 후 46시간, 아급성기 염증) 의 [A]/[M] 비는 33.94±20.76 (n=3) 을 나타내었지만, 염증 부위로의 집적은 투여 후 2시간 (기염 후 26시간) 의 1.66±0.63% 투여량/K pixel 로부터, 투여 후 22시간 (기염 후 46시간) 에서는 0.90±0.29% 투여량/K pixel 로 감소되었다.

이에 비하여, 본 발명의 Tc-99m-펩티드 3 은 투여 후 2시간 (기염 후 26시간) 의 [A]/[M] 비는 6.55±2.06 (n=5), 투여 후 22시간 (기염 후 46시간) 의 [A]/[M] 비는 54.16±32.86 (n=5) 을 나타내고, 또한 염증 부위로의 집적은 투여 후 2시간 (기염 후 26시간) 의 0.93±0.31% 투여량/K pixel 로부터, 투여 후 22시간 (기염 후 46시간) 에서는 3.70±2.67% 투여량/K pixel 로 증대되었다. 또한, Tc-99m-펩티드 4 는 투여 후 2시간 (기염 후 26시간) 의 [A]/[M] 비는 6.75±2.71 (n=3), 투여 후 22시간 (기염 후 46시간) 의 [A]/[M] 비는 29.07±19.97 (n=3) 을 나타내어, 종래 기술의 Tc-99m-펩티드 12 보다 낮은 값을 나타내었지만, 염증 부위로의 집적은 투여 후 2시간 (기염 후 26시간) 의 1.09±0.22% 투여량/K pixel 로부터, 투여 후 22시간 (기염 후 46시간) 에서는 1.85±0.34% 투여량/K pixel 로 증대되었다. 또한, Tc-99m-펩티드 6 은 투여 후 2시간 (기염 후 26시간) 의 [A]/[M] 비는 14.25±0.31 (n=3), 투여 후 22시간 (기염 후 46시간) 의 [A]/[M] 비는 43.84±12.58 (n=3) 을 나타내고, 염증 부위로의 집적은 투여 후 2시간 (기염 후 26시간) 의 1.22±0.05% 투여량/K pixel 로부터, 투여 후 22시간 (기염 후 46시간) 에서는 1.77±0.07% 투여량/K pixel 로 증대되었다.

일반적으로, 감염 후 약 24시간 정도까지는 염증 부위로 침윤하는 백혈구의 대부분이 호중구 (과립구의 대부분을 차지한다) 로 이루어지지만, 그 후 서서히 감소되어, 침윤하는 백혈구의 주체는 대식세포를 비롯한 단구 및 림프구가 된다. 임상상, 핵의학 검사를 필요로 하는 염증의 대부분은 단구 및 림프구의 침윤이 현저해진 아급성기 이후의 염증이다. 이 검토의 결과에 의해, 본 발명의 펩티드가 기염 후 26시간 (투여 후 2시간) 의 급성기 뿐만 아니라, 아급성기에 해당되는 기염 후 46시간 (투여 후 22시간) 에서도 매우 유용한 것이 나타났다.

실시예 5

펩티드 3, 펩티드 4, 펩티드 6, 펩티드 12 의 Tc-99m 표지 화합물의 체내 동태

(1) 방법

실시예 2 에서 얻은 Tc-99m-펩티드 3, Tc-99m-펩티드 4, Tc-99m-펩티드 6 및 Tc-99m-펩티드 12 로 이루어지는 4종의 Tc-99m 표지 화합물의 정상 래트 체내 분포 실험을 하였다. 체내 분포 실험은 당업자가 실시하는 통상의 방법으로 행하였다. 즉, 시료의 3.0∼3.7MBq 를 비절식 하의 SD (Sprague-Dawley) 래트 (체중 140∼200g) 에 라보날 마취 하 꼬리 정맥으로부터 투여하였다. 투여 후 5분, 30분, 60분 및 180분에 래트를 복부 대동맥으로부터 피를 흘리게 도살하였다. 각 장기를 적출하여 각각의 장기의 방사능 카운트를 NaI 싱글 채널 애널라이저로 측정하였다. 또한, 각 장기의 중량을 측정하여 이들에 의해 체내 분포를 산출하였다. 각 장기의 방사능의 비율을, 장기당 값 (%ID/장기), 또는 그램당 값 (%ID/g 장기) 으로 나타내었다.

(2) 결과

표 6, 표 7, 표 8 및 표 9 에 그 결과를 나타낸다. 또한, 표 6, 표 7, 표 8 및 표 9 의 결과로부터 뇨 및 소장의 경시 변화를 각각 도 16 및 도 17 에 나타낸다.

표 6, 표 7, 표 8, 표 9, 도 16 및 도 17 을 통해, Tc-99m 표지 펩티드의 정상 래트 체내 분포는 청구항 1 에 기재된 식에 있어서의 Z 및 W 의 아미노산 잔기의 차이에 의해 크게 체내 동태가 달라지는 것이 인정되었다. 즉, 종래 기술의 Tc-99m-펩티드 12 의 대사 경로는 투여 후 5분에 있어서의 간장으로의 높은 집적, 각 시간점에서의 위로의 타 펩티드에 비해 높은 집적, 소장으로의 각 시간점에서의 높은 집적, 소장으로부터 이어지는 맹장으로의 180분점에서의 높은 집적이 관찰되는 점에서, 간담도계 배설 경로가 주류이었다 (도 17). 또한 소장으로의 집적이 높기 때문에 염증성 장 질환 등의 복부 염증을 묘출하는 것은 곤란하다.

이에 비하여, 본 발명의 펩티드 중, 청구항 1 에 기재된 식에 있어서의 T 및 U 를 하전성 아미노산 및 산성 아미노산아미드 등의 친수성 아미노산으로 변경 또는 부가한 펩티드 3, 펩티드 4 및 펩티드 6 의 Tc-99m 표지 화합물은 Tc-99m-펩티드 12 에서 관찰되는 동태와는 달리, 뇨로의 배설이 촉진되었다 (도 16). 특히 Tc-99m-펩티드 6 에서 그 경향이 현저하였다. 이 특징은 염증성 장 질환 등의 복부 염증을 묘출하는 데에 있어서 매우 중요하다. 따라서, 본 발명에 의한 펩티드는 종래 기술인 펩티드 12 에 비하여, 복부, 특히 소장으로의 분포가 낮고, 복부의 백혈구 침윤이 발생된 부위 등을 보는 데에 있어서, 보다 유효해지는 것이 시사되었다.

실시예 6

래트 궤양성 대장염 모델에서의 체내 동태, 만성 염증에 대한 유용성

(1) 방법

염증 모델 제작: 안토니 등의 방법 (Anthony 등 Int. J. Exp. Path., 76, 215-224(1995)) 에 기초하여 래트 궤양성 대장염 모델을 제작하였다. 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 360㎎ 을 초순수 4㎖ 에 용해하고, 그 후 에탄올을 3.2㎖ 첨가하여 50.0㎎/㎖ 46% 에탄올/생리 식염수으로 하였다. 24시간 전에 절식시킨 에테르 마취 하의 SD계 래트 (Sprague Dawley, Specific Pathogen Free) 암컷 7주령 (체중 164∼177g) 의 장 내로 항문부로부터 튜브를 7∼8cm 깊이로 삽입하고, 공기를 0.1㎖ 주입하였다. 다음에, TNBS/46% 에탄올/생리 식염수를 0.2㎖ 주입하고, 2분간 마사지 및 체위 변경을 행하였다. 5일 후에 래트를 실험에 사용하였다.

Tc-99m-펩티드 3, Tc-99m-펩티드 4, Tc-99m-펩티드 6 및 비교 대조로서 종래 기술의 Tc-99m-펩티드 12 를 각각 래트 1마리당 약 7.4MBq 를 꼬리 정맥 내 투여하였다. 투여 5분후, 30분후, 60분후, 180분후에 도살하여 각 장기의 방사능 분포를 NaI 싱글 채널 애널라이저로 측정하여 각 장기당 %투여량, 장기 1g 당 %투여량을 구하였다. 염증 부위의 직장을 염증 부위로 설정하여, 장기 1g 당 %투여량을 기초로 [직장(염증)]/[근육] 비 ([A]/[M] 비) 및 [직장(염증)]/[혈액] 비 ([A]/[B] 비) 를 구하였다.

(2) 결과

결과를, 표 10, 표 11, 표 12 및 표 13 에 나타낸다.

Tc-99m-펩티드 3 은 투여 후 5분에서는 [A]/[M] 비 3.36±0.58, 투여 후 180분에서는 7.91±1.16 을 나타냈다. 비염증 부위인 근육에 대하여 염증 부위는 높은 방사능을 나타냄과 함께 [A]/[M] 비의 경시적 증가 경향을 나타내었다. 또한 투여 후 60분 이후, [A]/[B] 비는 1 을 초과하고, 투여 후 180분에서는 2.00±1.50 을 나타내어, 증가 경향이 관찰되었다. 이것은 혈류 증가를 반영한 비특이적 집적이 아니라, 염증으로의 특이적 집적에 의한 것으로 생각된다.

Tc-99m-펩티드 4 는 투여 후 5분에서는 [A]/[M] 비 4.37±0.68, 투여 후 180분에서는 9.29±2.82 를 나타냈다. 비염증 부위인 근육에 대하여 염증 부위는 높은 방사능을 나타냄과 함께 [A]/[M] 비의 경시적 증가 경향을 나타내었다. 또한 투여 후 60분 이후, [A]/[B] 비는 1 을 초과하고, 투여 후 180분에서는 1.51±0.41 을 나타내어, 증가경향이 관찰되었다. 이것은 혈류 증가를 반영한 비특이적 집적이 아니라, 염증으로의 특이적 집적에 의한 것으로 생각된다.

Tc-99m-펩티드 6 은 투여 후 5분에서는 [A]/[M] 비 4.41±0.97, 투여 후 180분에서는 16.50±11.08 을 나타냈다. 비염증 부위인 근육에 대하여 염증 부위는 높은 방사능을 나타냄과 함께 [A]/[M] 비의 경시적 증가 경향을 나타내었다. 또한 투여 후 30분 이후, [A]/[B] 비는 1 을 초과하고, 투여 후 180분에서는 2.74±1.72 를 나타내어, 증가 경향이 관찰되었다. 이것은 혈류 증가를 반영한 비특이적 집적이 아니라, 염증으로의 특이적 집적에 의한 것으로 생각된다.

Tc-99m-펩티드 12 는 투여 후 5분에서는 [A]/[M] 비 4.66±3.13, 투여 후 180분에서는 6.22±4.61 을 나타냈다. 본 발명의 펩티드에 비해 낮은 [A]/[M] 비이었다.

또한 [A]/[M] 비는 투여 후 60분에서 최대치 11.10±12.33 을 나타내었지만, 그 후 감소되었다. [A]/[B] 비에서는 투여 후 60분에서, 1.89±2.39 를 나타내었지만, 그 후 감소되어, 투여 후 180분에서는 1.00±0.89 이었다.

본 검토를 통해, 종래 기술의 펩티드 12 보다, 림프구 및 단구의 침윤이 많은 만성기의 염증 부위로의 집적성 및 체류성 등의 점에서도 본 발명의 펩티드가 우수하고, 궤양성 대장염 등의 만성 염증에 대하여도 유용하다는 것을 알 수 있었다.

실시예 7

Tc-99m 표지된 펩티드 3, 펩티드 6 의 인간 혈액 내 분포

(1) 방법

본 발명의 펩티드가 인간을 대상으로 한 임상에 있어서도 유효한지를 확인하기 위해서, 인간 혈액을 사용한 검토로, 본 발명의 펩티드 2종에 관해서 백혈구에 대한 결합성을 확인하였다. 실시예 2 에서 Tc-99m 표지된 펩티드 3 및 펩티드 6 을, 실시예 2 와 동일한 HPLC 조건의 역상 HPLC 를 이용하여 미표지의 펩티드와 표지 펩티드의 분리 정제를 행하였다. 구배 용리는 설정 20%→80% (0.1% TFA 아세토니트릴/0.1% TFA 수) : 0→20분 (펩티드 6 의 정제 후의 방사능량은 111MBq/㎖ 이었다) 의 조건하에서 행하였다.

또한 종래 기술의 펩티드로서, Tc-99m-펩티드11, Tc-99m-펩티드 12 를 조제하였다. 펩티드11 과 펩티드 12 를 디메틸포름아미드 (DMF) 에 용해하여 농도 0.1㎎/500μL 의 용액을 조제하였다. 타르타르산/PBS 액 (5㎎/200μL) 에 SnCl₂/10mM 염산 용액 (5㎎/10㎖) 50μL 를 첨가하고, 펩티드 용액을 첨가하였다. 즉시 ^99mTcO₄ ^- 용액 (2738MBq/㎖) 을 0.25μL 주입하고, 수 초 동안 진탕 후 120℃ 10분의 표지 반응을 행하였다. 최종 농도는∼855.6MBq/125㎎/㎖ 이었다. 분취 정제 및 방사 화학적 순도의 측정을 HPLC 를 사용하여 행하였다. 분석 조건은 실시예 2 와 동일한 조건으로, 즉 구배는 20%→50% (0.1% TFA 아세토니트릴/0.1% TFA 수) : 0→20분으로 행하였다. 정제 후의 방사능 농도는 287∼311MBq/㎖ 이었다.

계속해서, 실시예 3 에 기재된 방법에 따라서 Percoll 비중 구배액을 제작하였다.

40세까지의 성인 지원자로부터 20∼30 ㎖ 의 혈액을 채취하였다. 계속해서 Tc-99m 표지 펩티드 각각을 30μL (111MBq/㎖, Tc-펩티드로서 1.8×10^-11mol/㎖) 첨가한 후, 30분 인큐베이션하였다. 그 혈액 시료 2∼3㎖ 를 빼내고, 조제한 Percoll 비중 구배액에 조심스럽게 중층하였다. 2000rpm (800×g) 15분간의 원심분리를 행하고, 튜브를 동결시킨 후, 각 획분을 커터로 절단하여, 각각을 오토 웰 감마 카운터로 방사능량을 측정하여 각 혈액 성분 중의 Tc-99m 표지 펩티드의 방사능 분포를 구하였다.

(2) 결과

인간의 혈액학적 파라미터로부터 백혈구수 4100∼6100세포/μL, 문헌에서 관찰되는 수용체 FPR 수 100,000∼120,000/세포 의 수치를 기초로, 인간 혈액의 수용체 FPR 의 추정량은 0.68∼1.2×10^-12mol/㎖ 로 계산되고, 인간에 있어서의 펩티드/수용체비는 0.03∼0.01 이었다. Tc-99m-펩티드 4종 및 음성 대조 (Tc-99m-글루코헵톤산) 의 인간 혈액 내 분포의 결과를 도 18 에 나타낸다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대한 과립구 획분의 방사능량과 림프구 및 단구 획분의 방사능량의 백분율을 나타낸 결과를 표 14 에 나타낸다. Tc-99m-펩티드 3, Tc-99m-펩티드11, Tc-99m-펩티드 12 의 n수는 1, Tc-99m-펩티드 6 의 n수는 3 이었다.

Tc-99m-펩티드 3 은 30분의 인큐베이션 후 과립구 획분에 전체 혈액 중의 방사능의 21.91% 가 분포하고, 림프구 및 단구 획분에는 39.98% 분포하였다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대하여 과립구 획분의 방사능량은 35.41% 이고, 림프구 및 단구 획분의 방사능량은 64.59% 이었다. 이 결과로부터, 본 발명의 Tc-99m-펩티드 3 은 건강한 인간 혈액에 있어서 종래 기술의 Tc-99m-펩티드 11 및 Tc-99m-펩티드 12 보다 림프구 및 단구 획분에 더 많이 분포하고 있는 것이 분명해졌다.

Tc-99m-펩티드 6 은 30분의 인큐베이션 후 과립구 획분에 전체 혈액중의 방사능의 29.45% 가 분포하고, 림프구 및 단구 획분에는 6.59% 분포하였다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대하여 과립구 획분의 방사능량은 81.94±8.67% 이고, 림프구 및 단구 획분의 방사능량은 18.07±8.67% 이었다. 이 결과로부터, 본 발명의 Tc-99m-펩티드 6 은 건강한 인간 혈액에 있어서 종래 기술의 Tc-99m-펩티드 11 보다 림프구 및 단구 획분에 더 많이 분포하고 있는 것이 분명해졌다.

한편, 음성 대조의 Tc-99m-글루코헵톤산은 30분의 인큐베이션 후 과립구 획분에 전체 혈액 중의 방사능의 1.11% 가 분포하고, 림프구 및 단구 획분에는 2.52% 분포하였다. 혈장 획분에는 95.39% 가 분포하였다. 백혈구 결합이 일어나지 않는 음성 대조이기 때문에, 전체 백혈구의 방사능량에 대한 과립구 획분 및 림프구 및 단구 획분의 방사능량의 비율은 산출하지 않는다.

Tc-99m-펩티드 11 은 인간 혈액에 있어서, 30분의 인큐베이션 후 과립구 획분에 전체 혈액 중의 58.70% 가 분포하고, 림프구 및 단구 획분에는 8.02% 가 분포하였다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대하여 과립구 획분의 방사능량은 87.98% 이고, 림프구 및 단구 획분의 방사능량은 12.03% 이었다.

Tc-99m-펩티드 12 는 인간 혈액에 있어서, 30분의 인큐베이션 후 과립구 획분에 전체 혈액 중의 25.09% 가 분포하고, 림프구 및 단구 획분에는 13.77% 가 분포하였다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대하여 과립구 획분의 방사능량은 64.57% 이고, 림프구 및 단구 획분의 방사능량은 35.43% 이었다.

이상의 결과를 통해, 본 발명의 펩티드는 음성 대조의 Tc-99m-글루코헵톤산 및 종래 기술의 Tc-99m-펩티드 11 또는 Tc-99m-펩티드 12 와 비교하여, 과립구로의 결합보다 림프구 및 단구에 보다 강하게 결합되는 것을 알 수 있었다. 또한, 실시예 4 및 실시예 6 의 결과를 감안하더라도, 림프구 및 단구가 많이 침윤하는 만성 염증에 본 발명의 펩티드가 유효한 것이 확인되었다.

실시예 8

Tc-99m 표지된 펩티드 3, 펩티드 6 의 래트 혈액 내 분포

(1) 방법

염증 모델 제작:
안토니 등의 방법 (Anthony 등 Int. J. Exp. Path., 76, 215-224(1995)) 에 기초하여, 래트 궤양성 대장염 모델을 제작하였다. 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 360㎎ 을 초순수 4㎖ 에 용해하고, 그 후 에탄올을 3.2㎖ 첨가하고, 50.0㎎/㎖ 46% 에탄올/생리 식염수으로 하였다. 24시간 전에 절식시킨 에테르 마취 하의 SD계 래트 (Sprague Dawley, Specific Pathogen Free) 암컷 7주령 (체중 164∼184g) 의 장 내로 항문부로부터, 튜브를 7∼8cm 깊이로 삽입하고, 공기를 0.1㎖ 주입하였다. 다음에, TNBS/46% 에탄올/생리 식염수를 0.2㎖ 주입하고, 2분간 마사지 및 체위 변경을 행하였다. 이것을 3일 반복하였다. 최종 투여일의 4일 후에 래트를 실험에 제공하여 혈액을 채취하였다. 채취한 래트의 혈액 2㎖ 를 37℃ 온수욕 중에서 5분 가온하였다. 계속해서 HPLC 정제를 행한 Tc-99m-펩티드 3, Tc-99m-펩티드 6 의 시료액 3μL (111MBq/㎖, Tc-99m-펩티드로서 1.8×10^-11mol/㎖) 를 첨가한 후, 30분 인큐베이션하였다. 그 혈액 시료를 미리 조제한 Percoll 비중 구배액에 조심스럽게 중층하였다. 중층된 시료에 2000rpm (800×g) 15분간의 원심분리를 행하였다. 원심분리 후 튜브를 동결시킨 후, 각 획분을 커터로 절단하고, 각각을 오토 웰 감마 카운터를 이용하여 방사능량을 측정하고, Tc-99m-펩티드 3, Tc-99m-펩티드 6 의 혈액에 차지하는 각 성분의 방사능 분포를 구하였다.

(2) 결과

래트 암컷의 혈액학적 파라미터로부터 백혈구수 6600∼12600세포/μL, 문헌에서 관찰되는 수용체 FPR 수 100,000∼120,000/세포 의 수치를 기초로, 래트 혈액의 수용체 FPR 의 추정량은 1.1∼2.5×10^-12mol/㎖ 로 계산되고, 래트에 있어서의 펩티드/수용체비는 0.02∼0.05 이었다. 전체 혈액 중의 방사능량에 대한 각 혈액 성분의 방사능량의 백분율을 나타낸 결과를 도 19 에 나타낸다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대한 과립구 획분의 방사능량과 림프구 및 단구 획분의 방사능량의 백분율을 나타낸 결과를 표 15 에 나타낸다.
TNBS 에 의한 궤양성 대장염 모델의 래트 혈액에 있어서, Tc-99m-펩티드 3 은 30분의 인큐베이션 후 과립구 획분에 전체 혈액 중의 방사능의 7.82% 가 분포하고, 림프구 및 단구 획분에는 10.00% 분포하였다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대하여 과립구 획분의 방사능량은 43.69% 이고, 림프구 및 단구 획분의 방사능량은 56.31% 이었다. Tc-99m-펩티드 6 은 30분의 인큐베이션 후 과립구 획분에 전체 혈액 중의 방사능의 18.34% 가 분포하고, 림프구 및 단구 획분에는 6.57% 분포하였다. 또한, 전체 백혈구의 방사능량에 대하여 과립구 획분의 방사능량은 74.08% 이고, 림프구 및 단구 획분의 방사능량은 25.92% 이었다.

이들 결과를 통해, 본 발명의 일부인 Tc-99m-펩티드 3 및 Tc-99m-펩티드 6 은 궤양성 대장염 모델의 래트 혈액에 있어서, 림프구 및 단구 획분에도 많이 분포하고 있는 것을 알 수 있었다.

이상과 같은 점에서, 림프구 및 단구가 많이 침윤하는 만성 염증에 본 발명의 펩티드가 유효한 것이 확인되었다.

실시예 9

펩티드 3, 펩티드 6 의 Tc-99m 표지 화합물의 래트 대장염 모델에 의한 이미징, 만성기 염증에 대한 유용성

(1) 방법

염증 모델 제작:
안토니 등의 방법 (Anthony 등 Int. J. Exp. Path., 76, 215-224(1995)) 에 기초하여 래트 궤양성 대장염 모델을 제작하였다. 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 360㎎ 을 초순수 4㎖ 에 용해하고, 그 후 에탄올을 3.2㎖ 첨가하고, 50.0㎎/㎖ 46% 에탄올/생리 식염수으로 하였다. 24시간 전에 절식시킨 에테르 마취 하의 SD계 래트 (Sprague Dawley, Specific Pathogen Free) 암컷 7주령 (체중 164∼184g) 의 장 내로 항문부로부터, 튜브를 7∼8cm 깊이로 삽입하여 공기를 0.1㎖ 주입하였다. 다음에, TNBS/46% 에탄올/생리 식염수를 0.2㎖ 주입하고, 2분간 마사지 및 체위 변경을 행하였다. 이것을 3일 반복하였다. 최종 투여일의 4일 후에 래트를 실험에 제공하였다. 실시예 2 에서 얻어진 Tc-99m-펩티드 3, Tc-99m-펩티드 6 을 각각 1마리당 약 37MBq 의 방사능량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 5분 후, 30분 후, 60분 후, 120분 후에 감마 카메라를 이용하여 이미지를 촬상하였다. 비교 대조로서, 인간의 궤양성 대장염을 진단하는 데에 이용되는 Tc-99m 표지 백혈구를 로카 등의 방법 (M. Roca 등 Eur. J. Nucl. Med. 1998, 25, 797-799) 을 기초로 조제하고, 이것을 1마리당 약 37MBq 의 방사능량으로 꼬리 정맥 내 투여하고, 5분 후, 30분 후, 60분 후, 120분 후에 감마 카메라를 이용하여 이미지를 촬상하였다. Tc-99m 표지 백혈구는 과립구, 림프구 및 단구 등의 모든 백혈구를 포함하여 조제되었다. 또한 촬상 종료 후, 즉 투여 후 130분으로 복부 대동맥으로부터 피를 뺀 후, 각 장기를 적출하였다. 적출된 장기의 중량 및 방사능량을 각각 측정하여 조직 1g 당 방사능량 (%ID/g) 을 산출하였다. 또한 산출된 수치를 사용하여 〔염증〕/〔근육〕비 ([A]/[M] 비), 〔염증〕/〔혈액〕 비 ([A]/[BL] 비), 〔염증〕/〔뼈〕 비 ([A]/[BO] 비), 〔염증〕/〔맹장〕 비 ([A]/[AP] 비), 〔염증〕/〔결장〕비 ( [A]/[C] 비), 〔염증〕/〔직장〕 비 ( [A]/[R] 비) 를 구하였다.

(2) 결과

얻어진 결과의 대표도를, 도 20, 도 21 및 도 22 에 나타낸다. 이미지 상에 관심 영역을 설정하고, 전신 카운트에 대한 각 관심 영역 1화소당 카운트의 비율 (%투여량 (ID)/pixel) 을 구한 결과를 표 16 에 나타낸다. 또한, 그 비율로부터〔염증〕/〔복부 백그라운드〕 비 ([A]/[BG] 비) 를 구한 결과를 표 17 에 나타낸다. 또한 해부 결과 얻어진 염증의 %ID/g, [A]/[M] 비, [A]/[BL] 비, [A]/[BO] 비, [A]/[AP] 비, [A]/[C] 비, [A]/[R] 비를 표 18 및 도 23 에 나타내었다. 그 결과, 비교 대조의 Tc-99m 표지 백혈구는 투여 후 30분의 %투여량/pixel 은 0.11±0.025 (이하 평균치±표준 편차) (n=5), [A]/[BG] 비는 3.21±1.96 (n=5) 을 나타내었다. 또한 투여 후 130분에 피를 제거하고 해부한 결과 얻어진 염증 조직 1g 당 방사능량 (%ID/g) 은 0.71±0.33 이었지만, [A]/[BO] 비는 2.08±1.37 을 나타내고, 또한 [A]/[BL] 비는 0.25±0.17 을 나타내었다. 결과는 염증보다 혈액에 많이 분포하고 있었다는 것을 나타내었다.

이에 비하여, 본 발명의 Tc-99m-펩티드 3 은 투여 후 30분의 %투여량/pixel 은 0.043±0.015 (n=5), [A]/[BG] 비는 2.23±0.77 (n=5) 을 나타내었다. 또한 투여 후 130분에 피를 제거하고 해부한 결과 얻어진 염증 조직 1g 당 방사능량 (%ID/g) 은 0.13±0.12 이었지만, [A]/[BO] 비는 3.40±2.78 을 나타내고, 또한 [A]/[BL] 비는 2.33±2.22 를 나타내었다. 이것은 혈액보다 염증 부위에 더 많이 방사능이 분포하고 있는 것을 나타내고 있다. 또한, Tc-99m-펩티드 6 은 투여 후 30분의 %투여량/pixel 은 0.093±0.048 (n=5), [A]/[BG] 비는 2.15±0.53 (n=5) 을 나타내었다. 또한 투여 후 130분에 피를 제거하고 해부한 결과 얻어진 염증 조직 1g 당 방사능량 (%ID/g) 은 0.55±0.51 이었지만, [A]/[BO] 비는 4.44±2.74 을 나타내고, 또한 [A]/[BL] 비는 2.88±1.61 을 나타내었다. 이것은 펩티드 3 과 같이 혈액보다 염증 부위에 더 많이 방사능이 분포하고 있는 것을 나타내고 있다. 이러한 점들로부터, 본 발명의 Tc-99m 표지 펩티드가, 혈액의 영향을 받기 쉬운, 간장, 비장, 심장, 신장, 뇌, 뼈 등의 혈류가 많은 장기에 있어서 특히 염증의 묘출이 우수한 것으로 판단되었다. 특히 펩티드 6 은 [A]/[M] 비, [A]/[BL] 비, [A]/[BO] 비, [A]/[AP] 비, [A]/[C] 비, [A]/[R] 비에 있어서, 비교 대조의 Tc-99m 표지 백혈구보다 우수한 수치를 나타내었다. 그 결과, 본 발명의 펩티드가 만성 염증인 궤양성 대장염의 묘출에서도 우수한 것이 확인되었다.

실시예 10

Tc-99m-펩티드 6 및 Tc-99m-펩티드 14 의 래트 대장염 모델에 의한 오토라디오그래피 및 만성기 염증에 대한 유용성

(1) 방법

안소니 등의 방법 (Anthony 등 Int. J. Exp. Path., 76, 215-224(1995)) 에 근거하여, 래트 궤양성 대장염 모델을 제작하였다. 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 360㎎ 을 초순수 4㎖ 에 용해하고, 그 후 에탄올 3.2㎖ 더하여, 50.0 ㎎/㎖ 46% 에탄올/생리식염액으로 하였다. 24 시간전에 절식을 한 에테르 마취 하의 SD 계 래트 (Sprague Dawley, Specific Pathogen Free) 암컷 7주령 (체중 164∼184g) 의 장 내로 항문부에서, 튜브를 7∼8㎝ 깊이로 삽입하여, 공기를 0.1㎖ 주입하였다. 다음에, TNBS/46% 에탄올/생리식염액을 0.2㎖ 주입하고, 2분간 마사지 및 체위를 변경하였다. 이것을 3일 반복하였다. 최종 투여일인 4일 후에 래트를 실험에 제공하였다. 실시예 2 에서 얻어진 Tc-99m-펩티드 6, Tc-99m-펩티드 14 를 각각 1마리 당 약 74MBq 의 방사능량으로 꼬리정맥내 투여하여, 120분 후에 탈혈 및 도살하였다. 즉시 대장을 적출하여, 내용물을 제거한 후, 현미경 관찰에 의해 염증부위로 판단되는 지점을 동결 절편 제작용의 미디엄에 포매하였다. 그 후 즉시 액체질소내에 용기와 함께 수십 초간 담가, 대장 절제부위를 포함하는 미디엄을 동결하였다. -20℃ 의 냉동고에 샘플을 수십 초간 정치한 후, 크라이오스탯으로 동결 절편을 작성하였다. 절편 제작 후, 오토라디오그래피용 이미징 플레이트 (후지필름사 제조) 에 12 내지 19시간 밀착시켰다. 계속해서 이미징 애널라이저 BAS 2500 (후지필름사 제조) 에 의해 방사능 분포를 화상화하였다. 또한, 동일하게 제작한 동결 절편을 과립구 항체 및 단구 항체의 면역조직 화학염색을 하여, 과립구 및 단구의 조직에 대한 침윤을 확인하였다.

(2) 결과

얻어진 결과의 대표적인 도면을 도 24, 도 25, 도 26 에 나타낸다. 또한, 오토라디오그래피의 결과로부터 얻어진 이미지상에 관심영역을 설정하여, 각 관심영역 1 화소 당 카운트를 구하여, 그것을 기초로〔염증〕/〔정상조직〕비 ([A]/[N] 비) 를 구하였다. 결과를 도 27 에 나타낸다.

염증을 일으킨 래트는, 직장부에 2㎝ 내지 4㎝ 폭의 염증이 장관 전체둘레에 형성되어 있고, 모든 래트에 염증부위가 있는 것을 확인하였다. 면역조직 화학염색의 결과, 염증부위에 과립구 및 단구의 현저한 침윤이 관찰되어, 과립구 및 단구는 염증부에 일치한 분포를 나타내었다.

한편, Tc-99m-펩티드 6 과 Tc-99m-펩티드 14 는 어느 쪽도 Tc-99m-표지 백혈구와 동일하게, 면역 염색 이미지에 의한 과립구와 단구의 분포와 일치한 방사능의 분포를 볼 수 있었다. 동일한 절편 내에서 얻은 [A] /[N] 비를 비교 대조의 Tc-99m-표지 백혈구, Tc-99m-펩티드 6 및 Tc-99m-펩티드 14 로 비교하면, Tc-99m-펩티드 6 및 Tc-99m-펩티드 l4 는 Tc-99m-표지 백혈구보다도 높은 [A]/[N] 비를 나타내었다. 그 결과, 본 발명의 펩티드가, 만성염증인 궤양성 대장염에서도 우수한 것이 확인되었다.

실시예 11

펩티드 3, 펩티드 4, 펩티드 6, 펩티드 8, 펩티드 9, 펩티드 16, 펩티드 17, 펩티드 18 의 재조합 인간 수용체 결합 저해 활성 분석)

(1) 방법

CHO 세포 유래 재조합 수용체 FPR (6.24p㏖/㎖, 50mM Tris-HCl pH7.4, 10% 글리세롤, 1% BSA, BioSignal Packard Inc. 아마샴 바이오사이언스) 및 [³H]-FMLP (fMLF, 9.25MBq/2.88∼6.25n㏖, 다이이찌화학약품(주)) 를 사용하여 실험을 실시하였다. 일정량의 수용체 FPR (0.05nM, 200㎕/웰) 에 각 펩티드를 10^-4∼10^-14M 의 농도범위로 첨가한 후, 일정량의 [³H]-FMLP (0.3nM, 25㎕/웰) 을 첨가하였다. 반응 후에 GF/C 필터로 수용체 FPR 미결합의 [³H]-FMLP 와 수용체 FPR 결합의 [³H]-FMLP 를 분리하였다. 수용체 FPR 결합의 [³H]-FMLP 의 방사능량을 측정함으로써, [³H] FMLP 의 수용체 FPR 에 대한 결합량을 구하였다. [³H]-FMLP 의 결합을 50% 로 저해하는 각 펩티드 농도 (IC₅₀) 를 해석 소프트웨어「Xlfit ver 3.0.3 (CTC laboratory systems(주))」에 의해 구하고, 다시 [³H]-FMLP 의 Kd치로부터 저해상수 (Ki) 를 구하였다. 시험을 3회 실시하여, 각 시험에서는 측정을 3 회 실시하고, 평균치를 구하였다.

(2) 결과

얻어진 결과를 도 28 에 나타낸다. 또한 산출된 IC₅₀치 및 Ki치를 표 19 에 나타낸다. 비교 대조인 FMLP는 Ki치가 (2.33±0.45)×10e^-10M 으로 산출되었다. 이것에 대하여, 펩티드 3 은 Ki치가 (6.50±1.84)×10e^-9M, 펩티드 4 는 Ki치가 (8.36±3.74)×10e^-10M, 펩티드 6 은 Ki치가 (2.83±1.07)×10e^-10M, 펩티드 8 은 Ki치가 (2.33±0.91)×10e^-9M, 펩티드 9 는 Ki치가 (1.28±0.69)×10e^-10M 으로 산출되었다. 또한 포르밀기를 아세틸기로 변경한 펩티드 16, 카르바밀기로 변경한 펩티드 17, 메틸기로 변경한 펩티드 18 의 각각의 Ki치는, (3.74±3.53)×10e^-6M, (4.24±3.60)×10e^-7M, (3.83±1.12)×10e^-5M 을 나타내었다. 그 결과, 본 발명의 펩티드는, 수용체 FPR 에 대한 친화성을 갖고 있어, 수용체 FPR 을 발현하는 백혈구를 통해 매개되는 염증진단에 유용한 것이 확인되었다.

실시예 12

Tc-99m-펩티드 6 의 토끼 감염증 모델에 의한 저해 이미징, 생체내에서의 백혈구 결합의 확인

(1) 방법

황색 포도상 구균의 약 1O⁸개의 생균을 생리식염액 1㎖ 에 현탁시켰다. 현탁액 100㎕ 을 뉴질랜드 화이트 (NZW) 계 토끼 (체중 2㎏ 전후) 의 오른쪽 장딴지에 근육내 투여하였다. 24시간 경과후, 분명히 염증이 관찰된 모델 토끼에게 펜토바르비탈 마취를 실시하였다. 실시예 2 에서 얻어진 Tc-99m-펩티드 6 을 약 74MBq 의 투여방사능량으로 귀정맥 내 투여하였다. 투여후 5분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간에 감마카메라로 이미지를 촬상하였다. 추정 수용체 최대량 0.1n㏖/㎏ 의 약 1만배에 상당하는 FMLP 1㎎ 을 5% DMSO/생리 식염수에 용해하여 FMLP 용액을 제조하였다. FMLP 에 의해 저해되는지 확인하기 위해 설정한 FMLP 예비투여군에서는, FMLP 용액을 Tc-99m-펩티드 6 의 투여 5분 전에 귀정맥으로부터 투여하였다. FMLP 를 투여하지 않은 군과 동일하게 투여 후 5분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간에 감마카메라로 이미지를 촬상하였다.

(2) 결과

얻어진 결과의 대표도를 도 29 및 도 30 에 나타낸다. 이미지 상에 관심영역을 설정하여, 전신 카운트에 대한 각 관심영역 1000 화소 당 카운트의 비율 (% 투여량/Kpixel) 을 구한 결과를 표 20 에 나타낸다. 또한, 그 비율로부터〔염증〕/〔정상근육〕비 ([A]/[M] 비) 를 구한 결과를 표 21 에 나타낸다. 그 결과, FMLP 저해 없음의 Tc-99m-펩티드 6 은, 투여 후 2시간의 염증부위에 대한 집적은 1.77±0.25% 투여량/Kpixel (이하 평균치±표준 편차) (n=3) 이고, 투여 후 5시간에서는 2.62±0.25% 투여량/Kpixel 로 증가하였다. [A]/[M] 비도 투여 후 2시간의 12.78±6.14 로부터 투여 후 5시간의 21.39±5.39 로 증가되었다. 한편, FMLP 저해 있음의 Tc-99m-펩티드 6 은, [A]/[M] 비는 투여 후 2시간의 3.93±0.60 으로 「FMLP 저해 없음」과 비교하여 낮고, 투여 후 5시간의 [A]/[M] 비는 9.05±3.l0 으로 증가되었다. 그러나, 염증부위에 대한 집적은 투여 후 2시간의 0.41±0.10% 투여량/Kpixel 으로부터, 투여 후 5시간에서는 0.30±0.04% 투여량/Kpixel 로 감소되었다.

이것은 본 발명의 펩티드 6 이 백혈구에 존재하는 수용체 FPR 에 결합함으로써, 염증부위를 묘출하는 것을 나타낸다. 본 발명의 펩티드의 집적은 백혈구 침윤을 수반하는 염증이 일어나고 있는 것을 나타내고 있다고 생각되었다.

본 발명에 의해, 생체 내외에서 모든 백혈구, 즉 호중구, 단구, 림프구에 대하여 특이적인 결합성을 나타내고, 또한 방사성 금속 또는 상자성 금속으로 표지 가능한 화합물, 그 표지 화합물을 유효성분으로 하는 SPECT 화상 진단, PET 화상 진단, MRI 화상 진단에 유용한 의약 조성물의 제공이 가능해져, 개체의 면역 반응을 수반하는 백혈구 침윤이 활발한 부위의 이미지화를 실시하는 화상 진단이 가능해졌다.

<110> Nihon Medi-Physics Corporation Limited <120> Leukocyte Binding Compound and Phramacutical Composition Containing Labelled Leukocyte Binding Compound <130> W1229-00 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leukocyte Binding Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ,Nle <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ,Nle <400> 1 Xaa Leu Phe Xaa Tyr Lys Ser Cys Gly Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leukocyte Binding Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ,Nle <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ,Nle <400> 2 Xaa Leu Phe Xaa Tyr Lys Ser Cys Asp Asp 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leukocyte Binding Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ,Nle <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ,Nle <400> 3 Xaa Leu Phe Xaa Tyr Lys Ser Cys Gly Asp 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leukocyte Binding Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ,Nle <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ,Nle <400> 4 Xaa Leu Phe Xaa Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp Asp 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leukocyte Binding Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> BLOCKED <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ,Nle <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ,Nle <400> 5 Xaa Leu Phe Xaa Tyr Lys Ser 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leukocyte Binding Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> BLOCKED <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ,Nle <400> 6 Xaa Leu Phe Lys Ser Ser Asn Arg Cys Asp Asp 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leukocyte Binding Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> BLOCKED <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ,Nle <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ,Nle <400> 7 Xaa Leu Phe Xaa Tyr Lys Ser Arg 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leukocyte Binding Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> BLOCKED <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ,Nle <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ,Nle <400> 8 Xaa Leu Phe Xaa Tyr Lys Ser 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leukocyte Binding Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> BLOCKED <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ,Nle <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ,Nle <400> 9 Xaa Leu Phe Xaa Tyr Lys Ser Arg Asp 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leukocyte Binding Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> BLOCKED <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ,Nle <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ,Nle <400> 10 Xaa Leu Phe Xaa Tyr Lys Ser Ser Asn 1 5 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leukocyte Binding Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ,Nle <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ,Nle <400> 11 Xaa Leu Phe Xaa Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp Asp 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leukocyte Binding Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> BLOCKED <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ,Nle <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ,Nle <400> 12 Xaa Leu Phe Xaa Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp Asp 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leukocyte Binding Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ,Nle <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ,Nle <400> 13 Xaa Leu Phe Xaa Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp Asp 1 5 10

Claims

하기 식 (1)

Z-Y-Leu-Phe-(X)_n-Lys(NH₂)_m-ε(-R-(T)_l-U) (1)

(식 (1) 중 Z 는 아미노기의 보호기로서, 포르밀기, 카르바밀기, 아세틸기, 메틸기 중 어느 하나에서 선택되고;

Y 는 Met 또는 Nle 를 나타내고;

(X)_n 에서 X 는 1 에서 2 의 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 배열을 갖는 스페이서, n 은 1 또는 0 을 나타내고;

(NH₂)_m 에서 NH₂ 는 Lys 의 α위치의 카르복시기의 보호기로서의 아미드기, m 은 1 또는 0 을 나타내고;

ε(-R-(T)_l-U) 에서 R 은 Lys 의 ε-아미노기에 아미드 결합한 Ser 또는 Thr, T 는 1 에서 3 의 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 배열을 갖는 스페이서, l 은 1 또는 0, U 는 금속 표지 가능한 기를 나타내고;

상기 금속 표지 가능한 기가, 3 개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드, DTPA, 시크람테트라카르복실산, 시크람부티르산 중 어느 하나에서 선택되고;

단, 상기 X 와 T 는 동일하거나 상이해도 된다)

로 나타내는 백혈구 결합성 화합물.
제 1 항에 있어서, 식 (1) 의 U 가 -Cys-A1-A2 (A1 및 A2 는 Cys 및 Pro를 제외하는 아미노산임) 로 표시되는 펩티드로 이루어지는 금속 표지 가능한 기인 백혈구 결합성 화합물.
삭제
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 식 (1) 로 표시되는 백혈구 결합성 화합물이,

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-Cys-Gly-Asn) ;

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-Cys-Asp-Asp) ;

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-Cys-Gly-Asp) ;

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp) ;

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산) ;

포르밀-Nle-Leu-Phe-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Ser-Asn-D-Arg-Cys-Asp-Asp) ;

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-디에틸렌트리아민 펜타아세트산) ;

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-1,4,8,1l-테트라아자시클로테트라데칸-부티르산) ;

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-부티르산) ;

포르밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Ser-Asn-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-부티르산) ;

아세틸-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp) ;

카르바밀-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)및

메틸-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH₂)-ε(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)

으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 인 백혈구 결합성 화합물.
제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 기재된 백혈구 결합성 화합물을 방사성 금속 또는 상자성 금속으로 표지된 상태로 유효성분으로서 함유하는 백혈구 침윤을 수반하는 질환의 진단용 또는 치료용 의약 조성물.
제 5 항에 있어서, 방사성 금속이, Tc-99m, In-111 또는 Ga-67 인 백혈구 침윤을 수반하는 질환의 진단용 또는 치료용 의약 조성물.
제 6 항에 있어서, 개체의 면역 반응에 의해 수반되는 백혈구 침윤이 활발한 부위의 이미지화를 위한 SPECT 화상 진단에 사용되는 의약 조성물.
제 5 항에 있어서, 방사성 금속이 Cu-64 또는 Ga-68 인 백혈구 침윤을 수반하는 질환의 진단용 또는 치료용 의약 조성물.
제 8 항에 있어서, 개체의 면역 반응에 의해 수반되는 백혈구 침윤이 활발한 부위의 이미지화를 위한 PET 화상 진단에 사용되는 의약 조성물.
제 5 항에 있어서, 상자성 금속이 Gd, Fe, Mn 또는 Cu 인 백혈구 침윤을 수반하는 질환의 진단용 또는 치료용 의약 조성물.
제 10 항에 있어서, 개체의 면역 반응에 의해 수반되는 백혈구 침윤이 활발한 부위의 이미지화를 위한 MRI 화상 진단에 사용되는 의약 조성물.
제 5 항에 있어서, 방사성 금속이, Y-90, Sn-117m, Sm-153, Re-186 또는 Re-188 인 백혈구 침윤을 수반하는 질환의 진단용 또는 치료용 의약 조성물.
제 12 항에 있어서, 방사성 요법에 사용되는 의약 조성물.