ES2297268T3 - Compuesto que se une a leucocitos y composicion medicinal que contiene el compuesto en estado marcado como ingrediente activo. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que tiene propiedades de unión específica para leucocitos representado por la fórmula (1): (Ver fórmula) en la que, en la fórmula (1), Z representa un grupo protector para un grupo amino; Y representa Met o Nle; en (X)n, X representa un espaciador que consiste en uno o más aminoácidos, y n representa 1 ó 0; en (NH2)m, NH2 representa un grupo amida como grupo protector para un grupo carboxilo en la posición de Lys, y m representa 1 ó 0; en "(-R-(T)l -U), R representa Ser o Thr unido a un grupo "-amino de Lys a través de un enlace amida, T representa un espaciador que consiste en uno o más aminoácidos, l representa 1 ó 0, y U representa un grupo que puede marcarse con un metal; con la condición de que dichos X y T pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Description
Compuesto que se une a leucocitos y composición
medicinal que contiene el compuesto en estado marcado como
ingrediente activo.
La presente invención se refiere a un compuesto
que se une a leucocitos y a una composición medicinal que contiene
el compuesto en estado marcado como ingrediente activo, que puede
utilizarse para dirigirse a un sitio anómalo, así como para
comprender con precisión la actividad de un estado de enfermedad
cuando debe diagnosticarse y/o tratarse una enfermedad de un
individuo asociada con una reacción inmunológica. Más en detalle,
la presente invención se refiere a un nuevo compuesto que tiene
propiedades de unión específicas para leucocitos, in vivo e
in vitro, y que puede marcarse con un metal radiactivo o un
metal paramagnético, que es útil para la formación de imágenes
patológicas de un sitio de enfermedad, incluyendo enfermedades
infecciosas, inflamación, tumor y aterosclerosis en el cuerpo de
mamíferos. Además, la presente invención se refiere a una
composición medicinal que contiene dicho compuesto en estado marcado
como ingrediente activo, que es útil para el diagnóstico de
radioisótopos, el diagnóstico de formación de imágenes SPECT, el
diagnóstico de formación de imágenes PET, el diagnóstico de
formación de imágenes MRI, o la radioterapia.
Los animales, incluyendo el ser humano, siempre
están influidos por factores que pueden afectar a los sistemas de
soporte de la vida de un individuo, procedentes del entorno
circundante. Éstos incluyen, por ejemplo, factores con efectos
positivos, tales como el aire, la luz solar y los alimentos, y
factores con efectos negativos, tales como la invasión de
microorganismos, las sustancias químicas peligrosas, el calor y la
radiación. Para oponerse a los factores que tienen estos efectos
negativos, los individuos ponen en acción diversos sistemas
protectores para mantenerse vivos.
Este sistema autoprotector se define
biológicamente como inmunidad, y una reacción biológica con relación
a la inmunidad se denomina reacción inmunológica. Como factores que
desencadenan estas reacciones se conocen, por ejemplo,
microorganismos, tales como bacterias y micoplasmas, virus,
heteroinjertos de tejidos u órganos, compuestos químicos
peligrosos, calor de alta temperatura, enfriamiento excesivo,
radiación nuclear de alta energía, y lesiones eléctricas o físicas
de tejidos. La reacción inmunológica, que incluye la reacción de
inflamación, es una reacción biológica en respuesta al
reconocimiento de "propio" o "no propio" para el
individuo, que es una acción del sistema de protección en un
sentido amplio, tal como fiebre, activación y migración de
leucocitos, y eliminación de todos los factores exceptos los
"propios". La reacción de inflamación es un fenómeno que
aparece como parte de los resultados de las reacciones
inmunológicas, tales como la eliminación de sustancias extrañas
infiltradas en un individuo, la demolición de tejidos invadidos y la
restauración de tejido lesionado.
Los leucocitos se incluyen como uno de los
factores importantes en las reacciones inmunológicas. Los tejidos
producen diversos mediadores que especifican la especie de
leucocitos infiltrantes y controlan su nivel y duración, y también
tienen, sobre la superficie de la membrana celular, diversos
receptores que pueden responder uniéndose a los mediadores y otras
moléculas que existen en el fluido corporal, incluyendo la sangre.
El receptor activa los leucocitos uniéndose al correspondiente
mediador, y diferentes tipos de receptores se expresan
específicamente, dependiendo de la especie de leucocito. Por tanto,
la especie de leucocito que se infiltre en el tejido está gobernada
por el mediador existente.
En general, en la respuesta inmunológica local,
tal como la inflamación, después de que algo reciba el estímulo de
demolición del tejido, las proteínas relacionadas con la inmunidad,
tales como los complementos, toman parte para eliminar el estímulo
durante varias horas. Después de esto, mediadores tales como los
complementos descompuestos y/o las citoquinas son liberados desde
el tejido demolido hacia un fluido corporal, tal como la sangre, y,
con ello, se activan granulocitos compuestos principalmente por
neutrófilos, a través del receptor, de forma que la infiltración de
leucocitos hacia el tejido se produce según un gradiente de densidad
del mediador. En este caso, el mediador se denomina generalmente
factor quimiotáctico. Normalmente, la infiltración del tejido por
los granulocitos alcanza un valor máximo pasadas diez horas desde el
estímulo inicial. Además, la infiltración de macrófagos compuestos
fundamentalmente por monocitos aumenta gradualmente, para eliminar
la sustancia causa del estímulo, en colaboración con los
granulocitos. Se liberan citoquinas y similares desde los
macrófagos y granulocitos activados, así como desde el tejido
lesionado, y, con ello, se potencia la infiltración del tejido por
linfocitos que consisten en células T y células B que pueden llevar
a cabo con eficacia reacciones inmunológicas, tales como la
producción de anticuerpos, o la reparación del tejido demolido, o la
regulación de la reacción para la respuesta inmunológica. La
infiltración de linfocitos alcanza un valor máximo docenas de horas
después del estímulo inicial.
La reacción inmunológica es una acción bastante
importante para mantener la biosis de un individuo. Sin embargo,
puesto que la regulación de la reacción en un individuo es
imperfecta con respecto al objetivo de mantener su biosis, la
reacción a veces puede provocar efectos negativos cruciales. Los
fenómenos típicos de estos efectos negativos son el desarrollo de
trastornos denominados enfermedades autoinmunológicas. Un grupo de
este tipo de trastornos son, por ejemplo, la dermatitis atópica, la
artritis reumatoide, el síndrome de Behcet, el lupus eritematoso
sistémico, la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn, la
tiroiditis crónica y otras enfermedades del colágeno. En el caso de
inflamaciones provocadas, por ejemplo, por la invasión de sustancias
extrañas, tal como una infección, o por la demolición de tejidos,
tal como lesiones de quemaduras, pueden identificarse las causas de
la inflamación. Sin embargo, en el caso de las enfermedades
autoinmunológicas, no existe un factor causal específico, o el
factor no ha sido identificado. Por tanto, una enfermedad
autoinmunológica es una enfermedad intratable con una causa
desconocida. Sin embargo, se sabe que el fenómeno observado
habitualmente en este grupo de trastornos es la infiltración de los
tejidos, específica de la enfermedad, por leucocitos, en particular
por linfocitos, monocitos y macrófagos.
Por tanto, en las enfermedades autoinmunológicas
y los estados crónicos de inflamación e infección, los linfocitos y
monocitos desempeñan un papel central universal en la reacción
inmunológica a través de la infiltración de leucocitos. Por tanto,
la búsqueda o detección de la infiltración de leucocitos por
linfocitos, monocitos y neutrófilos, y la determinación de sus
niveles precisos es bastante importante para llevar a cabo un
tratamiento médico eficaz, que puede mantener a los pacientes
alejados de una medicación inapropiada y puede aliviar la angustia
mental y los costes del tratamiento, y puede contribuir a reducir el
coste del seguro médico.
Por tanto, puesto que la formación de imágenes
de diagnóstico es una herramienta útil para buscar y detectar la
infiltración de leucocitos y para determinar su nivel preciso, se
han investigado diversos agentes radiactivos y su aplicación en el
campo de la medicina nuclear.
El citrato de galio-67
(^{67}Ga) se ha utilizado durante mucho tiempo como agente para la
centellografía de la inflamación (véase, por ejemplo, Ebright, Jr.
et al., Arch. Int. Med., 142, 246-254
(1982)). Sin embargo, este agente no tiene especificidad por el
sitio de infección o el sitio de inflamación. Además, la energía de
radiación de rayos gamma procedente del ^{67}Ga es insuficiente y
no resulta adecuada para obtener una buena imagen fotográfica con
una cámara gamma común. Además, requiere un tiempo de espera de
aproximadamente 72 horas desde la inyección del agente para la
formación completa de las imágenes.
En siguiente lugar, como método para la
formación de imágenes del sitio de infección mediante medicina
nuclear, se emplearon leucocitos marcados con
indio-111 (denominado en lo sucesivo
^{111}In-leucocitos) (véase, por ejemplo, Peters,
A. M. et al., J. Nucl. Med., 33, 65-67
(1992)). Thakur et al. han informado acerca del marcaje
in vitro de neutrófilos con núclidos radiactivos, y han
analizado ampliamente y discutido su utilidad (Thakur et
al., Sem. Nucl. Med., 14, 10-17 (1984)). En este
método, los neutrófilos de un individuo se marcan in vitro
con indio-111 (denominado en lo sucesivo
In-111), y los neutrófilos marcados se utilizaron
para estudios cinéticos in vitro. Además, los neutrófilos
marcados también son capaces de utilizarse para la formación de
imágenes de focos inflamatorios en una fase aguda de un
individuo.
Sin embargo, cuando se utilizan
^{111}In-leucocitos, la preparación de un
compuesto marcado radiactivo requiere las etapas de la extracción
aséptica de sangre autóloga, el aislamiento aséptico de leucocitos
de la sangre, el marcaje aséptico de los leucocitos, y la
retroinyección de los leucocitos marcados con el núclido radiactivo
al paciente, y con esto se gasta un tiempo considerable de más de 2
horas. Además, se considera que se requiere un periodo de espera de
12 a 48 horas desde la retroinyección para obtener una imagen
pictórica óptima. Además, la radiactividad de 200 \muCi por 1 x
10^{7} células de leucocitos, que normalmente se emplea para los
estudios de formación de imágenes, es peligrosa para los leucocitos
cuando se emplea el In-111, por su alta energía
radiactiva. En las condiciones anteriores, los granulocitos
compuestos principalmente por neutrófilos en los leucocitos
sobreviven al marcaje, pero los linfocitos y similares mueren
inmediatamente después del marcaje (Chianelli, M. et al.,
Nucl. Med. Comm., 18, 437-455 (1997)). Por tanto,
resulta difícil controlar los estados dinámicos de linfocitos y
monocitos empleando leucocitos marcados con In-111.
Además, desde el punto de vista de una dosificación segura de
radiación, se limita la cantidad de administración de radiactividad,
dando como resultado, en muchos casos, el deterioro de la calidad
de la imagen pictórica.
Los leucocitos marcados con
tecnecio-99m (Tc-99m) desarrollados
después son capaces de disminuir el tiempo de espera para la
formación de imágenes que ha sido un problema con los
^{111}In-leucocitos, y son capaces de controlar
los estados dinámicos de linfocitos y monocitos, y también son
capaces de administrar una cantidad considerablemente mayor de
radiactividad, comparados con In-111 (véase, por
ejemplo, Vorne, M. et al., J. Nucl. Med., 30,
1332-1336 (1989)). Sin embargo, puesto que la
estabilidad de marcaje de Tc-99m no es
suficientemente buena, la acumulación en un órgano metabólico que
no es diana representa, por consiguiente, un problema. En lo que se
refiere a los problemas del largo tiempo de preparación y manejo de
la muestra sanguínea, este método es similar a los de
^{111}In-leucocitos (Chianelli, M. et al.,
Nucl. Med. Comm., 18, 437-455 (1997)).
Se han llevado a cabo ensayos para desarrollar
anticuerpos monoclonales y policlonales marcados con núclidos
radiactivos que tengan propiedades de unión con leucocitos humanos,
incluyendo monocitos, neutrófilos, granulocitos y similares. Por
ejemplo, se ha estudiado el anticuerpo monoclonal antigranulocitos
marcado con ^{99m}Tc (véase, por ejemplo, Lind, P. et al.,
J. Nucl. Med., 31, 417-473 (1990)) y la
inmunoglobulina humana no específica marcada con ^{111}In
(^{111}In-HIG, véase, por ejemplo, LaMuraglia, G.
M. et al., J. Vasc. Surg., 10, 20-28 (1989))
para la detección de un sitio de inflamación provocado por una
infección. Sin embargo, la ^{111}In-HIG tiene un
inconveniente similar con respecto al periodo de espera de 24 a 48
horas desde la administración para obtener una imagen pictórica
óptima.
Además, se ha considerado que la
^{111}In-HIG se acumula en el sitio de inflamación
y permite representar el sitio (véase, por ejemplo, Rubin, R. et
al., J. Nucl. Med., 29, 651-656 (1988)), aunque
sin embargo, a este respecto, existen dos hipótesis acerca del
mecanismo de acumulación. Una idea es que la acumulación de
^{111}In-HIG en el sitio de inflamación se produce
a través de la unión al receptor Fc sobre la superficie de los
leucocitos que se infiltran hacia el sitio de inflamación (Fischman,
A. et al., J. Nucl. Med., 31, 1199-1205
(1990)), y la otra es que, además de la infiltración de leucocitos,
se produce una diapedesis local de ^{111}In-HIG
desde los vasos sanguíneos por una mayor permeabilidad a través de
los vasos sanguíneos, que se observa, de una manera similar, para
proteínas, tales como la albúmina (Morrel, E. et al., J.
Nucl. Med., 30, 1538-1545 (1989)).
Hasta la fecha, han aparecido informaciones
acerca de estudios sobre las biomoléculas que tienen propiedad de
unión con leucocitos utilizando otras proteínas.
Van der Laken, C. J. et al. han informado
acerca de la interleuquina 1 de citoquinas inflamatorias marcada
con yodo radiactivo (van der Laken, C. J. et al., European J.
Nucl. Med., 22, 1249-1255 (1995)).
Signore et al. han informado acerca de la
enfermedad inflamatoria crónica utilizando interleuquina 2 de
citoquinas inflamatorias marcada con yodo radiactivo (Signore, A.
et al., Nucl. Med. Comm., 13, 713-722
(1992)).
Hay, R. V. et al. han informado acerca de
la inflamación químicamente inducida utilizando interleuquina 8 de
citoquinas inflamatorias marcada con yodo radiactivo (Hay, R. V.
et al., Nucl. Med. Comm., 18, 367-378
(1997)).
Estos compuestos radiomarcados han producido
imágenes satisfactorias de la inflamación aguda, tal como una
infección, o de la inflamación crónica, tal como las enfermedades
autoinmunológicas.
Sin embargo, desde el punto de vista de que
estas proteínas, incluyendo los anticuerpos, tienen un gran peso
molecular, la diapedesis de estas proteínas con los componentes
sanguíneos puede provocar problemas en la inflamación aguda, con
una mayor permeabilidad vascular (Roitt, I. et al., Essential
Immunology, 8ª ed., Oxford, Blackwell Scientific (1994)). Las
moléculas con un peso molecular de aproximadamente 2000 no
permanecen en el mismo sitio de diapedesis durante mucho tiempo,
incluso si éstas se escapan, pero proteínas, tales como la albúmina
(peso molecular: aproximadamente 64000) tienden a permanecer en el
mismo sitio comparadas con compuestos con bajo peso molecular,
debido a su gran peso molecular. Por tanto, es difícil juzgar si la
acumulación es específica o no de la inflamación (Morrel, E. et
al., J. Nucl. Med., 30, 1538-1545 (1989)).
Es preferible utilizar, de forma rutinaria como
agente medicinal radiactivo, moléculas pequeñas y que puedan
sintetizarse con facilidad. Los péptidos marcados con núclidos
radiactivos se consideran adecuados como compuesto sintético con
bajo peso molecular, que pueden unirse de manera selectiva con los
leucocitos en sangre completa, y que pueden inyectarse directamente
a los pacientes, permitiendo la formación de imágenes del sitio de
enfermedad, de infección y de inflamación, mediante la
determinación del sitio de acumulación de los leucocitos.
Por ejemplo, Moyer et al. han informado
acerca de las características acumulativas de los compuestos
peptídicos marcados con Tc-99m derivados de una
secuencia carboxilo terminal del factor de plaquetas 4
(PF-4) que tienen propiedad de unión con glicanos
multisulfatados, tales como la heparina (Moyer, B. R. et al.,
J. Nucl. Med., 37, 673-679 (1996)). Este compuesto
(péptido PF-4-heparina) es un
complejo de un péptido con 23 restos aminoácidos que contiene una
secuencia de aminoácidos quelada con Tc-99m (peso
molecular: aproximadamente 2600) y heparina (peso molecular: de
aproximadamente 7000 a 25000), construyendo una única molécula con
un peso molecular de aproximadamente 10000 a 30000.
El péptido PF-4 unido a heparina
no puede ser un agente indicador sólo de la acumulación en el sitio
de infiltración de leucocitos, por su gran peso molecular del tipo
de las proteínas. Por tanto, se necesita un agente que consista en
un compuesto con bajo peso molecular que muestre poca acumulación no
específica por una mayor permeabilidad capilar, que indique los
verdaderos leucocitos infiltrados. Además, el uso de heparina a
veces debe limitarse debido a su actividad fisiológica.
Dahlman, T. et al., y Ringe, J. D. et
al. han informado acerca del riesgo de efectos secundarios de la
heparina, en que la administración de heparina puede inducir la
reducción de la densidad ósea y la administración a largo plazo
puede producir osteoporosis (Dahlman, T. et al., Br. J.
Obsted. Gynaecol., marzo, 97, 3, 221-228 (1990);
Ringe, J. D. et al., Geburtshilfe Frauenheilkd., 52, 7,
426-429 (1992)). Además de esto, puede haber un
riesgo de efectos secundarios producidos por la función fisiológica
de la heparina, que incluyen, por ejemplo, actividad antitrombina,
inhibición de la producción de tromboplastina, e inhibición de la
agregación plaquetaria, o se requiere un tratamiento cuidadoso
cuando el paciente tiene una enfermedad hemorrágica o un potencial
para transformarse en hemorrágica, o una enfermedad renal y
enfermedad hepática grave. Como se indicó anteriormente, la
heparina presenta muchas cuestiones cautelosas para su uso.
Con respecto a otros péptidos marcados con
núclidos radiactivos, en la técnica anterior se ha informado acerca
de péptidos que contienen
formil-metionil-leucil-fenilalanilo
(fMLF).
Day et al. han informado acerca del
marcaje con ^{125}I del péptido formilado quimiotáctico (fMLF)
(Day, A. R. et al., FEBS Lett., 77, 291-294
(1977)).
Jiang et al. han informado acerca de la
acumulación in vivo del péptido formilado quimiotáctico
(fMLF) marcado con ^{125}I en el sitio de inflamación (véase, por
ejemplo, Jiang, M. S. et al., Nuklearmedizin, 21,
110-113 (1982)).
Fisherman et al. han informado acerca del
marcaje con ^{111}In del péptido formilado quimiotáctico (fMLF)
unido a través de DTPA (véase el documento JP 2931097).
Verbeke et al. han informado acerca del
marcaje con Tc-99m del péptido formilado
quimiotáctico (fMLF) unido a través de
mercaptoacetil-glicil-glicina
(véase, por ejemplo, Verbeke, K. et al., Nuclear Medicine
& Biology, 27, 769-779 (2000)).
Baidoo et al. han informado acerca del
marcaje con Tc-99m del péptido formilado
quimiotáctico (fMLF) unido a través de un compuesto de
diaminoditiol (véase, Baidoo, K. E. et al., Bioconjugate
Chemistry, 9, 208-217 (1998)).
Además, existen informes acerca del uso de
péptidos formilados quimiotácticos (fMLF) marcados con núclidos
radiactivos para el marcaje in vitro de leucocitos con
núclidos radiactivos a través de su fotoafinidad (véase, por
ejemplo, el documento USP 4.986.979).
Además, existen informes acerca de péptidos
formilados quimiotácticos (fMLF) capaces de ser marcados con
núclidos radiactivos (véase, por ejemplo, el documento USP
5.792.444).
Se considera que el péptido formilado
quimiotáctico (fMLF) se une a los leucocitos a través del receptor
del péptido formilado (denominado en lo sucesivo receptor FPR
(Niedel, J. E. et al., Science, 205, 4413,
1412-1414 (1979)), y los leucocitos que expresan el
receptor FPR son neutrófilos y monocitos (Lewis, S. L. et
al., Inflammation, 4, 363-375 (1983)).
La composición normal de leucocitos presentes en
la sangre humana está compuesta de aproximadamente 50% de
neutrófilos y 10% de monocitos. Se ha informado acerca de que la
mayoría de los leucocitos que están unidos con algunos análogos de
péptidos formilados quimiotácticos conocidos son neutrófilos, porque
la población de monocitos en sangre es sólo una quinta parte o
menos de neutrófilos, y la unión de los péptidos a linfocitos y
monocitos no es fuerte (Verbeke, K. et al., Nucl. Med. Biol.,
27, 769-779 (2000)).
Además, se observa la acumulación de péptido
formilado marcado con núclido radiactivo en la inflamación aguda,
tal como enfermedades infecciosas de bacterias con infiltración de
neutrófilos (véase, Babich, J. W. et al., J. Nucl. Med., 34,
2176-2181 (1993)), pero no existen informes acerca
de la acumulación de dicho péptido en la enfermedad diagnosticada
como inflamación crónica.
Además, en el diagnóstico clínico, para las
enfermedades que necesitan un diagnóstico de formación de imágenes,
se emplea principalmente el ensayo de medicina nuclear o MRI
(formación de imágenes de resonancia magnética) en enfermedades en
las que es difícil identificar una lesión mediante diagnóstico
primario, tal como ensayos in vitro, o los casos de
enfermedad en estado crónico. En estos casos, se han aplicado con
frecuencia tratamientos médicos para inhibir la reacción
inmunológica y la infiltración de leucocitos mediante la
administración de un fármaco esteroide y un tratamiento de
reducción de leucocitos. Por tanto, se necesita un agente con bajo
peso molecular que no sea susceptible de aumentar la permeabilidad
vascular y que permita visualizar la reacción inmunológica y la
infiltración de leucocitos para realizar un diagnóstico de formación
de imágenes de las enfermedades acompañadas por una inflamación de
reacción inmunológica, incluyendo la inflamación crónica.
El método para marcar péptidos y polipéptidos
con Tc-99m es muy conocido en la técnica (véase, por
ejemplo, el documento
JP-A-8-231587).
Considerando las circunstancias de la técnica
anterior, un objeto de la presente invención es proporcionar un
compuesto que tiene propiedades de unión específicas para
leucocitos, es decir, neutrófilos, monocitos y linfocitos, in
vivo e in vitro, y que es capaz de ser marcado con un
metal radiactivo o un metal paramagnético, y una composición
medicinal que contiene dicho compuesto en un estado marcado como
ingrediente activo que es útil para el diagnóstico de formación de
imágenes SPECT, el diagnóstico de formación de imágenes PET, el
diagnóstico de formación de imágenes MRI, el tratamiento radiactivo,
etc., en el que la formación de imágenes se realiza en un sitio con
vigorosa infiltración de leucocitos acompañada de una reacción
inmunológica en un individuo.
Es decir, la presente invención se refiere a un
compuesto que tiene propiedades de unión específicas para
leucocitos representado por la siguiente fórmula (1):
(1)Z-Y-Leu-Phe-(X)_{n}-Lys(NH_{2})_{m}-
\varepsilon
(-R-(T)_{l}-U)
en la que, en la fórmula (1), Z
representa un grupo protector para un grupo amino; Y representa Met
o Nle; en (X)_{n}, X representa un espaciador que consiste
en uno o más aminoácidos, y n representa 1 ó 0; en
(NH_{2})_{m}, NH_{2} representa un grupo amida como
grupo protector para un grupo carboxilo en la posición \alpha de
Lys, y m representa 1 ó 0; en
\varepsilon(-R-(T)_{l}-U), R representa Ser o Thr unido a un grupo \varepsilon-amino de Lys a través de un enlace amida, T representa un espaciador que consiste en uno o más aminoácidos, l representa 1 ó 0, y U representa un grupo que puede marcarse con un metal; con la condición de que dichos X y T pueden ser iguales o diferentes entre sí.
\varepsilon(-R-(T)_{l}-U), R representa Ser o Thr unido a un grupo \varepsilon-amino de Lys a través de un enlace amida, T representa un espaciador que consiste en uno o más aminoácidos, l representa 1 ó 0, y U representa un grupo que puede marcarse con un metal; con la condición de que dichos X y T pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Además, la presente invención se refiere a una
composición medicinal que comprende un compuesto marcado, en la que
el compuesto marcado es un compuesto que tiene propiedades de unión
específicas para leucocitos representado por la anterior fórmula
(1), marcado con un metal radiactivo o un metal paramagnético.
Además, la presente invención se refiere a una composición
medicinal que contiene el compuesto que tiene propiedades de unión
específicas para leucocitos representado por la anterior fórmula (1)
en estado marcado con un metal radiactivo o un metal paramagnético
como ingrediente activo para su uso en radioterapia. Además, la
presente invención se refiere al uso de un compuesto que tiene
propiedades de unión específicas para leucocitos de fórmula (1) o
una composición medicinal que comprende un compuesto marcado, en los
que el compuesto marcado es un compuesto que tiene propiedades de
unión específicas para leucocitos de fórmula (1) marcado con un
metal radiactivo o un metal paramagnético, en la fabricación de un
medicamento para su uso en el tratamiento de la
leishmaniasis.
leishmaniasis.
La Figura 1 muestra un cromatograma de HPLC del
Tc-99m-péptido 4.
La Figura 2 muestra un cromatograma de HPLC del
Tc-99m-péptido 6.
La Figura 3 muestra la distribución del
Tc-99m-péptido en sangre de
conejo.
La Figura 4 muestra una imagen del
Tc-99m-péptido 3 en un modelo de
conejo con enfermedad infecciosa. A la izquierda se muestra una
imagen 2 horas después de la administración; a la derecha se muestra
una imagen 22 horas después de la administración.
La Figura 5 muestra una imagen del
Tc-99m-péptido 4 en un modelo de
conejo con enfermedad infecciosa. A la izquierda se muestra una
imagen 2 horas después de la administración; a la derecha se muestra
una imagen 22 horas después de la administración.
La Figura 6 muestra una imagen del
Tc-99m-péptido 6 en un modelo de
conejo con enfermedad infecciosa. A la izquierda se muestra una
imagen 2 horas después de la administración; a la derecha se muestra
una imagen 22 horas después de la administración.
La Figura 7 muestra una imagen del
Tc-99m-péptido 8 en un modelo de
conejo con enfermedad infecciosa. A la izquierda se muestra una
imagen 2 horas después de la administración; a la derecha se muestra
una imagen 5 horas después de la administración.
La Figura 8 muestra una imagen del
Tc-99m-péptido 9 en un modelo de
conejo con enfermedad infecciosa. A la izquierda se muestra una
imagen 2 horas después de la administración; a la derecha se muestra
una imagen 5 horas después de la administración.
La Figura 9 muestra una imagen del
Tc-99m-péptido 12 en un modelo de
conejo con enfermedad infecciosa. A la izquierda se muestra una
imagen 2 horas después de la administración; a la derecha se muestra
una imagen 22 horas después de la administración.
La Figura 10 muestra una imagen del
Tc-99m-péptido 13 en un modelo de
conejo con enfermedad infecciosa. A la izquierda se muestra una
imagen 2 horas después de la administración; a la derecha se muestra
una imagen 5 horas después de la administración.
La Figura 11 muestra una imagen del
Tc-99m-péptido 14 en un modelo de
conejo con enfermedad infecciosa. A la izquierda se muestra una
imagen 2 horas después de la administración; a la derecha se muestra
una imagen 5 horas después de la administración.
La Figura 12 muestra una imagen del
Tc-99m-péptido 15 en un modelo de
conejo con enfermedad infecciosa. A la izquierda se muestra una
imagen 2 horas después de la administración; a la derecha se muestra
una imagen 5 horas después de la administración.
La Figura 13 muestra una imagen del
Tc-99m-péptido 16 en un modelo de
conejo con enfermedad infecciosa. A la izquierda se muestra una
imagen 2 horas después de la administración; a la derecha se muestra
una imagen 5 horas después de la administración.
La Figura 14 muestra una imagen del
Tc-99m-péptido 17 en un modelo de
conejo con enfermedad infecciosa. A la izquierda se muestra una
imagen 2 horas después de la administración; a la derecha se muestra
una imagen 5 horas después de la administración.
La Figura 15 muestra una imagen del
Tc-99m-péptido 18 en un modelo de
conejo con enfermedad infecciosa. A la izquierda se muestra una
imagen 2 horas después de la administración; a la derecha se muestra
una imagen 5 horas después de la administración.
La Figura 16 muestra el cambio a lo largo del
tiempo de la excreción urinaria de
Tc-99m-péptidos en una rata
normal.
La Figura 17 muestra el cambio a lo largo del
tiempo de la acumulación de
Tc-99m-péptidos en el intestino
delgado de una rata normal.
La Figura 18 muestra la distribución del
Tc-99m-péptido en sangre humana.
La Figura 19 muestra la distribución del péptido
marcado con Tc-99m en la sangre de un modelo de rata
con colitis.
La Figura 20 muestra una imagen del péptido 3
marcado con Tc-99m en un modelo de rata con colitis.
A la izquierda se muestra una imagen 30 minutos después de la
administración; a la derecha se muestra una imagen 120 minutos
después de la administración.
La Figura 21 muestra una imagen del péptido 6
marcado con Tc-99m en un modelo de rata con colitis.
A la izquierda se muestra una imagen 30 minutos después de la
administración; a la derecha se muestra una imagen 120 minutos
después de la administración.
La Figura 22 muestra una imagen de leucocitos
marcados con Tc-99m en un modelo de rata con
colitis. A la izquierda se muestra una imagen 30 minutos después de
la administración; a la derecha se muestra una imagen 120 minutos
después de la administración.
La Figura 23 muestra la proporción de
inflamación/órgano de péptidos marcados con Tc-99m
en un modelo de rata con colitis.
La Figura 24 muestra imágenes del péptido 6 en
una autorradiografía y una inmunotinción de una rata con colitis. A
la izquierda se muestra la autorradiografía; en el centro se muestra
la inmunotinción con anticuerpos antigranulocitos; a la derecha se
muestra la inmunotinción con anticuerpos antimonocitos.
La Figura 25 muestra imágenes del péptido 14 en
una autorradiografía y una inmunotinción de una rata con colitis. A
la izquierda se muestra la autorradiografía; en el centro se muestra
la inmunotinción con anticuerpos antigranulocitos; a la derecha se
muestra la inmunotinción con anticuerpos antimonocitos.
La Figura 26 muestra imágenes de leucocitos
marcados con Tc-99m en una autorradiografía y una
inmunotinción de una rata con colitis. A la izquierda se muestra la
autorradiografía; en el centro se muestra la inmunotinción con
anticuerpos antigranulocitos; a la derecha se muestra la
inmunotinción con anticuerpos antimonocitos.
La Figura 27 muestra la proporción de
inflamación/tejido normal de una autorradiografía de una rata con
colitis utilizando péptido marcado con Tc-99m y
leucocitos marcados con Tc-99m.
La Figura 28 muestra las proporciones de
inhibición de los péptidos para la unión entre el receptor humano
recombinante y [^{3}H]-FMLP.
La Figura 29 muestra una imagen del péptido 6
marcado con Tc-99m en un modelo de conejo con
enfermedad infecciosa sin inhibición de FMLP. A la izquierda se
muestra una imagen 2 horas después de la administración; a la
derecha se muestra una imagen 5 horas después de la
administración.
La Figura 30 muestra una imagen del péptido 6
marcado con Tc-99m en un modelo de conejo con
enfermedad infecciosa con inhibición de FMLP.
A continuación se describe un modo para realizar
la presente invención. Todos los aminoácidos empleados en la
presente descripción se indican mediante la expresión de uno o tres
caracteres y, a menos que se indique lo contrario, a la izquierda
se muestra el extremo N-terminal y a la derecha se
muestra el extremo C-terminal. Dentro de los
paréntesis después de un aminoácido se indica, a menos que se
indique lo contrario, un péptido o un compuesto orgánico unido a la
cadena lateral. Además, una secuencia de aminoácidos entre
paréntesis se indica de tal manera que a la derecha se muestra el
extremo N-terminal y a la izquierda se muestra el
extremo C-terminal para facilitar la comprensión de
la estructura completa. Además, en la presente descripción, un
aminoácido en la configuración D se denomina
D-aminoácido.
Un compuesto que se une a leucocitos de la
presente invención se representa mediante la siguiente fórmula
(1):
(1)Z-Y-Leu-Phe-(X)_{n}-Lys(NH_{2})_{m}-
\varepsilon
(-R-(T)_{l}-U)
Es decir, dicha fórmula (1) comprende un sitio
de unión
Z-Y-Leu-Phe- al
receptor FPR de leucocitos; una parte de unión -R- que consiste en
Ser o Thr que eleva la proporción de unión a monocitos y linfocitos
de los leucocitos totales; una estructura -U- que puede estar
marcada con un metal radiactivo o un metal paramagnético; y
espaciadores -(X)_{n}-,
-Lys(NH_{2})_{m}-, y -(T)_{l}- que unen
estos grupos entre sí.
De manera más específica, se presentan como
ejemplos los siguientes compuestos que se unen a leucocitos como
realizaciones preferidas.
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-Cys-Gly-Asn);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-Cys-Asp-Asp);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-Cys-Gly-Asp);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecan-1,4,8,11-tetraacético);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Ser-Asn-D-Arg-Cys-Asp-Asp);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-ácido
dietilentriaminopentaacético);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecanbutírico);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecanbutírico);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Ser-Asn-ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecanbutírico);
acetil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp);
carbamil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp);
y
metil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp).
Con respecto al compuesto que se une a
leucocitos representado por la fórmula (1), en el sitio de unión al
receptor FPR
Z-Y-Leu-Phe-, Z es
un grupo protector para un aminoácido que incluye, por ejemplo, un
grupo acilo con 1 a 9 átomos de carbono, tal como grupos formilo y
acetilo, un grupo aciloxi con 2 a 9 átomos de carbono, tal como un
grupo t-Boc, un grupo alquilo inferior con 1 a 6
átomos de carbono, tal como grupos metilo, etilo y propilo, y un
grupo carbamilo. Cuando el N-terminal de Met o Nle
en Y es un grupo formilo, muestra propiedad de unión con el
receptor FPR de leucocitos que reconocen el péptido formilado, y un
grupo acetilo y un grupo t-Boc también muestran
propiedad de unión con el receptor también.
En
Z-Y-Leu-Phe- de la
anterior fórmula (1), Y representa Met o Nle como un aminoácido. El
receptor FPR, que es uno de los receptores que se expresan
habitualmente sobre la membrana celular de neutrófilos y monocitos
en leucocitos, tiene una fuerte propiedad de unión con un péptido
formilado y, por tanto, muestra una propiedad de unión con Met. El
receptor también muestra una propiedad de unión con Nle también, que
tiene una estructura estérica similar a la de Met.
Leu y Phe tienen una alta propiedad de unión con
neutrófilos y monocitos. El receptor FPR que tiene una fuerte
propiedad de unión con el péptido formilado también tiene una
propiedad de unión con péptidos, tales como
formil-Met,
formil-Met-Met,
formil-Met-Met-Leu y
formil-Met-Leu-Leu,
y de forma más fuerte con
formil-Met-Leu-Phe.
La característica más destacada de la presente
invención es R, que está unido a
Z-Y-Leu-Phe- en la
anterior fórmula (1) a través del espaciador X y un grupo
\varepsilon-amino de
-Lys-(NH_{2})_{m}-.
R se selecciona de Ser y Thr, que son
aminoácidos que tienen un grupo hidroxilo en la cadena lateral.
Utilizando esta estructura que tiene Ser o Thr que pueden estar
marcados con un metal, se ha conseguido una notable propiedad de
unión con linfocitos y monocitos, que no se ha observado con los
compuestos de unión a leucocitos convencionales con bajo peso
molecular. Los péptidos convencionales que consisten sólo en
Z-Y-Leu-Phe-, que es
un sitio de unión al receptor FPR, muestran una propiedad de unión
con neutrófilos y monocitos, pero apenas muestran una propiedad de
unión con linfocitos. Combinando
Z-Y-Leu-Phe- del
sitio de unión al receptor FPR y una estructura que puede marcarse
con un metal a través de Ser o Thr unidos a un grupo
\varepsilon-amino de Lys, se mejoró
significativamente la proporción de unión del péptido con monocitos
y linfocitos. En consecuencia, se ha comprendido que el compuesto
que se une a leucocitos de la presente invención representado por la
fórmula (1) tiene una capacidad de unirse a todas las especies de
leucocitos, es decir, neutrófilos, monocitos y linfocitos. Por
ejemplo, en el caso de los compuestos de unión a hemocitos
convencionales, una proporción del compuesto unido a linfocitos y
monocitos frente al compuesto unido a los leucocitos totales está en
el intervalo de aproximadamente 12% a 35%, mientras que en el caso
del compuesto que se une a hemocitos de la presente invención, una
proporción del compuesto unido a linfocitos y monocitos frente la
compuesto unido a los leucocitos totales se eleva hasta el
intervalo de aproximadamente 18% a 65%. Esto indica que una lesión
con una infiltración vigorosa de leucocitos puede detectarse, y que
el compuesto de la presente invención es un agente útil para el
diagnóstico o tratamiento médico de las enfermedades acompañadas
por una infiltración de leucocitos.
En el compuesto que se une a leucocitos de la
presente invención, cada distancia entre el sitio de unión al
receptor FPR
Z-Y-Leu-Phe-, en
particular Ser o Thr del sitio de unión R al receptor de linfocitos
y monocitos, y la estructura U que se va a marcar con un metal
radiactivo o un metal paramagnético, puede ajustarse de manera
adecuada uniendo estas partes a través de un espaciador X, y un
grupo \varepsilon-amino de
-Lys(NH_{2})_{m}- y un espaciador T. Debido a
esto, estas partes pueden unirse entre sí al mismo tiempo que se
mantiene la propiedad de unión con el receptor que se ve
significativamente influida por la estructura estérica. Es decir,
para unir el C-terminal de Ser o Thr de R con el
C-terminal de
Z-Y-Leu-Phe-, es
preferible añadir Lys que tiene una cadena lateral con 4 átomos de
carbono y un grupo amino al grupo C-terminal de
Z-Y-Leu-Phe-, y
después Ser o Thr se une al grupo
\varepsilon-amino de Lys. Cuando se necesite mayor
distancia espacial puede añadirse el espaciador X.
Cada uno de X y T es un espaciador que consiste
en uno o más aminoácidos, que pueden ser un componente del
compuesto que se une a leucocitos de la presente invención cuando
sea necesario. X y T pueden ser iguales o diferentes entre sí. Sin
embargo, un resto Cys no es un aminoácido apropiado para utilizar
como componente de X o T, porque el grupo sulfanilo puede formar un
enlace disulfuro intramolecular o intermolecular, dando como
resultado una forma polímera, tal como un dímero, y este cambio
estructural puede influir significativamente en la propiedad de
unión con el receptor. Además, Pro no es preferible para la unión al
receptor, porque si Pro está contenido en X o T, la estructura
estérica se restringe y, en consecuencia, se limita el grado de
libertad espacial. Por tanto, resulta deseable que Cys y Pro se
excluyan de los aminoácidos que construyen la secuencia de X o
T.
De manera más específica, el aminoácido que se
va a usar para X que tiene poca influencia sobre la propiedad de
unión con el receptor incluye, por ejemplo, aminoácidos sin carga,
tales como Gly, Ala, Val, Leu e Ile, Nle, Tyr, y
Nle-Tyr. Con respecto al aminoácido para T, con el
fin de proporcionar una distancia desde el sitio de unión al
receptor hasta la estructura que se va a marcar con un metal
radiactivo o un metal paramagnético, o para controlar el estado
dinámico in vivo en el cuerpo vivo, o para proporcionar
resistencia contra el metabolismo en el cuerpo vivo, pueden
utilizarse los mismos aminoácidos descritos anteriormente,
compuestos sin aminoácidos o sus combinaciones. Además, pueden
emplearse las formas L y D de aminoácidos distintos de los
anteriores aminoácidos, aminoácidos hidrófobos, tales como Gly, y
aminoácidos polares y cargados (ácidos o básicos), tales como Arg,
Asp, Glu y Lys.
Con respecto al grupo U que puede marcarse con
un metal, puede utilizarse un grupo que consista en uno o más
aminoácidos, o un grupo que consiste en compuestos sin aminoácidos.
Como grupo que consiste en uno o más aminoácidos, puede emplearse
el péptido representado por
-Cys-A1-A2 (con la condición de que
A1 y A2 son aminoácidos excepto Cys y Pro). Estos péptidos
incluyen, por ejemplo, -Cys-Gly-Asp,
-Cys-Asp-Asp,
-Cys-Asp-Gly,
-Cys-Gly-Glu,
-Cys-Glu-Glu,
-Cys-Glu-Gly,
-Cys-Gly-Asn,
-Cys-Asn-Asn,
-Cys-Asn-Gly,
-Cys-Gly-Gln,
-Cys-Gln-Gln,
-Cys-Gln-Gly,
-Cys-Gly-Lys,
-Cys-Lys-Lys,
-Cys-Lys-Gly,
-Cys-Gly-Arg,
-Cys-Arg-Arg, y
-Cys-Arg-Gly.
El grupo que consiste en compuestos sin
aminoácidos que pueden marcarse con un metal incluye, por ejemplo,
un compuesto cíclico que contiene nitrógeno con 8 a 20 átomos de
carbono, tal como 1,4,7,10-tetraazaciclododecano
(Cyclen), 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano
(Cyclam), 1,4,8,12-tetraazaciclopentadecano y
1,4,8,11-tetraazaciclotetradeca-5,7-diona
(Dioxocycam); un compuesto de ácido carboxílico cíclico que
contiene nitrógeno con 8 a 20 átomos de carbono, tal como ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecan-1,4,8,11-tetraacético
(TETA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,N',N'',N'''-tetraacético
(DOTA), ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecan-5,7-dion-N,N',N'',N'''-tetraacético,
ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecanbutírico, y
ácido 1,4,8,10-tetraazaciclododecanbutírico; un
derivado de un ácido carboxílico cíclico que contiene nitrógeno con
8 a 20 átomos de carbono, tal como ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1-aminoetilcarbamoilmetil-4,7,10-tris[R,S]-metilacético
(DO3MA), y ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-\alpha,\alpha',\alpha'',\alpha'''-tetrametilacético
(DOTMA); y un ácido alquilenaminocarboxílico con 4 a 10 átomos de
carbono, tal como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido
dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido
trietilentetraaminohexaacético, y ácido
etilenglicol-(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético
(EGTA).
Cuando el compuesto que se une a leucocitos de
la presente invención se utiliza como una composición medicinal
para el diagnóstico de formación de imágenes, dependiendo del
objetivo del diagnóstico o la lesión que se va a tratar, la
formación de la imagen de la región que se va a diagnosticar puede
realizarse en poco tiempo en virtud de la reducción de la radiación
innecesaria al cuerpo vivo, y al alivio del efecto de fondo sobre
el diagnóstico de formación de imágenes por la excreción suave de
metabolitos innecesarios para controlar el estado dinámico in
vivo. Por ejemplo, con respecto a los aminoácidos que se
utilizan para construir los espaciadores X y T, su transferencia
metabólica puede controlarse hacia el tracto gastrointestinal
utilizando aminoácidos alifáticos, tales como Gly, Ala, Ile, Leu y
Val, aminoácidos aromáticos, tales como Phe, Trp y Tyr, o
aminoácidos que contienen azufre, tales como Met. Para controlar su
transferencia metabólica hacia la orina y el riñón, pueden
emplearse aminoácidos cargados seleccionando aminoácidos
hidroxílicos, tales como Ser y Thr, amidas de aminoácidos ácidos,
tales como Asn y Gln, aminoácidos cargados (ácidos y básicos), tales
como Arg, Asp, Glu y Lys. Además, cuando se necesite una distancia
entre el sitio de unión al receptor y la estructura que se va a
marcar con un metal, pueden utilizarse uno o más aminoácidos.
Con respecto a un aminoácido contenido en el
grupo U que puede marcarse con un metal, puede aplicarse la misma
descripción anterior. Por ejemplo, cuando se selecciona Asp o Lys, o
un compuesto que contiene un grupo carboxilo o un grupo amino, la
vía de excreción principal de los metabolitos finales después de la
administración del compuesto marcado con un metal radiactivo puede
controlarse hacia el riñón. Además, cuando se selecciona un
aminoácido hidrófobo, tal como Gly, la vía de excreción principal de
los metabolitos finales puede controlarse hacia el tracto
gastrointestinal.
Además, con respecto al aminoácido utilizado
como componente de los espaciadores X y T, para proporcionar
resistencia contra el metabolismo in vivo, pueden emplearse
D-aminoácidos o aminoácidos artificiales. De manera
más específica, el espaciador que consiste en
D-aminoácidos incluye, por ejemplo, secuencias de
aminoácidos, tales como D-Arg-Asp,
Arg-D-Asp,
D-Arg-D-Asp,
D-Asp-Arg,
Asp-D-Arg,
D-Asp-D-Arg,
Ser-D-Arg,
D-Ser-Arg,
D-Ser-D-Arg,
D-Arg-Ser,
Arg-D-Ser,
D-Arg-D-Ser,
Ser-D-Asp,
D-Ser-Asp,
D-Ser-D-Asp,
D-Asp-Ser,
Asp-D-Ser, y
D-Asp-D-Ser.
El compuesto que se une a leucocitos de la
presente invención puede sintetizarse según los métodos descritos a
continuación.
- (1)
- Cuando dicho compuesto consiste sólo en aminoácidos, el compuesto puede sintetizarse según métodos tales como el método con Boc y el método con Fmoc, utilizando sintetizadores de péptidos automáticos que se emplean habitualmente, tales como el sintetizador de péptidos automático fabricado por Applied Biosystems (EEUU). Un complejo sintetizado puede purificarse realizando simultáneamente una desprotección y una escisión del estado unido a la resina portadora en fase sólida, seguido de una cromatografía líquida de alto rendimiento (denominada en lo sucesivo HPLC) empleando una columna en fase inversa. De otra manera, dicho compuesto puede obtenerse mediante una síntesis peptídica en fase líquida, o a partir de fuentes animales y similares.
- (2)
- Cuando dicho compuesto no contiene aminoácidos, el compuesto puede sintetizarse en la mayoría de los casos mediante el mismo método descrito anteriormente. Por ejemplo, dicho compuesto puede sintetizarse como sigue. Es decir, un resto Lys o su derivado protegido se une a la fase sólida de una resina portadora, y su N-terminal se une satisfactoriamente con un resto aminoácido o su derivado protegido de X, Phe o su derivado protegido, Leu o su derivado protegido, y un aminoácido o su derivado protegido de Y. Después se activa un grupo \varepsilon-amino de la cadena lateral de Lys unida a la fase sólida de la resina portadora, y Ser o Thr o su derivado protegido de R se une a él, seguido de la posterior unión con un aminoácido o su derivado protegido del espaciador T, y un compuesto U que puede ser un grupo que se va a marcar con un metal o su derivado protegido, después se escinde el compuesto sintético de la fórmula anterior (1) de la resina portadora.
La composición medicinal que contiene un
compuesto en estado marcado como ingrediente activo obtenido
mediante el marcaje de un compuesto que se une a leucocitos de la
presente invención con un metal radiactivo o un metal paramagnético,
puede emplearse, por ejemplo, como agente para el diagnóstico con
radioisótopos o como agente terapéutico radiactivo, en particular,
para el diagnóstico de formación de imágenes y el tratamiento de un
sitio de lesión con infiltración vigorosa de leucocitos acompañada
de una reacción inmunológica en un individuo. Es decir, en una
enfermedad que presenta una lesión activa con infiltración vigorosa
por neutrófilos, monocitos o linfocitos, o más de dos especies de
células leucocíticas, puede realizarse la detección del sitio y la
medida del nivel de acumulación de leucocitos empleando un detector
específico.
Las enfermedades acompañadas de una reacción
inmunológica en un individuo incluyen un grupo de trastornos que
consisten en infección, inflamación y aterosclerosis en el cuerpo de
un mamífero. Es decir, dicho grupo de trastornos incluyen infección
vírica, infección bacteriana, infección fúngica, enfermedad por
protozoos, enfermedad por nematodos, enfermedad del colágeno, y
enfermedades autoinmunológicas distintas de la enfermedad del
colágeno. En Japón, aproximadamente 80% de los pacientes con
hepatitis son hepatitis víricas provocadas por una infección
vírica, y otras son principalmente hepatitis autoinmunológicas y,
por tanto, un gran número de enfermedades inflamatorias del hígado
son una enfermedad que tiene infiltración por linfocitos y
monocitos, comparadas con las que son por neutrófilos. En el caso
de una enfermedad que tenga un nivel relativamente bajo de
infiltración por neutrófilos como éstas, se hace notar que, si se
aplican los análogos convencionales de fMLF, la infiltración por
leucocitos de la lesión puede infraestimarse, porque la unión a
linfocitos y monocitos es más débil, comparada con la unión a
neutrófilos. Sin embargo, el compuesto que se une a leucocitos de
la presente invención permite identificar correctamente la
infiltración por leucocitos de la enfermedad con poca infiltración
de neutrófilos, tal como la mayoría de las enfermedades
autoinmunológicas y la leishmaniasis, porque dicho compuesto tiene
una alta propiedad de unión no sólo a neutrófilos, sino también a
linfocitos y monocitos.
Un grupo de trastornos que muestra una cantidad
de infiltración por linfocitos y monocitos comparada con
neutrófilos, o un grupo que muestra una gran población de
linfocitos y monocitos en los leucocitos infiltrados, incluye la
infección vírica, enfermedad por protozoos, enfermedad por
nematodos, enfermedad del colágeno, y enfermedades
autoinmunológicas distintas de la enfermedad del colágeno. La
presente invención se considera eficaz para el grupo de trastornos
acompañados de una reacción inmunológica, tal como infiltración de
leucocitos, es particularmente eficaz para el grupo de trastornos
que muestran una cantidad de infiltración por linfocitos y
monocitos, comparada con neutrófilos, o para el grupo que muestra
una gran población de linfocitos y monocitos en los leucocitos
infiltrados.
Además, puesto que el compuesto de la presente
invención tiene una propiedad de unión específica con neutrófilos
también, como se describe en la técnica anterior, el compuesto
también es eficaz para un grupo de trastornos que muestra una
cantidad de infiltración por neutrófilos comparada con las que
presentan linfocitos y monocitos, o para un grupo que muestra una
gran población de neutrófilos en los leucocitos infiltrados. Este
grupo de trastornos incluye, por ejemplo, endocarditis bacteriana,
infarto cardíaco, neumonía bronquial, neumonía lobar, tuberculosis
infiltrante, gastritis aguda, colitos pseudomembranosa, infección
por Yersinia, colitis ulcerosa, apendicitis aguda, angiocolitis
aguda, colecistitis, glomerulonefritis proliferativa intratubular,
glomerulonefritis infiltrante, pileonefritis aguda, salpingitis
aguda, cervicitis aguda, mastadenitis aguda, testitis aguda,
prostatitis aguda, angitis alérgica, inflamación purulenta aguda,
meningitis tuberculosa, osteomielitis supurante aguda, linfadenitis
aguda, y periarteritis tuberculosa.
Cuando el compuesto que se une a leucocitos de
la presente invención se emplea como agente para el diagnóstico con
radioisótopos, una realización preferida de dicho compuesto es un
compuesto marcado con un metal radiactivo adecuado para el
diagnóstico de formación de imágenes SPECT, tal como
Tc-99m, In-111,
Ga-67, Sn-117m,
Sm-153, y Re-186, o con un metal
radiactivo adecuado para el diagnóstico de formación de imágenes
PET, tal como Cu-64 o Ga-68. Cuando
el compuesto de la presente invención se emplea como un agente
terapéutico radiactivo, una realización preferida de dicho
compuesto es un compuesto marcado con un metal radiactivo, tal como
Y-90, Re-186 o
Re-188. Cuando el compuesto de la presente invención
se emplea como medio de contraste para el diagnóstico de formación
de imágenes MRI, una realización preferida de dicho compuesto es un
compuesto marcado con un metal paramagnético, tal como Cu, Fe o Gd
en estado coordinado.
El marcaje del compuesto que se une a leucocitos
de la presente invención con Tc-99m,
Re-186 y Re-188 puede realizarse
según el método habitual. Es decir, el compuesto marcado puede
prepararse disolviendo dicho compuesto en disolución salina o una
disolución tampón acuosa o similar, seguido de la adición de un
agente reductor, tal como cloruro estannoso, después se mezcla con
una disolución de pertecnetato de sodio o una disolución de
perrenato de sodio. Para el marcaje con Cu, Cu-64,
Fe, Mn, Gd o In-111, el compuesto marcado que se une
a leucocitos de la presente invención puede prepararse mezclando el
compuesto con una disolución acuosa ligeramente ácida que contenga
un ion de Cu, Cu-64, Fe, Mn, Gd o
In-111. En el caso del marcaje con
Ga-67, Ga-68 o Y-90,
el compuesto marcado que se une a leucocitos puede prepararse
mezclando dicho compuesto con un disolución acuosa ligeramente
ácida o ligeramente alcalina que contenga iones de
Ga-67, Ga-68 o
Y-90.
Cuando el compuesto marcado con un metal
radiactivo se emplea como agente para el diagnóstico con
radioisótopos o como agente terapéutico radiactivo, o el compuesto
marcado con un metal paramagnético se emplea como medio de
contraste para MRI, los compuestos marcados preparados según el
método anterior pueden utilizarse después de otra purificación
mediante HPLC para eliminar las impurezas y los iones sin reaccionar
de ion pertecnetato, ion perrenato, ion In-111, ion
Cu, ion Cu-64, ion Ga-67, ion
Ga-68, ion Fe, ion Mn, ion Gd, e ion
Y-90.
El compuesto marcado con un metal radiactivo o
un metal paramagnético puede mezclarse con aditivos
farmacológicamente aceptables para preparar un agente para el
diagnóstico con radioisótopos, un agente terapéutico radiactivo, o
un medio de contraste para MRI. Estos aditivos incluyen, por
ejemplo, estabilizantes farmacológicamente aceptables, tales como
ácido ascórbico y ácido p-aminobenzoico, ajustadores
del pH, tales como una disolución tampón acuosa, excipientes, tales
como D-manitol, agentes útiles para mejorar la
pureza radioquímica, tales como ácido cítrico, ácido tartárico,
ácido malónico, gluconato de sodio y glucoheptonato de sodio.
Además, la composición medicinal puede proporcionarse en forma de
un kit para la preparación en el sitio mezclando estos aditivos y
liofilizando, que resulta particularmente útil como agente para el
diagnóstico con radioisótopos de la presente invención.
El agente para el diagnóstico con radioisótopos,
el agente terapéutico radiactivo, o el medio de contraste para MRI
que contiene el compuesto que se une a leucocitos de la presente
invención en estado marcado con un metal radiactivo puede
administrarse a través de la vía parenteral, utilizada de forma
habitual, tal como mediante administración intravenosa. La
dosificación y la radiactividad de la composición que se creen
permiten la formación de imágenes y el tratamiento médico se
determinan considerando diversas condiciones, tales como el peso
corporal y la edad del paciente, el instrumento de formación de
imágenes radiactivas adecuado, el instrumento de medida de MRI, y
el estado de la enfermedad.
Para un uso humano, la dosificación del agente
de diagnóstico que contiene el compuesto marcado con
Tc-99m se encuentra en el intervalo de 37 MBq a
1110 MBq, preferiblemente en el intervalo de 185 MBq a 1110 MBq,
como radiactividad de Tc-99m. En el caso del agente
terapéutico que contiene el compuesto marcado con
Re-186 o Re-188, la dosificación se
encuentra en el intervalo de 37 MBq a 18500 MBq, preferiblemente en
el intervalo de 370 MBq a 7400 MBq, como radiactividad. En el caso
del agente terapéutico que contiene el compuesto marcado con
Y-90, la dosificación se encuentra en el intervalo
de 37 MBq a 3700 MBq, preferiblemente en el intervalo de 37 MBq a
1110 MBq, como radiactividad. La dosificación del compuesto marcado
con otros metales radiactivos es casi la misma. La dosificación de
un agente de diagnóstico que contiene el compuesto marcado con un
metal paramagnético, tal como Gd, Fe, Mn y Cu, es variable
correspondiendo al hospedante que se va a tratar, la sensibilidad
del instrumento de formación de imágenes MR, el tejido diana del
experimento de formación de imágenes, la manera específica de
administración, y la eficacia prevista del uso. Sin embargo, una
medicación específica para un paciente específico depende de
diversos factores, incluyendo la actividad (relajación inducida)
del reactivo específico que se va a utilizar, la edad, el peso
corporal, la condición de salud general, el sexo, las comidas, el
momento de la administración, la velocidad de excreción, la
combinación de agentes, y el criterio del médico encargado.
El nivel eficaz de dosificación del compuesto
marcado se encuentra entre aproximadamente 0,1 \mumol/kg de peso
corporal y aproximadamente 1000 \mumol/kg de peso corporal
diarios, preferiblemente entre aproximadamente 0,5 \mumol/kg de
peso corporal y aproximadamente 300 \mumol/kg de peso corporal
diarios. La preparación representativa contiene el compuesto
marcado en una cantidad de aproximadamente 1 mM a 1000 mM,
preferiblemente de aproximadamente 10 mM a 500 mM.
A continuación, la presente invención se
describe con más detalles mediante los ejemplos, pero el alcance de
la presente invención no debe limitarse a éstos. Los métodos de
medida para los compuestos obtenidos y los reactivos utilizados en
los ejemplos se describen a continuación.
- (1)
- Contador gamma: la medida de la distribución del compuesto marcado en sangre se realizó utilizando un contador gamma Auto-Well (fabricado por ALOKA Corporation, Japón), y la medida de la distribución del compuesto marcado en el cuerpo se realizó utilizando un analizador de canal único de NaI (fabricado por OHYO KOKEN KOGYO CO., Japón).
- (2)
- Cámara gamma: se empleó GMS-550U (fabricada por TOSHIBA MEDICAL SYSTEMS CORPORATION, Japón).
- (3)
- HPLC de fase inversa: se utilizó la columna en fase inversa Millipore Puresil 5 \mum C18 (4,6 x 150 mm) (fabricada por Millipore Corporation, EEUU).
- (4)
- Todos los compuestos peptídicos se sintetizaron mediante el método de síntesis peptídica en fase sólida.
- (5)
- ^{99m}TcO_{4}^{-}: se empleó un eluato como una disolución salina de un generador ^{99}Mo/^{99m}Tc (NIHON MEDI-PHYSICS CO., LTD., Japón).
- (6)
- Todos los reactivos utilizados eran de calidad extrapura.
- (7)
- Todos los animales experimentales se alimentaron durante una semana bajo condiciones de un ciclo de luz-oscuridad cada 12 horas antes de emplearlos. Durante el periodo, la ingesta de alimento y agua no se limitó.
Ejemplo
1
Los siguientes péptidos se sintetizaron mediante
síntesis peptídica en fase sólida y se emplearon en los Ejemplos a
continuación.
Péptido 3:
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-Cys-Gly-Asn);
Péptido 4:
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-Cys-Asp-Asp);
Péptido 5:
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-Cys-Gly-Asp);
Péptido 6:
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp);
Péptido 7:
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-ácido
cyclamtetracarboxílico);
Péptido 8:
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Ser-Asn-D-Arg-Cys-Asp-Asp);
Péptido 9:
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-DTPA);
Péptido 13:
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-ácido
cyclambutírico);
Péptido 14:
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-ácido
cyclambutírico);
Péptido 15:
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Ser-Asn-ácido
cyclambutírico);
Péptido 16:
acetil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp);
Péptido 17:
carbamil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp);
y
Péptido 18:
metil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp).
En los anteriores péptidos, el ácido
cyclamtetracarboxílico, el DTPA y el ácido cyclambutírico significan
ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecan-1,4,8,11-tetraacético,
ácido dietilentriaminopentaacético y ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecanbutírico,
respectivamente.
Péptido 1:
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-Glu-Cys;
Péptido 2:
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Cys-Asn-Asp);
Péptido 10:
formil-Met-Leu-Phe-Lys-\varepsilon-(-Gly-Gly-Cys);
Péptido 11:
formil-Met-Leu-Phe-Lys-\varepsilon-(-Gly-Gly-Ac-S-Bzl);
y
Péptido 12:
formil-Met-Leu-Phe-Lys-\varepsilon-(-Gly-Asp-Ac-S-Bzl).
Empleando el sintetizador peptídico (modelo
430A, Applied Biosystems), el péptido se sintetizó bajo la condición
de escala de 0,5 mM en resina MBHA (hidrocloruro de resina de
p-metoxibenzhidrilamina, copolímero de
poliestireno-divinilbenceno al 1%) mediante el
método de Boc. La cadena lateral del resto Lys en el
C-terminal se protegió con un grupo Fmoc. Después
de la extensión de la cadena peptídica y la formilación del grupo
amino N-terminal, el grupo Fmoc de la cadena
lateral del resto Lys se escindió mediante piperidina al 20%/DMF
para extender la cadena peptídica hacia la dirección de la cadena
lateral. El péptido se retiró bajo una reacción en una mezcla de
anhídrido de fluoruro de hidrógeno:p-cresol (80:20)
a -2ºC a -5ºC durante 1,0 hora.
La purificación se realizó mediante una
cromatografía líquida (HPLC) utilizando una columna
YMC-Pack ODS-A
SH-365-5 (30 x 250 mm) y eluyente A:
TFA al 0,1%/agua purificada, y eluyente B: TFA al 0,1%/acetonitrilo
bajo una condición de gradiente de concentración de A a B a una
velocidad de elución de 20 ml/min. Las fracciones de los
principales picos se recogieron y se liofilizaron para obtener el
péptido objetivo. La pureza de péptido obtenido de esta manera se
determinó mediante HPLC de fase inversa.
La síntesis también puede realizarse empleando
una resina de precarga en lugar de una resina de MBHA.
Después el péptido se hidrolizó en ácido
clorhídrico 6 M a 110ºC durante 22 horas, se determinó una
composición de aminoácidos que se corresponde con el pico principal
obtenido, y se confirmó que era el péptido 3 objetivo, después el
pico que coincide con la composición de aminoácidos se liofilizó
para obtener el péptido 3 objetivo. Se confirmó que el peso
molecular del péptido era idéntico al valor teórico mediante
espectrometría de masas (denominada en lo sucesivo
ESI-MS) para determinar el peso molecular. Los
valores analíticos de la composición de aminoácidos (número de cada
aminoácido en una molécula) del péptido 3 obtenido se muestran a
continuación. Entre paréntesis se muestran los valores teóricos de
la composición de aminoácidos (número de cada aminoácido en una
molécula) del péptido objetivo. Péptido 3 = Asp: (1) 1,02; Ser: (1)
0,93; Gly: (1) 1,03; Tyr: (1) 1,00; Phe: (1) 1,01; Lys: (1) 1,00,
NH_{3} (2) 2,10; Cys: (1) 0,86; Leu: (1) + Nle (2) 2,88.
Además, el peso molecular del péptido 3 obtenido
mediante ESI-MS se muestra a continuación. El valor
numérico entre paréntesis indica un valor teórico del peso
molecular del péptido objetivo.
ESI-MS: PM = 1183,9
(1184,4).
Otros péptidos se sintetizaron y se
identificaron de una manera similar. Puesto que el péptido 1, el
péptido 10, el péptido 11 y el péptido 12 son péptidos que no están
amidados en sus C-terminales, se sintetizaron de
una manera similar a la que se muestra en la síntesis del péptido 3
empleando una resina de HMP (resina de
4-hidroximetilfenoximetilcopoliestireno-divinilbenceno
al 1%) en lugar de una resina de MBHA. Los valores analíticos de la
composición de aminoácidos se muestran a continuación. Para el
péptido 1 y el péptido 10, sólo se muestran las composiciones de
aminoácidos.
Péptido 1 = Glu: (1) 1,04; Leu: (1) 0,99; Tyr:
(1) 0,98; Phe: (1) 0,99; Lys: (1) 1,00; Cys: (1) 0,97; Nle: (2)
2,03.
Péptido 2 = Asp: (2) 2,00; Leu: (1) 0,86; Tyr:
(1) 1,00; Phe: (1) 1,01; Lys: (1) 1,00, NH_{3}: (2) 1,94; Cys:
(1) 0,88; Nle: (2) 2,10; ESI-MS: PM = 1.155,0
(1.155,4).
Péptido 4 = Asp: (2) 2,00; Ser: (1) 0,90; Tyr:
(1) 0,99; Phe: (1) 1,01; Lys: (1) 1,00; NH_{3}: (1) 1,10; Leu:
(1) + Nle: (2) 2,84; Cys: (1) 0,92; ESI-MS: PM =
1.243,0 (1.243,4).
Péptido 5 = Asp: (1) 1,00; Ser: (1) 0,90; Gly:
(1) 1,01; Tyr: (1) 0,97; Phe: (1) 1,00; Lys: (1) 1,03; NH_{3}:
(1) 1,18; Leu: (1) + Nle: (2) 2,86; Cys: (1) 0,91;
ESI-MS: PM = 1.185,1 (1.185,4).
Péptido 6 = Asp: (3) 3,19; Ser: (1) 0,97; Tyr:
(1) 0,97; Phe: (1) 0,98; Lys: (1) 1,00; NH_{3}: (1) 1,20; Leu:
(1) + Nle: (2) 2,80; Arg: (1) 1,06; Cys: (1) 0,92;
ESI-MS: PM = 1.514,4 (1.514,7).
Péptido 7 = Ser: (1) 0,92; Tyr: (1) 1,00; Phe:
(1) 1,02; Lys: (1) 1,00; NH_{3}: (1) 1,15; Leu: (1) + Nle: (2)
2,89; ESI-MS: PM = 1.324,3 (1.324,6).
Péptido 8 = Asp: (3) 2,94; Ser: (2) 1,80; Leu:
(1) 1,01; Phe: (1) 1,00; Lys: (1) 1,01; NH_{3}: (2) 2,10; Nle:
(1) 0,95; Cys: (1) 1,01; ESI-MS: PM = 1.324,1
(1.324,5).
Péptido 9 = Ser: (1) 0,91; Tyr: (1) 1,00; Phe:
(1) 0,99; Lys: (1) 1,00; NH_{3}: (1) 1,23; Leu: (1) + Nle: (2)
2,87; Arg: (1) 1,00; ESI-MS: PM = 1.441,4
(1.441,6).
Péptido 10 = Gly: (2) 1,88; Met: (1) 0,98; Phe:
(1) 1,00; Lys: (1) 1,02; Leu: (1) 1,04.
Péptido 11 = Gly: (2) 1,94; Met: (1) 0,91; Phe:
(1) 1,00; Lys: (1) 1,02; Leu: (1) 1,01; ESI-MS: PM =
842,5 (842,4).
Péptido 12 = Asp: (1) 0,94; Gly: (2) 0,92; Met:
(1) 0,96; Phe: (1) 1,00; Lys: (1) 1,01; Leu: (1) 1,00;
ESI-MS: PM = 901,5 (902,1).
Péptido 13 = Ser: (1) 0,92; Tyr: (1) 1,00; Phe:
(1) 1,01; Lys: (1) 1,01; NH_{3}: (1) 1,11; Leu: (1) + Nle: (2)
2,88; ESI-MS: PM = 1.178,3 (1.178,5).
Péptido 14 = Asp: (1) 1,01; Ser: (1) 0,91; Tyr:
(1) 1,00; Phe: (1) 1,00; Lys: (1) 1,01; NH_{3}: (1) 1,06; Leu:
(1) + Nle: (2) 2,89; Arg: (1) 1,00; ESI-MS: PM =
1.449,6 (1.449,8).
Péptido 15 = Asp: (1) 1,01; Ser: (2) 1,77; Tyr:
(1) 0,98; Phe: (1) 1,00; Lys: (1) 1,01; NH_{3}: (2) 2,09; Leu:
(1) + Nle: (2) 2,87; ESI-MS: PM = 1.379,5
(1.379,7).
Péptido 16 = Asp: (3) 3,02; Ser: (1) 0,93; Tyr:
(1) 1,00; Phe: (1) 1,00; Lys: (1) 1,00; NH_{3}: (1) 1,10; Leu:
(1) + Nle: (2) 2,86; Arg: (1) 1,01; Cys (1) 1,07;
ESI-MS: PM = 1.528,3 (1.528,7).
Péptido 17 = Asp: (3) 2,95; Ser: (1) 0,91; Tyr:
(1) 1,00; Phe: (1) 1,00; Lys: (1) 1,00; NH_{3}: (1) 1,79; Leu:
(1) + Nle: (2) 2,58; Arg: (1) 1,00; Cys (1) 1,00;
ESI-MS: PM = 1.529,4 (1.529,7).
Péptido 18 = Asp: (3) 2,99; Ser: (1) 0,92; Tyr:
(1) 0,88; Phe: (1) 0,97; Lys: (1) 0,97; NH_{3}: (1) 1,12; Leu:
(1) + Nle: (1) 1,85; Arg: (1) 1,00; Cys (1) 1,03; MeNle: (1) 0,95;
ESI-MS: PM = 1.500,5 (1.500,7).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Una disolución de
Tc-99m-pertecnetato de sodio
(denominado en lo sucesivo ^{99m}TcO4^{-}),
1,1-3,0 GBq, se añadió a un vial que contenía una
mezcla de ácido glucoheptónico 40,3 \mumol/300 \mul y una
disolución de cloruro estannoso 130 nmol/50 \mul para alcanzar un
volumen total de 1,35 ml. La mezcla se hizo reaccionar a
temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación y volteando de
vez en cuando. Un parte se recogió y se confirmó que la proporción
de marcaje de Tc-99m de Tc-99m-ácido
glucoheptónico era 95% o más.
Cada uno de los 16 péptidos obtenidos en el
Ejemplo 1 se disolvieron en dimetilformamida (DMF) y se ajustó una
concentración de cada uno en cada disolución hasta
0,25-12,5 nmol/200 \mul con agua ultrapura, tampón
fosfato 10 mM que contenía NaCl al 0,9%, pH 7,4 (denominado en lo
sucesivo PBS), o tampón carbonato 10 mM, pH 8,0 (denominado en lo
sucesivo CB). A cada disolución se le añadieron 200 \mul de
disolución de Tc-99m-ácido glucoheptónico, se
mezcló con agitación y se hizo reaccionar a
100ºC-120ºC durante 10 minutos. Después de
finalizar el marcaje, una parte de la mezcla de reacción se recogió
y se determinó la proporción de marcaje de Tc-99m
empleando HPLC. Las condiciones de HPLC fueron las siguientes:
columna: Millipore puresil 5 \mum C18 (4,6 x 150 mm); caudal: 1
ml/min; longitud de onda de detección: 220 nm; detector de
radiactividad: analizador de canal único de NaI; eluyente A: ácido
trifluoroacético al 0,1% (denominado en lo sucesivo TFA)/agua
purificada; eluyente B: TFA al 0,1%/acetonitrilo; y gradiente de
concentración: 0 minutos (B al 20%) \rightarrow 20 minutos (B al
50%).
En la Tabla 1 se muestran las proporciones de
marcaje de 16 especies de péptidos marcados con
Tc-99m. Los resultados del péptido 4 y del péptido
6 como el cromatograma representativo en un análisis HPLC de los
compuestos marcados obtenidos se muestran en la Figura 1 y la
Figura 2, respectivamente. En cada péptido se reconoció un único
producto marcado. Los resultados de las proporciones de marcaje
mostrados en la Tabla 1 indican que puede obtenerse un elevado
marcaje con Tc-99m de 80% o más.
Ejemplo
3
(1) Los péptidos que se marcaron con
Tc-99m en el Ejemplo 2 (péptido 3, péptido 4,
péptido 6, péptido 8, péptido 9, péptido 12, péptido 13, péptido
14, péptido 15, péptido 16, péptido 17 y péptido 18) se purificaron
separando los péptidos no marcados y los péptidos marcados
empleando una HPLC de fase inversa bajo las mismas condiciones de
HPLC que en el Ejemplo 2. Se realizó un gradiente de elución bajo la
condición de 20% \rightarrow 50% (TFA al 0,1% acetonitrilo/TFA al
0,1% agua): 0 \rightarrow 20 minutos. Posteriormente se preparó
una disolución de gradiente de densidad Percoll. A 90 ml de una
disolución de Percoll no diluida (Pharmacia Biotech Inc.) (gravedad
específica 1,130 g/ml) se le añadieron 10 ml de NaCl 1,5 M, para
preparar una disolución isotónica igual a la disolución salina
fisiológica. Esta disolución se diluyó añadiendo disolución salina
fisiológica para preparar disoluciones de Percoll 1,096, 1,077 y
1,063 g/ml. Las disoluciones de Percoll 1,096, 1,077 y 1,063 g/ml
preparadas de esta manera, de cada una 1 ml, se dispusieron en capas
en un tubo de 15 ml. Se confirmó que se había obtenido la densidad
deseada utilizando esferas marcadoras de densidad (roja: 1,062;
azul: 1,075; naranja: 1,087; y verde: 1,098). La sangre utilizada
para el ensayo se recogió de la vena auricular de un conejo macho
de raza New Zeland White (NZW) sano, exento de patógenos específicos
(SPF), con un peso corporal de aproximadamente 2 kg.
Para estudiar la distribución en la sangre de
conejo con infección como modelo de inflamación aguda, se empleó
sangre de conejo inflamada con Staphylococcus aureus en lugar
de la sangre del conejo sano. Se suspendieron aproximadamente
10^{8} de recuentos viables de Staphylococcus aureus en 1
ml de disolución salina fisiológica, y se administraron 100 \mul
de la suspensión bacteriana por vía intramuscular en la pantorrilla
derecha de un conejo macho de raza New Zeland White (NZW) con un
peso corporal de aproximadamente 2 kg. La sangre se recogió de la
vena auricular del conejo después de aproximadamente 24 horas y se
empleó para el estudio.
Para estudiar la distribución en la sangre de un
conejo con colitis ulcerosa como modelo de inflamación aguda, se
empleó sangre de conejo inflamada con ácido
2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBS) en lugar de la
sangre del conejo sano. Se preparó un modelo de conejo con colitis
ulcerosa según el método de Anthony et al. (Anthony et
al., Int. J. Exp. Path., 76, 215-224, 1995). Se
disolvieron 360 mg de TNBS en 4 ml de agua ultrapura y se añadieron
3,2 ml de etanol para preparar etanol al 46%/disolución salina
fisiológica 50,0 mg/ml. Un tubo se insertó por el ano hasta una
profundidad de aproximadamente 15 cm hacia el intestino de un conejo
de raza New Zeland White (NZW) nembutalizado, de 7 semanas de edad,
con un peso de 1,3-1,4 kg, macho, en ayunas durante
un día, y se infusionaron 3 ml de aire. Una disolución de
TNBS/etanol al 46%/disolución salina fisiológica, 0,8 ml, se
infusionó posteriormente y se masajeó y se cambió la postura durante
2 minutos. Después de 4-5 días, se recogió sangre
de la vena auricular del conejo y se empleó para el estudio.
La sangre de conejo, 2 ml de cada uno, se
calentó a 37ºC durante 5 minutos en un baño tibio. Cada muestra de
cuatro 3 \mul de los
Tc-99m-péptidos (111 MBq/ml,
Tc-99m-péptido 1,8 x 10^{-11}
mol/ml) purificada mediante HPLC se añadieron a ella, y se incubó
durante 30 minutos. La muestra de sangre se dispuso sobre una
disolución de gradiente de densidad Percoll. La muestra en capa se
centrífugo a 2000 rpm (800 x g) durante 15 minutos. Después de la
centrifugación, el tubo se congeló y cada fracción se escindió con
un escalpelo, después se midió la radiactividad de cada fracción
utilizando un contador gamma Auto-Well para
determinar la distribución de la radiactividad de cuatro tipos de
Tc-99m-péptidos en cada componente
sanguíneo.
Según los recuentos de leucocitos de
1000-8000 células/\mul del parámetro hematológico
de conejos y el número de receptores FPR,
100.000-120.000/célula, encontrado en el patrón, se
calcularon los números estimados del receptor FPR en la sangre de
los conejos como 0,17-1,6 x 10^{-12} mol/ml, y las
proporciones de péptido/receptor en conejos eran de
0,01-0,11. Los resultados que muestran los
porcentajes entre la radiactividad en cada componente sanguíneo y
la radiactividad en sangre completa se muestran en la figura 3. Los
resultados que muestran los porcentajes entre la radiactividad de
la fracción de granulocitos y la radiactividad en los leucocitos
totales, y entre la radiactividad de la fracción de linfocitos y
monocitos y la radiactividad en los leucocitos totales se muestran
en la Tabla 2 y la
Tabla 3.
Tabla 3.
En la sangre de conejo NZW sano, las
distribuciones de Tc-99m-péptido 3 y
Tc-99m-péptido 12 en la fracción de
granulocitos y en la fracción de linfocitos y monocitos eran de 5% o
menos de la radiactividad en sangre completa, y no se observó unión
fuerte.
En la sangre de conejos con enfermedad
infecciosa provocada por Staphylococcus aureus, la
distribución de radiactividad del
Tc-99m-péptido 4 en la fracción de
granulocitos era de 10,78% de la radiactividad en sangre completa y
la del Tc-99m-péptido 4 en la
fracción de linfocitos y monocitos era de 10,22% de la radiactividad
en sangre completa después de una incubación de 30 minutos. La
radiactividad de la fracción de granulocitos era de 50,22% para la
radiactividad de los leucocitos totales, y la radiactividad de la
fracción de linfocitos y monocitos era de 49,78% para la
radiactividad de los leucocitos totales. La distribución de
radiactividad del Tc-99m-péptido 6
en la fracción de granulocitos era de 18,27% de la radiactividad en
sangre completa y la del
Tc-99m-péptido 6 en la fracción de
linfocitos y monocitos era de 20,21% de la radiactividad en sangre
completa después de una incubación de 30 minutos. La radiactividad
de la fracción de granulocitos era de 47,65% para la radiactividad
de los leucocitos totales, y la radiactividad de la fracción de
linfocitos y monocitos era de 52,35% para la radiactividad de los
leucocitos totales. En los compuestos marcados con
Tc-99m del péptido 8, péptido 9, péptido 13,
péptido 14, péptido 15, péptido 16, péptido 17 y péptido 18, 10% o
más de la radiactividad de la sangre completa se distribuyó en los
leucocitos, y aproximadamente del 27% a aproximadamente 77% de la
radiactividad de la sangre completa se distribuyó en la fracción de
linfocitos y monocitos.
La distribución de la radiactividad del
Tc-99m-péptido 12 control en la
fracción de granulocitos era de 39,73% de la radiactividad de
sangre completa, y la del
Tc-99m-péptido 12 en la fracción de
linfocitos y monocitos era de 8,89% de la radiactividad en sangre
completa después de una incubación de 30 minutos. La radiactividad
de la fracción de granulocitos era de 81,58% para la radiactividad
de los leucocitos totales, y la radiactividad de la fracción de
linfocitos y monocitos era de 18,42% para la radiactividad de los
leucocitos totales. A partir de estos resultados, resulta evidente
que la distribución de los compuestos marcados con
Tc-99m del péptido 4, péptido 6, péptido 8, péptido
9, péptido 13, péptido 14, péptido 15, péptido 16, péptido 17 y
péptido 18, como parte de la presente invención, en la fracción de
linfocitos y monocitos era mayor que la del péptido convencional,
Tc-99m-péptido 12, en sangre de
conejo con enfermedad infecciosa provocada por Staphylococcus
aureus.
En la sangre de un modelo de conejo con colitis
ulcerosa preparada mediante TNBS, como se muestra en la figura 3,
la distribución de radiactividad del
Tc-99m-péptido 3 en la fracción de
granulocitos era de 18,44% de la radiactividad en sangre completa,
y la del Tc-99m-péptido 3 en la
fracción de linfocitos y monocitos era de 15,94% de la
radiactividad en sangre completa después de una incubación de 30
minutos. La radiactividad de la fracción de granulocitos era de
53,72% para la radiactividad de los leucocitos totales, y la
radiactividad de la fracción de linfocitos y monocitos era de
46,28% para la radiactividad de los leucocitos totales, como se
muestra en la tabla 3. La distribución de radiactividad del
Tc-99m-péptido 6 en la fracción de
granulocitos era de 45,44% de la radiactividad en sangre completa,
y la del Tc-99m-péptido 6 en la
fracción de linfocitos y monocitos era de 12,60% de la
radiactividad en sangre completa después de una incubación de 30
minutos. La radiactividad de la fracción de granulocitos era de
78,27% para la radiactividad de los leucocitos totales, y la
radiactividad de la fracción de linfocitos y monocitos era de 21,73%
para la radiactividad de los leucocitos totales. La distribución de
radiactividad del Tc-99m-péptido 12
control en la fracción de granulocitos era de 15,10% de la
radiactividad en sangre completa, y la del
Tc-99m-péptido 12 en la fracción de
linfocitos y monocitos era de 8,34% de la radiactividad en sangre
completa después de una incubación de 30 minutos. La radiactividad
de la fracción de granulocitos era de 64,66% para la radiactividad
de los leucocitos totales, y la radiactividad de la fracción de
linfocitos y monocitos era de 35,34% para la radiactividad de los
leucocitos totales.
Para estos resultados, resulta evidente que las
distribuciones del Tc-99m-péptido 3
y Tc-99m-péptido 6, como parte de
la presente invención, en la fracción de linfocitos y monocitos son
mayores que la del péptido convencional,
Tc-99m-péptido 12, en sangre de un
modelo de conejo con colitis ulcerosa.
De lo anterior, se demuestra que el péptido de
la presente invención se une con más fuerza a los linfocitos y
monocitos que a los granulocitos, comparado con el
Tc-99m-péptido 12 convencional, y se
confirmó que el péptido de la presente invención es eficaz para el
tratamiento de la inflamación crónica frecuentemente infiltrada por
linfocitos y monocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
(Proporción de unión (%) para
leucocitos totales, n = 3, media \pm
DE)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Proporción de unión (%) para
leucocitos totales, n = 3, media \pm
DE)
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se suspendieron Staphylococcus aureus
viables, aproximadamente 10^{8} recuentos, en 1 ml de disolución
salina fisiológica, y 100 \mul de la suspensión se administraron
por vía intramuscular en la pantorrilla derecha de un conejo de
raza New Zeland White (NZW) de aproximadamente 2 kg. Después de 24
horas, los conejos del modelo que mostraron una inflamación
aparente se anestesiaron con pentobarbital, y cada uno de péptido 3,
péptido 4, péptido 5, péptido 6, péptido 7, péptido 8, péptido 9,
péptido 12, péptido 13, péptido 14, péptido 15, péptido 16, péptido
17 y péptido 18 que estaban marcados con Tc-99m,
37-74 MBq cada uno, se administraron en la vena de
la oreja. Después de 5 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5
horas y 22 horas desde la administración se registraron imágenes
utilizando una cámara gamma. Los momentos desde 5 minutos a 5 horas
después de la administración son los momentos desde aproximadamente
24 horas a 29 horas después de iniciarse la inflamación y
corresponden a la fase aguda de la inflamación. Los momentos después
de 22 horas son los momentos después de aproximadamente 46 horas
desde el inicio de la inflamación y corresponden a la fase subaguda
de la
inflamación.
inflamación.
Las figuras representativas de los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7,
Figura 8, Figura 9, Figura 10, Figura 11, Figura 12, Figura 13,
Figura 14 y Figura 15. Las regiones de interés se muestran sobre
las imágenes, y las proporciones de cuentas en la región de interés
de 1000 píxeles para las cuentas del cuerpo total (proporción de
dosis inyectada (ID)/K píxel) se muestran en la tabla 4. Las
proporciones que indican [inflamación]/[músculo normal]
(proporciones de [A]/[M]) determinadas a partir de las proporciones
anteriores se muestran en la Tabla 5.
En el
Tc-99m-péptido 12 conocido
anteriormente, la proporción de [A]/[M] después de 2 horas desde la
administración (26 horas después de iniciarse la inflamación, fase
aguda de la inflamación) era de 10,34 \pm3,34 (media \pmerror
estándar) (n = 3), y la proporción de [A]/[M] después de 22 horas
desde la administración (46 horas después de iniciarse la
inflamación, fase subaguda de la inflamación) era de 33,94
\pm20,76 (n = 3), mientras que la acumulación en la región
inflamatoria disminuyó desde 1,66 \pm0,63% ID/K píxel después de 2
horas desde la administración (26 horas después de iniciarse la
inflamación) a 0,90 \pm0,29% ID/K píxel después de 22 horas desde
la administración (46 horas después de iniciarse la
inflamación).
En el
Tc-99m-péptido 3 de la presente
invención, la proporción de [A]/[M] después de 2 horas desde la
administración (26 horas después de iniciarse la inflamación) era
de 6,55 \pm2,06 (n = 5), y la proporción de [A]/[M] después de 22
horas desde la administración (46 horas después de iniciarse la
inflamación) era de 54,16 \pm32,86 (n = 5), mientras que la
acumulación en la región inflamatoria aumentó desde 0,93 \pm0,31%
ID/K píxel después de 2 horas desde la administración (26 horas
después de iniciarse la inflamación) a 3,70 \pm2,67% ID/K píxel
después de 22 horas desde la administración (46 horas después de
iniciarse la inflamación). En el
Tc-99m-péptido 4, la proporción de
[A]/[M] después de 2 horas desde la administración (26 horas después
de iniciarse la inflamación) era de 6,75 \pm2,71 (n = 3), y la
proporción de [A]/[M] después de 22 horas desde la administración
(46 horas después de iniciarse la inflamación) era de 29,07
\pm19,97 (n = 3), que son valores más bajos que los del
Tc-99m-péptido 12 conocido
anteriormente, mientras que la acumulación en la región inflamatoria
aumentó desde 1,09 \pm0,22% ID/K píxel después de 2 horas desde
la administración (26 horas después de iniciarse la inflamación) a
1,85 \pm0,34% ID/K píxel después de 22 horas desde la
administración (46 horas después de iniciarse la inflamación). En
el Tc-99m-péptido 6, la proporción
de [A]/[M] después de 2 horas desde la administración (26 horas
después de iniciarse la inflamación) era de 14,25 \pm0,31 (n = 3),
y la proporción de [A]/[M] después de 22 horas desde la
administración (46 horas después de iniciarse la inflamación) era
de 43,84 \pm12,58 (n = 3), mientras que la acumulación en la
región inflamatoria aumentó desde 1,22 \pm0,05% ID/K píxel
después de 2 horas desde la administración (26 horas después de
iniciarse la inflamación) a 1,77 \pm0,07% ID/K píxel después de
22 horas desde la administración (46 horas después de iniciarse
la
inflamación).
inflamación).
En general, la mayoría de los leucocitos
infiltrados hacia la región inflamatoria después de aproximadamente
24 horas desde la infección consistían principalmente en neutrófilos
(ocupados principalmente por granulocitos), después éstos
disminuyen gradualmente y la mayoría de los leucocitos infiltrados
cambian a monocitos, incluyendo macrófagos y linfocitos. Desde el
punto de vista clínico, la mayoría de las inflamaciones, que
requieren un ensayo médico nuclear, son inflamaciones después de la
fase subaguda que muestran una significativa infiltración de
monocitos y linfocitos. A partir de los anteriores resultados, se
demuestra que los péptidos de la presente invención son
extremadamente útiles para el diagnóstico, no sólo en la fase aguda
de la inflamación después de 26 horas de la aparición de la
inflamación (2 horas después de la administración), sino también en
la fase subaguda de la inflamación después de 46 horas desde la
aparición de la inflamación (22 horas después de la
administración).
(n = 3,
Tc-99m-péptido 3: n= 5, media \pm
desviación
estándar)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
(n = 3,
Tc-99m-péptido 3: n= 5, media \pm
desviación
estándar)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Las biodistribuciones de cuatro tipos de
compuestos marcados con Tc-99m que consisten en el
Tc-99m-péptido 3,
Tc-99m-péptido 4,
Tc-99m-péptido 6 y
Tc-99m-péptido 12 obtenidos en el
Ejemplo 2 se estudiaron en ratas normales. Los experimentos de
biodistribución se realizaron según el método convencional para los
expertos en la técnica. Una muestra, 3,0-3,7 mBq
cada una, se administró a la vena de la cola de ratas de raza
Sprague-Dawley SD que no están en ayunas (peso
corporal 140-200 g) bajo anestesia con ravonal.
Después de 5 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 180 minutos desde la
administración, las ratas se exanguinaron desde la aorta abdominal.
Se midieron las cuentas radiactivas de cada órgano extirpado frente
a la dosis inyectada con un analizador de canal único de NaI. Se
midió el peso de cada órgano para el cálculo de la biodistribución.
Se mostró una proporción de radiactividad en cada órgano frente a
la dosis inyectada mediante un valor por órgano (%ID/órgano) o un
valor por gramo de órgano
(%ID/g órgano).
(%ID/g órgano).
Los resultados se muestran en la Tabla 6, Tabla
7, Tabla 8 y Tabla 9. Los cambios a lo largo del tiempo en la orina
y el intestino delgado se muestran en la Figura 16 y Figura 17 a
partir de los resultados de la Tabla 6, Tabla 7, Tabla 8 y Tabla
9.
Según los resultados que aparecen en la Tabla 6,
Tabla 7, Tabla 8, Tabla 9, Figura 16 y Figura 17, se descubrió que
las biodistribuciones de los péptidos marcados con
Tc-99m en ratas normales eran muy diferentes entre
sí, dependiendo de los restos aminoácidos de Z y W de la fórmula
descrita en la reivindicación 1. Es decir, una vía metabólica del
Tc-99m-péptido 12 convencional puede
ir, principalmente, a través de la vía de excreción hepatobiliar,
debido a la alta acumulación en el hígado después de 5 minutos desde
la administración, la alta acumulación en el estómago en cada
momento comparado con otros péptidos, la alta acumulación en cada
momento en el intestino delgado, y la alta acumulación a los 180
minutos desde el intestino al apéndice (Figura 17). Además, resulta
difícil visualizar la inflamación abdominal, tal como la enfermedad
del intestino inflamatoria, debido a la alta acumulación en el
intestino delgado.
Al contrario de esto, entre los péptidos de la
presente invención, los compuestos marcados con
Tc-99m del péptido 3, péptido 4 y péptido 6, en los
que T y U de la fórmula descrita en la reivindicación 1 se
convirtieron o añadieron con un aminoácido hidrófilo, tal como un
aminoácido cargado y un aminoácido ácido, fueron diferentes de la
biodistribución del Tc-99m-péptido
12 y fueron estimulados para la excreción hacia la orina (Figura
16). En particular, la tendencia resultó significativa para
Tc-99m-péptido 6. Esta
característica es bastante importante para la visualización de la
inflamación abdominal, tal como la enfermedad del intestino
inflamatoria. Por consiguiente, se sugiere que los péptidos de la
presente invención son eficaces para observar la región con
infiltración de leucocitos abdominal debido a la baja distribución
en la región abdominal, en particular en el intestino delgado,
comparado con el péptido 12 conocido convencionalmente.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Columna superior: %ID/órgano;
columna inferior:
%ID/g
(n = 3, media \pm desviación
estándar)
Columna superior: %ID/órgano;
columna inferior:
%ID/g
(n = 3, media \pm desviación
estándar)
Columna superior: %ID/órgano;
columna inferior:
%ID/g
(n = 3, media \pm desviación
estándar)
Columna superior: %ID/órgano;
columna inferior:
%ID/g
(n = 3, media \pm desviación
estándar)
\newpage
Ejemplo
6
Preparación del modelo de inflamación: se
preparó un modelo de colitis ulcerosa de rata según el método de
Anthony et al. (Anthony et al., Int. J. Exp. Path.,
76, 215-224, 1995). Se disolvieron 360 mg de ácido
2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBS) en 4 ml de
agua ultrapura, y se añadieron 3,2 ml de etanol para preparar una
disolución de etanol al 46%/disolución salina fisiológica 50,0
mg/ml. Un tubo se insertó por el ano hasta una profundidad de
7-8 cm hacia el intestino de ratas de raza SD
(Sprague Dawley, exentas de patógenos específicos) eterizadas,
hembras, de 7 semanas de edad, con un peso corporal de
164-177 g, en ayunas desde hacía 24 horas, y se
infusionaron 0,1 ml de aire. Posteriormente se infusionó una
disolución de TNBS/etanol al 46%/disolución salina fisiológica, 0,2
ml, se masajeó y se cambió la postura durante 2 minutos. Después de
5 días, las ratas se emplearon para el
estudio.
estudio.
El
Tc-99m-péptido 3,
Tc-99m-péptido 4,
Tc-99m-péptido 6 y
Tc-99m-péptido 12 convencional
conocido anteriormente como control, aproximadamente 7,4 MBq/rata
de cada uno, se administraron a la vena de la cola. Después de 5
minutos, 30 minutos, 60 minutos y 180 minutos desde la
administración, las ratas se exanguinaron y se midió la
distribución radiactiva en cada órgano utilizando un analizador de
canal único de NaI para obtener %ID/cada órgano y %ID/g órgano. El
recto con región de inflamación se designó como región de
inflamación y se obtuvieron las proporciones de [recto
(inflamación)]/[músculo] (proporciones de [A]/[M]) y las
proporciones de [recto (inflamación)]/[sangre] (proporciones de
[A]/[B]) basándose en los valores de %ID/g órgano.
Los resultados se muestran en la Tabla 10, Tabla
11, Tabla 12 y Tabla 13.
El
Tc-99m-péptido 3 mostró unas
proporciones de [A]/[M] de 3,36 \pm 0,58 después de 5 desde la
administración, y de 7,91 \pm 1,16 después de 180 minutos desde
la administración. Apareció un alto nivel de radiactividad en la
región de inflamación, comparado con el músculo sin región de
inflamación, así como una tendencia en aumento de la proporción de
[A]/[M] de una manera dependiente del tiempo. Además, a los 60
minutos y después desde la administración, la proporción de [A]/[B]
fue mayor que 1, y era de 2,00 \pm 1,50 después de 180 minutos
desde la administración, mostrando una tendencia en aumento. Esto
puede no ser debido a una acumulación no específica que refleje un
mayor flujo sanguíneo, sino que se considera que es debido a una
acumulación específica por la
inflamación.
inflamación.
El
Tc-99m-péptido 4 mostró unas
proporciones de [A]/[M] de 4,37 \pm 0,68 después de 5 desde la
administración, y de 9,29 \pm 2,82 después de 180 minutos desde
la administración. Apareció un alto nivel de radiactividad en la
región de inflamación, comparado con el músculo sin región de
inflamación, así como una tendencia en aumento de la proporción de
[A]/[M] de una manera dependiente del tiempo. Además, a los 60
minutos y después desde la administración, la proporción de [A]/[B]
fue mayor que 1, y era de 1,51 \pm 0,41 después de 180 minutos
desde la administración, mostrando una tendencia en aumento. Esto
puede no ser debido a una acumulación no específica que refleje un
mayor flujo sanguíneo, sino que se considera que es debido a una
acumulación específica por la
inflamación.
inflamación.
El
Tc-99m-péptido 6 mostró unas
proporciones de [A]/[M] de 4,41 \pm 0,97 después de 5 desde la
administración, y de 16,50 \pm 11,08 después de 180 minutos desde
la administración. Apareció un alto nivel de radiactividad en la
región de inflamación, comparado con el músculo sin región de
inflamación, así como una tendencia en aumento de la proporción de
[A]/[M] de una manera dependiente del tiempo. Además, a los 30
minutos y después desde la administración, la proporción de [A]/[B]
fue mayor que 1, y era de 2,74 \pm 1,72 después de 180 minutos
desde la administración, mostrando una tendencia en aumento. Esto
puede no ser debido a una acumulación no específica que refleje un
mayor flujo sanguíneo, sino que se considera que es debido a una
acumulación específica por la
inflamación.
inflamación.
El
Tc-99m-péptido 12 mostró unas
proporciones de [A]/[M] de 4,66 \pm 3,13 después de 5 desde la
administración, y de 6,22 \pm 4,61 después de 180 minutos desde
la administración. Esto demostró una proporción baja de [A]/[M],
comparado con los péptidos de la presente invención.
Aunque la proporción de [A]/[M] mostró un valor
máximo, 11,10 \pm 12,33, después de 60 minutos desde la
administración, después disminuyó. Aunque la proporción de [A]/[B]
fue de 1,89 \pm 2,39 después de 60 minutos desde la
administración, después disminuyó, y era de 1,00 \pm 0,89 después
de 180 minutos desde la administración.
Según el presente estudio, los péptidos de la
presente invención fueron superiores en los puntos de acumulación y
retención en la región inflamatoria crónica con alta infiltración de
linfocitos y monocitos que el péptido 12 conocido anteriormente, y
se demostró que son útiles para la inflamación crónica, tal como la
colitis ulcerosa.
\newpage
Columna superior: %ID/órgano;
columna inferior:
%ID/g
(n = 3, media \pm desviación
estándar)
Columna superior: %ID/órgano;
columna inferior:
%ID/g
(n = 3, media \pm desviación
estándar)
Columna superior: %ID/órgano;
columna inferior:
%ID/g
(n = 3, media \pm desviación
estándar)
Columna superior: %ID/órgano;
columna inferior:
%ID/g
(n = 3, media \pm desviación
estándar)
\newpage
Ejemplo
7
Para confirmar la eficacia clínica del péptido
de la presente invención en seres humanos, se estudiaron las
afinidades de unión a leucocitos de dos tipos de péptidos de la
presente invención empleando sangre humana. El péptido 3 y el
péptido 6 marcados con Tc-99m del Ejemplo 2 se
separaron en péptidos no marcados y péptidos marcados, y se
purificaron mediante HPLC en fase inversa bajo las mismas
condiciones que la HPLC del Ejemplo 2. Se realizó un gradiente de
elución bajo las siguientes condiciones: 20% \rightarrow 80% (TFA
al 0,1% acetonitrilo/TFA al 0,1% agua); 0 \rightarrow 20 minutos
(la radiactividad del péptido 6 después de la purificación era de
111 MBq/ml).
Se prepararon los péptidos convencionalmente
conocidos, Tc-99m-péptido 11 y
Tc-99m-péptido 12. El péptido 11 y
el péptido 12 se disolvieron cada uno en dimetilformamida para
preparar una disolución que tenía una concentración de 0,1 mg/500
\mul. Se añadieron 50 \mul de una disolución de SnCl_{2}/ácido
clorhídrico 10 mM (5 mg/10 ml) a una disolución de ácido
tartárico/PBS (5 mg/200 \mul), y a esto se le añadió la disolución
de péptido. Después se infusionaron inmediatamente 0,25 \mul de
una disolución de ^{99m}TcO_{4}^{-} (2738 MBq/ml) y se agitó
durante varios segundos para que se realizase la reacción de marcaje
a 120ºC durante 10 minutos. La concentración final era de
aproximadamente 855,6 MBq/125 mg/ml. La purificación y medida de la
pureza radioquímica se realizaron utilizando una HPLC preparativa.
El análisis se realizó bajo las mismas condiciones que en el
Ejemplo 2, es decir, gradiente: 20% \rightarrow 50% (TFA al 0,1%
acetonitrilo/TFA al 0,1% agua); 0 \rightarrow 20 minutos. La
concentración de radiactividad después de la purificación era de
287-311 MBq/ml.
Posteriormente, se preparó una disolución de
gradiente de densidad Percoll basándose en el método descrito en el
Ejemplo 3.
Se recogió sangre, 20-30 ml, de
voluntarios adultos de 40 años o menos. Los péptidos marcados con
Tc-99m, 30 \mul de cada uno (111 MBq/ml, 1,8 x
10^{-11} mol/ml como Tc-péptido), se añadieron y
se incubaron durante 30 minutos. La muestra de sangre,
2-3 ml, se dispuso en una capa cuidadosamente sobre
la disolución de gradiente de densidad Percoll preparada. Después
de una centrifugación a 2000 rpm (800 x g) durante 15 minutos, el
tubo se congeló y cada fracción se escindió con un escalpelo,
después se midió la radiactividad de cada fracción utilizando un
contador gamma Auto-Well para determinar la
distribución de la radiactividad de los
Tc-99m-péptidos en los componentes
sanguíneos.
Según los recuentos de leucocitos de
4100-6100 células/\mul del parámetro hematológico
de seres humanos y el número de receptores FPR,
100.000-120.000/célula, encontrado en el patrón, se
calcularon los números estimados del receptor FPR en la sangre
humana como 0,68-1,2 x 10^{-12} mol/ml, y la
proporción de péptido/receptor en sangre humana era de
0,03-0,01. Los resultados que muestran las
distribuciones de los cuatro tipos de
Tc-99m-péptidos y el control
negativo (Tc-99m-ácido glucoheptónico) en sangre
humana se muestran en la Figura 18. Los resultados que muestran los
porcentajes entre la radiactividad de la fracción de granulocitos y
la radiactividad en los leucocitos totales, y entre la
radiactividad de la fracción de linfocitos y monocitos y la
radiactividad en los leucocitos totales se muestran en la Tabla 14.
En el Tc-99m-péptido 3,
Tc-99m-péptido 11 y
Tc-99m-péptido 12, n es 1, y en el
Tc-99m-péptido 6, n es 3.
La distribución de radiactividad del
Tc-99m-péptido 3 en la fracción de
granulocitos era de 21,91% de la radiactividad en sangre completa,
y la del Tc-99m-péptido 3 en la
fracción de linfocitos y monocitos era de 39,98% de la
radiactividad en sangre completa después de una incubación de 30
minutos. La radiactividad de la fracción de granulocitos era de
35,41% para la radiactividad de los leucocitos totales, y la
radiactividad de la fracción de linfocitos y monocitos era de
64,59% para la radiactividad de los leucocitos totales. Los
resultados demuestran que en sangre humana sana, el
Tc-99m-péptido 3 de la presente
invención se distribuye en linfocitos y monocitos mucho más que el
Tc-99m-péptido 11 y
Tc-99m-péptido 12, convencionalmente
conocidos.
La distribución de radiactividad del
Tc-99m-péptido 6 en la fracción de
granulocitos era de 29,45% de la radiactividad en sangre completa,
y la del Tc-99m-péptido 6 en la
fracción de linfocitos y monocitos era de 6,59% de la radiactividad
en sangre completa después de una incubación de 30 minutos. La
radiactividad de la fracción de granulocitos era de 81,94 \pm
8,67% para la radiactividad de los leucocitos totales, y la
radiactividad de la fracción de linfocitos y monocitos era de 18,07
\pm 8,67% para la radiactividad de los leucocitos totales. Los
resultados demuestran que en sangre humana sana, el
Tc-99m-péptido 6 de la presente
invención se distribuye en linfocitos y monocitos mucho más que el
Tc-99m-péptido 11 convencionalmente
conocido.
La distribución de la radiactividad del control
negativo Tc-99m-ácido glucoheptónico en la fracción
de granulocitos era de 1,11% de la radiactividad en sangre
completa, y la del Tc-99m-ácido glucoheptónico en la
fracción de linfocitos y monocitos era de 2,52% de la radiactividad
en sangre completa después de una incubación de 30 minutos. En la
fracción plasmática, se distribuyó una radiactividad de 95,39%.
Puesto que es el control negativo, que no puede unirse a
leucocitos, no se calculó la proporción de radiactividad en la
fracción de granulocitos y la proporción de radiactividad de la
fracción de linfocitos y monocitos para los leucocitos totales.
En sangre humana, la distribución de
radiactividad del Tc-99m-péptido 11
en la fracción de granulocitos era de 58,70% de la radiactividad en
sangre completa, y la del
Tc-99m-péptido 11 en la fracción de
linfocitos y monocitos era de 8,02% de la radiactividad en sangre
completa después de una incubación de 30 minutos. La radiactividad
de la fracción de granulocitos era de 87,98% para la radiactividad
de los leucocitos totales, y la radiactividad de la fracción de
linfocitos y monocitos era de 12,03% para la radiactividad de los
leucocitos totales.
En sangre humana, la distribución de
radiactividad del Tc-99m-péptido 12
en la fracción de granulocitos era de 25,09% de la radiactividad en
sangre completa, y la del
Tc-99m-péptido 12 en la fracción de
linfocitos y monocitos era de 13,77% de la radiactividad en sangre
completa después de una incubación de 30 minutos. La radiactividad
de la fracción de granulocitos era de 64,57% para la radiactividad
de los leucocitos totales, y la radiactividad de la fracción de
linfocitos y monocitos era de 35,43% para la radiactividad de los
leucocitos totales.
Los resultados anteriores indican que el péptido
de la presente invención se une con más fuerza a los linfocitos y
monocitos que a los granulocitos, comparado con el control negativo,
Tc-99m-ácido glucoheptónico, y el
Tc-99m-péptido 11 o
Tc-99m-péptido 12, convencionalmente
conocidos. También se demostró que, considerando los resultados del
Ejemplo 4 y Ejemplo 6, los péptidos de la presente invención son
eficaces para la inflamación crónica infiltrada con linfocitos y
monocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
(n = 3, media \pm desviación
estándar)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se preparó un modelo de rata con colitis
ulcerosa según el método de Anthony et al. (Anthony et
al., Int. J. Exp. Path., 76, 215-224, 1995). Se
disolvieron 360 mg de ácido
2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBS) en 4 ml de
agua ultrapura y se añadieron 3,2 ml de etanol para preparar etanol
al 46%/disolución salina fisiológica 50,0 mg/ml. Un tubo se insertó
por el ano hasta una profundidad de aproximadamente
7-8 cm hacia el intestino de una rata SD (rata de
raza Sprague Dawley, exenta de patógenos específicos), hembra, de 7
semanas de edad, con un peso de 164-184 kg, macho,
en ayunas desde hacía 24 horas, y se infusionaron 0,1 ml de aire.
Una disolución de TNBS/etanol al 46%/disolución salina fisiológica,
0,2 ml, se infusionó posteriormente y se masajeó y se cambió la
postura durante 2 minutos. Estos procedimientos se repitieron
durante 3 días. Después de 4 días desde la administración final, la
rata estaba lista para el experimento y se recogió sangre. La sangre
de rata recogida, 2 ml, se calentó a 37ºC durante 5 minutos en un
baño tibio. Cada muestra de 3 \mul de
Tc-99m-péptido 3 y
Tc-99m-péptido 6 (111 MBq/ml,
Tc-99m-péptido 1,8 x 10^{-11}
mol/ml) purificada mediante HPLC se añadió a ella, y se incubó
durante 30 minutos. La muestra de sangre se dispuso en capa
cuidadosamente sobre una disolución de gradiente de densidad
Percoll previamente preparada. La muestra en capa se centrífugo a
2000 rpm (800 x g) durante 15 minutos. Después de la
centrifugación, el tubo se congeló y cada fracción se cortó con un
escalpelo, después se midió la radiactividad de cada fracción
utilizando un contador gamma Auto-Well para
determinar la distribución de la radiactividad del
Tc-99m-péptido 3 y
Tc-99m-péptido 6 en cada componente
sanguíneo.
Según los recuentos de leucocitos de
6600-12600 células/\mul del parámetro hematológico
de rata hembra y el número de receptores FPR,
100.000-120.000/célula, encontrado en el patrón, se
calcularon los números estimados del receptor FPR en la sangre de
ratas como 1,1-2,5 x 10^{-12} mol/ml, y las
proporciones de péptido/receptor en ratas eran de
0,02-0,05. Los resultados que muestran los
porcentajes entre la radiactividad en cada componente sanguíneo y
la radiactividad en sangre completa se muestran en la Figura 19. Los
resultados que muestran los porcentajes entre la radiactividad de
la fracción de granulocitos y la radiactividad en los leucocitos
totales, y entre la radiactividad de la fracción de linfocitos y
monocitos y la radiactividad en los leucocitos totales se muestran
en la Tabla
15.
15.
En la sangre de rata con colitis ulcerosa
provocada por TNBS, la distribución de radiactividad de
Tc-99m-péptido 3 en la fracción de
granulocitos era de 7,82% de la radiactividad en sangre completa, y
la de Tc-99m-péptido 3 en la
fracción de linfocitos y monocitos era de 10,00% de la radiactividad
en sangre completa después de una incubación de 30 minutos. La
radiactividad de la fracción de granulocitos era de 43,69% para la
radiactividad de los leucocitos totales, y la radiactividad de la
fracción de linfocitos y monocitos era de 56,31% para la
radiactividad de los leucocitos totales. La distribución de
radiactividad del Tc-99m-péptido 6
en la fracción de granulocitos era de 18,34% de la radiactividad en
sangre completa y la del
Tc-99m-péptido 6 en la fracción de
linfocitos y monocitos era de 6,57% de la radiactividad en sangre
completa después de una incubación de 30 minutos. La radiactividad
de la fracción de granulocitos era de 74,08% para la radiactividad
de los leucocitos totales, y la radiactividad de la fracción de
linfocitos y monocitos era de 25,92% para la radiactividad de los
leucocitos
totales.
totales.
A partir de estos resultados, resulta evidente
que el Tc-99m-péptido 3 y
Tc-99m-péptido 6, como parte de la
presente invención, se distribuyen ampliamente en la fracción de
linfocitos y monocitos en sangre de un modelo de rata con colitis
ulcerosa.
A partir de lo anterior, se demuestra que el
péptido de la presente invención es eficaz para el diagnóstico de
una inflamación crónica frecuentemente infiltrada por linfocitos y
monocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
(Proporción de unión a leucocitos
totales (%), n = 2, media \pm desviación
estándar)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se preparó un modelo de rata con colitis
ulcerosa según el método de Anthony et al. (Anthony et
al., Int. J. Exp. Path., 76, 215-224, 1995). Se
disolvieron 360 mg de ácido
2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBS) en 4 ml de
agua ultrapura, y se añadieron 3,2 ml de etanol para preparar una
disolución de etanol al 46%/disolución salina fisiológica 50,0
mg/ml. Un tubo se insertó por el ano hasta una profundidad de
7-8 cm hacia el intestino de ratas de raza SD
(Sprague Dawley, exentas de patógenos específicos) eterizadas,
hembras, de 7 semanas de edad, peso corporal de
164-184 g, en ayunas desde hace 24 horas, y se
infusionaron 0,1 ml de aire. Posteriormente se infusionó una
disolución de TNBS/etanol al 46%/disolución salina fisiológica, 0,2
ml, se masajeó y se cambió la postura durante 2 minutos. Estos
procedimientos se repitieron durante 3 días. Después de 4 días desde
la administración final, las ratas se emplearon para el estudio. El
Tc-99m-péptido 3 o el
Tc-99m-péptido 6 obtenidos en el
Ejemplo 3, cada uno con una radiactividad de aproximadamente 37
MBq/rata, se administraron a la vena de la cola. Después de 5
minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos, las imágenes se
registraron con una cámara gamma. Como control, se prepararon
leucocitos marcados con Tc-99m, que se emplean para
el diagnóstico de la colitis ulcerosa en seres humanos, según el
método de Roca et al. (M. Roca et al., Eur. J. Nucl.
Med., 25, 797-799, 1998), y se administraron a la
vena de la cola de la rata con una radiactividad de aproximadamente
37 MBq/rata, y después de 5 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120
minutos, las imágenes se registraron con una cámara gamma. Los
leucocitos marcados con Tc-99m preparados contenían
todas las especies de leucocitos, tales como granulocitos,
linfocitos y monocitos. Después de finalizar la formación de
imágenes, es decir, 130 minutos después de la administración, las
ratas se exanguinaron desde la aorta abdominal y cada órgano se
seccionaron. Se midieron los pesos y radiactividades de los órganos
seccionados para calcular la radiactividad por g de tejido (%ID/g).
Después, utilizando los valores numéricos calculados, se
determinaron las proporciones de [inflamación]/[músculo]
(proporciones de [A]/[M]), las proporciones de
[inflamación]/[sangre] (proporciones de [A]/[BL]), las proporciones
de [inflamación]/[hueso] (proporciones de [A]/[BO]), las
proporciones de [inflamación]/[apéndice] (proporciones de
[A]/[AP]), las proporciones de [inflamación]/[colon] (proporciones
de [A]/[C]), y las proporciones de [inflamación]/[recto]
(proporciones de
[A]/[R]).
[A]/[R]).
Los dibujos representativos de los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 20, Figura 21 y Figura 22. Las
regiones de interés se muestran en las imágenes, y las proporciones
de cuentas en la región de interés de 1 píxel por cuentas del
cuerpo total (% de dosis inyectada (ID)/píxel) se muestran en la
Tabla 16. Los resultados de las proporciones que indican
[inflamación]/[fondo abdominal] (proporciones de [A]([BG])
determinados a partir de las anteriores proporciones se muestran en
la Tabla 17. Además, en la Tabla 18 y la Figura 23 se muestran la
%ID/g de la inflamación, las proporciones de [A]/[M], las
proporciones de [A]/[BL], las proporciones de [A]/[BO], las
proporciones de [A]/[AP], las proporciones de [A]/[C], y las
proporciones de [A]/[R] obtenidas a partir de los resultados de la
escisión. Como resultado, en los leucocitos marcados con
Tc-99m control, la %ID/píxel después de 30 minutos
era de 0,11 \pm 0,025 (media \pm desviación estándar) (n = 5), y
la proporción de [A]/[BG] era de 3,21 \pm 1,96 (n = 5). Además,
la radiactividad por g de tejido con inflamación (%ID/g) obtenida
de la exanguinación y la escisión después de 130 minutos desde la
administración era de 0,71 \pm 0,33, y la proporción de [A]/[BO]
era de 2,08 \pm 1,37, y la proporción de [A]/[BL] era de 0,25
\pm 0,17. Los resultados indican que la distribución era mayor en
la inflamación que en la
sangre.
sangre.
Al contrario de esto, en el
Tc-99m-péptido 3 de la presente
invención, la proporción de administración/píxel después de 30
minutos era de 0,043 \pm 0,015 (n = 5), y la proporción de
[A]/[BG] era de 2,23 \pm 0,77 (n = 5). Además, la radiactividad
por g de tejido con inflamación (%ID/g) obtenida de la exanguinación
y la escisión después de 130 minutos desde la administración era de
0,13 \pm 0,12, y la proporción de [A]/[BO] era de 3,40 \pm
2,78, y la proporción de [A]/[BL] era de 2,33 \pm 2,22. Estos
resultados indican que la distribución de la radiactividad era
mayor en la inflamación que en la sangre. Además, en el
Tc-99m-péptido 6, la %ID/píxel
después de 30 minutos era de 0,093 \pm 0,048, y la proporción de
[A]/[BG] era de 2,15 \pm 0,53 (n = 5). Además, la radiactividad
por g de tejido con inflamación (%ID/g) obtenida de la exanguinación
y la escisión después de 130 minutos desde la administración era de
0,55 \pm 0,51, y la proporción de [A]/[BO] era de 4,44 \pm
1,61, y la proporción de [A]/[BL] era de 2,88 \pm 1,61. Estos
resultados indican que la distribución de radiactividad era mayor
en la inflamación que en la sangre, indicando lo mismo que en el
péptido 3. A partir de los anteriores resultados, se demuestra que
los péptidos marcados con Tc-99m de la presente
invención son mejores en la representación de la inflamación en
órganos con gran corriente sanguínea, tales como el hígado, bazo,
corazón, riñones, cerebro y hueso, que son afectados con más
facilidad por la sangre. En particular, el péptido 6 muestra unos
valores numéricos mayores en la proporción de [A]/[M], la proporción
de [A]/[BL], la proporción de [A]/[BO], la proporción de [A]/[AP],
la proporción de [A]/[C], y la proporción de [A]/[R] que los
leucocitos marcados con Tc-99m control. Como
resultado, se demostró que el péptido de la presente invención era
excelente para la representación en la inflamación crónica, la
colitis ulcerosa.
\vskip1.000000\baselineskip
(n = 5, media \pm desviación
estándar)
\vskip1.000000\baselineskip
(n = 5, media \pm desviación
estándar)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(n = 5, media \pm desviación
estándar)
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se preparó un modelo de rata con colitis
ulcerosa según el método de Anthony et al. (Anthony et
al., Int. J. Exp. Path., 76, 215-224, 1995). Se
disolvieron 360 mg de ácido
2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBS) en 4 ml de
agua ultrapura, y se añadieron 3,2 ml de etanol para preparar una
disolución de etanol al 46%/disolución salina fisiológica 50,0
mg/ml. Un tubo se insertó por el ano hasta una profundidad de
7-8 cm hacia el intestino de ratas de raza SD
(Sprague Dawley, exentas de patógenos específicos) eterizadas,
hembras, de 7 semanas de edad, peso corporal de
164-184 g, en ayunas desde hace 24 horas, y se
infusionaron 0,1 ml de aire. Posteriormente se infusionó una
disolución de TNBS/etanol al 46%/disolución salina fisiológica, 0,2
ml, se masajeó y se cambió la postura durante 2 minutos. Estos
procedimientos se repitieron durante 3 días. Después de 4 días desde
la administración final, las ratas se emplearon para el estudio. El
Tc-99m-péptido 6 o el
Tc-99m-péptido 14 obtenidos en el
Ejemplo 2, cada uno con una radiactividad de aproximadamente 74
MBq/rata, se administraron a la vena de la cola, y después de 120
minutos, las ratas se exanguinaron y se mataron. Después de la
escisión inmediata del intestino grueso y la eliminación del
contenido intestinal, las áreas juzgadas como región de inflamación
mediante observación macroscópica se sumergieron en el medio para la
preparación de secciones congeladas. Inmediatamente después, las
muestras sumergidas, junto con el recipiente, se sumergieron en
nitrógeno líquido durante aproximadamente diez segundos para que el
medio que contenía la región seccionada del intestino grueso se
congelase. Después de dejar en reposo la muestra en la nevera a
-20ºC durante aproximadamente diez segundos se prepararon las
secciones congeladas utilizando un criostato. Después de preparar
las secciones, éstas se pusieron en contacto con la placa de
formación de imágenes para una autorradiografía (Fuji Photo Film
Co., Ltd.) durante periodos de 12 horas a 19 horas. Posteriormente,
se formaron imágenes de la distribución de la radiactividad
utilizando un analizador de imágenes BAS 2500 (Fuji Photo Film Co.,
Ltd.). Después, las secciones congeladas preparadas del mismo modo
se sometieron a una tinción inmunohistoquímica con anticuerpos
antigranulocitos y anticuerpos antimonocitos para confirmar la
infiltración de granulocitos y monocitos hacia el tejido.
Los dibujos representativos de los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 24, Figura 25 y Figura 26. Las
regiones de interés se muestran en las imágenes obtenidas a partir
de los resultados de la autorradiografía, y se calcularon las
cuentas por píxel en la región de interés y se determinaron las
proporciones de [inflamación]/[tejido normal] (proporciones de
[A]([N]). Los resultados se muestran en la Figura 27.
En la región rectal de ratas con inflamación, se
formó una inflamación que varía de 2 cm a 4 cm en el área circular
completa del tracto intestinal, y se observaron regiones
inflamatorias en todas las ratas. Como resultado de la tinción
inmunohistoquímica, se observó una significativa infiltración de
granulocitos y monocitos en la región de inflamación, y se observó
que los granulocitos y monocitos se distribuían en la región
correspondiente a la inflamación.
Tanto el
Tc-99m-péptido 6 como el
Tc-99m-péptido 14 mostraron unas
distribuciones de radiactividad que corresponden a las
distribuciones de granulocitos y monocitos que muestra la
inmunotinción de una manera similar a los leucocitos marcados con
Tc-99m. En comparación con la proporción de [A]/[N]
en los leucocitos marcados con Tc-99m control, el
Tc-99m-péptido 6 y el
Tc-99m-péptido 14, obtenidos de la
misma sección, mostraron unas proporciones mayores de [A]/[N] que
los leucocitos marcados con Tc-99m. Como resultado,
también se confirmó que el péptido de la presente invención era
superior en la inflamación crónica, tal como la colitis
ulcerosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
El experimento se realizó utilizando un receptor
FPR recombinante derivado de células CHO (6,24 pmol/ml,
Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, glicerol al 10%, BSA al 1%,
BioSignal Packard Inc., Amersham Biosciences) y
[^{3}H]-FMLP (fMLF, 9,25
MBq/2,88-6,25 nmol, Daiichi Pure Chemicals Co.
Ltd.). Después de añadir cada péptido a una cierta cantidad del
receptor FPR (0,05 nM, 200 \mul/pocillo) en concentraciones que
varían de 10^{-4} M a 10^{-14} M, se añadió una cierta cantidad
de [^{3}H]-FMLP (0,3 nM, 25 \mul/pocillo).
Después de la reacción, se separó el [^{3}H]-FMLP
sin unir con el receptor FPR y el [^{3}H]-FMLP
unido con el receptor FPR, mediante un filtro GF/C. Se determinó la
cantidad de [^{3}H]-FMLP unido con el receptor FPR
ensayando la radiactividad del [^{3}H]-FMLP unido
con el receptor FPR. Se determinó la concentración de cada péptido
que inhibe 50% de la unión con [^{3}H]-FMLP
(IC_{50}) utilizando el programa informático analítico "X1fit
versión 3.0.3 (CTC Laboratory Systems K.K.)", y después se
determinó la constante de inhibición (Ki) a partir del valor Kd de
[^{3}H]-FMLP. Las pruebas se repitieron tres veces
y los ensayos se repitieron tres veces en cada prueba para
determinar un valor medio.
Los resultados se muestran en la Figura 28. Los
valores IC_{50} y los valores Ki calculados se muestran en la
Tabla 19. Se calculó que el FMLP control tenía un valor Ki de (2,33
\pm 0,45) x 10e-^{10} M. El valor Ki de cada
péptido se calculó como sigue: péptido 3: Ki = (6,50 \pm 1,84) x
10e^{-9} M; péptido 4: Ki = (8,36 \pm 3,74) x 10e^{-10} M;
péptido 6: Ki = (2,83 \pm 1,07) x 10e^{-10} M; péptido 8: Ki =
(2,33 \pm 0,91) x 10e^{-9} M; y péptido 9: Ki = (1,28 \pm
0,69) x 10e^{-10} M. En el péptido 16, en el que un grupo formilo
está reemplazado por un grupo acetilo, el péptido 17, en el que un
grupo formilo está reemplazado por un grupo carbamilo, y el péptido
18, en el que un grupo formilo está reemplazado por un grupo
metilo, los valores Ki fueron de (3,74 \pm 3,53) x 10e^{-6} M,
(4,24 \pm 3,60) x 10e^{-7} M, y (3,83 \pm 1,12) x 10e^{-5}
M, respectivamente. Como resultado, se demostró que el péptido de la
presente invención tiene afinidad por el receptor FPR, y es útil
para el diagnóstico de la inflamación mediada por los leucocitos
que expresan el receptor FPR.
(n = 9, media \pm desviación
estándar)
Ejemplo
12
Se suspendieron aproximadamente 10^{8} de
recuentos viables de Staphylococcus aureus en 1 ml de
disolución salina fisiológica. Se inyectaron 100 \mul de la
suspensión por vía intramuscular en la pantorrilla derecha de
conejos de raza New Zeland White (NZW) con un peso corporal de
aproximadamente 2 kg. Después de 24 horas, los conejos del modelo
que mostraban una inflamación evidente se anestesiaron con
pentobarbital. Se administro el
Tc-99m-péptido 6 obtenido en el
Ejemplo 2, con una administración de radiactividad de
aproximadamente 74 MBq, en la vena auricular. Después de 5 minutos,
1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas y 5 horas se registraron imágenes
utilizando una cámara gamma. Se preparó una disolución de FMLP
disolviendo 1 mg de FMLP, que corresponde a aproximadamente 10.000
veces la cantidad máxima estimada del receptor 0,1 nmol/kg, en DMSO
al 5%/disolución salina fisiológica. En el grupo de
preadministración de FMLP, que se estableció para confirmar la
inhibición por FMLP, la disolución de FMLP se administró a la vena
auricular 5 minutos antes de la administración del
Tc-99m-péptido 6. De forma similar
al grupo sin administración de FMLP, se registraron imágenes
utilizando una cámara gamma después de 5 minutos, 1 hora, 2 horas,
3 horas, 4 horas y 5 horas.
Las figuras representativas de los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 29 y Figura 30. Las regiones de
interés se muestran sobre las imágenes, y las proporciones de
cuentas en la región de interés de 1000 píxeles para las cuentas
del cuerpo total (%ID)/K píxel) se muestran en la Tabla 20. Las
proporciones que indican [inflamación]/[músculo normal]
(proporciones de [A]/[M]) determinadas a partir de las proporciones
anteriores se muestran en la Tabla 21. Como resultado, en el
Tc-99m-péptido 6 sin inhibición de
FMLP, la acumulación en la región de inflamación después de 2 horas
desde la administración era de 1,77 \pm 0,25%ID/Kpíxel (media
\pm desviación estándar) (n = 3) y aumentó a 2,62 \pm
0,25%ID/Kpíxel después de 5 horas desde la administración. La
proporción de [A]/[M] también aumento de 12,78 \pm 6,14 después de
2 horas, a 21,39 \pm 5,39 después de 5 horas desde la
administración. Al contrario de esto, en el
Tc-99m-péptido 6 con inhibición de
FMLP, la proporción de [A]/[M] después de 2 horas desde la
administración era de 3,93 \pm 0,60, que es menor comparado con
el caso sin inhibición de FMLP, y la proporción de [A]/[M] después
de 5 horas desde la administración aumentó a 9,05 \pm 3,10. Sin
embargo, la acumulación en la región de inflamación disminuyó de
0,41 \pm 0,10%ID/Kpíxel después de 2 horas desde la
administración a 0,30 \pm 0,04%ID/Kpíxel después de 5 horas desde
la administración.
Estos resultados indican que el péptido 6 de la
presente invención demuestra que representa la región de inflamación
uniéndose al receptor FPR que existe en leucocitos. Se cree que la
acumulación del péptido de la presente invención indica la
aparición de inflamación con infiltración de leucocitos.
(n = 3, media \pm desviación
estándar)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(n = 3, media \pm desviación
estándar)
\vskip1.000000\baselineskip
Según la presente invención, pueden
proporcionarse compuestos, que muestran propiedades de unión
específica para todas las especies de leucocitos, es decir,
neutrófilos, monocitos y linfocitos, in vivo e in
vitro, y pueden marcarse con un metal radiactivo o un metal
paramagnético, una composición farmacéutica que contiene el
compuesto marcado como ingrediente activo útil para el diagnóstico
de formación de imágenes SPECT, el diagnóstico de formación de
imágenes PET, y el diagnóstico de formación de imágenes MRI, y el
diagnóstico de formación de imágenes puede realizarse formando una
imagen de un sitio con vigorosa infiltración de leucocitos
acompañada de una reacción inmunológica en un individuo.
<110> Nihon Medi-Physics
Corporation Limited
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Compuesto que se une a leucocitos y
composición farmacéutica que contiene el compuesto que se une a
leucocitos en estado marcado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> W1229-00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> FORMILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que se une a leucocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Cys Gly
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> FORMILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que se une a leucocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Cys Asp
Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> FORMILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que se une a leucocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Cys Gly
Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> FORMILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que se une a leucocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp
Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> FORMILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> BLOQUEADO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que se une a leucocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> FORMILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> BLOQUEADO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que se une a leucocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Nle Leu Phe Lys Ser Ser Asn Arg Cys Asp
Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> FORMILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> BLOQUEADO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que se une a leucocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> FORMILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> BLOQUEADO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que se une a leucocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> FORMILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> BLOQUEADO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que se une a leucocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> FORMILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> BLOQUEADO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que se une a leucocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Ser Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACETILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que se une a leucocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp
Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> BLOQUEADO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que se une a leucocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp
Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> METILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que se une a leucocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp
Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1, Un compuesto que tiene propiedades de unión
específica para leucocitos representado por la fórmula (1):
(1)Z-Y-Leu-Phe-(X)_{n}-Lys(NH_{2})_{m}-\varepsilon
(-R-(T)_{l}-U)
en la que, en la fórmula (1), Z
representa un grupo protector para un grupo amino; Y representa Met
o Nle; en (X)_{n}, X representa un espaciador que consiste
en uno o más aminoácidos, y n representa 1 ó 0; en
(NH_{2})_{m}, NH_{2} representa un grupo amida como
grupo protector para un grupo carboxilo en la posición \alpha de
Lys, y m representa 1 ó 0; en
\varepsilon(-R-(T)_{l}-U), R representa Ser o Thr unido a un grupo \varepsilon-amino de Lys a través de un enlace amida, T representa un espaciador que consiste en uno o más aminoácidos, l representa 1 ó 0, y U representa un grupo que puede marcarse con un metal; con la condición de que dichos X y T pueden ser iguales o diferentes entre sí.
\varepsilon(-R-(T)_{l}-U), R representa Ser o Thr unido a un grupo \varepsilon-amino de Lys a través de un enlace amida, T representa un espaciador que consiste en uno o más aminoácidos, l representa 1 ó 0, y U representa un grupo que puede marcarse con un metal; con la condición de que dichos X y T pueden ser iguales o diferentes entre sí.
2. El compuesto según la reivindicación 1, en el
que U es un péptido representado por
-Cys-A1-A2 (A1 y A2 son cada uno un
aminoácido excepto Cys y Pro).
3. El compuesto según la reivindicación 1, en el
que U se selecciona del grupo que consiste en compuestos cíclicos
que contienen nitrógeno con 8 a 20 átomos de carbono, compuestos de
ácido carboxílico cíclico que contiene nitrógeno con 8 a 20 átomos
de carbono, derivados de compuestos de ácido carboxílico cíclico que
contiene nitrógeno con 8 a 20 átomos de carbono, y ácidos
alquilenaminocarboxílicos con 4 a 10 átomos de carbono.
4. El compuesto según la reivindicación 1 ó 2,
en el que dicho compuesto representado por la fórmula (1) es:
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-Cys-Gly-Asn);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-Cys-Asp-Asp);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-Cys-Gly-Asp);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-ácido
1,4,8,11-tetraazaciclo-tetradecan-1,4,8,11-tetraacético);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Ser-Asn-D-Arg-Cys-Asp-Asp);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-ácido
dietilentriamino-pentaacético);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-ácido
1,4,8,11-tetraazaciclo-tetradecanbutírico);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecanbutírico);
formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Ser-Asn-ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecanbutírico);
acetil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp);
carbamil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp);
o
metil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH_{2})-\varepsilon-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp).
5. Una composición medicinal que comprende un
compuesto marcado, en el que el compuesto marcado es un compuesto
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 marcado con un
metal radiactivo o un metal paramagnético.
6. La composición medicinal según la
reivindicación 5, en la que dicho metal radiactivo es
Tc-99m, In-111 o
Ga-67.
7. La composición medicinal según la
reivindicación 6, en la que dicha composición se utiliza en el
diagnóstico de formación de imágenes SPECT para formar imágenes de
un sitio de infiltración vigorosa de leucocitos acompañada de una
reacción inmunológica en un individuo.
8. La composición medicinal según la
reivindicación 5, en la que dicho metal radiactivo es
Cu-64 o Ga-68.
9. La composición medicinal según la
reivindicación 8, en la que dicha composición se utiliza en el
diagnóstico de formación de imágenes PET para formar imágenes de un
sitio de infiltración vigorosa de leucocitos acompañada de una
reacción inmunológica en un individuo.
10. La composición medicinal según la
reivindicación 5, en la que dicho metal paramagnético es Gd, Fe, Mn
o Cu.
11. La composición medicinal según la
reivindicación 10, en la que dicha composición se utiliza en el
diagnóstico de formación de imágenes MRI para formar imágenes de un
sitio de infiltración vigorosa de leucocitos acompañada de una
reacción inmunológica en un individuo.
12. La composición medicinal según la
reivindicación 5, en la que dicho metal radiactivo es
Y-90, Sn-117m,
Sm-153, Re-186 o
Re-188.
13. La composición medicinal según una
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12 para su uso en
radioterapia.
14. El uso del compuesto según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, o la composición medicinal según una
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en la fabricación de un
medicamento para su uso en el tratamiento de la leishmaniasis.
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