JP2003522186A - 病原体に対する宿主免疫応答を誘導するか、またはｈｉｖ感染を抑制するｆｐｒクラス受容体に対するリガンド - Google Patents

病原体に対する宿主免疫応答を誘導するか、またはｈｉｖ感染を抑制するｆｐｒクラス受容体に対するリガンド

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ウイルス感染を抑制し、病原体に対する宿主免疫応答を促す分子の発見に関する。特に本明細書中に開示された本発明は、ＦＰＲクラス受容体と相互作用し、ＨＩＶ感染を抑制し、被検体における炎症性応答を刺激する。本発明の実施形態は、ＨＩＶ感染の研究、治療および予防ならびに被検体における炎症応答の誘導のための生物工学的ツール、予防薬、治療薬および上記のものの使用方法を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 ［発明の分野］ 本発明は、ウイルス感染を抑制し、病原体に対する免疫応答を促す分子の発見
に関する。特に本明細書中に開示された本発明は、ＦＰＲクラス受容体と相互作
用し、ＨＩＶ感染を抑制し、そして被験体における炎症応答を刺激する分子に関
する。
【０００２】 ［発明の詳細な説明］
【０００３】 ［発明の分野］ 本発明は、ウイルス感染を抑制し、病原体に対する免疫応答を促す分子の発見
に関する。特に本明細書中に開示された本発明は、ＦＰＲクラス受容体と相互作
用し、ＨＩＶ感染を抑制し、そして被験体における炎症応答を刺激する分子に関
する。
【０００４】 ［発明の背景］ ヒト単球は、広範な種々の７回膜貫通型（ＳＴＭ）、細菌走化性ペプチドＮ−
ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）のような、ケ
モカイン受容体ならびに古典的走化性因子を含むＧタンパク質共役型受容体、、
活性化補体構成成分５（Ｃ５ａ）およびロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）を発現
する（Murphy. Annu Rev Immunol, 12:593(1994); Murphy, "The N-formyl pept
ide chemotactic receptors," Chemoattractant ligands and their receptors,
CRC Press, Boca Raton, 1996:269;およびProssnitz and Ye, Pharmacol Ther,
74:73(1997)）。古典的化学誘引物質およびケモカインはともに、これらのＧタ
ンパク質共役型ＳＴＭ受容体を結合し、活性化し、これが次に細胞カルシウム（
Ｃａ2+）動員、ホスホイノシチド加水分解、走化性および有糸分裂活性化プロテ
インキナーゼの活性化を促すシグナリングカスケード(signaling cascade)を誘
導する（Schiffmann et al., Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72:1059-1062(19
75); Oppenheim et al., Annu. Rev. Immunol., 9: 617-648(1991); Murphy, "T
he N-formyl peptide chemotactic receptors," Chemoattractant ligands and
their receptors, CRC Press, Boca Raton, vol. 269(1996); およびBalkwill,
J. Viral Hepatitis, 5:1-14(1998)）。この方法で活性化される細胞は、病原体
に対する宿主免疫応答における不可欠な関与者である。
【０００５】 ＦＰＲクラス受容体は、化学誘引物質ｆＭＬＰを結合するＧタンパク質共役型
ＳＴＭ受容体であり、単球走化性および病原体に対する宿主免疫応答の誘導に関
与する。表現型ＦＰＲクラス受容体であるＦＰＲは、高親和性を有するｆＭＬＰ
と結合し、そして低濃度のｆＭＬＰにより活性化される。ｆＭＬＰによるＦＰＲ
の結合は、Ｇタンパク質媒介性シグナリング事象のカスケードを誘導して、食細
胞接着、走化性、酸素中間体の放出、食作用強化および細菌殺害、ならびにＭＡ
Ｐキナーゼ活性化および遺伝子転写をもたらす（Krump et al., J Biol Chem 27
2:937(1997); Prossnitz et al., Pharmacol Ther 74:73(1997); Murphy, Annu.
Rev. Immuno. 12:593(1994);および Murphy, The N-formyl peptide chemotact
ic receptors, Chemoattractant ligands and their receptors, CRC Press, Bo
ca Raton, vol. 269(1996)）。別のＦＰＲクラス受容体は、ＦＰＲＬ１と命名さ
れた(ＦＰＲＨ２およびＬＸＡ４Ｒとも呼ばれる)ＦＰＲの高相同変異体である.
ＦＰＲＬ１は、もともとはオーファン受容体（orphan receptor）としてクロー
ン化された（Murphy et al., J. Biol. Chem., 267: 7637-7643 (1992); Ye et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 184: 582-589 (1992);Bao et al., Gen
omics, 13:437-440(1992); Gao, J.L. and P.M. Murphy, J. Biol. Chem., 268:
25395-25401(1993);およびNomura et al., Int. Immunol., 5:1239-1249(1993)
）が、しかしその後、高濃度のｆＭＬＰに応答してＣａ2+動員を媒介することが
判明した（Ye et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 184:582-589(1992);
およびGao, J.L. and P.M. Murphy, J. Biol. Chem., 268:25395-25401(1993)）
。
【０００６】 ケモカイン受容体ＣＣＲ５はもうひとつのＧタンパク質共役型ＳＴＭ受容体で
あり、ヒト免疫不全症１型ウイルス(ＨＩＶ−１)の最も根源的な単離物により活
用される主要融合補因子である（Horuk, Immunol Today, 20:89(1999); Dimitro
v and Broder, "HIV and Membrane Receptors," HIV and membrane fusion: Med
ical Inteliqence Unit, Landes Bioscience, Austin, TX, 1997:99;およびBerg
er, AIDS 11, Suppl A:S3(1997)）。ＣＣＲ５を発現できない個体は、ＨＩＶ−
１感染に対して非常に耐性である（Paxton, et al., Nat Med, 2:412(1996); De
an, et al., Science, 273:1856(1996)）。ＨＩＶ−１融合および進入における
その顕著な役割のために、研究者は、ＨＩＶ−１エンベロープおよびＣＣＲ５間
の相互作用を妨げる分子の開発にかなりの研究を集中させてきた。例えばケモカ
インリガンドおよびＣＣＲ５に特異的な抗体が、ＨＩＶ−１進入および複製を抑
制することが示されている（Cocchi et al., Science, 270:1811(1995); Wu et
al., J Exp Med, 186:373(1997); Proudfoot et al., J Biol Chem, 271:2599(1
996); Arenzana-Seisdedos et al., Nature, 383:400(1996); Gong et al., J B
iol Chem, 273:4289 (1998)）。
【０００７】 ［発明の要約］ 本発明の一態様は、病原体に対する宿主免疫応答を調節するＦＰＲクラス受容
体に対する新規のリガンドに関する。本発明の別の態様は、活性化ＦＰＲクラス
受容体がＣＣＲ５のリン酸化およびダウンレギュレーション(downregulation)を
促し、これが次にＨＩＶ感染を抑制するという発見に関する。いくつかの異なる
リガンドは、ＦＰＲクラス受容体と相互作用し、そして食細胞中でのＣａ＋２動
員および走化性を刺激することが見出された。これらのリガンドのいくつかとＦ
ＰＲクラス受容体との相互作用がＣＣＲ５のリン酸化およびダウンレギュレーシ
ョンおよび／またはＨＩＶ感染の抑制を生じることも判明した。
【０００８】 初期実験において、ＦＰＲクラス受容体とのｆＭＬＰの結合がＣＣＲ５のリン
酸化およびダウンレギュレーションならびにＨＩＶ感染の抑制を生じる、という
ことが観察された。その他の実験は、ｇｐ１２０のＶ３領域由来の合成ペプチド
（「Ｖ３ペプチド」と呼ばれる）、ｇｐ４１の外ドメインのＣ末端における一領
域に対応する合成ペプチド(「Ｔ２０／ＤＰ１７８」または「Ｔ２０」）および
血清アミロイドＡ（「ＳＡＡ」）はＦＰＲクラス受容体を活性化し、ＣＣＲ５の
リン酸化を誘導する、ということを明示した。さらに、白血球活性化ペプチドま
たは「Ｗペプチド」として既知の合成ヘキサペプチドはＦＰＲクラス受容体を活
性化し、食細胞におけるＣａ2+動員および走化性を誘導し、ならびにＨＩＶ−１
感染を抑制する、ということが見出された。
【０００９】 本発明の実施形態は、ＦＰＲクラス受容体との相互作用によりＨＩＶ感染を抑
制する作用物質の同定方法を含む。一アプローチは合理的薬剤設計における技術
を含み、それにより、ＦＰＲクラス受容体に対するリガンド(「結合パートナー
（binding partner）」とも呼ばれる)に類似する化合物が設計され、コンピュー
タベースのホモロジー検索、タンパク質モデリングおよびコンビナトリアルケミ
ストリーを用いて作製される。これらの候補結合パートナーは次に、「結合パー
トナー特性化アッセイ」においてＣＣＲ５をリン酸化し、および／またはＨＩＶ
感染を抑制する能力に関して評価される。ＨＩＶ感染を抑制する作用物質は、パ
ートナー特性化アッセイにおいてＣＣＲ５をリン酸化し、および／またはＨＩＶ
感染を抑制するそれらの能力により同定される。別のアプローチにより、分子の
ランダムライブラリー(random library)は、ＣＤ４、ＣＣＲ５およびＦＰＲクラ
ス受容体を発現する細胞と接触させ、そしてＨＩＶ感染を抑制する作用物質は、
ＣＣＲ５をリン酸化し、および／またはＨＩＶ感染を抑制するそれらの能力によ
り同定される。さらに別のアプローチは、ツーハイブリッドシステム（two-hybr
id systems）(例えば酵母または哺乳類ツーハイブリッドシステム)を利用して、
ＨＩＶ感染を抑制する作用物質を同定する。これらのアプローチの多くは、高ス
ループット分析で調べることができる。
【００１０】 ＦＰＲクラス受容体に対する結合パートナーは、好ましくは医薬品中に配合さ
れ、病原体に対する免疫応答を刺激する、および／またはＨＩＶ感染を治療およ
び予防する薬剤を必要とする被験体に投与する。好ましくは、ＦＰＲクラス受容
体と相互作用する分子は、ＦＰＲクラス受容体およびＣＣＲ５の両方を発現する
ヒト樹状細胞(ＤＣ)に提供される。さらに、ヒト粘膜組織中に存在するＤＣはＨ
ＩＶに対する主要標的細胞として関係があるため、本発明の分子は、ＨＩＶ伝染
の危険を低減するように、粘膜組織(例えば肛門−膣粘膜)に送達され得る。これ
らの医薬品は、任意の慣用的経路により送達され、その例としては経皮、局所、
非経口、胃腸、経気管支および経肺胞経路が挙げられるが、これらに限定されな
い。好ましい適用は、医療用具用コーティング(coating for medical devices)
における結合パートナーの使用に関する。
【００１１】 病原体に対する宿主免疫応答の誘導方法ならびにＨＩＶ感染の抑制方法も、実
施形態である。したがって病原体に対する宿主免疫応答の誘導方法は、ＦＰＲク
ラス受容体と相互作用する化合物を必要とする被験体を同定することと、治療に
十分な量のＶ３ペプチドまたはＷペプチドあるいはその断片、誘導体または修飾
物を上記被験体に提供することとを含む。ＨＩＶ感染の抑制方法は、本発明の一
態様によれば、ＨＩＶ感染に罹患する恐れのある被験体あるいはＨＩＶ感染にす
でに苦しめられている被験体を同定することと、ＦＰＲクラス受容体に対する治
療的に十分な量の結合パートナーを上記記被験体に提供することとを含む。本発
明のさらなる実施形態は、ＣＣＲ５のリン酸化の誘導方法、ＨＩＶ融合の抑制方
法ならびにＨＩＶ感染の治療および予防方法を含む。これらの方法は、それぞれ
、ＣＣＲ５のリン酸化を誘導する分子、またはＨＩＶ融合を抑制する分子、また
はＨＩＶ感染を治療および予防する分子を必要とする被験体を同定し、そしてＦ
ＰＲクラス受容体に対する治療に十分量の結合パートナーを上記被験体に投与す
ることを含む。
【００１２】 ［発明の詳細な説明］ ＦＰＲクラス受容体に対するいくつかの新規のリガンドの発見が、本開示にお
いて提示される。さらに、ＦＰＲクラス受容体に対するリガンドはＣＣＲ５のリ
ン酸化およびダウンレギュレーションを誘導し、ＨＩＶ感染を抑制する、という
ことが示される。好ましくは、ＦＰＲクラス受容体と相互作用する分子は、ＦＰ
Ｒクラス受容体およびＣＣＲ５の両方を発現するヒト樹状細胞(ＤＣ)に提供され
る。ヒト粘膜組織中に存在するＤＣはＨＩＶに対する主要標的細胞として関係が
あるため、本発明の分子は、ＨＩＶ伝染の危険を低減するように、粘膜組織(例
えば肛門−膣粘膜)に送達され得る。これらの医薬品は、任意の慣用的経路によ
り送達され、その例としては経皮、局所、非経口、胃腸、経気管支および経肺胞
経路が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい適用は、医療用具用コー
ティングにおける結合パートナーの使用に関する。本発明の実施形態は、ＨＩＶ
感染の研究、治療および予防ならびに病原体に対する宿主炎症応答の誘導のため
の生物工学的ツール、予防薬、治療薬および上記のものの使用方法を包含する。
【００１３】 第一群の実験において、古典的走化性因子である細菌走化性ペプチドＮ−ホル
ミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）は、ＣＣＲ５のセ
リンリン酸化およびダウンレギュレーションを迅速に誘導する、ということが見
出された。ＦＰＲクラス受容体とのｆＭＬＰの結合は、ＣＣＲ５リガンドに対す
る細胞応答の有意の減衰ならびにＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質媒介性融
合およびＣＤ４、ＣＣＲ５およびＦＰＲを発現する細胞の感染の抑制も生じた。
第二群の実験では、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のＶ３領域に由来する合成ペプチドド
メインはＦＰＲクラス受容体を活性化する、ということが判明した。ＦＰＲクラ
ス受容体に結合することにより、Ｖ３ペプチドはＣＣＲ５の食細胞走化性および
セリンリン酸化を誘導した。さらに、ＳＡＡおよびＴ２０を含むその他のＦＰＲ
クラス受容体リガンドがＣＣＲ５のリン酸化を誘導するということが発見された
。別の群の実験では、合成白血球活性化ペプチドまたは「Ｗペプチド」Ｔｒｐ−
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ（ＷＫＹＭＶＭ）（配列番号１）（ここで、Ｎ
Ｈ2末端のメチオニンはＤ型アミノ酸である）はＦＰＲクラス受容体を活性化し
、それによりカルシウム放出、走化性およびＨＩＶ感染の抑制を誘導する、とい
うことが発見された。
【００１４】 ＦＰＲクラス受容体の誘導を強化または抑制する（「調節する」）ことにより
、細胞応答、例えばシグナル変換、白血球移動、白血球移動免疫系応答、炎症応
答、ならびにＨＩＶ融合、進入および増殖が選択的に変更され得る。本発明の実
施形態は、ＦＰＲクラス受容体の誘導を調節する分子の使用を包含する。この開
示を通して、「ＦＰＲクラス受容体」という用語は、ｆＭＬＰにより活性化され
、ＦＰＲおよび／またはＦＰＲＬ１と少なくとも８０％の相同性を有し得る受容
体を指す。ＦＰＲクラス受容体と相互作用する分子は、本考察の目的のために、
「ＦＰＲクラス受容体に対する結合パートナー」または「結合パートナー（ｂｉ
ｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）」と呼ばれる。本発明の望ましい結合パートナー
はＦＰＲクラス受容体と相互作用し、それにより病原体に対する宿主免疫応答を
誘導し、および／またはＣＣＲ５をリン酸化し、ＣＣＲ５の発現をダウンレギュ
レートし、そしてＨＩＶ感染を抑制する。
【００１５】 病原体に対する免疫応答の誘導のためのいくつかの異なる結合パートナーの使
用、ＣＣＲ５受容体のリン酸化およびダウンレギュレーション、ならびにＨＩＶ
感染の抑制が意図される。例えばｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０およ
びＷペプチドならびにこれらの分子の断片または変異体は、病原体に対する免疫
応答を誘導し、および／またはＣＣＲ５受容体をリン酸化し、ＣＣＲ５受容体の
発現をダウンレギュレートし、そしてＨＩＶ感染を抑制することを必要とする被
験体に提供され得る。ＦＰＲクラス受容体リガンドまたはその断片およびＦＰＲ
クラス受容体リガンドまたはそれらの断片のプロテアーゼ安定性変異体に類似す
る化学物質およびペプチド擬似体も、病原体に対する宿主免疫応答を誘導し、お
よび／またはＣＣＲ５受容体をリン酸化し、その発現をダウンレギュレートし、
そしてＨＩＶ感染を抑制するために用いられ得る。
【００１６】 さらに、病原体に対する宿主免疫応答を誘導し、および／またはＣＣＲ５受容
体をリン酸化し、その発現をダウンレギュレートし、そしてＨＩＶ感染を抑制す
るさらなる結合パートナーの同定を可能にする方法が提供される。ひとつのアプ
ローチは合理的薬剤設計における技術の使用を包含する。したがって、同定され
た結合パートナーおよびこれらの分子の断片または変異体が設計され、コンピュ
ータベースのホモロジー検索、タンパク質モデリングおよびコンビナトリアルケ
ミストリーを用いて作製される。例えばｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２
０またはＷペプチドあるいはこれらの分子の断片または変異体に対応する核酸ま
たはタンパク質配列を含むデータベースが、相同リガンドを同定するために公的
にまたは商業的に利用しうるデータベース中のその他の配列と当該配列を比較す
る検索プログラムによりアクセスされる。別の合理的アプローチにより、結合パ
ートナーのモデルを構築するために、タンパク質モデリング（例えばＸ線結晶、
ＮＭＲおよびコンピュータモデリング）における技術が用いられる。これらのモ
デルから、合理的薬剤設計が達成され得る。さらにＦＰＲクラス受容体を含むタ
ンパク質モデルが作製され、リガンド結合Ｖが同定されて、この情報を用いてよ
り多くの結合パートナー候補（ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔ
ｎｅｒ）を合理的に設計し得る。
【００１７】 結合パートナー候補が設計され、作製された場合、それらは、ＦＰＲクラス受
容体と結合し、それによりＣＣＲ５のリン酸化し、ＣＣＲ５のダウンレギュレー
ションおよびＨＩＶ感染の抑制を誘導するそれらの能力に関して評価されるのが
好ましい。ＦＰＲクラス受容体と相互作用し、ＣＣＲ５のリン酸化を誘導し、Ｃ
ＣＲ５のダウンレギュレーションを誘導し、そしてＨＩＶ感染を抑制する結合パ
ートナー候補または結合パートナーの能力を評価するアプローチは、本開示中で
は、「結合パートナー特性化アッセイ」と集合的に呼ばれる。結合パートナー特
性化アッセイは、病原体に対する宿主免疫応答を誘導する結合パートナー候補ま
たは結合パートナーの能力を評価するアプローチも包含する（例えば走化性アッ
セイ、Ｃａ2+動員アッセイおよび脱感作アッセイ）。結合パートナー特性化アッ
セイは、ＦＰＲクラス受容体と相互作用する結合パートナーの能力を査定する、
コンピュータによるアプローチも包含し得る。例えばＦＰＲクラス受容体とのコ
ンピュータ刺激リガンド相互作用の評価は、本開示のために、結合特性化アッセ
イである。結合パートナー特性化アッセイにおける結合パートナー候補の評価後
、ＨＩＶ感染を抑制する結合パートナーが、ＣＣＲ５をリン酸化し、ＣＣＲ５の
発現をダウンレギュレートし、および／またはＨＩＶ感染を抑制するその能力に
より同定される。
【００１８】 合理的薬剤の設計のほかに、高スループット技術を用いて、ＨＩＶ感染を抑制
する結合パートナーを得るためには、分子のランダムライブラリーを迅速にスク
リーニングし得る。このような技法は、支持結合ＦＰＲクラス受容体、細胞ベー
スの系およびツーハイブリッドアプローチを利用する。例えばＦＰＲクラス受容
体を有する多量体支持体は、結合パートナー候補を同定するためにコンビナトリ
アルライブラリー中に存在する分子に対してスクリーニングされ得る。これらの
候補リガンド（ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｌｉｇａｎｄ）は次に、ＣＤ４、ＣＣＲ５
およびＦＰＲクラス受容体を発現する細胞に接触し、そしてＣＣＲ５をリン酸化
し、ＣＣＲ５発現をダウンレギュレートし、および／またはＨＩＶ感染を抑制す
る結合パートナーの能力が確定され得る。あるいは、ＣＤ４、ＣＣＲ５およびＦ
ＰＲクラス受容体を発現する細胞は、ＦＰＲクラス受容体を有する多量体支持体
を用いることにより、結合パートナー候補のクラスを先ず同定することなしにコ
ンビナトリアルライブラリーの分子と接触され得る。
【００１９】 さらに、ツーハイブリッドシステム（例えば酵母または哺乳類ツーハイブリッ
ドアプローチ）は、結合パートナーを同定するために利用され得る。例えば、Ｆ
ＰＲクラス受容体に連結されたＤＮＡ結合ドメイン（例えばＧａｌ−４）を有す
る一次融合タンパク質、ならびに活性化タンパク質に連結されたランダムペプチ
ドを有する二次融合タンパク質（例えばＶＰ−１６）が作製され得る。これらの
融合タンパク質をコードする構築物は、１つまたはそれ以上のＧａｌ−４結合部
位、最小プロモーターおよびレポーター分子（例えばＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ））で構成された鋳型ＤＮＡを有する細胞中
にトランスフェクトされ得る。活性化タンパク質に連結されたランダムペプチド
が結合パートナーに対応する場合には、レポーターシグナルが検出される。合理
的な薬剤設計および高スループット技術の組合せを用いることにより、ＣＣＲ５
のリン酸化、ＣＣＲ５発現のダウンレギュレーションおよびＨＩＶ感染の抑制を
誘導するいくつかの結合パートナーが同定され得る。
【００２０】 結合パートナーを有する治療的および予防的化合物も、本発明の実施形態であ
る。これらの医薬品は任意の慣用的経路により送達され、その例としては、経皮
、非経口、胃腸、経気管支および経肺胞経路が挙げられるが、これらに限定され
ない。上記有効成分のほかに、医薬品実施形態は、担体、タンパク質、支持体、
アジュバント、または薬剤送達を促進するか、もしくは増強する構成成分を含み
得る。好ましい適用は医療用具用コーティングにおける結合パートナーの使用に
関し、その例としては手袋、膣器具およびコンドームが挙げられるが、これらに
限定されない。
【００２１】 医薬品実施形態は、病原体に対する免疫応答の誘導、ならびに／またはＨＩＶ
感染の治療および予防のための治療プロトコルに用いられ得る。ひとつのアプロ
ーチにより、ＦＰＲクラス受容体と相互作用し、それにより病原体に対する宿主
免疫応答を誘導する作用物質を必要とする被験体が同定され、上記被験体は、治
療的十分量のＶ３ペプチドまたはＷペプチドを提供される。別のアプローチによ
れば、ＨＩＶ感染を抑制する作用物質を必要とする被験体が同定され、上記被験
体はＦＰＲクラス受容体に対する結合パートナーを、治療に十分量提供される。
同様に、ＨＩＶ感染に罹患する恐れのある被験体あるいはＨＩＶ感染にすでに苦
しめられている被験体が同定され、次にＦＰＲクラス受容体に対する結合パート
ナーが治療に十分量提供される、ＨＩＶ感染を治療および予防するためのアプロ
ーチが提供される。以下のセクションでは、ｆＭＬＰがＣＣＲ５のリン酸化を誘
導し得ることを明示した実験の考察が提示される。
【００２２】 ｆＭＬＰおよびＴ２０はＣＣＲ５のリン酸化を誘導する 末梢血単球中のＣＣＲ５のリン酸化パターンに及ぼすＣＣＲ５リガンドの作用
が、最初に調べられた。いくつかの研究は、ＣＣＲ５がそのネイティブリガンド
、例えばＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１の結合時に迅速にリン酸化され得ること
を示している（Oppermann et al., J Biol Chem, 274: 8875(1999); Olbrich et
al., J Leukoc Biol, 65:281(1999); Aramori et al., EMBO J, 16: 4606(1997
);およびRodriguez-Frade et al., J Cell Biol, 144: 755 (1999)）。しかしな
がらこれらの研究は、ＣＣＲ５と結合したシグナリング分子が異なり得るネイテ
ィブ細胞ではなく、ＣＣＲ５を発現するためにトランスフェクトされた細胞系で
実施された。
【００２３】 単球およびＣＣＲ５−トランスフェトしたＨＥＫ２９３細胞（ＣＣＲ５／２９
３）から調製された溶解産物中のＣＣＲ５を検出する能力に関して、抗ＣＣＲ５
ポリクローナル抗体を試験した。単球（図１Ａ）およびＣＣＲ５／２９３細胞（
図１Ｂ）の両方において、非還元状態下で約７５ｋＤａであり、かつ、還元条件
下で４０ｋＤａである単一タンパクとして、イムノブロッティングすることによ
りＣＣＲ５を検出した。これらの結果は、単球中のＣＣＲ５がホモ二量体の形態
で存在することを立証した。さらに単球でなく、ＣＣＲ５／２９３細胞の、特定
のケモカインによる刺激はさらにＣＣＲ５の二量体化を促し、これは還元条件下
でさえ検出可能であった（図１Ｂ）。次に単球中でのＣＣＲ５のリン酸化を、抗
ホスホセリン抗体を用いた免疫沈降と、その後の抗ＣＣＲ５抗体によるイムノブ
ロッティングを用いて調べた。ＣＣＲ５リン酸化は、受容体のＣ末端のセリン残
基上で専ら起こると報告されている（Dean, et al., Science, 273:1856(1996)
）。図１ＣおよびＤに示したように、休止中の単球においては、ＣＣＲ５の低レ
ベルのリン酸化が一貫して観察されるが、ＣＣＲ５アゴニストによる細胞刺激時
には、迅速（１分以内、図１Ｃ）かつリガンド濃度依存性の（図１Ｄ）ＣＣＲ５
リン酸化の増大が認められた。
【００２４】 ＣＣＲ５のようなＳＴＭ受容体のアゴニスト誘導性リン酸化は、受容体の同種
脱感作およびインターナライゼーションを生じ得る（Oppermann et al., J Biol
Chem, 274: 8875(1999); Olbrich et al., J Leukoc Biol, 65:281(1999); Ara
mori et al., EMBO J, 16: 4606(1997); Rodriguez-Frade et al., J Cell Biol
, 144: 755 (1999)）。細胞がある種の関連しないＳＴＭ受容体を用いてアゴニ
ストにより活性化される場合には、ＳＴＭ受容体には「異種脱感作」も施し得る
。単球は種々のＳＴＭ化学誘引物質受容体、例えば高親和性ｆＭＬＰ受容体であ
る、ＦＰＲを発現するため、ＣＣＲ５のリン酸化および発現に影響を及ぼすｆＭ
ＬＰの能力を次に調べた。図２Ａに示したように、低ナノモル濃度のｆＭＬＰを
用いた単球のインキュベーションは、ＣＣＲ５リン酸化のレベルを増大させた。
さらに単球中のＣＣＲ５のリン酸化の増大は、ｆＭＬＰによる刺激後１分以内に
観察され（図２Ｂ）、最大リン酸化は６０分で観察された。これらの結果は、単
球中のＣＣＲ５のケモカイン誘導性およびｆＭＬＰ誘導性リン酸化のメカニズム
が異なっているという証拠を示す。
【００２５】 ネイティブケモカインリガンドにより誘導されるＣＣＲ５のリン酸化は、Ｇタ
ンパク質受容体キナーゼのカップリングに依存している（Oppermann et al., J
Biol Chem, 274: 8875(1999); Olbrich et al., J Leukoc Biol, 65:281(1999);
Aramori et al., EMBO J, 16: 4606(1997); Rodriguez-Frade et al., J Cell
Biol, 144: 755 (1999)）。あるいはｆＭＬＰは、受容体「交差脱感作」経路を
介してＣＣＲ５に及ぼすその作用を発揮し、これはプロテインキナーゼＣの活性
化を包含し得る（Ali et al., J Biol Chem, 274: 6027 (1999); Ali et al., M
ed Clin North Am, 81:1(1997); Tomhave et al., J Immunol, 153:267(1994)）
。この可能性を試験するために、特定のプロテインキナーゼＣ（「ＰＫＣ」）阻
害剤スタウロスポリンまたはカルホスチンＣを用いて単球をインキュベートし、
その後ｆＭＬＰで刺激した。図２Ｃに示したように、ｆＭＬＰにより誘導される
ＣＣＲ５リン酸化のレベルは、カルホスチンＣを用いてプレインキュベートされ
た単球中では顕著に低減された。これに対して、カルホスチンＣは、ＭＩＰ−１
誘導性ＣＣＲ５リン酸化にほとんど影響を及ぼさなかった。これらの結果は、ｆ
ＭＬＰ誘導性ＣＣＲ５リン酸化がＰＫＣの活性化に依存しているという見解を裏
付ける。
【００２６】 次に、ＦＰＲクラス受容体を活性化し、それによりＣＣＲ５のリン酸化を誘導
するその能力に関して、ＦＰＲクラス受容体リガンドＴ２０／ＤＰ１７８を分析
した（Su et al., Blood, 93:3885(1999); Kilby et al., Nat Med, 4: 1302(1
998); Lawless et al., Biochemistry, 35: 13697(1996); Wild et al., AIDS R
es Hum Retroviruses, 9: 1051(1993); Wild et al., Pro. Natl. Acad. Sci. U
SA, 91:9770(1994);およびChen et al., J Virol, 69: 3771(1995)）。ｆＭＬＰ
を用いた場合、合成ペプチドＴ２０／ＤＰ１７８は、単球におけるＣＣＲ５の有
意なかつ用量依存性リン酸化を誘導し（図２Ｄ）、単球中のＦＰＲの活性化がＣ
ＣＲ５リン酸化をもたらすシグナルを変換するというさらなる証拠を示す。以下
のセクションでは、ｆＭＬＰがＣＣＲ５の発現をダウンレギュレートし得るとい
うことを明示した実験の考察を示す。
【００２７】 ｆＭＬＰを媒介としたＦＰＲクラス受容体の活性化はＣＣＲ５発現をダウンレ
ギュレートする 単球中のＣＣＲ５の発現および機能をアッセイすることにより、ＣＣＲ５のｆ
ＭＬＰ誘導性リン酸化の生物学的結果を調べた。細胞に関連した125Ｉ−ＭＩＰ
−１のほとんどは１０００倍過剰量の非標識リガンドにより置換され得るので、
新たに単離されたヒト単球は、放射性ヨウ素化ＭＩＰ−１に関する特異的結合部
位を発現した（図３Ａ）。これに対比して、高濃度のｆＭＬＰはいかなる125Ｉ
−ＭＩＰ−１結合も置換しなかったが、このことは、これら２つのリガンドが別
個の細胞表面受容体を用いることを立証する。ｆＭＬＰを用いて３７℃で３０分
間処理した単球は、125Ｉ−ＭＩＰ−１の結合のわずかな低減のみを示した。し
かしながら、ｆＭＬＰを用いた１時間の処理は、125Ｉ−ＭＩＰ−１に対する特
異的結合のレベルを顕著に低減し、結合のこの低減は、細胞がＰＫＣ阻害剤で前
処理された場合には逆になった（図３Ａ）。
【００２８】 リガンドの結合結果と一致して、ｆＭＬＰで前処理した単球では、ＣＣＲ５ア
ゴニストＭＩＰ−１に対する走化性応答が次第に低減した（図３Ｂ）。ｆＭＬＰ
による処理後のＣＣＲ５リガンドに応答する単球の機能的能力も、カルシウム（
Ｃａ2+）動員実験によっても調べた。ＭＩＰ−１は単球におけるＣａ2+放出の不
十分な誘導物質であるため、ＣＣＲ５を含めた多数の受容体を活性化し、かつ、
ＣＣＲ５のリン酸化の顕著な誘導物質である２つのケモカインであるＭＩＰ−１
およびＲＡＮＴＥＳを用いた（図２ＡおよびＢ）。ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−
１はともに、単球中のＣａ2+の一時的な上昇を誘導した（図３Ｃ）。しかしなが
らｆＭＬＰで前処理された細胞は、これらのケモカインに応答してＣａ2+放出低
減を示した。これに対比して、ＰＫＣ阻害剤で前処理された単球は、かろうじて
正常な走化性およびＣＣＲ５リガンドに対するＣａ放出応答を示した（図３Ｂお
よびＣ）。
【００２９】 単球上のＣＣＲ５の表面発現も、抗ＣＣＲ５抗体およびフローサイトメトリー
を用いて検査した。新たに単離されたヒト単球のうち、相当の割合のものは細胞
表面上にＣＣＲ５を発現し（図４ＡおよびＢ）、ＣＣＲ５発現は、ケモカインリ
ガンドＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１またはＲＡＮＴＥＳによりダウンレギュレートさ
れた（図４Ｃ）。単球上のＣＣＲ５の発現は、ｆＭＬＰによる細胞の従来の処理
によっても顕著にダウンレギュレートされた（図４Ｄ）が、一方、ＰＫＣ阻害剤
でプレインキュベートされた細胞は、野生型の単球に匹敵する表面上のＣＣＲ５
レベルを示した（図４Ｅ）。これらの結果は、単球中でｆＭＬＰにより誘導され
るＣＣＲ５のリン酸化が、機能的受容体としてＣＣＲ５を用いるケモカインに対
する細胞のシグナリング能力低減に伴う細胞表面におけるＣＣＲ５のダウンレギ
ュレーションを生じるという証拠を提供する。さらに、単球応答に及ぼすｆＭＬ
Ｐの脱感作作用はＰＫＣ阻害剤により逆になり、このことは、ＰＫＣがｆＭＬＰ
誘導性ＣＣＲ５脱感作の媒介における重要な分子であるという見解を支持する。
以下のセクションにおいて、ｆＭＬＰがＨＩＶ感染を抑制し得るということを明
示する実験の考察を提示する。
【００３０】 ＦＰＲクラス受容体のｆＭＬＰ誘導性活性化はＨＩＶ感染を抑制する ＦＰＲクラス受容体の活性化がＨＩＶ−１エンベロープ融合およびＨＩＶ−１
感染を実行し得るか否かを確定するよう調べる実験を、以下のように実行した。
ＦＰＲクラス受容体であるＦＰＲを、ＣＤ４およびＣＣＲ５をともにすでに発現
していたヒト骨肉種細胞系（ＨＯＳ）中に安定的にトランスフェクトした。ＦＰ
Ｒを用いたトランスフェクション後、細胞は、ｆＭＬＰおよびＣＣＲ５アゴニス
トの両方に応答してＣａ2+を移動し、動員した。さらに、ＦＰＲを同時発現する
ＨＯＳ／ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞のｆＭＬＰまたはＭＩＰ−１を用いた処理は、Ｃ
ＣＲ５のリン酸化の増大を誘導し（図５Ａ）、これは、ＣＣＲ５およびＦＰＲの
両方がこれらの細胞中で機能的に発現されたことを立証する。ＦＰＲの存在下ま
たは非存在下で、単球指指向性ＨＩＶ−１ＢＡＬ−ｅｎｖまたはレポーター遺伝
子を発現する組換えワクシニアウイルスを用いた定量的ガラクトシダーゼ遺伝子
活性化アッセイ系により評価したように、ＨＯＳ／ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞はＨＩ
Ｖ−１ＢＡＬ−ｅｎｖ媒介性融合を裏付けた（図５Ｂ）。
【００３１】 ＨＩＶ−１ｅｎｖ融合を、ＣＣＲ５特異的ケモカインにより抑制した。さらに
、ｆＭＬＰはＦＰＲを同時発現する細胞中でのＨＩＶ−１ＢＡＬ−ｅｎｖ媒介性
融合を顕著に抑制したが、ＣＤ４およびＣＣＲ５のみを発現する細胞中ではそう
でなかった。ｅｎｖ発現細胞を用いた融合アッセイ系へのｆＭＬＰの同時付加は
融合を有意に抑制したため、ＦＰＲ発現細胞とのＨＩＶ−１ｅｎｖ媒介性融合に
及ぼすｆＭＬＰの作用は迅速であった（図５Ｂ）。また、ｆＭＬＰの存在下で、
血中単球とのＨＩＶ−１ｅｎｖ融合の抑制が観察された（図５Ｃ）。ＦＰＲトラ
ンスフェトしたＨＯＳ細胞および末梢血単球／マクロファージの両方において、
ｆＭＬＰによる処理は、融合細胞形成およびｐ２４産生により測定した場合、Ｈ
ＩＶ−１の単球指指向性株により細胞の融合および感染を有意に低減した、とい
うことも確証された（図５Ｄ）。これらの結果は、ｆＭＬＰにより誘導されたＣ
ＣＲ５のリン酸化の迅速な増大がＨＩＶ−融合補助受容体として作用するように
ＣＣＲ５の能力を有効に減損したことを証明する。
【００３２】 これらの初期実験からの結果は、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の発現および重要
な機能がＦＰＲクラス受容体に対するリガンドにより抑制され得るという証拠を
提供する。これらの結果は、単球中のＣＣＲ５がＦＰＲ活性化誘導性リン酸化の
標的であり、ＣＣＲ５リン酸化レベルが迅速かつ次第に増加していくのに伴って
、単球中のＣＣＲ５の表面発現および機能がダウンレギュレートされるというこ
とを立証する。前記のこれらの結果は、局所炎症の部位での多数の白血球化学誘
引物質の結集におけるＦＰＲの重要な役割も強調する。有意には、ＣＣＲ５の発
現および機能は、無関係な受容体を用いるペプチドによりダウンレギュレートさ
れ得る。これらの観察により、ＣＣＲ５のリン酸化、ＣＣＲ５発現のダウンレギ
ュレーションおよびＨＩＶ感染の抑制を誘導するＦＰＲクラス受容体に対するさ
らなるリガンドを同定するため研究がさらに深まった。以下のセクションは、「
Ｖ３ペプチド」が病原体に対する宿主免疫応答を誘導し得ることを明示した実験
の考察を提示する。
【００３３】 Ｖ３ペプチドは病原体に対する宿主免疫応答を誘導し得る ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のＶ３領域は、ＨＩＶ−１の細胞指向性を確定するのに
大きい役割を演じると考えられる（O'Brien et al., Nature (London), 348:69(
1990); Sakaida et al., J. Virol., 72:9763(1998); Shioda et al., Nature(L
ondon), 349:167(1991); Hwang et al., Science, 253:71(1991);およびBerger,
AIDS 11(suppl A): S3(1997)）。最初に、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４のような
ウイルス融合補助因子と直接相互作用する合成Ｖ３ペプチドの能力を確定した。
Ｔ指向性ＨＩＶ株ＩＩＩＢおよびＥＬ１の線状または環状合成Ｖ３ドメインは、
ＣＸＣＲ４を直接結合し、ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔリンパ球の移動を誘導するこ
とが報告されている。ＨＩＶ−１のＭＮ株由来の合成Ｖ３ペプチドドメインが試
験され、このＶ３ペプチドはヒト単球および好中球に対して強力な化学誘引物質
である（図６Ａ）が、しかしＴリンパ球に関する弱化学誘引物質であるというこ
とが見出された。Ｖ３ペプチドに対するヒト食細胞の走化性応答は百日咳毒素を
用いた細胞のプレインキュベーションにより抑制されたため（図６Ｂ）、このＶ
３ペプチドがＧタンパク質共役型ＳＴＭ受容体（単数または複数）を活性化する
ことが認識された。
【００３４】 このＶ３ペプチドにより用いられる受容体（単数または複数）の性質を特性化
するよう試みる一方で、単球および好中球はともにペプチドによる刺激後にＣａ 2+ を動員する、ということが発見された（図７ＡおよびＢ）。しかしながら、Ｖ
３ペプチドは、受容体ＣＸＣＲ４に対する同源リガンドであるＳＤＦ−１αを含
めた多数のケモカインに対する細胞応答を弱めなかった（図７Ｃ〜Ｆ）。これに
対比して、食細胞中でのＶ３ペプチドのシグナリングは、高濃度のｆＭＬＰによ
り弱められ、あるいはその逆もあり（図７ＧおよびＨ）、このことは、Ｖ３ペプ
チドがｆＭＬＰに対する低親和性受容体を活性化するという証拠を提供する。Ｖ
３ペプチドがｆＭＬＰに対する低親和性受容体を活性化するというさらなる証拠
は、ＦＰＲＬ１を発現するためにトランスフェクトされた細胞を分析することに
より得られた。図８ＡおよびＢに示したように、Ｖ３ペプチドは、ＦＰＲＬ１を
発現するようトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のＣａ2+動員および走化
性の両方を誘導した。これに対比して、Ｖ３ペプチドは、低レベルの走化性応答
を誘導した（図８Ａ）が、ＦＰＲを過剰発現する細胞中でのＣａ2+動員は誘導し
なかった（図８Ｃ）。これらの結果は、ＦＰＲＬ１が、Ｖ３ペプチドにより用い
られる主要な機能性受容体であることを示した。以下のセクションは、Ｖ３ペプ
チドおよびＳＡＡがＣＣＲ５受容体のリン酸化を誘導し得ることを明示した実験
の考察を示す。
【００３５】 Ｖ３ペプチドおよびＳＡＡはＣＣＲ５受容体のリン酸化を誘導し得る Ｖ３ペプチドによるヒト食細胞の刺激はケモカインを用いたその後の試験に対
するＣａ放出応答を弱めなかったため、Ｖ３ペプチドはケモカインと受容体を共
有しないと考えられた。実験を実施して、Ｖ３ペプチドによる単球の長期処理が
、恐らくは「異種」脱感作により、ケモカインに対する細胞応答を弱め得るか否
かを確定した。ケモカインＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１αおよびＭＣＰ−１はすべ
て、培地を用いてプレインキュベートされた単球中での有意のＣａ2+動員を誘導
した。しかしながら、単球をＶ３ペプチド（１．５μＭ）を用いて３７℃で６０
分間プレインキュベートした場合、ＲＡＮＴＥＳおよびＳＤＦ−１αに対する細
胞応答は有意に低減された（図９ＡおよびＢ）。これに対して、プロテインキナ
ーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤スタウロスポリンを用いて、その後Ｖ３ペプチドを用い
てプレインキュベートされた単球は、ＲＡＮＴＥＳまたはＳＤＦ−１αに応答す
るほぼ正常なＣａ2+動員を示した。これらの結果は、Ｖ３ペプチドがＦＰＲＬ１
受容体を活性化することによりこれらのケモカインに対する細胞応答の異種脱感
作を引き起こして、ＰＫＣ媒介性シグナル変換経路を誘導するという証拠を提供
した。別のケモカインであるＭＣＰ−１および走化性ペプチドｆＭＬＰに対する
細胞応答は、Ｖ３ペプチドを用いた予備インキュベーションにより最小限に影響
された（図９ＣおよびＤ）。
【００３６】 次に、ケモカイン受容体ＣＣＲ５がＶ３ペプチドによる単球の刺激によりリン
酸化され得るか否かを確かめるための実験を実施した。単球と受容体トランスフ
ェトしたＨＥＫ２９３細胞（ＣＣＲ５／２９３細胞）との両方において、他の研
究者によりＣＣＲ５をトランスフェクトした細胞系を用いて得られた結果と一致
して、非還元状態下では約７５ｋＤａであり還元条件下では約４０ｋＤａである
、二量体化タンパク質として、ポリクローナル抗ＣＣＲ５抗体を用いてイムノブ
ロッティングすることによりＣＣＲ５を検出した（Rodriguez-Frade et al., J.
Cell. Biol., 144:755(1999)）。さらに、単球でなく、ＣＣＲ５／２９３細胞
の、特定のケモカインによる刺激はさらにＣＣＲ５の二量体化を促し、これは還
元条件下で検出可能であった。
【００３７】 抗ホスホセリン抗体を用いて、細胞溶解産物を免疫沈降させ、抗ＣＣＲ５ポリ
クローナル抗体を用いて抗ホスホセリン免疫沈降物をイムノブロッティングする
ことにより、リン酸化ＣＣＲ５を検出した。これらの実験は、ＣＣＲ５ケモカイ
ンアゴニストＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１βを用いた細胞の刺
激によりＣＣＲ５が迅速にリン酸化され（図１０ＡおよびＢ）、最大レベルのリ
ン酸化は１分で起こる、ということを示した。抗ＣＣＲ５抗体を用いた全単球溶
解産物のイムノブロッティングは、同一分子量の位置でタンパク質を示した（図
１０Ｃ）。Ｖ３ペプチドによる単球の刺激もＣＣＲ５の有意のセリンリン酸化を
誘導したが、最大レベルのＣＣＲ５リン酸化は、刺激後１５分で観察された（図
１０ＤおよびＥ）。これらの結果は、異種受容体脱感作が、刺激剤を用いたより
長いインキュベーション時間ならびに無関係のＳＴＭ受容体のリン酸化において
完了する二次メッセンジャーの蓄積を必要とし得るという見解と一致する。実際
、単球がＰＫＣ阻害剤スタウロスポリンで前処理された場合、Ｖ３ペプチドはも
はやＣＣＲ５のリン酸化を有意に誘導せず、一方スタウロスポリン処理はＭＩＰ
−１β誘導性ＣＣＲ５リン酸化に影響を与えなかった（図１０Ｆ）。
【００３８】 ＦＰＲクラス受容体リガンドＳＡＡも、ＦＰＲクラス受容体を活性化し、ＣＣ
Ｒ５のリン酸化を誘導するその能力に関して分析された。ｆＭＬＰおよびＴ２０
を用いた場合と同様に、ＳＡＡは単球におけるＣＣＲ５の有意のかつ用量依存性
のリン酸化を誘導した（図１０ＧおよびＨ）。主に単球中の受容体ＦＰＲを用い
る細菌走化性ペプチドｆＭＬＰはＣＣＲ５リン酸化を誘導し（図１０Ｅ）、最大
レベルの効果は６０分においてであった。
【００３９】 上記実験は、ＨＩＶ−１ ＭＮ株からのｇｐ１２０の合成Ｖ３ペプチドドメイ
ンは、Ｇタンパク質共役型ＳＴＭ受容体ＦＰＲＬ１を選択的に活性化することに
より、ヒト単球および好中球における移動およびＣａ2+動員を誘導した、という
ことを立証する。さらに、実験のこの第二群において示されたデータは、ＦＰＲ
クラス受容体の活性化が選定ケモカインに応答する細胞シグナリングの減衰に関
連してケモカイン受容体ＣＣＲ５のリン酸化を誘導した、というさらなる証拠を
提供した。興味深いことに、ＭＮ株（NIH AIDS Research and Reference Reagen
t Program）のＨＩＶ−１ｇｐ１２０由来の環化Ｖ３ペプチドは単球または好中
球を活性化せず、ｇｐ１２０（ＭＮ）の線状または環状Ｖ３ペプチドはともにＣ
ＸＣＲ４と相互作用しなかった。これらの知見は、ペプチドの二次または三次構
造がＣＸＣＲ４に関する特定結合ドメインの形成のために極めて重大であり、そ
して異なるＨＩＶ−１株のＶ３ドメインはケモカイン融合補助受容体と直接的に
相互作用する互いに異なる能力を有し得るという見解を裏付ける。以下のセクシ
ョンは、「Ｗペプチド」が病原体に対する宿主免疫応答を誘導し得るということ
を明示した実験の考察を提供する。
【００４０】 Ｗペプチドは病原体に対する宿主免疫応答を誘導し得る Ｗペプチドは、１つまたはそれ以上のＧタンパク質共役型ＳＴＭ受容体により
媒介されるヒト白血球における一連のシグナリング事象を誘導することが報告さ
れているが、このペプチドに関する受容体（単数または複数）は同定されていな
かった（Baek et al., J. Biol. Chem., 271:8170-8175(1996); Seo et al., J.
Immunol., 158:1895-1901(1997); Seo et al., Clin. Biochem., 31:137-141(1
998);およびBae et al., J. Leuko. Bio., 65:241-248(1999)）。初期実験はＷ
ペプチド受容体ならびにヒト食細胞の移動を誘導するＷペプチドの能力の同定に
注目した。
【００４１】 ヒト末梢血単球および好中球は、Ｗペプチドの濃度勾配に応答し、用量依存的
方法で移動した（図１１Ａ）。Ｗペプチドの走化性活性は、単球および好中球の
両方に関して、ピコモル（ｐＭ）濃度で非常に強力かつ明確なものであった。用
量応答曲線は鐘形で、低ナノモル（ｎＭ）のペプチド濃度で、最大の細胞移動（
ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を示した。次に、Ｗペプチドにより誘導された
食細胞の移動が走化性に基づいているかあるいはケモキネシスに基づいているか
を調べる実験を実施した。チェッカー盤分析は、高濃度のＷペプチドが走化性チ
ャンバの下部ウエル中に存在する場合にのみ、単球は良好に移動することを示し
た（表１）。高濃度のＷペプチドが上部ウエル中に存在する場合には、細胞移動
の増大は認められなかった。上部および下部ウエル中にＷペプチドが等濃度にあ
る場合は、わずかではあるがしかし有意の細胞移動の増大を誘導した。これらの
結果は、Ｗペプチドにより誘導される細胞移動が走化性作用によるものであり、
ケモキネシスに基づくものは少数であるという証拠を提供した。
【００４２】
【表１】
【００４３】 Ｗペプチドに応答する食細胞の移動は、百日咳毒素（ＰＴ）を用いた細胞の前
処理により完全に抑制されたが、コレラ毒素（ＣＴ）（図１１Ｂ）またはハービ
マイシンＡによっては抑制されず、このことは、Ｇｉタンパク質共役型受容体が
関与していたという証拠を提供した。この知見は、Ｗペプチドが、単球および好
中球において用量依存性および百日咳毒素感受性のカルシウム（Ｃａ2+）動員を
強力に誘導したという証拠によりさらに裏付けられた（図１２ＡおよびＥ）。Ｃ
ａ2+動員は、観察されたＷペプチド媒介性走化性活性と一致して、Ｗペプチドが
ｐＭ濃度で与えられた場合に検出された。
【００４４】 食細胞上のＷペプチド受容体をさらに特性化するために、Ｃａ2+動員の交差脱
感作を調べる一連の実験を、種々の化学誘引物質を用いて実施した。単球または
好中球中でＷペプチドにより誘導されるＣａ2+放出は、種々のケモカイン、例え
ばＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１ ＩＬ−８およびＳＤＦ
−１により脱感作されなかった。これらの結果は、Ｗペプチドがこれらのケモカ
インのいずれとも受容体を共有しなかったことを示唆した。低濃度（ｎＭ範囲）
のｆＭＬＰも、Ｗペプチド誘導性Ｃａ2+放出に及ぼす作用は限定的であった（図
１２ＢおよびＦ）。しかしながら、ｆＭＬＰの濃度がμモル範囲に増大された場
合には、単球（図１２Ｃ）または好中球（図１２Ｇ）中でのＷペプチドに対する
応答は、有意に減衰された。さらに、Ｗペプチドは、Ｃａ2+放出応答を単球（図
１２Ｄ）および好中球（図１２Ｈ）の両方において高濃度のｆＭＬＰの１０-3〜
１０-4倍に脱感作できた。これらの結果は、Ｗペプチドがヒト食細胞上でｆＭＬ
Ｐと受容体（単数または複数）を共有し、ｆＭＬＰより非常に高い効率で受容体
（単数または複数）を活性化するという見解を裏付ける。
【００４５】 次に、ＦＰＲまたはＦＰＲＬ１を発現するようトランスフェクトされた細胞に
及ぼすＷペプチドの作用を分析した。ｆＭＬＰは、広範囲の濃度に亘って提供さ
れ、ＦＰＲ−トランスフェクトしたラット好塩基性白血病細胞下部（ＥＴＦＲ細
胞）におけるＣａ2+動員を誘導し、最小有効用量は１０-10Ｍであった（図１３
Ａ）。これに対して、ＦＰＲＬ１トランスフェトした細胞（ＦＰＲＬ１／２９３
細胞）中でのＣａ2+動員を誘導するためのｆＭＬＰに関する最小有効濃度は、Ｍ
範囲内であった（図１３Ｅ）。Ｗペプチドは、これらのＦＰＲクラス受容体のい
ずれかを用いてトランスフェクトされた細胞中でのＣａ2+動員も誘導した（図１
３ＢおよびＦ）。しかしながらＦＰＲおよびＦＰＲＬ１の両方を活性化するため
のＷペプチドに関する最小有効用量は１０-11Ｍであって、これはＷペプチドが
ｆＭＬＰより高い効率でこれらの受容体を活性化することを実証する。
【００４６】 この知見はさらに、両受容体トランスフェクタントにおいてＷペプチドおよび
ｆＭＬＰ間のＣａ2+放出の交差脱感作によりさらに裏付けられた。図１３Ｇおよ
びＨに示したように、ＷペプチドおよびｆＭＬＰによるＦＰＲＬ１を発現する細
胞の継続的刺激は二方指向性脱感作を生じたが、ＦＰＲＬ１／２９３細胞におけ
るＷペプチドの作用を脱感作するためには１０5倍過剰量のｆＭＬＰが必要とさ
れた。同様に、ＥＴＦＲ細胞においては、Ｗペプチドは、等濃度のｆＭＬＰの作
用をより強力に脱感作した（図１３ＣおよびＤ）。コントロール実験では、Ｗペ
プチドおよびｆＭＬＰは親ラットまたは偽トランスフェクトしたラット好塩基性
細胞系およびＨＥＫ２９３細胞中でのＣａ2+動員を誘導しなかった。これらの結
果は、ＷペプチドがＦＰＲおよびＦＰＲＬ１受容体の両方を高い効力で活性化す
るという証拠を示す。
【００４７】 ＦＰＲまたはＦＰＲＬ１でトランスフェクトされた細胞の移動を誘導するＷペ
プチドの能力も試験した。ＦＰＲＬ１／２９３細胞は、〜１ｐＭのＥＣ５０でＷ
ペプチドに対する顕著な移動性応答を示した（図１４ＡおよびＢ）が、これらの
細胞は広い濃度範囲のｆＭＬＰに応答して移動することができなかった（図１４
ＡおよびＢ）。他方、ｆＭＬＰおよびＷペプチドはともに、ＥＴＦＲ細胞の移動
を、類似する用量−応答曲線にて誘導した（図１４ＡおよびＣ）。これらの走化
性実験は、ｆＭＬＰがＦＰＲＬ１発現細胞の移動を誘導しないため、ｆＭＬＰが
ＦＰＲＬ１に対する部分的かつ低親和性アゴニストに過ぎない、ということを実
証する。一方、Ｗペプチドは、ＦＰＲおよびＦＰＲＬ１の両方に対する非常に効
率的なアゴニストであり、ＦＰＲＬ１に関してはＦＰＲより高い効力を持つこと
が判明した。低ピコモル濃度のＷペプチドは、これらの細胞中でのＣａ2+放出お
よび走化性の両方を誘導するのに十分であるので、ＦＰＲＬ１に関してより高い
効率さえ示した。
【００４８】 食細胞を用いて観察されたように、ＷペプチドはＦＰＲＬ１／２９３の移動を
誘導し（図１４Ｄ）、そしてＥＴＦＲ細胞は、百日咳毒素による細胞の前処理に
より抑制された。ＷペプチドがｆＭＬＰと受容体を共有することをさらに確かめ
るために、3Ｈ標識ｆＭＬＰを用いたリガンド結合競合実験を実施した。ＥＴＦ
Ｒ細胞に関する走化性およびＣａ2+動員活性と一致して、ＷペプチドはＥＴＦＲ
細胞との結合に関して3Ｈ−ｆＭＬＰと有効に競合した（図１５）。3Ｈ−ｆＭＬ
Ｐは、恐らくはＦＰＲＬ１に対するその低親和性のために、ＦＰＲＬ１／２９３
細胞と有意に結合しなかった。このセクションに提示した結果は、Ｗペプチドが
、ＦＰＲクラス受容体との相互作用により、病原体に対する宿主免疫応答と関連
した細胞事象である走化性およびＣａ2+動員を誘導し得る、ということを立証す
る。以下のセクションは、ＷペプチドがＨＩＶ感染を抑制し得ることを示す実験
を考察する。
【００４９】 ＷペプチドはＨＩＶ感染を抑制する ＷペプチドがＦＰＲクラス受容体を活性化し、そして病原体に対する宿主免疫
応答に関連した細胞事象を誘導するという発見がされた後、ＷペプチドがＨＩＶ
感染を抑制し得るか否かを確定するための実験を実施した。ＦＰＲクラス受容体
ＦＰＲＬ１を、ＣＤ４およびＣＣＲ５の両方をすでに発現したヒト骨肉種細胞系
（ＨＯＳ）中に安定的にトランスフェクトした。ＣＤ４／ＣＣＲ５／ＦＰＲＬ１
受容体を発現する宿主細胞を先ず指定濃度のＷペプチドを用いて１時間処理し、
その後ＨＩＶ−１JRFLに１時間感染させた。感染細胞を培地で３回洗浄し、培養
した。感染後４８時間および７２時間目に、ＥＬＩＳＡによりｐ２４のレベルを
測定した。図１６Ａは、ＨＩＶ感染の初期段階でＷペプチド（１０-5Ｍ）にさら
すと、ＦＰＲＬ１トランスフェクタントにおけるＨＩＶ−１感染性を有意に低減
するが、偽トランスフェトした細胞ではそうでないことを示す。Ｗペプチドは、
１０-11Ｍという低い濃度でＨＩＶ−１感染性を低減することが見出された（図
１６Ｂ）。ｆＭＬＰの存在下で実施したＨＩＶ感染実験と対応して、Ｗペプチド
はＨＩＶの増殖を有効に抑制した。これらの結果は、ＦＰＲまたはＦＰＲＬ１と
相互作用するリガンドがＨＩＶ感染を抑制し得るということも立証する。
【００５０】 Ｗペプチドは、生物学的に活性なペプチドＷＫＹＭＶＭ−ＮＨ2（配列番号１
）から得られ、ペプチドライブラリーから単離された（Seo et al., J. Immunol
., 158:1895-1901(1997)）。ＷＫＹＭＶＭ−ＮＨ2（配列番号１）は、ヒトＢ細
胞中での、そのホスホイノシチド加水分解を刺激し、百日咳毒素によるその抑制
に基づいてＧｉタンパク質共役型ＳＴＭ受容体を使用していることが仮定された
（Baek et al., J. Biol. Chem., 271:8170-8175(1996)）。Ｄ型アミノ酸を用い
たＮＨ2末端でのメチオニンの修飾は、ＷＫＹＭＶＭ（「Ｗペプチド」配列番号
１）を生じ、これはその原型であるＷＫＹＭＹＭ−ＮＨ2の１００倍より高い生
物学的作用の増大を示し、Ｂリンパ球のほかに、ヒト単球（Bae et al., J. Leu
ko. Bio., 65:241-248(1999)）および好中球（Seo et al., J. Immunol., 158:1
895-1901(1997)）におけるシグナリング事象を媒介する種々のＳＴＭ、Ｇタンパ
ク質受容体を刺激した。
【００５１】 上記実験結果の組み合わせは、いくつかの異なるリガンドによるＦＰＲクラス
受容体（例えばＦＰＲおよびＦＰＲＬ１）の活性化がＣＣＲ５のリン酸化、ＣＣ
Ｒ５のダウンレギュレーションおよびＨＩＶ感染の抑制を誘導する、という証拠
を示す。特に前記のデータは、ｆＭＬＰ、Ｔ２０、Ｖ３ペプチドおよびＳＡＡが
ＦＰＲクラス受容体を活性化し、それによりＣＣＲ５をリン酸化するということ
を示した。また、上記のデータは、ＣＣＲ５のリン酸化が細胞表面からのＣＣＲ
５のダウンレギュレーションならびにケモカインによるＣＣＲ５を介したシグナ
リングの減衰を生じることを示した。さらに上記のデータは、ｆＭＬＰが、ＦＰ
Ｒとの相互作用によりＨＩＶ−１感染を抑制し、そしてＷペプチドがＦＰＲＬ１
との相互作用によりＨＩＶ−１感染を抑制し得るということも示した。したがっ
て、ＦＰＲクラス受容体と相互作用するいくつかのリガンドはこれらの受容体を
活性化して、ＣＣＲ５のリン酸化を生じるシグナルを変換し、これが次に細胞表
面からのＣＣＲ５をダウンレギュレートして融合の、したがってＨＩＶ−１の増
殖の抑制を生じるということが予想される。
【００５２】 初期の研究は、ｆＭＬＰ上に存在するＮ−ホルミル基が最適なアゴニストの効
力に不可欠であることを示したが、近年の研究は、非ホルミル化ペプチドもＦＰ
Ｒを結合し、活性化し得ることを示している（Freer et al., Biochemistry, 21
:257(1982); Higgins et al., J Med Chem, 39:1013(1996)）（これらの記載内
容はともに、参照により本明細書中に含まれる）。Ｎ−ホルミル化またはＮ−ア
セチル化された合成ペンタペプチドＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−
ＯＨ（配列番号２）は、例えばヒト好中球におけるＣａ2+放出の誘導に関して親
ｆＭＬＰより有効である（Murphy, Annu Rev Immunol, 12:593(1994); Murphy,
"The N-formyl peptide chemotactic receptors," Chemoattractant ligands an
d their receptors, CRC Press, Boca Raton, 1996:269; Prossnitz and Ye, Ph
armacol Ther, 74:73(1997)）（これらの記載内容はともに、参照により本明細
書中に含まれる）。アミノ末端尿素置換およびカルボメート修飾されたペプチド
も、ＦＰＲに対する有効なアゴニストである（Higgins et al., J Med Chem, 39
:1013(1996)）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。上記の
結果は、報告されたＦＰＲアゴニストとのいかなる配列同一性も保有しない、Ｔ
２０／ＤＰ１７８、Ｖ３ペプチドおよびＷペプチドのような分子が、ＨＩＶ感染
の抑制に有効である、ということも立証した。さらに、プラスミドベースのラン
ダムライブラリーに由来するいくつかのペプチドも、ＦＰＲＬ１に対する非常に
有効なアゴニストであることが示されている（Klein et al., Nat. Biotechnol.
, 16:1334-1337(1998)）。
【００５３】 ペプチドおよびタンパク質アゴニストのほかに、脂質代謝物質リポキシンＡ４
（ＬＸＡ４）が、ＦＰＲＬ１に対する高親和性リガンドおよび強力なアゴニスト
であると報告されている（したがってＬＸＡ４Ｒとも呼ばれる）（Fiore et al.
, J. Exp. Med., 180:253-260(1994)）。ＬＸＡ４は、炎症、血栓およびアテロ
ーム性動脈硬化症のような多数の宿主反応中に生成されるエイコサノイドであり
、そして免疫応答の阻害剤として最初に発見された。ＬＸＡ４は、高親和性を有
するＦＰＲＬ１（ＬＸＡ４Ｒ）を用いてトランスフェクトされたチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）と結合し、そしてＧＴＰアーゼ活性およびエス
テル化アラキドネートの放出を増大した（Fiore et al., J. Exp. Med., 180:25
3-260(1994)）。したがって多数の異なる種類の分子がＦＰＲクラス受容体と相
互作用し得る。以下のセクションは、病原体に対する宿主免疫応答を誘導し、お
よび／またはＨＩＶ感染を抑制するＦＰＲクラス受容体に対するいくつかの結合
パートナーの考察を提示する。
【００５４】 病原体に対する宿主免疫応答を誘導しおよび／またはＨＩＶ感染を抑制するた
めのＦＰＲクラス受容体に対する結合パートナーの使用 いくつかの実施形態では、ｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０およびＷ
ペプチドならびにこれらの分子の断片または変異体が、治療的および予防的な使
用のためにバイオテクノロジーツールおよび医薬品中に組入れられる。望ましく
は、ｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０およびＷペプチドならびにこれら
の分子の断片または変異体は、病原体に対する宿主免疫応答を誘導し、および／
またはＨＩＶ感染を抑制するために被験体に提供される。しばしば、単離または
精製ｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０およびＷペプチドならびにこれら
の分子の断片または変異体が用いられる。「単離された」という用語は、物質が
その元々の環境（例えば、それが天然に生じる場合には天然環境）から取り去ら
れることを必要とする。例えば生存細胞中に存在する天然タンパク質は単離され
ないが、天然系中の共在物質のいくつかまたはすべてから分離された同一タンパ
ク質は単離される。「精製された」という用語は、絶対純粋性を要しない。むし
ろそれは相対的定義として意図される。例えばタンパク質は、クーマシー染色に
より検出される場合、ごく普通に電気泳動により精製され、夾雑物の存在を有す
るにもかかわらず、いくつかのアッセイに適している。
【００５５】 好ましくは、ｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０およびＷペプチドなら
びにこれらの分子の断片または変異体は、リガンド／ＦＰＲクラス受容体複合体
の構築に関与する配列に対応する。望ましいペプチドは、３〜１００アミノ酸の
長さであり、リガンド／ＦＰＲクラス受容体複合体の構築に関与するペプチドの
配列の少なくともいくつかの部分を有する。さらに、３〜１００アミノ酸のｆＭ
ＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０およびＷペプチドならびにこれらの分子の
断片または変異体に類似するペプチド擬似体は、本発明の実施形態とともに用い
られる。例えば本発明の態様に用いるためのオリゴペプチドは、３アミノ酸、４
アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８、９、１０、１１、１２、
１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、
２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、
３７、３８、３９または４０または５０または６０または７０または８０または
９０または１００またはそれより多いアミノ酸を有し得る。同様に、本発明のペ
プチド擬似体は、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ
酸、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、
２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、
３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０または５０または
６０または７０または８０または９０または１００またはそれより多いアミノ酸
に類似する構造を有し得る。
【００５６】 本発明の態様で用いるためのペプチドは、修飾もされ得る。例えばペプチドは
、ペプチド上に通常では見出されない置換基を有し得るし、あるいはペプチドは
、ペプチド上に通常に見出されるがしかし通常でないペプチドの領域に組み入れ
られる置換基を有し得る。本発明の態様に用いるためのペプチドは、例えばアセ
チル化、アシル化またはアミノ化され得る。それを修飾するためにペプチド上に
含み入れられ得る置換基としては、Ｈ、アルキル、アリール、アルケニル、アル
キニル、芳香族、エーテル、エステル、非置換もしくは置換アミン、アミド、ハ
ロゲンまたは非置換もしくは置換スルホニル、または５もしくは６員脂肪族また
は芳香族環が挙げられるが、これらに限定されない。本開示を通して用いられる
場合、「結合パートナー」という用語は、修飾または非修飾ペプチドおよび化学
物質または修飾もしくは非修飾ｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０および
Ｗペプチドならびにこれらの分子の断片または変異体に構造的に（三次元的にま
たは二次元的に）類似するペプチド擬似体を指す。「Ｖ３ペプチド擬似体」とは
Ｖ３ペプチドに類似する結合パートナーであり、そして「Ｗペプチド擬似体」と
はＷペプチドに類似する結合パートナーである。Ｖ３ペプチドおよびＷペプチド
擬似体は、ペプチド擬似体、ペプチド、修飾ペプチドおよび誘導化ペプチドであ
り、したがって結合パートナーのクラスに含まれる。結合パートナーは、以下に
詳述される合理的薬剤設計の方法により同定されるＦＰＲクラス受容体に対する
リガンドも包含する。
【００５７】 ｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０およびＷペプチドならびにこれらの
分子の断片または変異体に類似する結合パートナー（例えばＶ３ペプチド擬似体
およびＷペプチド擬似体）は、一次アミノ酸配列として天然に見出されるｆＭＬ
Ｐ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０およびＷペプチドならびにこれらの分子の断
片または変異体のアミノ酸配列の全部もしくは一部を含有する分子を包含するだ
けでなく、機能的に等価のアミノ酸残基が配列内の残基に置換されて、サイレン
ト変化を生じる変更された配列も包含する。したがってｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド
、ＳＡＡ、Ｔ２０およびＷペプチドならびにこれらの分子の断片または変異体の
配列内の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する同
様の極性を有する別のアミノ酸により置換されて、サイレントな変更を生じ得る
。配列内のアミノ酸に対する置換基は、そのアミノ酸が属するクラスの他のアミ
ノ酸から選択され得る。例えば非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、
ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファ
ンおよびメチオニンが挙げられる。非荷電極性中性アミノ酸としては、グリシン
、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン
が挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシ
ンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、
アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。芳香族アミノ酸としては、フ
ェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。本発明のその他
の態様では、例えばリン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク分解的
切断または抗体分子もしくは膜分子もしくはその他のリガンドとの結合により、
翻訳中または翻訳後に区別をつけて修飾されるｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ
、Ｔ２０およびＷペプチドならびにこれらの分子の断片または変異体が意図され
る（Ferguson et al., Ann. Rev. Biochem. 57: 285-320(1988)）。
【００５８】 ＦＰＲクラス受容体またはそれらの断片に対する天然結合パートナーのほかに
、本発明の実施形態は、より望ましい細胞応答を生じる変異体または修飾分子を
用い得る。例えば変異体結合パートナーとしては、ジスルフィド結合形成を介し
てより安定な変異体の生成を促すようタンパク質中に組み入れられる１つまたは
それ以上のシスチン残基を有するように設計されたポリペプチドを包含し得る（
例えば、米国特許第４，９０８，７７３号参照）。過去においては、研究者はコ
ンピュータおよびコンピュータグラフィックプログラムを用いて考え得るシスチ
ン結合部位の適正性を査定するのに役立てた（Perry, L.J., & Wetzel, R., Sci
ence, 226: 555-557(1984); Pabo, C.O., et al., Biochemistry, 25:5987-5991
(1986); Bott, R., et al.,欧州特許第130,756号; Perry, L.J., & Wetzel, R.,
Biochemistry, 25:733-739(1986);Wetzel, R.B., 欧州特許第155,832号）。ポリ
ペプチド中のシスチン残基の導入は、慣用的な分子生物学を用いて成し遂げられ
得る。
【００５９】 さらなる結合パートナー変異体としては、当該ポリペプチドに類似するペプチ
ド擬似体が挙げられる。ペプチドの生物学的産生に用いられる天然アミノ酸はす
べて、Ｌ配置を有する。合成ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸または２
つの異なる配置のアミノ酸の種々の組み合せを利用して、慣用的合成方法を用い
て調製され得る。特定のペプチドの立体構造および望ましい特徴を模倣する（例
えばこのようなペプチドが見出されたことがある場合は、オリゴペプチド）が、
望ましくない特徴、例えば柔軟性（立体構造の損失）および結合の切断を回避す
る合成化合物は、「ペプチド擬似体」として既知である（例えば、Spatola, A.F
. Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins(Weist
ein, B. Ed.), Vol. 7, pp.267-357, Marcel Dekker, New York(1983)（これは
、エンケファリン類縁体におけるアミド置換としてのメチレンチオビオイソステ
レ［ＣＨ2Ｓ］の使用を記載する）; Szelke et al., In peptides: Structure a
nd Function, Proceedings of the Eighth American Peptide Symposium, (Hrub
y and Rich, Eds.);pp.579-582, Pierce Chemical Co., Rockford, III.(1983)
（これは、アンギオテンシノゲン由来の６〜１３オクタペプチド中のＬｅｕ−Ｖ
ａｌ結合にメチレンアミノ［ＣＨ2ＮＨ］およびヒドロキシエチレン［ＣＨＯＨ
ＣＨ2］バイオイソステレを有するレニン阻害剤を記載する）参照）。
【００６０】 概してペプチド擬似体の設計および合成は、所望のペプチド（例えば最も有望
な模造ペプチド）のペプチドの配列および立体構造のデータ（例えば幾何学デー
タ、例えば結合長および角度）を用いて開始すること、ならびにペプチド擬似体
に設計されるべき幾何学的配列を確定するためにこのようなデータを用いること
を包含する。この過程を実施するための多数の方法および技術が当業界で既知で
あり、これらのうちのいずれかが用いられ得る（例えば、Farmer, P.S., Drug D
esign, (Ariens, E.J. ed.), Vol. 10, pp.119-143(Academic Press, New York,
London, Tronto, Sydney and San Francisco) (1980); Farmer, et al., in TI
PS, 9/82, pp.362-365; Verber et al., in TINS, 9/85, pp.392-396; Kaltenbr
onn et al., in J. Med. Chem. 33: 838-845(1990);およびSpatola, A.F., in C
hemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides, and Proteins, Vol. 7
, pp.267-357, Chapter 5, "Peptide Backbone Modifications: A Structure-Ac
tivity Analysis of Peptides Containing Amide Bond Surrogates. Conformati
onal Constraints, and Relations" (B. Weisten, ed.; Marcell Dekker: New Y
ork, pub.)(1983); Kemp, D.S., "Peptidomimetics and the Template Approach
to Nucleation of beta-sheets and alpha. Helices in Peptides," Tibech, V
ol. 8, pp.249-255(1990)参照）。さらなる教示は、米国特許第５，２８８，７
０７号、第５，５５２，５３４号、第５，８１１，５１５号、第５，８１７，６
２６号、第５，８１７，８７９号、第５，８２１，２３１号および第５，８７４
，５２９号に見出され得る。以下の考察において、分子モデリングおよび合理的
薬剤設計のいくつかの方法が記載される。これらの技術は、ｆＭＬＰ、Ｖ３ペプ
チド、ＳＡＡ、Ｔ２０およびＷペプチドならびにこれらの分子の断片または変異
体に類似するさらなるリガンドを同定するために適用され得る。さらにこれらの
技術は、ｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０およびＷペプチドならびにこ
れらの分子の断片または変異体に類似しないが、しかし病原体に対する宿主免疫
応答を誘導し、および／またはＨＩＶ感染を抑制する結合パートナーを同定する
ために適用され得る。
【００６１】 合理的薬剤設計方法 ポリペプチドに関する合理的薬剤設計は、設計する薬剤が相互作用する第１ペ
プチドを同定および定義し、かつ、第１標的ペプチドを使用して第２ペプチドの
要件を定義することを必要とする。このような定義された要件でもって、定義さ
れた要件の全てまたは実質的に全てを満足する適当なペプチドまたは非ペプチド
リガンドを見つけるかあるいは調製することができる。すなわち、合理的薬剤設
計の１つの目的は、対象とする生物学的に活性を有するポリペプチドまたはこれ
らが相互作用する小分子（例えば、多かれ少なかれリガンドの潜在的形態である
薬剤を創り出すためのアゴニスト、アンタゴニスト、空(null)化合物）の構造的
または機能的アナログを生産することにある（例えば、Hodgson, Bio. Technolo
gy 9:19-21 (1991)参照）。合理的薬剤設計の例としては、ＨＩＶプロテアーゼ
阻害剤の開発がある(Erickson et al. Science 249:527-533 (1990)) 。コンビ
ナトリアルケミストリーとは化合物を個々に代えて、まとめて合成し、かつ生物
活性について試験する化学であり、その目的はそれまでに可能であったよりも早
くかつ安価に薬剤および物質を発見することにある。合理的薬剤設計とコンビナ
トリアルケミストリーは、コンピュータ支援タンパク質モデリングおよび薬剤発
見アプローチの開発により、近年、より深く関連するようになっている(例えば
、米国特許第４，９０８，７７３号、第５，８８４，２３０号、第５，８７３，
０５２号、第５，３３１，５７３号および第５，８８８，７３８号参照)。
【００６２】 合理的薬剤設計およびコンビナトリアルケミストリーのための手段として、分
子モデリングを使用することは、コンピュータグラフィックの出現によって飛躍
的に増加している。コンピュータスクリーンで分子を３次元で見ることができる
だけでなく、酵素および受容体などの種々の巨大分子とリガンドとの相互作用を
調査することおよび試験する変異体分子を合理的に設計することでも可能である
(Boorman, Chem. Eng. News 70: 18-26 (1992))。利用者にとって難しくなく楽
に扱える膨大な量のソフトウェアやハードウェアが今や入手可能であり、実質的
に全ての製薬企業は合理的薬剤設計に貢献するコンピュータモデリング群を有し
ている。例えば、Molecular Simulations Inc. (www.msi.com)は、利用者がアミ
ノ酸配列から始めて、タンパク質またはポリペプチドの２または３次元モデルを
構築し、他の２および３次元モデルと比較し、かつ、実時間の３次元モデルと化
合物、薬剤およびペプチドとの相互作用を解析することができる数種の高度なプ
ログラムを販売している。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、ソフ
トウェアはｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０、およびＷペプチドの領域
、ならびにこれらの分子の断片と同様に、変異体およびＦＰＲクラス受容体なら
びにこれらの受容体の断片および変異体を、ペプチド、ペプチド模倣体および化
学薬品などの他の分子と比較するために使用して、新規結合パートナーとの治療
的の相互作用が予測および設計を可能にしている(Schneider, Genetic Engineer
ing News December: page 20 (1998), Tempczyk et al., Molecular Simulation
s Inc. Solutions April (1997) およびButenhof, Molecular Simulations Inc.
Case Notes (August 1998))。
【００６３】 合理的薬剤設計への出発点として、対象とするポリペプチドの２または３次元
モデルが作成される（例えば、ｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０および
Ｗペプチド、またはこれらの分子の断片または変異体またはＦＰＲクラス受容体
またはこれらの受容体の断片または変異体）。過去には、タンパク質の３次元構
造は多くの方法で決定されていた。おそらく、タンパク質構造を決定する最もよ
く知られている方法は、Ｘ線結晶の使用に関する。この技術の一般的な総説は、
Van Holde, K.E. Physical Biochemistry, Prentice-Hall, N.J. pp.221-239 (1
971)に見ることができる。この技術を使用して、良好な精度で３次元構造を明ら
かにすることができる。さらに、タンパク質構造は中性子回折の技術を使用して
、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）により決定することができる（例えば、Moore, W
.J., Physical Chemistry, 4th Edition, Prentice-Hall, N.J. (1972)参照）。
【００６４】 また、対象とするポリペプチドのタンパク質モデルが、コンピュータベースタ
ンパク質モデリング技術を使用して構築され得る。１つのアプローチではタンパ
ク質の折りたたみに関する問題が、公知３次元タンパク質構造において残基の構
造環境を示すプロフィールと最も適合性ある標的配列を見つけることによって解
決される（例えば、米国特許第５，４３６，８５０号参照）。他の技術では、所
与のファミリーのタンパク質の公知３次元構造を重ね合わせて、そのファミリー
の構造的保存領域を明確にする。このタンパク質モデリング技術もまた、相同タ
ンパク質の公知３次元構造を使用して、対象とするポリペプチドの構造に近づけ
る（例えば、米国特許第５，５５７，５３５号、第５，８８４，２３０号および
第５，８７３，０５２号参照）。従来のホモロジーモデリング技術は、プロテア
ーゼおよび抗生物質のモデルを構築するためにルーチンで使用されている（Sowd
hamini et al., Protein Engineering 10: 207, 215 (1997)）。対象とするタン
パク質が鋳型タンパク質と配列同一性が低い場合、３次元タンパク質モデルを開
発するために比較研究アプローチが使用され得る。いくつかの例では、タンパク
質は非常に弱い配列同一性を有するにもかかわらず、折り畳まれて同様な３次元
構造となる。例えば、多くの螺旋状サイトカインの３次元構造は弱い配列相同性
を有するにもかかわらず、同様な３次元トポロジーに折り畳まれる。
【００６５】 標的と鋳型間の構造的関連性が配列レベルで検出可能でない多くの状況下にあ
り得る、折りたたみパターンおよび機能的タンパク質ドメインを多分同定するこ
とが、スレディング法および「ファジー」アプローチの最近の開発により、今や
可能である。１つのアプローチでは、折りたたみ認識は、多数配列スレディング
（ＭＳＴ）を使用して実施され、低分解モデルを構築する距離幾何学プログラム
ＤＲＡＧＯＮを使用して、スレディングアウトプットから演繹される。次いで、
完全原子表示がＱＵＡＮＴＡなどの分子モデリングパッケージを使用して構築さ
れる。
【００６６】 この３段階アプローチによると、鋳型候補はまず、新規折りたたみ認識アルゴ
リズムＭＳＴを使用して同定される。これは１つまたは複数の３−Ｄ構造上で多
数整列された配列の同時スレディングを実施できる。第２段階では、ＭＳＴアウ
トプットから得た構造的均等物は内部残基距離制約子に変換され、第２構造予測
から得た補助的情報とともに、距離幾何学プログラムＤＲＡＧＯＮ中に入力され
る。このプログラムは不偏的手法で制約子を結合させ、多数の低解像度のモデル
確認を急速に作製される。第３段階では、これらの低解像度のモデル確認は、完
全原子モデルに変換され、分子モデリングパッケージＱＵＡＮＴＡを使用して、
エネルギー極小化に付される（例えば、Aszodi et al., Proteins: Structure,
Function, and Genetics, Supplement 1:38-42 (1997)参照）。
【００６７】 好ましいアプローチでは、市販の「ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ９８」プログラム(Mol
ecular Simulations, Inc.)および付属のモジュールが、アミノ酸配列から対象
とするポリペプチドの２次元および／または３次元モデルを作成するために使用
される。ＩｎｓｉｇｈｔＩＩは、多くの構造解析を実施し、かつリアルタイムの
合理的薬剤設計とコンビナトリアルケミストリーを可能とする数種のモジュール
とインターフェイスすることができる３次元グラフィックプログラムである。例
えば、Ｂｕｉｌｄｅｒ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ、およびＣ
ｏｎｖｅｒｔｅｒなどのモジュールにより、誰もがその配列または構造からポリ
ペプチド、炭水化物、核酸、化学物質またはこれらの組合せの２次元または３次
元モデルを速やかに作成することができる。ＩｎｓｉｇｈｔＩＩに関連するモデ
リング手段は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ およびＣａｍｂｒｉｄｇｅ ｄａｔａｂ
ａｓｅｓ；ＡＭＰＡＣ／ＭＯＰＡＣおよびＯＣＰＥプログラム；Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｍｏｌｆｉｌｅ および ＳＤ ｆｉｌ
ｅｓ，Ｓｙｂｅｌ Ｍｏ１２ ｆｉｌｅｓ，ＶＲＭＬおよびＰｉｃｔ ｆｉｌｅ
ｓを含む多くの異なったデータファイルフォーマットをサポートしている。
【００６８】 さらに、上記した技術は対象とするタンパク質のモデルを設計するために、分
子生物学の技術を補充され得る。例えば、対象のポリペプチドがアラニンスキャ
ン(Wells, Methods in Enzymol. 202:390-411 (1991))または他のタイプの部位
特異的突然変異誘発分析によって解析され得る。アラニンスキャンでは、対象の
ポリペプチドの各アミノ酸残基は段階的に定順にアラニンで置換され（すなわち
、位置＃１にて始まり、全分子中へ進む分子当たり、たった１個のアラニンの点
変異が組み込まれる）、結合パートナー特性化アッセイでのペプチド活性におけ
る突然変異の効果が測定される。ペプチドのそれぞれのアミノ酸残基は、このよ
うにして解析され、リガンド／ＦＰＲクラス受容体複合体の構築において重要な
領域が同定される。これらの機能的に重要である領域は、コンピュータリーダブ
ルな媒体で記録され、コンピュータシステムのデータベースに蓄えられ、かつサ
ーチプログラムは機能的に重要な領域のタンパク質モデルを生成するために使用
され得る。
【００６９】 対象であるポリペプチドモデルが一旦、作成されると、リガンド／ＦＰＲクラ
ス受容体複合体の構築に影響を与えることができる新規な結合パートナー（「結
合パートナー候補（ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）」）
を同定するように、他のモデルと比較され得る。例えば、アミノ酸配列またはタ
ンパク質モデルから始めることによって、公知結合パートナーと２次元および／
または３次元相同性を有する分子が迅速に同定され得る。１つのアプローチでは
、配列同一性のパーセントは２つのポリペプチドのアミノ酸の類似性と位置を比
較するために一般的に使用される標準的方法によって測定され得る。ＢＬＡＳＴ
またはＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを使用して、２つのポリペプチ
ドはそのそれぞれのアミノ酸の最適マッチングのために整列され得る（１つまた
は両方の配列の全長に沿って、あるいは１つまたは両方の配列の予定された部位
に沿って）。このようなプログラムは「デフォルト」オープニングペナルティー
および「デフォルト」ギャップペナルティーを生じ、ＰＡＭ２５０（標準スコア
リングマトリックス、Dayhoff et al., in: Atlas of Protein Sequence and St
ructure, Vol. 5, Supp. 3 (1978)参照）がコンピュータプログラムとともに使
用され得る。同一性のパーセントは次のようにして計算され得る。
【００７０】 （一致したマッチの総数／［一致した範囲内のより長い配列の長さ＋２つの配列
を整列するために、より長い配列中に導入されたギャップの数]）×１００
【００７１】 したがって、ｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０およびＷペプチド、ま
たはこれらの分子の断片もしくは変異体に対応するタンパク質配列は、タンパク
質ベースで公知である配列と比較され得る。ｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、
Ｔ２０およびＷペプチド、またはこれらの分子の断片もしくは変異体に対応する
タンパク質配列は、例えば、パラメーターＷ＝８とともにＢＬＡＳＴＰを使用し
、最大１０マッチを与えるＳｗｉｓｓｐｒｏｔ ｒｅｌｅａｓｅ３５、ＰＩＲｒ
ｅｌｅａｓｅ５３およびＧｅｎｐｅｐｔ ｒｅｌｅａｓｅ１０８ ｐｕｂｌｉｃ
ｄａｔａｂａｓｅｓ中に見出される公知アミノ酸配列と比較される。さらに、
これらの結合パートナーをコードするタンパク質配列はパラメーターＥ−０．０
０１とともにＢＬＡＳＴＸを使用して、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔの公衆に知られてい
るアミノ酸配列と比較される。候補リガンドは望ましくはｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチ
ド、ＳＡＡ、Ｔ２０、またはＷペプチドと少なくとも５０％の相同性を有し、好
ましくは６０％または７０％または８０％または９０％またはそれより高い相同
性を有する。結合パートナー候補は、ｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０
、またはＷペプチドと下記程度の相同性を有することができる。例えば、５０％
、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％
、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％
、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％
、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５、８６％、
８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％および９９％。５０％相同性よりも大きいかあるいは等
しい相同性を有する結合パートナー候補は、結合パートナー特性化アッセイを使
用して同定され、かつ、実質的に試験される。ＦＰＲクラス受容体を活性化する
ことができ、それによって病原体に対する宿主免疫応答を誘導し、および／また
はＣＣＲ５のリン酸化およびＨＩＶ感染の抑制を誘導する結合パートナーが次い
で同定され得る。
【００７２】 他の実施形態では、コンピュータモデリングおよび配列対構造対機能パラダイ
ムが、病原体に対する宿主免疫応答を誘導し、および／またはＣＣＲ５のリン酸
化およびＨＩＶ感染の抑制を誘導するより多くの結合パートナーを同定するため
に活用される。このアプローチでは、まず、結合パートナー特性化アッセイにて
公知反応を示す結合パートナーの構造を、構造データベースのもっともマッチす
る構造に対して配列を整列するスレディングアルゴリズムを使用して、その配列
から決定する。次に、タンパク質活性部位（すなわち、特性化アッセイで所望反
応において重要である部位）が同定され、かつ、「ファジー機能体」（ＦＦＦ）
--タンパク質の活性部位の３次元ディスクリプタ--を作成する（例えば、Fetrow
et al., J. Mol. Biol. 282:703-711 (1998)およびFetrow および Skolnick, J
. Mol. Biol. 281:949-968 (1998)参照）。
【００７３】 ＦＦＦは公知構造を持つ機能的に関連する一連のタンパク質からタンパク質幾
何学を繰り返し重ね合わせて構築する。しかしながら、ＦＦＦは過度に特異的で
なく、ディスクリプターがリラックスされ得る程度が探索される。本質的には、
所望反応に対して保存され、かつ機能的に重要である残基が同定され、一連の幾
何学的および特異的機能の構造的制限はコンピュータアルゴリズムの形態で定義
される。次いで、このプログラムはその特定制限子を満足する残基セットについ
て、タンパク質構造データベースから実験的に決定したタンパク質構造を探索す
る。このようにして、相同３次元構造が比較され、その程度（例えば、３次元相
同性のパーセント）が確認され得る。対象とするタンパク質に対する構造的類似
性について３次元構造データベースを探索する能力はまた、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅ
ｒ、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ＡｎａｌｙｓｉｓおよびＰｒｏｆｉｌｅｓ−３
Ｄなどのモジュールを使用するＩｎｓｉｇｈｔＩＩを使用して達成され得る。
【００７４】 このコンピュータプロトコールを使用することによって、http://www.tigr.or
g/tdb; http://www.genetics.wisc.edu; http://genome-www.stanford.edu/~bal
l; http;//hiv-web.lanl.gov; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; http://www.ebi.
ac.uk; http://pasteur.fr/other/biology;およびhttp://www.genome.wi.mit.ed
uを含む種々の組織が維持するものなどのゲノム配列データベースが、特異的タ
ンパク質活性部位のために、および所望分子に類似するこれらの活性部位での残
基を同定するために迅速にスクリーニングされ得る。いくつかの他のグループは
、タンパク質の所与の機能または活性を同定するために設計された短い配列パタ
ーンやモチーフのデータベースを開発している。これらのデータベースの多く、
特にＰｒｏｓｉｔｅ(http://expacy.hcuge.ch/sprot.prosite.html)；Ｂｌｏｃ
ｋｓ(http://www.blocks.fhcrc.org)；Ｐｒｉｎｔｓ(http://www.biochem.ucl.a
c.uk/bsm/dbbrowser/PRINTS/PRONTS.html)、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｌ
ｉｎｇ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＭＤＢ）およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａ
ｎｋは、所与の機能に対して特異的である配列パターンを同定する配列情報の短
いストレッチを使用することができる。すなわち、これらは全配列と一致する必
要性から生じる問題を避ける。このようにして、新規な結合パートナーは上記し
たように結合パートナー特性化アッセイによって、さらに同定のために合理的に
選択される。分子およびその変異体の機能的分析の連続またはくり返し、および
さらなるＦＦＦ改良およびデータベース検索により、研究者は病原体に対する宿
主免疫応答の所望程度の誘導および／またはＣＣＲ５リン酸化およびＨＩＶ感染
抑制を生じる結合パートナーのクラスをより狭く定義することができる。
【００７５】 同様のアプローチによって、ＦＰＲクラス受容体と相互作用する結合パートナ
ーが同定され、次のようにして製造され得る。まず、ＦＰＲクラス受容体と相互
作用するこれらの分子の１つまたは複数の公知結合パートナーまたはその部分の
分子モデルは、上記した技術または当該技術分野で公知である技術のうちの１つ
を使用して作成される。次に、化学ライブラリーおよびデータベースを公知結合
パートナーと構造的に類似した分子について探索する。すなわち、標的化合物の
公知構造と３次元類似性を有する非ペプチド（有機）構造体（例えば、非ペプチ
ド類縁体および／またはジペプチドアナログ）に関して、３次元データベースを
検索することができる。例えば、Cambridge Crystal Structure Data Base, Cry
stallographic Data Center, Lensfield Road, Cambridge, CB2 1EW, England;
および Allen, F.H., et al., Acta Crystallogr., B35: 2331-2339 (1979)参照
。 なお、３次元データベース比較に関するサーチアルゴリズムは、文献から入手
可能であることが注目される。例えば、Cooper, et al., J. Comput.-Aided Mol
. Design, 3: 253-259 (1989)およびここで引用される文献；Brent, et al., J.
Comput.-Aided Mol. Design, 2:311-310 (1988)およびここで引用される文献を
参照。このような探索の市販ソフトウェアはDay Light Information Systems, I
nc., Irvine, Calif. 92714およびMolecular Design Limited,, 2132 Faralton
Drive, San Leandro, Calif. 94577などの業者からも入手可能である。この探索
は各残基レベルに置換部分を有するアナログをシミュレートするかあるいは合成
することによる系統的な方法で行われる。好ましくは、骨格部分の置換は３次構
造を妨げず、または側鎖の置換は適合性よく、受容体基質相互作用を保持するよ
うに注意する。
【００７６】 他のアプローチでは、ＦＰＲクラス受容体のタンパク質モデルは、上記した方
法によって作られ、これらのモデルは結合パートナーの相互作用を予測するため
に使用され得る。ＦＰＲクラス受容体の結合パートナーとして、ｆＭＬＰ、Ｖ３
ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０、およびＷペプチドを同定して、受容体の活性部位ま
たは領域が同定され得る。このような活性部位は通常、リガンド結合部位であろ
う。活性部位は、例えば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配
列から、あるいはｆＭＬＰ、Ｖ３ペプチド、ＳＡＡ、Ｔ２０、およびＷペプチド
などのリガンドとＦＰＲクラス受容体との複合体の研究から、当該技術分野で公
知である方法を使用して同定され得る。後者の場合、受容体上のどこに複合リガ
ンドが見出されるかを見つけ出して、活性部位を見つけるために、化学的または
Ｘ線結晶的方法が使用され得る。次に、活性部位の３次元幾何学構造が決定され
る。次に活性部位の３次元幾何学構造が決定される。これは完全な分子構造を決
定できるＸ線結晶を含む公知方法によって行ない得る。他方、固体または液体Ｎ
ＭＲが、特定の分子内距離を測定するために使用され得る。構造決定の他のいか
なる実験方法も部分的または完全な幾何学構造を得るために使用され得る。幾何
学構造は、決定された活性部位構造の正確性を増加させる天然または合成の複合
化リガンドを使用して測定され得る。
【００７７】 もしも不完全または不十分に正確な構造が決定されるなら、構造を完成するか
、あるいはその正確性を改良するために、コンピュータベースの数値モデリング
方法が使用され得る。タンパク質または核酸などの特殊なバイオポリマーに特異
的なパラメーター化されたモデル、分子運動を算定することに基づく分子動的モ
デル、熱アンサンブルに基づく統計学的力学モデル、またはこれらを組み合わせ
たモデルを含む、いかなる認識モデリング方法を使用してもよい。ほとんどのタ
イプのモデルでは、構成原子と基との間の力を示す標準的分子力場が必要であり
、物理化学にて公知である力場から選択され得る。不完全であるかまたはより正
確性の低い実験的構造は、これらのモデリング方法によって算定される完全でか
つより正確な構造の制限として働くことができる。
【００７８】 最後に、実験的にモデリングによってあるいは組み合わせて、ＦＰＲクラス受
容体の活性部位の構造を決定して、結合パートナー候補は、その分子構造の情報
とともに化合物を含むデータバンクを探索して同定され得る。このような検索で
は、決定された活性部位構造とマッチし、活性部位を定義する基との相互作用す
る化合物を求められる。このような探索は手で行われ得るが、好ましくはコンピ
ュータを使用する。このような解析を可能とする１つのプログラムは、Ｌｕｄｉ
モジュールを有するＩｎｓｉｇｈｔＩＩである。さらに、Ｌｕｄｉ／ＡＣＤモジ
ュールにより、利用者は６５，０００以上の市販薬剤候補(MDL's Available Che
micals Directory)にアクセスすることができ、対象とするタンパク質と相互作
用する化合物をスクリーニングするためのこれらの能力を提供する。
【００７９】 また、これらの方法は、すでに公知である結合パートナーから改良された結合
パートナーを同定するために使用され得る。公知結合パートナーの組成は改質さ
れ、改質の構造的効果は新規な組成物に適用する上記した実験的およびコンピュ
ータモデリング方法を使用して測定され得る。次いで、この変化した構造は、改
良されたフィットまたは相互作用が得られるか否かを決定するために化合物の活
性部位構造と比較される。このようにして、側鎖を変化させるなど組成の系統的
変化は、改質調節化合物または改良された特異性または活性を有するリガンドを
得るために、急速に評価され得る。ＦＰＲクラス受容体の活性部位の同定に基づ
く結合パートナーを同定するために有用である、さらなる実験的およびコンピュ
ータモデリング方法は、当業者には明らかであろう。
【００８０】 多くの文献、Rotivinen, et al., 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97:15
9-166; Ripka, New Scientist 54-57 (Jun. 16, 1988); McKinaly および Rossm
ann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29: 111-122; Perry および Dav
ies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design
pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1988); Lewis および Dean, 1989 Proc. R.
Soc. Lond. 236:125-140 および 141-162; および核酸成分のモデル受容体につ
いては、Askew, et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090などが、特異
的タンパク質と相互作用する薬剤のコンピュータモデリングを考察する。
【００８１】 病原体への宿主免疫応答を誘導し、および／またはＨＩＶ感染を抑制する結合
パートナーを同定するために、本発明の実施形態では、より多くのコンピュータ
プログラムおよびデータベースが使用され得る。下記リストは本発明を限定する
ことを意図しないが、上記したアプローチで有用であるプログラムおよびデータ
ベースへの手引きを提供する。使用され得るプログラムおよびデータベースとし
ては、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ(EMBL)、 ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＢａｓｅ (Molecular
Applications Group)、ＧｅｎｅＭｉｎｅ (Molecular Applications Group)、
Ｌｏｏｋ (Molecular Applications Group)、ＭａｃＬｏｏｋ (Molecular Appli
cations Group)、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２(NCBI)、ＢＬＡＳＴＮおよびＢ
ＬＡＳＴＸ(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)、本明細書中に参
考として挿入する)、ＦＡＳＴＡ(Pearson および Lipman, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 85:2444 (1988)、本明細書中に参考として挿入する)、Ｃａｔａｌｙｓ
ｔ(Molecular Simulations Inc.)、Ｃａｔａｌｙｓｔ／ＳＨＡＰＥ(Molecular S
imulations Inc.)、Ｃｅｒｉｕｓ2．ＤＢＡｃｃｅｓｓ(Molecular Simulations
Inc.)、ＨｙｐｏＧｅｎ(Molecular Simulations Inc.)、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ(Mo
lecular Simulations Inc.)、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ(Molecular Simulations Inc.)
、ＣＨＡＲＭｍ(Molecular Simulations Inc.)、Ｆｅｌｉｘ(Molecular Simulat
ions Inc.)、ＤｅｌＰｈｉ(Molecular Simulations Inc.)、ＱｕａｎｔｅＭＭ(M
olecular Simulations Inc.)、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ(Molecular Simulations Inc.)
、Ｍｏｄｅｌｅｒ(Molecular Simulations Inc.)、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ４(Sali お
よび Blundell J. Mol. Biol. 234:217-241 (1997))、ＩＳＩＳ(Molecular Simu
lations Inc.)、Ｑｕａｎｔａ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ(Molecular Simu
lations Inc.)、ＷｅｂＬａｂ(Molecular Simulations Inc.)、ＷｅｂＬａｂ
Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ(Molecular Simulations Inc.)、Ｇｅｎ
ｅ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ(Molecular Simulations Inc.)、ＳｅｑＦｏｌｄ(Molecul
ar Simulations Inc.)、Ｂｉｏｐｅｎｄｉｕｍ(Inpharmatica)、ＳＢｄＢａｓｅ
(Structural Bioinformatics)、ＥＭＢＬ／Ｓｗｉｓｓpｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ
ｂａｓｅ、ＭＤＬ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｒｅｃｔｏ
ｒｙ ｄａｔａｂａｓｅ、ＭＤＬ Ｄｒｕｇ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｒｔ ｄａｔ
ａｂａｓｅ、ｔｈｅＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ｄａｔａｂａｓｅ、Ｄｅｒｗｅｎｔ’ｓ Ｗｏｒｌｄ Ｄｒｕｇ
Ｉｎｄｅｘ ｄａｔａｂａｓｅ、およびＢｉｏＢｙｔｅＭａｓｔｅｒＦｉｌｅ
ｄａｔａｄａｓｅが挙げられるが、これらに限定されない。多くの他のプログ
ラムおよびデータベースｈａ、本開示に関与する当業者にとって明白である。
【００８２】 候補作用物質が一度同定されると、望ましくは、これらは結合パートナー特性
化アッセイにおいて解析される。モデリングと結合パートナー特性化アッセイの
さらなる繰り返しが、結合パートナーにおいて必要とされるパラメーターをより
狭く定義するために使用され得る。結合パートナー特性化アッセイにおける各結
合パートナーとその反応は、コンピュータリーダブルな媒体上に記録され、結合
パートナーのデータベースまたはライブラリーおよび結合パートナー特性化アッ
セイにおけるそれぞれの反応が生成され得る。これらのデータベースまたはライ
ブラリーは、活性および不活性分子間の重要な相違点を同定するために研究者に
よって使用され得る。その結果、化合物ライブラリーは好ましい特性を有する結
合パートナーが豊富になる。以下のセクションは病原体に対する宿主免疫応答を
誘導し、および／またはＨＩＶ感染を抑制する分子を同定するために使用され得
る、数種の結合パートナー特性化アッセイについて記述する。
【００８３】 結合パートナー特性化アッセイ 上記結合パートナーは、好ましくは、病原体に対する宿主免疫応答を誘導する
能力および／またはＨＩＶ感染を抑制する能力を確定するための結合パートナー
の特性化アッセイにて分析される。多くの結合パートナー特性化アッセイのため
開始点として、多量体作用物質を創出するように、結合パートナーおよび／また
はＦＰＲクラス受容体を支持体上に配置する。これらの多量体作用物質は、結合
パートナー特性化アッセイにて用いることができ、かつ医薬品のための構成成分
でもあり得る生物工学的ツールである。あるいは、結合パートナー特性化アッセ
イは、液相において行うことができ、反応生成物は、未反応の構成成分と分離さ
れ、リガンド／受容体複合体は、例えば結合パートナーまたはＦＰＲクラス受容
体の特異的な固定化抗体を用いて検出され得る。
【００８４】 ＦＰＲクラス受容体、合成リガンドまたは多量体リガンド（例えば、支持体上
に配置された多量体ユニットとして現れるｆＭＬＰ、Ｗペプチド、Ｖ３ペプチド
、Ｔ２０、ＳＡＡまたはそれらの断片）と相互作用するのに十分な天然の単量体
化合物（例えば、ｆＭＬＰ、Ｗペプチド、Ｖ３ペプチド、Ｔ２０、ＳＡＡまたは
それらの断片）は、ＦＰＲクラス受容体を発現する細胞と相互作用するかなり大
きな能力を有する。「多量体」という用語は、単一の別個のユニットとしてタン
デムに結合した複数の結合パートナー（これもまた支持体に結合され得る）の存
在を指す「多量体化」という用語と区別して、支持体上の１つより多い結合パー
トナーの存在を指すことを意味する。
【００８５】 多量体作用物質（合成または天然）は巨大分子支持体に結合パートナーを結合
して得られ得る。「支持体」はまた、結合パートナーを結合または固定化するた
めに使用される担体、樹脂またはいかなる巨大分子構造体と呼ばれ得る。固体支
持体としては、反応トレーのウェル壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性粒子
、ニトロセルロース片、膜、ラテックス粒子などの微粒子、細胞膜、合成細胞な
どが挙げられるが、これらに限定されない。支持体はまた、結合パートナーを自
己凝集して製造され得る。例えば、本開示の目的で支持体と呼ばれる巨大構造体
を作成するために、加熱されたタンパク質または疎水性タンパク質は凝集する。
好都合にも、このタイプの支持体はまた、その作成の性質から多量体作用物質で
もある。
【００８６】 巨大分子支持体（例えば、樹脂あるいはビーズ）はまた、疎水性非共有相互作
用によって結合パートナーの部分と相互作用する疎水性表面を有することもでき
る。支持体の疎水性表面は、疎水性基がポリスチレン、ポリエチレンまたはポリ
ビニルなどに結合されているプラスチックなどのポリマーまたは他のいかなるポ
リマーであり得る。また、結合パートナーはタンパク質およびオリゴ／ポリサッ
カライド（例えば、セルロース、澱粉、グリコーゲン、キトサンまたはアミノ化
セファロース）を含む担体に共有結合され得る。これらの後者実施形態では、結
合パートナー上の反応性基、ヒドロキシまたはアミノ基などは、担体上の反応性
基と結合するために使用されて、共有結合を生成し得る。支持体はまた、結合パ
ートナーと相互作用する電荷表面を有し得る。さらに、支持体は結合パートナー
と結合できるように化学的に活性化され得る他の反応性基を有し得る。例えば、
臭化シアン活性化マトリックス、エポキシ活性化マトリックス、チオおよびチオ
プロピルゲル、ニトロフェニルクロロフォルメート、およびＮ−ヒドロキシスク
シンイミドクロロフォルメート結合、およびオキシランアクリル支持体がこの分
野で一般的である(Sigma)。
【００８７】 支持体はまた、結合パートナーがヒドロキシ、カルボキシまたはアミノ基と担
体上の反応性基が共有結合されるシリコーンオキシド材料（例えば、シリカゲル
、ゼオライト、珪藻土またはアミノ化ガラス）などの無機担体を含む。さらに、
いくつかの実施形態では、リポソームまたは脂質二重層（天然または合成）は支
持体として使用され、結合パートナーは膜表面に結合されるか、あるいはリポソ
ーム工学の技術によって膜中に組み込まれる。１つの方法では、リポソーム多量
体支持体は、二重層の表面上で露出される結合パートナーと脂質二重層へ結合パ
ートナーを固着する第２ドメインを含む。アンカーは既知の膜貫通ドメインに似
ている疎水性アミノ酸残基から構築されるか、あるいは従来技術によって第1ド
メインに結合するセラミドを含むことができる。
【００８８】 人体に使用する担体（すなわち予防または治療用途では）は、望ましくは生理
学的でかつ非毒性であり、好ましくは非免疫応答性である。人体に使用する好適
な担体としては、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ，Ｌ−アラニン、リポソーム、お
よびＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂR(Johns-Manville Products, Denver Co.)が挙げられ
る。リガンド結合ＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂR(Synsorb-Pk)は溶血性尿毒症症候群の
阻止について人間で試験されて、副作用を示さないと報告されている(Armstrong
et al., J. Infectious Diseases 171:1042-1045 (1995))。いくつかの実施形
態では、被験体の体内の結合パートナーに結合する能力を有する「ありのままの
」担体（すなわち、結合した結合パートナーを欠く）が投与される。この方法で
は、「プロドラッグタイプ」治療は裸担体が結合パートナーとは別に投与される
ように意図され、一旦、両者が被験体の体内に存在すると、担体と結合パートナ
ーが多量体複合体中に集められる。
【００８９】 結合パートナーと支持体の間の適当な長さを有するリンカー（例えば、λファ
ージの柔軟領域に似せて作製された「λリンカー」）などのリンカーの挿入は、
結合パートナーのより大きな柔軟性を助長し、それによって支持体が提示し得る
立体障害を克服するようにも企図される。最適な細胞反応またはそれを欠くこと
を可能とするリンカーの適当な長さの測定は、本開示にて詳述される分析法でリ
ンカーを変えて、結合パートナーをスクリーニングして決定され得る。
【００９０】 １つ以上のタイプの結合パートナーを含む複合支持体もまた企図される。「複
合支持体」は病原体に対する宿主免疫応答を誘導し、および／またはＨＩＶ感染
を抑制する２つ以上の異なった結合パートナーを結合または固定化するために使
用される担体、樹脂、または任意の巨大分子構造体でもあり得る。いくつかの実
施形態では、リポソームまたは脂質二重層（天然または合成）は、複合支持体を
構築する用途に企図され、かつ結合パートナーは膜表面に結合されるか、あるい
はリポソーム工学の技術を使用して膜中に組み込まれる。
【００９１】 上記したように、結合パートナーと支持体の間に適当な長さを有するλリンカ
ーなどのリンカーの挿入もまた、分子中でより大きな柔軟性をもたらし、支持体
によって生じ得るいかなる立体障害をも克服するために企図される。最適細胞反
応またはそれを欠くことを可能とするリンカーの適当な長さの測定は、本開示中
に詳述される分析法でリンカーを変えることによってリガンドをスクリーニング
して測定され得る。
【００９２】 本発明の他の実施形態では、上記した多量体支持体および複合支持体は、「多
量体化−多量体支持体」および「多量体化複合支持体」をそれぞれ作成するため
に、多量体化リガンドを結合し得る。多量体化リガンドは、例えば、分子生物学
の従来技術を使用して２つ以上の結合パートナーを縦一列に結合して得られ得る
。多量体形のリガンドは病原体に対する宿主免疫応答を誘導し、および／または
ＨＩＶ感染を抑制するより良い能力を有する作用物質を得ることができるため、
多くの用途において有利である場合がある。多量体化作用物質を作り上げる個々
のドメイン間の柔軟なλリンカーなどのリンカーやスペーサーを組み込むことも
、いくつかの実施形態で有利であってよい。例えば、タンパク質結合ドメイン間
の適当な長さを有するλリンカーの挿入は、分子中により大きな柔軟性をもたら
し、支持体によってもたらされる立体障害を克服することができる。同様に、多
量体化リガンドと支持体の間にリンカーを挿入することは、より大きな柔軟性を
もたらし、支持体によりもたらされる立体障害を制限することができる。病原体
に対する宿主免疫応答の最適な誘導および／またはＨＩＶ感染の抑制を可能とす
るリンカーの適当な長さを測定することは、本開示にて詳述される分析法にてリ
ンカーを変化させて結合パートナーをスクリーニングして測定され得る。
【００９３】 好ましい実施形態では、上記した種々のタイプの支持体は、ｆＭＬＰ、Ｗペプ
チド、Ｖ３ペプチド、Ｔ２０、ＳＡＡ、またはこれらの断片、変異体または変性
体、またはこれらの分子に似たペプチド模倣体を使用して作成される。さらに、
好ましい多量体支持体としては、ＦＰＲまたはＦＰＲＬ１を有する支持体が挙げ
られる。結合パートナーを有する多量体支持体、複合支持体、多量体化−多量体
支持体、または多量体化−複合支持体はまとめて、「支持体−結合・結合パート
ナー」と呼ばれる。ＦＰＲクラス受容体を有する多量体支持体、複合支持体、多
量体化−多量体支持体、または多量体化−複合支持体は、「支持体−結合受容体
」と呼ばれる。
【００９４】 支持体−結合性結合パートナーおよび支持体−結合受容体は、動的コンビナト
リアルケミストリーの合理的薬剤設計および方法におけるバイオテクノロジー手
段として使用され得る（例えば、Angnew, Chem. Int. Ed., 37:2828 (1998)を参
照）。例えば、ＦＰＲクラス受容体などの標的生物分子は支持体に連結され、上
記した合理的薬剤設計方法によって生成されるライブラリーから結合パートナー
候補によって、またはランダムコンビナトリアルケミストリーライブラリーから
得た結合パートナー候補によって結合される。１つまたは複数の結合パートナー
候補と結合したＦＰＲクラス受容体含有樹脂は、結合反応から除去され、結合パ
ートナーは支持体から溶出され、次いで同定される。固定化標的結合分析は繰り
返して実施され、所望結合特性を示す結合パートナーのクラスが同定され、かつ
、このデータはコンピュータ読み取り可能な媒体上に記録され、所望反応を生じ
る別の結合パートナーを選択するために使用される。
【００９５】 さらに、上記した方法で同定された結合パートナーは、試験を容易にするため
に、スプリット−アンド−プール合成法、すなわち非常に多数の化合物を生産す
る多段階プロセスによって固体支持体ビーズ上で合成され得る。支持体−結合・
結合パートナーは、結合パートナー特性化アッセイ法でスクリーニングされ得る
か、あるいは「遊離混合物」が支持体から結合パートナーを開裂して作成され、
これらの遊離混合物は結合パートナー特性化アッセイ法でスクリーニングされる
。所望反応を生じる化合物は同定され、コンピュータ読み取り可能な媒体上で記
録され、かつ、このプロセスは最適結合パートナーを選択するために繰り返され
得る。
【００９６】 支持体−結合受容体と結合パートナーとの会合は、分子生物学で一般的な多く
の技術を使用して測定され得る。結合パートナーまたはＦＰＲクラス受容体は、
例えば検出可能に標識化されて（例えば、放射能、磁性、または蛍光）、その結
果、リガンド／受容体複合体はシグナルを検出して直接に測定され得る。また、
リガンド／受容体複合体の会合は、結合パートナーまたは受容体の領域に対応す
るエピトープを有する検出可能に標識化された抗体を使用して、間接的に測定さ
れ得る。
【００９７】 ＦＰＲクラス受容体と相互作用し、それによって病原体に対して宿主免疫応答
を誘導し、および／またはＨＩＶ感染を抑制する分子もまた同定され、かつタン
パク質−タンパク質相互作用を検出する他の方法を使用して特性化され得る。使
用され得る従来の方法には、ＦＰＲクラス受容体と相互作用する溶解産物中のタ
ンパク質を同定するために、細胞溶解産物およびＦＰＲクラス受容体から得た細
胞溶解産物またはタンパク質の勾配またはクロマトグラフカラムによる共免疫沈
澱、架橋および共精製がある。これらの分析では、ＦＰＲクラス受容体は、全長
受容体、またはその断片または変異体である。結合パートナーは、一旦、単離さ
れると同定され、順に結合パートナー候補を同定する合理的薬剤設計における技
術とともに使用され得る。
【００９８】 インビボでタンパク質−タンパク質相互作用を検出する１つの方法、すなわち
ツーハイブリッドシステムは、説明のためのみに詳細に記載されるが、限定され
るものではない。結合パートナーを同定するために適用されうる他の同様な分析
としては、次のものが挙げられる。 （１）ツーハイブリッドシステム(Field & Song, Nature 340:245-246 (1989);
Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582 (1991): およびYoun
g KH, Biol. Reprod. 58:302-311 (1998),全ての参考文献は特に本明細書中に参
照により援用される）； （２）逆ツーハイブリッドシステム(Leanna & Hannink, Nucl. Acid Res. 24:33
41-3347 (1996), 本明細書中に参照により援用される)； （３）抑制トランス活性因子システム(Sadowski et al., 米国特許第5,885,779
号、参照により援用される)； （４）ファージディスプレイ(Lowman HB, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct
. 26:401-424 (1997), 参照により援用される)；および （５）ＧＳＴ／ＨＩＳプルダウン分析、突然変異体オペレーター(Granger et al
. WO 98/01879)など(Mathis G., Clin. Chem. 41:139-147 (1995); Lam K.S. An
ticancer Drug Res., 12:145-167 (1997); およびPhizicky et al., Microbiol.
Rev. 59:94-123 (1995)も参照、全ての参考文献は特に参照により援用される)
【００９９】 Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582,(参照によ
り援用される)に記載されるシステムの適用は、以下のとおりである。これはＣ
ｌｏｎｔｅｃｈ(Palo Alto, Calif.)から商業的に入手可能である。２つのハイ
ブリッドタンパク質をコードするプラスミドを構築する：１つのプラスミドはＦ
ＰＲクラス受容体またはその断片をコードするヌクレオチド配列に融合した転写
活性因子タンパク質のＤＮＡ−結合ドメインをコードするヌクレオチドからなり
、かつもう１つのプラスミドはｃＤＮＡライブラリーの一部としてこのプラスミ
ド中に組換えられている未知タンパク質をコードするｃＤＮＡに融合した転写活
性因子タンパク質の活性ドメインをコードするヌクレオチドからなる。ＤＮＡ−
結合ドメイン融合プラスミドおよびｃＤＮＡライブラリーは、制御領域が転写活
性因子結合部位を含むレポーター遺伝子（例えば、ＨＢＳまたはｌａｃＺ）を含
む酵母、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の菌株中に形
質転換させる。片方のハイブリッドタンパク質のみでは、レポーター遺伝子の転
写を活性化できない。ＤＮＡ−結合ドメインハイブリッドは活性化機能をもたら
さないため、また活性化ドメインハイブリッドは活性化因子の結合部位へ局在化
できなため、活性化できない。２つのハイブリッドタンパク質の相互作用は、機
能的活性化因子タンパク質を再構成し、レポーター遺伝子の発現となり、これは
レポーター遺伝子産物を分析して検出される。
【０１００】 ツーハイブリッドシステムまたは関連方法論は、「おとり」遺伝子産物と相互
作用するタンパク質の活性化ドメインライブラリーをスクリーニングするために
使用してもよい。その例として、しかし限定ではなく、ＦＰＲクラス受容体はお
とり遺伝子産物として使用され得る。全ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列は活性化
ドメインをコードするＤＮＡに融合される。ＤＮＡ−結合ドメインに融合したＦ
ＰＲクラス受容体産物をコードするおとり遺伝子のハイブリッドをコードするこ
のライブラリーおよびプラスミドは、酵母受容体菌株中に共に形質転換され、か
つ、得られた形質転換体はレポーター遺伝子を発現するものについてスクリーニ
ングされる。例えば、しかし限定としてではなく、ＦＰＲクラス受容体をコード
するおとり遺伝子配列は、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ−結合ドメインをコード
するＤＮＡと翻訳されて融合ように、ベクター中にクローン化され得る。これら
のコロニーは精製され、レポーター遺伝子発現のもととなるライブラリープラス
ミドが単離される。次いで、ＤＮＡ配列決定を使用して、ライブラリープラスミ
ドがコードするタンパク質を同定する。
【０１０１】 餌ＦＰＲクラス受容体と相互作用するタンパク質が検出されるべきである細胞
系のｃＤＮＡライブラリーは、当該技術分野で通常行っている方法を使用して作
成され得る。ここに記載する特別なシステムによると、例えばｃＤＮＡ断片はＧ
ＡＬ４の転写活性化ドメインに融合して翻訳されるように、ベクター中に挿入さ
れ得る。このライブラリーは、ＧＡＬ４活性化配列を含むプロモーターによって
作用するｌａｃＺ遺伝子を含む酵母菌株中に、餌ＦＰＲクラス受容体遺伝子−Ｇ
ＡＬ４融合プラスミドとともに共形質転換され得る。タンパク質がコードされ、
ＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合し、餌ＦＰＲクラス受容体遺伝子産物と相互
作用するｃＤＮＡは、活性ＧＡＬ４タンパク質を再構成し、それによってｌａｃ
Ｚ遺伝子の発現を活発化するであろう。ｌａｃＺを発現するコロニーは検出され
、次いで、ｃＤＮＡはこれらの菌株から精製され、かつ当該技術分野で通常行わ
れる技術によって結合パートナーを産生し、単離するために使用され得る。
【０１０２】 他の方法では、病原体に対して宿主免疫応答を誘導し、および／またはＨＩＶ
感染を抑制する結合パートナーは、細胞ベースの分析法を使用して同定され得る
。したがって、天然で、または外来性構築物の発現によってのいずれかで、ＣＣ
Ｒ５およびＣＤ４を発現する細胞は、ＦＰＲクラス受容体をコードする核酸配列
を含む構築物をトランスフェクトされる。ポジティブトランスフェクタントは、
上記した合理的薬剤設計の方法から、または化合物のランダムライブラリーから
得た標識化結合パートナー候補と接触させる。次いで、ＦＰＲクラス受容体の活
性化はＣａ+2動員および細胞の移動をモニターして測定され得る。さらに、ＨＩ
Ｖ感染を抑制する能力は、ＣＣＲ５のリン酸化、細胞表面でのＣＣＲ５のダウン
レギュレーションをモニターするか、あるいはｐ２４などのＨＩＶ感染産物、細
胞溶解産物、またはウイルス子孫の産生などをモニターして測定され得る。さら
に、ＨＩＶ感染への結合パートナーの能力は、顕微鏡で（例えば、結合パートナ
ーの存在下に細胞凝集体(syncitia)形成の欠如を観察して）測定され得る。結合
パートナーがＨＩＶ感染を抑制するかどうかを測定する多くの他の方法は、本開
示を考慮すれば、当業者には明白であろう。以下の考察では、治療および／また
は予防用途を有する本発明のいくつかの実施形態が記述される。
【０１０３】 治療および予防用途 治療および予防の実施形態では、病原体に対する宿主免疫応答を誘導し、およ
び／またはＨＩＶ感染を抑制するとして同定された結合パートナーは、医薬製品
中に組み込まれ、必要な被験体に投与される。本発明の医薬品はアジュバントと
ともに配合されるか、あるいは遊離状態であり、望ましい実施形態は支持体結合
形の結合パートナーを提供する。所望により、結合パートナーは、例えば加熱に
よって作成される凝集体で提供され得る。高い結合力でＦＰＲクラス受容体を結
合し、ＨＩＶ感染を抑制するが、病原体への宿主免疫応答の誘導に関連して細胞
反応を誘導できない新規クラスの結合パートナーは、他の実施形態である。例え
ば、ＢＯＣ−ｆＭＬＰはこのような結合パートナー候補の１つである。これらの
医薬品はまたアジュバント中で配合されるか、あるいは遊離状態であり、また支
持体結合作用物質の形態で提供される。上記したように、この実施形態の凝集体
は、タンパク質を加熱して作成され、必要な被験体に投与され得る。
【０１０４】 リガンドは支持体結合作用物質の形態で、または被験体の体内に支持体結合作
用物質を作成するために支持体と相互作用するプロドラッグ形態で投与され得る
。さらに、いくつかの経路から結合パートナーおよび／または結合パートナーを
コードする核酸配列を送達する医薬品または治療剤の製造は、本発明の他の態様
である。例えば、限定ではないが、結合パートナーをコードする配列を有するＤ
ＮＡ、ＲＮＡおよびウイルスベクターの使用が企図される。所望の結合パートナ
ーをコードする核酸は、単独で、あるいは結合パートナーと組み合わせて投与さ
れ得る。
【０１０５】 これらの薬理学的に活性な化合物は、被験体、例えばヒトを含む哺乳動物へ投
与する医薬製品を生産する生薬製剤学の従来の方法に従って加工され得る。活性
成分は変更して、および変更しないで、医薬製品中に組み込まれてよい。さらに
、本発明の薬学的に活性な化合物をいくつかの経路から送達する医薬品または治
療剤の製造は本発明の態様である。例えば、限定するものではないが、結合パー
トナーをコードする配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡおよびウイルス性ベクターは、
実施形態で使用される。結合パートナーをコードする核酸は、単独で、または他
の活性成分と組み合わせて投与され得る。
【０１０６】 本発明の化合物は、従来の賦形剤、すなわち本発明の薬学的に活性な成分と有
害に作用しない非経口、経腸（例えば、経口）または局所適用に適した薬学的に
許容可能な有機または無機担体物質と混合して使用され得る。好適な薬学的に許
容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベン
ジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン／ラクトース、アミロース
または澱粉などの炭水化物／ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、粘性パ
ラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリト
ール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど
が挙げられるが、これらに限定されない。多くのより好適な担体は、Remmington
's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, Easton:Mack Publishing Company
, pages 1405-1412および1461-1487 (1975)およびThe National Formulary XIV,
14th Edition, Washington, American Pharmaceutical Association (1975)に
記載されており、本明細書中に参考として挿入する。薬学的調製物は滅菌され、
もし所望であれば、活性化合物と有害に作用しない補助剤、例えば、潤滑剤、防
腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、色素、香味
および／または芳香性物質などと混合され得る。
【０１０７】 特定薬学的配合物の有効な用量および投与方法は、個々の患者および疾患の種
類と段階ならびに当業者に既知である他の要因に基づいて変化し得る。このよう
な化合物の治療効率および毒性は、細胞培養または実験動物、例えばＥＤ５０（
５０％の集団中にて治療に有効な用量）での標準的な製薬手法によって測定され
得る。細胞培養分析および動物研究から得たデータは、ヒト用途への用量範囲を
処方するときに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは毒性のない
ＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。用量は結合パートナーの種類、使用した
用量形態、患者の感受性および投与経路に依存して変化する。
【０１０８】 正常用量は、投与経路に依存して約１〜１００，０００マイクログラム、全用
量約１０グラムまでに変化してよい。好ましい用量としては、２５０μｇ、５０
０μｇ、１ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ
、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ
、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ
、９００ｍｇ、１ｇ、１．１ｇ、１．２ｇ、１．３ｇ、１．４ｇ、１．５ｇ、１
．６ｇ、１．７ｇ、１．８ｇ、１．９ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ
、８ｇ、９ｇ、および１０ｇが挙げられる。さらに、結合パートナー濃度は局所
形態の作用物質を投与する実施形態では非常に高い。結合パートナーのモル濃度
はいくつかの実施形態で使用され得る。局所投与または医療器具をコーティング
するための好ましい濃度は、１００μＭ〜８００ｍＭの範囲である。これらの実
施形態での好ましい濃度は、５００μＭ〜５００ｍＭの範囲である。例えば、局
所投与および／または医療器具をコーティングするための好ましい濃度としては
、５００μＭ、５５０μＭ、６００μＭ、６５０μＭ、７００μＭ、７５０μＭ
、８００μＭ、８５０μＭ、９００μＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ
、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、
６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍ
Ｍ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍ
Ｍ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、３７５ｍＭ、４００ｍ
Ｍ、４２５ｍＭ、４５０ｍＭ、４７５ｍＭおよび５００ｍＭが挙げられる。
【０１０９】 いくつかの実施形態では、結合パートナーの投与は、好ましくは約０．１μＭ
〜５００ｍＭの組織濃度もしくは血管濃度またはその両方の濃度を示す。好まし
い投与は、約１〜８００μＭの組織濃度もしくは血管濃度またはその両方の濃度
を示す。好ましい用量は、約１０μＭ〜約５００μＭの組織濃度または血管濃度
を示す。好ましい用量は、例えば、組織濃度もしくは血管濃度またはその両方の
濃度が、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０
μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μ
Ｍ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１１０μＭ、１２
０μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、１４５μＭ、１５０μＭ、１６０μＭ、１７
０μＭ、１８０μＭ、１９０μＭ、２００μＭ、２２０μＭ、２４０μＭ、２５
０μＭ、２６０μＭ、２８０μＭ、３００μＭ、３２０μＭ、３４０μＭ、３６
０μＭ、３８０μＭ、４００μＭ、４２０μＭ、４４０μＭ、４６０μＭ、４８
０μＭ、および５００μＭに達するために必要な結合パートナーの量である。８
００μＭ以上の組織濃度を示す用量は好ましくないが、本発明のいくつかの実施
形態で使用され得る。結合パートナーの定常注入もまた、血液濃度を測定して組
織中の安定濃度を維持して行われ得る。
【０１１０】 正確な用量は治療される患者を考慮して個々の医者により選択される。用量お
よび投与は十分な濃度の活性成分をもたらすか、あるいは所望効果を維持するよ
うに調節される。考慮され得る他の要因は、患者の疾患状態の程度（severity）
、患者の年齢および体重、食事、投与時間と頻度、薬剤の組合せ、反応感受性お
よび治療に対する許容度／応答が挙げられる。短時間作用薬学的組成物は毎日投
与されるが、一方、長時間作用医薬組成物は２，３〜４日毎、毎週、または２週
間毎に１回投与される。特定配合物の半減期およびクリアランスの割合に依存し
て、本発明の薬学的組成物は１日当たり、１回、２回、３回、４回、５回、６回
、７回、８回、９回、１０回またはそれより多い回数で投与される。
【０１１１】 本発明の医薬品の投与経路としては、経皮、局所、非経口、胃腸管系、経気管
支、および経肺胞が挙げられるが、これらに限定されない。経皮または局所投与
は、薬学的に活性な化合物を皮膚または粘膜へ浸透させることができる、クリー
ム、リンス、ゲルなどを使用して実施される。非経口投与経路としては、電気的
注射または主要な静脈内へ直接注射するなどの直接注射、静脈内、筋肉内、腹膜
内、皮内、または皮下注射が挙げられるが、これらに限定されない。胃腸管系投
与経路としては、摂取および直腸投与が挙げられるが、これらに限定されない。
経気管支および経肺胞投与経路としては、吸入、すなわち口または鼻内のいずれ
かが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】 経皮または局所投与に適した本発明の薬学的に活性な化合物を有する組成物と
しては、皮膚に直接に塗布されるか、あるいは経皮装置（「経皮パッチ」）など
の保護担体中に組み込まれた薬学的に許容可能な懸濁液、油、クリーム、および
軟膏が挙げられるが、これらに限定されない。好適なクリーム、軟膏などの例は
、例えば、医者の机上参考書(Physician's Desk Reference)中に見られ得る。好
適な経皮装置の例は、例えば、１９８９年４月４日登録の、Chinen等に付与され
た米国特許第４，８１８，５４０号に記載され、本明細書中に参照により援用さ
れる。
【０１１３】 非経口投与に適した本発明の薬学的に活性な化合物を有する組成物としては、
薬学的に許容可能な無菌等張液が挙げられるが、これに限定されない。このよう
な溶液としては、主要な静脈内への注射、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮内、また
は皮下注射のための生理食塩水およびリン酸緩衝化生理食塩水が挙げられるが、
これらに限定されない。
【０１１４】 経気管支および経肺胞投与に適した本発明の薬学的に活性な化合物を有する組
成物としては、種々のタイプの吸入用アエロゾルが挙げられるが、これらに限定
されない。これらの経気管支および経肺胞投与に適した装置もまた、実施形態で
ある。このような装置としては、噴霧器および気化器が挙げられるが、これらに
限定されない。目下、入手可能である多くの形態の噴霧器および気化器は、本発
明の薬学的に活性な化合物を有する組成物を輸送するために容易に応用すること
ができる。
【０１１５】 胃腸系投与に適した本発明の薬学的に活性な化合物を有する組成物は、薬学的
に許容可能な経口摂取用粉末、丸薬または液体および直腸投与用座薬が挙げられ
るが、これらに限定されない。使いやすさから、胃腸系投与、特に経口投与は好
ましい実施形態である。結合パートナーを含む医薬品が一度得られると、ＨＩＶ
感染を治療または阻止する必要がある被験体に投与され得る。
【０１１６】 本発明の態様としてはまた、補綴具、移植片および器具などの医療用装置のた
めのコーティング剤が挙げられる。医療用装置における用途に適したコーティン
グ剤は、結合パートナーを含むゲルまたは粉末によって、または結合パートナー
が懸濁する重合性コーティング剤によってもたらされ得る。コーティングまたは
装置用の好ましい重合性物質は、生理学的に許容可能であって、かつ治療的有効
な量の活性パートナーが拡散できるものである。好適なポリマーとしては、ポリ
ウレタンポリメチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレン
、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニ
ル、酢酸セルロース、シリコーン弾性体、コラーゲン、絹などが挙げられるが、
これらに限定されない。このようなコーティング剤は、例えば、１９８６年９月
１６日登録の、Fox等に付与された米国特許第４，６１２，３３７号に記載され
、本明細書中に参照により援用される。
【０１１７】 本発明のいくつかの態様では、結合パートナー、特に結合パートナーを有する
医薬品は、ＦＰＲクラス受容体と相互作用する作用物質を必要とする被験体へ投
与して、病原体に対する宿主免疫応答を誘導させる。他の実施形態では、結合パ
ートナーを有する医薬品は、ＨＩＶ感染を抑制する作用物質を必要とする被験体
へ投与される。病原体に対する宿主免疫応答の誘導および／またはＨＩＶ抑制の
ための医薬品の配合方法は、本発明の実施形態である。
【０１１８】 １つの実施形態は、例えば、被験体での病原体に対する宿主免疫応答を誘導す
る方法に関する。したがって、ＦＰＲクラス受容体と相互反応し、それによって
宿主免疫応答を誘導する作用物質を必要とする被検者が確認され、この被験体は
治療的十分な量のＶ３ペプチドまたはＷペプチドを投与される。必要性あるこの
ような被験体の中には慢性病原性感染症（例えば、慢性ウイルス性疾患、細菌性
疾患、または真菌性疾患）に冒されている個人が含まれ得る。これらの個人は臨
床または生化学的技術によって確認され得る。
【０１１９】 他の実施形態はＨＩＶ感染を治療または阻止する方法に関する。１つの方法で
は、ＨＩＶ感染を抑制する作用物質を必要とする被験体が確認され、この被験体
は治療的十分量の結合パートナーを投与される。このような必要性ある被験体と
してはＨＩＶ感染にかかる危険性を有するか、あるいはすでにＨＩＶ感染に冒さ
れた個人が挙げられる。これらの個人は臨床または生化学的技術によって確認さ
れ得る。以下の章では、多くの実験に使用した材料および方法を詳述したいくつ
かの実施例が提供される。
【０１２０】 実施例１ ｆＭＬＰ実験 ＣＣＲ５リン酸化 単球を正常供与者(NIH Clinical Center, Transfusion Medicine Department,
Bethesda, MD)の抹消血から逆流エラトリエーションによって単離し、逆流エラ
トリエーションを使用して単核細胞を豊富にした。細胞調製物の純度は、サイト
プシン(cytopsin)後にその形態から調べたところ、９０％より高かった。３７℃
で示された時間、異なった濃度のケモカインにより細胞を刺激し、かつ、ホスフ
ァターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフッ素
、５ｇ／ｍｌアプロチニン、５ｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭオルソバナジウム
酸ナトリム、１ｍＭ ＥＧＴＡ）を含む可溶化緩衝液（１％トリトンＸ−１００
、２０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．０、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１５％グリセロ
ール、５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で定期的に混合して、氷上で２０分間、可溶化した
。細胞溶解産物は、３０ｌの精製プロテイン−Ａセファロースビーズ（Pharmaci
a Biotech. Piscataway, NJ）で前洗浄した。２×免疫沈澱（ＩＰ）緩衝液（１
×緩衝液は１％トリトンＸ−１００、１０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．４、１３
７ｍＬ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２ｍＭオルソバ
ナジウム酸ナトリウム、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５％ＮＰ−４０を含む）を
使用して希釈した２００ｇ細胞溶解産物へ１ｇのポリクローナル抗ホスホ−セリ
ン抗体（Zymed Laboratory Inc., South San Francisco, CA）を添加した。反応
混合物を常時振とうしながら４℃で一晩、インキュベートした。免疫複合体を５
０ｌの精製プロテイン−Ａセファロースビーズ（２５ｌパックビーズ）を添加し
、さらに４℃で２時間、反応混合物をインキュベートして捕捉した。ビーズを遠
心沈殿し（１４，０００ｒｍｐで１０秒間）、ペレットを氷冷ＩＰ緩衝液で３回
洗浄し、３０ｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（１２６ｍＭトリスＨＣｌ、２
０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．００５％ブロモフェノールブルー、および
、１％ ２−メルカプトエタノール添加または無添加。Novex, San Diego, CA）
中で再懸濁し、かつ５分間煮沸して免疫複合体を溶出した。４〜１２％ＳＤＳ−
ＰＡＧＥプレキャストゲル(Novex)上で電気泳動した後、タンパク質をイモビロ
ン(Immobilon)Ｐ膜(Millipore, Bedford, MA)へ転写した。３％ドライミルクを
含む、新たに調製したＰＢＳ中で、膜を２時間ブロッキングし、次いで１ｇ／ｍ
ｌの抗ＣＣＲ５ポリクローナル抗体(Millenium Biotechnology, Ramona, CA)と
ともに４℃で一晩、インキュベートし、続いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳで３回、洗浄した。膜を、３％ドライミルクを含むＰＢＳ中で西洋ワサビ
パーオキシダーゼが結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５０００）(Sigma, St,
Lous, MO)とともに、攪拌しながら室温で１時間、インキュベートした。ＰＢＳ
−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回、洗浄後、膜をスーパーシグナル化学発光基
質安定パーオキサイド溶液(Pierce, Rockford, IL)と共に１分間、インキュベー
トし、ＢＩＯＭＡＸ−ＭＲフィルム(Eastman Kodak Company, Rochester, NY)に
感光させた。
【０１２１】 結合アッセイ 結合アッセイは、容量２００ｌ／試料の結合培地（１％ＢＳＡ、２５ｍＭ Ｈ
ｅｐｅｓおよび０．０５％ＮａＮ3を含むＲＰＭＩ１６４０）中で、１０-6Ｍの
ｆＭＬＰと２組の単球（２×１０6）試料を３７℃で６０分間プレインキュベー
トして実施した。洗浄後、細胞を０．２ｎｇの125Ｉ−標識ＭＩＰ−１（比活性
：２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、Dupont NEW, Boston, MA）と室温で４０分間、イ
ンキュベートして細胞の結合の総数を測定した。１，０００倍過剰の非標識ＭＩ
Ｐ−１(Pepro Tech Inc. Rocky Hill, NJ)の存在下で細胞を平行インキュベーシ
ョンして非特異的結合を測定した。インキュベーション後、細胞をＤＰＢＳで洗
浄し、１０％蔗糖／ＤＰＢＳ緩衝液中で遠心分離した。細胞ペレットを含む試験
管の先端を切断し、細胞に関連した放射活性をγ線計数管で測定した。その結果
は２×１０6個の単球における、１分当たりのカウント（ｃｐｍ）として表示し
、その結果は少なくとも３回実施した実験の代表値であった。
【０１２２】 化学走化性アッセイ 単球移動（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を４８ウェルマイクロ−
化学走化性チャンバ技術によって評価した。アッセイ培地（１％のＢＳＡおよび
２５ｍＭのＨｅｐｅｓを含むＲＰＭＩ１６４０）で希釈した２５ｌのＭＩＰ−１
を化学走化性チャンバの下部区画に入れた。このチャンバの上部区画に５０ｌの
細胞懸濁液（１×１０6細胞／ｍｌ）を入れた。上部および下部区画をポリカー
ボネートフィルター（５ｍ孔径、Neuroprobe, Cabin John, MD）で分離した。５
％ＣＯ2を含む加湿空気中で、３７℃で９０分間、チャンバをインキュベートし
た。インキュベーションの最後に、フィルターを除去し、固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑ
ｕｉｋ(Harlew, Gibbstown, NJ)で染色した。試料をコード化した後、３組（４
００×）で得られた３つの高倍率視野（ＨＰＦ）での移動細胞を光学顕微鏡で計
数した。その結果は、自発的に移動した細胞を引いた、３ＨＰＦ中の移動細胞の
正味の平均（±ＳＤ）の数として表示される。少なくとも３つの実験は、同じ結
果であった。
【０１２３】 カルシウム動員 ５ＭのＦｕｒａ−２ＡＭ（Molecular Probes, Eugene, OR）とともにローデイ
ング培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ）中で単球（２×１０7／ｍｌ）を暗条件か
つ室温下で３０分間、インキュベートしてカルシウム動員を測定した。色素を載
せた細胞を３回洗浄し、生理食塩水緩衝液（１３８ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、５ｍＭグルコ
ース、０．１％ＢＳＡ）中で再懸濁した。次いで、発光光度計（ＬＳ−５０Ｂ、
Perkin-Elmer, Beaconsfield, UK）中に置かれた石英キュベット（２ｍｌ中、２
×１０6細胞）中に細胞を移送した。示された時間に、各キュベットへ異なった
濃度の刺激剤を、２０ｌの容量にて添加した。３４０および３８０ｎｍの蛍光比
率をＦＬ−ＷｉｎＬａｂプログラム(Perkin Elmer)を使用して計算した。ｆＭＬ
Ｐの効果を試験するために、単球を１０-6ＭのｆＭＬＰとともに、または培地の
みと３７℃で６０分間、プレインキュベートした。細胞を十分に洗浄し、次いで
、動員されたカルシウムを脱感作するためにＦｕｒａ−２で染色した。その結果
は少なくとも３回行われた実験の代表値である。
【０１２４】 ＣＣＲ５発現 単球表面上でのＣＣＲ５の表面発現の変化をＦＡＣＳ分析機器（L. Finchの好
意による。SAIC Frederick, National Cancer Institute Frederick Cancer Res
earch and Development Center, Frederick, MD）によってモニターした。１×
１０6の単球を培地または１０6Ｍ ｆＭＬＰ(Sigma)とともに３７℃で６０分間
、前処理した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、氷上で６０分間、ＦＩＴ
Ｃが結合した抗ＣＣＲ５モノクローナル抗体２Ｄ７（２０ｌ／テスト）(PharMin
gen, San Diego, CA)でもって染色した。プロテインキナーゼＣ阻害剤を処理す
るため、結合培地中に懸濁した細胞を、８−ワット蛍光光源下で、１．４ｎｇ／
ｍｌのスタウロスポリン(Sigma)を用いて３７℃で３０分間、または、５０ｎｇ
／ｍｌのカルホスチンＣ(Sigma)を用いて３７℃で２．５時間インキュベートし
た。続いて、細胞を、ｆＭＬＰおよび抗ＣＣＲ５抗体とともにインキュベートし
た。次いで２％ＢＳＡを含むＤＰＢＳで、細胞を２回洗浄し、１％パラホルムア
ルデヒド(Sigma)で固定した。蛍光をフローサイトメーター(Becton Dickinson,
San Jose, CA)で測定した。その結果は抗ＣＣＲ５抗体で染色された細胞のパー
セントとして表す。
【０１２５】 ＨＩＶ−１Ｅｎｖ融合およびウイルス感染 ＨＩＶ−１融合分析を先に記載されるようにして実施した(Nussbaum et al.,
J. Virol. 68:5411 (1994))。簡単には、ＣＤ４およびＣＣＲ５（ＨＯＳ／ＣＣ
Ｒ５／ＣＤ４細胞、NIH AIDS Research and Reference Reagents Programからの
好意ある寄贈品）を発現するようにトランスフェクトしたヒト骨肉腫細胞を、さ
らにＦＲＰ（すなわち細菌化学走化性ペプチドｆＭＬＰの高親和性受容体）を共
に発現するようにトランスフェクトした。コントロール細胞には、プラスミドベ
クターｐｃＤＮＡ３（Ｍｏｃｋ／ＣＣＲ５／ＣＤ４）のみをトランスフェクトし
た。ＨｅＬａ細胞（ATCC、Rockville, MD）にまず、単球指向性ＨＩＶ−１ｅｎ
ｖ（ＢＡＬ３１）と、ＬａｃＺレポーター遺伝子に結合したＴ７プロモーターを
含むｖＢＣ２１Ｒとを発現する組換えワクシニアウイルスｖＢＣ４３を感染させ
た。ＦＰＲ非存在下または存在下でＣＣＲ５／ＣＤ４を発現するＨＯＳ細胞に、
バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換えワクシニアウイ
ルス、ｖＴＦ７−３を、天然Ｐ７．５初期−後期ワクシニアプロモーターの制御
下に感染させた。３１℃で一晩、感染させた後、感染した１×１０5個のＨｅＬ
ａ細胞を１×１０5個の感染ＨＯＳ細胞と混合し、９６ウェル組織培養プレート
のウェル中に３通りにまいた。２つの細胞種を混合したとき、ケモカインまたは
ｆＭＬＰを同時に添加した。３７℃で１２時間、インキュベートした後、細胞を
０．０５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０で溶解させ、２５００ｒｐｍで５分間、回転
した。５０ｌの細胞溶解産物を２×リン酸緩衝液（０．１２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4、
０．０８Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、０．０２Ｍ ＫＣｌ、０．００２Ｍ ＭｇＳＯ4、
０．０１Ｍ メルカプトエタノール）中に溶解した５０ｌの１６ｍＭクロロフェ
ノールレッド−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ、Boerhinger Mannheim）と混合
した。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて５７０ｎｍの吸光度でその色を測定する前に
、反応を室温で２〜４時間、維持した。ヒト単球を用いる分析にも同じ方法を使
用した。マクロファージのウイルス感染の研究のため、抹消血単球細胞を２時間
、プラスチックに接着させ、非接着細胞を除去した。接着細胞をｒｈＭ−ＣＳＦ
（１００ｎｇ／ｍｌ）中で７日間、培養して、マクロファージ分化を誘導した。
次いで、単球由来のマクロファージを指定濃度にてｆＭＬＰで処理し、１時間後
、その処理済み細胞を１．０のＭＯＩでＨＩＶJRFLに感染させた。ＨＩＶ−感染
の４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、新たな培地を添加した。次いで、ＨＩＶｐ
２４抗原レベルを酵素結合免疫吸収分析法によって６日目に測定した。ｆＭＬＰ
処理は培地のみで処理した細胞に比べて、マクロファージの生存に影響を及ぼさ
なかった。
【０１２６】 実施例２ Ｖ３ペプチド実験 試薬と細胞 ＨＩＶ−１ｇｐ１２０（ＭＮ）の合成Ｖ３ペプチド（３３アミノ酸）（ＴＲＰ
ＮＹＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮＩＩＧＴＩＲＱＡＨ−ＮＨ2（配
列番号３）は、NIH AIDS Research and Reference Reagents Program (Bethesda
, MD)から好意により提供された。このペプチドを４３３Ａペプチド合成機(PE B
iosystem, Foster City, CA)(Proost et al., Cytokine, 7:97 (1995))でＦｍｏ
ｃ化学により調製スケール（０．２５ｍｍｏｌ）にて合成し、リソースＲＰＣカ
ラム(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)上でＲＰ−ＨＰＬＣにて
精製した。合成ペプチドの配列は、４７７Ａ／１２０Ａタンパク質配列決定機(P
E Biosystems)でエドマン分解法によって確認した。組換えヒトケモカインおよ
びＳＡＡは、Pepro Tech Inc.(Rocky Hill, NJ)から購入した。化学走化性ペプ
チドｆＭＬＰおよび西洋ワサビパーオキシダーゼが結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ
は、Sigma(St. Louis. MO)から購入した。タンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂ
ビーズはPharmacia Biotech(Piscataway, NJ)から購入した。ウサギ抗ホスホセ
リンポリクローナル抗体は、Zymed Laboratory Inc.(South San Francisco, CA)
から購入した。ウサギ抗ＣＣＲ５ポリクローナル抗体は、ProSci. Inc.(Poway,
CA)から購入した。
【０１２７】 先に記載されるように、ヒト抹消血単球および好中球をＢｕｆｆｙ−Ｃｏａｔ
ｓ(NIH Clinical Center, Transfusion Medicine Department, Bethesda, MD)か
ら分離した(Deng et al., Blood, 94:1165 (1999))。エピトープ付き高親和性ｆ
ＭＬＰ受容体ＦＰＲ（ＥＴＦＲ細胞と表す）をコードするｃＤＮＡをトランスフ
ェクトしたラット好塩基性白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）は、H.Ali博士およびR
.Snyderman博士(Duke University, Durham, NC)からの好意ある寄贈物である。
ＦＰＲＬ１（ＦＰＲＬ１／２９３細胞）をコードするｃＤＮＡをトランスフェク
トしたヒト胚性腎臓上皮２９３細胞は、既に記載されるようにして確立した(Gao
およびMurphy, J. Biol. Chem., 268:25395 (1993))。
【０１２８】 化学走化性分析 細胞の移動を (Su et al., J. Exp. Med., 189:395 (1999)) に記載されるよ
うに、４８ウェルマイクロ化学走化性チャンバ技術により評価した。化学誘引物
質を化学走化性チャンバの下部区画のウェル中に入れた。細胞懸濁液を上部区画
のウェル中に入れた。２つの区画をポリカーボネートフィルター(Neuroprobe, C
abinJohn, MD、単球および好中球では５μｍ孔径、受容体トランスフェクタント
では１０μｍ孔径)によって分離した。受容体遺伝子をトランスフェクトした細
胞系の移動において使用したフィルターは、５０μｇ／ｍｌのコラーゲンＩ型(C
ollaborative Biomedical Products, Bedford, MA)でもってプレコートした。５
％ＣＯ2を含む加湿空気中、３７℃でチャンバをインキュベートした。インキュ
ベーション（好中球では１時間、単球では１．５時間および受容体をトランスフ
ェクトした細胞系では５時間）後、フィルターを除去し、固定し、ＬｅｕｋｏＳ
ｔａｔ（登録商標）(Fisher Scientific, Pittsburg, PA)で染色した。試料をコ
ード化した後、３つの高倍率視野（４００×）中を移動した細胞を光学顕微鏡で
計数した。その結果は３つの試料中の移動の平均（±ＳＥ）値として表し、その
結果は、実施した少なくとも３つの実験の代表値である。また、細胞移動は、刺
激剤で誘導した細胞移動の、コントロール培地上の細胞移動に対する増加倍数を
示す化学走化性指数（ＣＩ）で表した。
【０１２９】 カルシウム動員 ５μＭ Ｆｕｒａ−２ＡＭ(Molecular Probes, Eugene, OR)とともに、ローデ
ィング培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ）中で２×１０7／ｍｌ細胞を暗条件かつ
室温で３０分間、インキュベートしてカルシウム動員を測定した。色素を載せた
細胞をローディング培地で３回、洗浄し、生理食塩緩衝液（１３８ｍＭ ＮａＣ
ｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４
）、５ｍＭグルコース、０．１％ＢＳＡ）に、１×１０6／ｍｌの濃度で再懸濁
した。次いで、発光光度計（ＬＳ−５０Ｂ、Perkin-Elmer, Beaconsfield, Engl
and）中に置いた石英キュベット（２ｍｌ）中に細胞を移送した。示された時間
に各キュベットへ２０μｌの容量にて異なった濃度の刺激剤を添加した。３４０
および３８０ｎｍ波長の蛍光比率をＦＬ ＷｉｎＬａｂプログラム(Perkin-Elme
r)を使用して計算した。
【０１３０】 ＣＣＲ５のリン酸化 ３７℃にて、示された時間に異なった濃度の刺激剤で刺激した単球を、ホスフ
ァターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ素、
５μｇ／ｍｌアプロチニン、５μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭオルソバナジウ
ム酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＧＴＡ）を含む可溶化緩衝液（１％トリトンＸ−１
００、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１５％グ
リセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で定期的に混合しながら、氷上で２０分間、
可溶化した。３０μｌの精製プロテインＡセファロースビーズ（１５μｌパック
ビーズ）を使用して、４℃で１時間、細胞溶解産物を前洗浄し、１μｇの抗ホス
ホセリンポリクローナル抗体を、２×免疫沈澱（ＩＰ）緩衝液[１×：１％トリ
トンＸ−１００、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ
、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２ｍＭナトリウム、０．２ｍＭ
ＰＭＳＦ、０．５％ＮＰ−４０]で希釈した２００μｇの細胞溶解産物へ添加し
た。反応混合物を常時振とうしながら４℃で一晩、インキュベートした。免疫複
合体を５０μの精製プロティンＡセファロースビーズ（２５μｌパックビーズ）
を添加し、反応混合物を４℃でさらに２時間、インキュベートして捕捉した。ビ
ーズを遠沈し（１４，０００ｒｐｍで１０秒間）、上清を排出し、氷冷１×ＩＰ
緩衝液を用い、３回洗浄し、次いで、３０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液
（１２６ｍＭトリスＨＣｌ、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．００５％ブ
ロモフェノールブルー、Novex, San Diego, CA）中に再懸濁し、５分間、煮沸し
て免疫複合体を溶出した。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥプレキャストゲル(Novex, Sa
n Diego, CA)上で電気泳動した後、イモビロンＰ膜(Millipore Corp., Bedford,
MA)へタンパク質を転写した。３％ドライミルクを含む新たに調製したＰＢＳ中
、４℃で２時間、膜をブロッキングし、次いで、１μｇ／ｍｌの抗ＣＣＲ５ポリ
クローナル抗体とともに、４℃で一晩、インキュベートし、続いて、ＰＢＳ−Ｔ
（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回、洗浄した。３％ドライミルクを含むＰＢ
Ｓ中に１：５０００倍希釈した、西洋ワサビパーオキシダーゼが結合したヤギ抗
ウサギＩｇＧとともに、膜を、攪拌しながら室温で１時間、インキュベートした
。ＰＢＳ−Ｔで３回、洗浄した後、膜をスーパーシグナル化学発光基質安定パー
オキサイド溶液（PIERCE、Rockford, IL）とともに１分間、インキュベートし、
ＢＩＯＭＡＸ−ＭＲフィルム(Eastman Kodak Company, Rochester, NY)に感光さ
せた。
【０１３１】 統計的分析 全ての実験を少なくとも３回実施し、示された結果は代表的な実験から得たも
のである。テスト群とコントロール群間の有意差はスチューデントｔテストを使
用して解析した。
【０１３２】 実施例３ Ｗペプチド実験 化学物質 発表された配列(Seo et al., J. Immunol., 158:1895-1901 (1997))に従い、Ｗ
ＫＹＭＶＭ（Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｔｒｙ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ、Ｗペプチ
ドと表す）（配列番号１）を合成し、Department of Biochemistry, Colorado S
tate University (Fort Collins, CO)で精製した。純度は９０％より高く、アミ
ノ酸組成は質量分析計で検証した。溶解したペプチド中のエンドトキシン濃度は
検出不可能であった。合成フォルミルペプチドｆＭＬＰはSigma（St. Louis, MO
）から購入した。トリチウム化（3Ｈ）ｆＭＬＰは、Dupont NEN (Boston, MA)か
ら購入した。
【０１３３】 細胞 ヒト抹消血単球細胞（ＰＢＭＣ）をTransfusion Medicine Department, NIH C
linical Center, Bethesda, MDの好意により、ロイコパック(leukopacks)から単
離した。さらに、エラトリエーションによって単球を精製し、純度が９０％より
高い調製物を得た。３％デキストラン沈降により同じロイコパックからヒト好中
球を精製し、９８％より高い純度を得た。エピトープ付き高親和性ｆＭＬＰ受容
体ＦＰＲ（ＥＴＦＲ細胞と表す）を安定的にトランスフェクトしたラット好塩基
性白血病細胞は、H.Ali博士およびR.Snyderman博士、Duke University, NCから
の好意ある寄贈物である。ＦＲＰ様受容体１（ＦＰＲＬ１）ｃＤＮＡをクローン
化し、先に報告されたように、ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ）２９３（ＦＰＲＬ１／
２９３細胞と表す）中に安定的にトランスフェクトした(Gao およびMurphy, J.
Biol. Chem.268:25395-25401 (1993))。トランスフェクトされた細胞の全てをＤ
ＭＥＭ、１０％ＦＣＳおよび０．８ｍｇ／ｍｌジェネテシン（Ｇ４１８、GibcoB
RL, Rockville, MD）中に維持した。
【０１３４】 化学走化性 白血球、ＥＴＦＲおよびＦＰＲＬ１／２９３細胞の移動は、既に記載されるよ
うに４８ウェルマイクロ化学走化性チャンバ技術を使用して評価した(Gong et a
l., J. Biol. Chem., 273:4289-4292 (1998); Gong et al., J. Biol. Chem., 2
72:11682-11685 (1997); Ben-Baruch et al., J. Biol. Chem., 270:22123-2212
8 (1995))。異なった濃度の刺激剤をチャンバ(Neuro Probe, Cabin John, MA)の
下部区画のウェルに入れ、細胞懸濁液をポリカーボネートフィルター(Osmonics,
Livermore, CA; 白血球では５ｍ孔径、ＥＴＦＲおよびＦＰＲＬ１／２９３細胞
では１０ｍ孔径)によって下部区画から分離された上部区画のウェル中にまいた
。ＥＴＦＲおよびＦＰＲＬ１／２９３細胞移動のためのフィルターは、細胞接着
を助けるために５０ｇ／ｍｌのコラーゲンＩ型(Collaborative Biomedical Prod
ucts, Bedford, MA)でもってプレコートした。３７℃でインキュベーション（単
球では９０分間、好中球では６０分間、およびＥＴＦＲまたはＦＰＲＬ１／２９
３細胞では３００分間）後、フィルターを取り除き、染色し、試料をコード化し
た後、フィルターを通過した移動細胞数を光学顕微鏡で計数した。各細胞タイプ
を使用して少なくとも５回、実験を実施した。細胞移動は、自発的細胞移動（コ
ントロール培地に対応）に対する、刺激に反応する移動細胞数の増加倍数を示す
化学走化性指数（ＣＩ）で表した。
【０１３５】 カルシウム動員 ５Ｍ Ｆｕｒａ２(Sigma)とともに１３８ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭグルコース
、０．１％ＢＳＡを含むローディング緩衝液中で、２×１０7／ｍｌの単球、好
中球、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲトランスフェクタントを３７℃で３０分間、イン
キュベートして、カルシウム可動度を分析した。色素を載せた細胞を洗浄し、新
たなローディング緩衝液中で再懸濁した。次いで、発光光度計ＬＳ５０Ｂ(Perki
n-Elmer Limited, Beaconsfield, England)中に置いた石英キュベット（２ｍｌ
中、１０6細胞）中に細胞を移送した。示された時間にキュベットへ２０ｌの容
量にて異なった濃度の刺激剤を添加した。波長３４０および３８０ｎｍの蛍光比
率をＦＬＷｉｎＬａｂプログラム(Perkin-Elmer)を使用して計算した。
【０１３６】 結合アッセイ 単一濃度の3Ｈ−ｆＭＬＰを、異なった濃度の未標識ｆＭＬＰまたはＷペプチ
ドとともに、２つの試料の細胞懸濁液（ＦＰＲＬ１／２９３またはＥＴＦＲ、Ｒ
ＰＭＩ１６４０中の２×１０6細胞／２００ｌ、１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｎ
ａＮ3）として同時に添加した。試料を３７℃で３０分間、常時回転下でインキ
ュベートした。インキュベーション後、試料を１２ウェルマニホールド上でワッ
トマンＧＦ／Ｃディスク(Whatman International Ltd., Kent, UK)上で濾過し、
続いて氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を大量に使用して洗浄した。ディ
スクを６５℃で空気乾燥し、液体シンチレーション反応混液中に浸漬し、β発光
をカウントした。
【０１３７】 統計的分析 特定な場合を除いて、全ての実験は３〜５回実施し、示される結果は代表的な
実験から得たものである。テスト群とコントロール群の間の有意差は、スチュー
デントｔテストでもって分析した。
【０１３８】 本発明は実施形態および実施例を参照して説明されているが、種々の変更は本
発明の精神から逸脱せずに行うことができることを理解すべきである。したがっ
て、本発明は併記の特許請求項によってのみ限定されない。本明細書中に引用し
た全ての参考文献は、特に参照としてここに援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜Ｄ ＭＩＰ−１はＣＣＲ５のリン酸化を誘導する ヒト単球(Ａ)またはＣＣＲ５をトランスフェクトした、ヒト腎臓胚２９３細胞
(Ｂ)を、ＭＩＰ−１の存在下または非存在下で３７℃で１分間インキュベートし
た。２−メルカプトエタノールの存在下(還元＋)または非存在下での電気泳動に
より、細胞溶解産物(２０μｇ)を分離し、次にイモビロンＰ膜に転写した。その
後、膜上のタンパク質を抗ＣＣＲ５ポリクローナル抗体でプローブした。指定時
間で(Ｃ)または指定濃度(Ｄ)のＭＩＰ−１でインキュベートされたヒト単球を溶
解し、２００μｇの細胞溶解産物を抗ホスホセリン抗体を用いて免疫沈降させた
。免疫複合体にＳＤＳ−ＰＡＧＥを施し、その後抗ＣＣＲ５抗体を用いてイムノ
ブロッティングした。パネル(Ｃ)の挿入図版は、免疫沈降前の２０μｇの細胞溶
解産物中のＣＣＲ５のイムノブロットによる検出を示す。
【図２】 図２(Ａ〜Ｄ) ｆＭＬＰおよびＴ２０はＣＣＲ５のリン酸化を誘導する 指定濃度のｆＭＬＰを用いて（Ａ）、または予定時間の間１０-6ＭのｆＭＬＰ
を用いて（Ｂ）プレインキュベートした単球を溶解し、溶解産物（２００μｇ）
を抗ホスホセリン抗体を用いた免疫沈降とその後の抗ＣＣＲ５抗体を用いたイム
ノブロッティングに付した。１μｇ／ｍｌの濃度のケモカインＭＩＰ−１αを陽
性対照として用いた。パネル（Ｃ）は、ＣＣＲ５のセリンリン酸化に関して試験
した単球細胞溶解産物を示す。カルホスチンＣ（５０ｎｇ／ｍｌ,３７℃で２．
５時間）を用いてまたは用いずに単球をプレインキュベートし、ＭＩＰ−１（１
μｇ／ｍｌ、３７℃、１分）またはｆＭＬＰ（１０-6Ｍ、３７℃、６０分）で刺
激した。パネル（Ｄ）は、異なる濃度のＴ２０ペプチドで処理した単球のＣＣＲ
５リン酸化を示す。１μｇ／ｍｌ（３７℃、１分）のＭＩＰ−１α処理を、陽性
対照として用いた。
【図３】 図３（Ａ〜Ｃ） ｆＭＬＰはケモカインリガンドに対するＣＣＲ５の応答を低減する パネル（Ａ）において、培地またはｆＭＬＰ（１０-6Ｍ、３７℃、６０分）を
用いてプレインキュベートした単球との125Ｉ−ＭＩＰ−１の結合を調べた。非
標識ＭＩＰ−１（１μｇ／ｍｌ）およびｆＭＬＰ（１０-6Ｍ）を用いて、結合に
関して125Ｉ−ＭＩＰ−１と競合させた。単球のアリコートを、ｆＭＬＰによる
処理の前に、カルホスチンＣ（５０ｎｇ／ｍｌ、３７℃で２．５時間、Ｃ＋ｆＭ
ＬＰ）またはスタウロスポリン（１．４ｎｇ／ｍｌ、３７℃で６０分、Ｓ＋ｆＭ
ＬＰ）を用いてプレインキュベートした。星印（＊）は、ｆＭＬＰで処理した細
胞上の125Ｉ−ＭＩＰ−１の結合が、非処理の細胞（Ｐ＜０．０１）と比較した
場合に、有意に低減したことを示す。パネル（Ｂ）は、ｆＭＬＰ（１０-6Ｍ、３
７℃）を用いた指定時間の間のインキュベーション後のＭＩＰ−１（１００ｎｇ
／ｍｌ）に応答する単球の移動を示す。カルホスチンＣ（５０ｎｇ／ｍｌ、３７
℃で２．５時間）によるプレインキュベートとその後のｆＭＬＰ処理された細胞
を、平行して試験した。結果は、培地に応答する自発的な移動を引いたの３つの
高倍率視野（ＨＰＦ）中の移動単球の正味数として表される（５５±７細胞）（
＊Ｐ＜０．０１）。パネル（Ｃ）は、培地に応答する単球のカルシウム動員を評
価した。単球を培地（培地）、カルホスチン（５０ｎｇ／ｍｌ、２．５時間）を
用いてプレインキュベートし、その後ｆＭＬＰ（１０-6Ｍ、３７℃、６０分）（
Ｃ＋ｆＭＬＰ）またはｆＭＬＰ（１０-6Ｍ、３７℃、６０分）（ｆＭＬＰ）を用
いてプレインキュベートした。次に、ｆＭＬＰ（１０-6Ｍ）またはケモカインＲ
ＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ−１（１ｇ／ｍｌ）に応答するＣａ2+動員を測定した。
【図４】 図４（Ａ〜Ｅ） ｆＭＬＰはＣＣＲ５発現をダウンレギュレートする 異なる試薬を用いてインキュベートした単球を、ＦＩＴＣ結合抗ＣＣＲ５モノ
クローナル抗体（２Ｄ７）で染色し、陽性染色された個体群のパーセンテージに
関して、フローサイトメトリーにより分析した。パネル（Ａ）では、培地を用い
て細胞をインキュベートし、次にＦＩＴＣ結合マウスＩｇＧで染色した。パネル
（Ｂ）では、培地を用いて細胞をインキュベートし、次にＦＩＴＣ抗ＣＣＲ５で
染色した。パネル（Ｃ）では、ＭＩＰ−１（１ｇ／ｍｌ、３７℃、１５分）で細
胞を処理し、次にＦＩＴＣ抗ＣＣＲ５で染色した。パネル（Ｄ）では、ｆＭＬＰ
（１０-6Ｍ、３７℃、６０分）で細胞を処理し、次にＦＩＴＣ抗ＣＣＲ５で染色
した。パネル（Ｅ）では、スタウロスポリン（１．４ｎｇ／ｍｌ、３７℃、３０
分）で細胞を前処理し、その後ｆＭＬＰ（１０-6Ｍ、３７℃、６０分）で処理し
た後、ＦＩＴＣ抗ＣＣＲ５で染色した。
【図５】 図５（Ａ〜Ｄ） ＦＰＲクラス受容体の活性化は単球指向性ＨＩＶ−１エンベロープ融合および
ウイルス感染を抑制する パネル（Ａ）では、ＦＰＲｃＤＮＡで安定的に同時トランスフェクトされたＨ
ＯＳ／ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞を、ＭＩＰ−１（１ｇ／ｍｌ、３７℃、１分）また
はｆＭＬＰ（１０-6Ｍ、３７℃、６０分）で処理し、その後、抗ホスホセリン抗
体を用いた免疫沈降および抗ＣＣＲ５抗体を用いたイムノブロッティングにより
ＣＣＲ５リン酸化に関して調べた。パネル（Ｂ）：ＨＩＶ−１ Ｂａｌ ３１由
来のエンベロープタンパク質をコードする組換えワクシニアに感染させたＨｅＬ
ａ細胞を、（ＦＰＲ／ＣＣＲ５／ＣＤ４）を用いてまたはＦＲＲ（Ｍｏｃｋ／Ｃ
ＣＲ５／ＣＤ４）を用いずに、ＨＯＳ／ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞と融合させた。ｅ
ｎｖ−発現ＨｅＬａ細胞および標的細胞を混合した際、ケモカイン（１０ｇ／ｍ
ｌ）またはｆＭＬＰを付加した。パネル（Ｃ）：ウシ胎仔血清の非存在下で４８
時間培養したヒト単球も、ｆＭＬＰの存在下または非存在下で、ＨＩＶ−１Ｂａ
ｌ ３１ｅｎｖを発現するＨｅＬａ細胞と融合させた。結果は、２つの別個の実
験からの平均（±ＳＤ）である。（*）は、ガラクトシダーゼの有意な低減を表
す。パネル（Ｄ）：マクロファージのＨＩＶ−１感染後のＨＩＶ−１ｐ２４タン
パク質の発現。ｒｈＭ−ＣＳＦ誘導性末梢血マクロファージをｆＭＬＰに１時間
さらし、その後ＨＩＶJRFLに感染させた。４時間後、細胞を洗浄し、６日間培養
した。次に、酵素結合免疫吸着アッセイ法によりｐ２４の分析のために上清を収
集した。（*）は、ｐ２４産生の有意な低減を表す。ＣＤ４、ＣＣＲ５、および
ｆＭＬＰレポーターＦＰＲを用いてトランスフェクトしたＨＯＳ細胞でも、同様
の結果を得た。
【図６】 図６（ＡおよびＢ） Ｖ３ペプチドは食細胞移動を誘導する パネル（Ａ）は、Ｖ３ペプチドに応答したヒト食細胞移動の、コントロール培
地の自発的移動（*Ｐ＜０．０１）に対する増加倍数（走化性指数）を示す。（
Ｂ）は、百日咳毒素（ＰＴ）がＶ３ペプチド誘導性の細胞移動を抑制することを
示す。１００ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素（ＰＴ）を用いて３７℃で３０分間プレイ
ンキュベートした細胞を洗浄し、ｆＭＬＰおよびＶ３ペプチドにより誘導される
移動に関して調べた（*Ｐ＜０．０１、培地単独（Ｍｅｄｉｕｍ）を用いてイン
キュベートした単球の移動と比較）。
【図７】 図７（Ａ〜Ｈ） Ｖ３ペプチドは食細胞中のカルシウム動員を誘導する パネル（ＡおよびＢ）は、単球および好中球中のＣａ2+動員がＶ３ペプチドに
より誘導されることを示す。パネル（Ｃ〜Ｆ）は、単球におけるケモカイン誘導
性Ｃａ2+放出に及ぼすＶ３ペプチド（１．５μＭ）の作用を示す。パネル（Ｇお
よびＨ）は、単球および好中球中でのＶ３（１．５μＭ）誘導性シグナリングが
ｆＭＬＰ（１μＭ）により交差脱感作され得ることを示す。
【図８】 図８（ＡおよびＢ） Ｖ３ペプチドはＦＰＲ（ＥＴＦＲ）およびＦＰＲＬ１（ＦＰＲＬ１／２９３）
発現細胞中での移動およびＣａ2+放出を誘導する パネル（Ａ）は、ＦＰＲ受容体発現細胞がＶ３ペプチドに応答して移動するこ
とを示す。ｆＭＬＰは、コントロールとして用いた。パネル（Ｂ）は、Ｖ３ペプ
チドがＦＰＲＬ１／２９３ＥＴＦＲ細胞においてＣａ2+放出を誘導することを示
す。
【図９】 図９（Ａ〜Ｄ） Ｖ３ペプチドはケモカインに対する細胞応答を低減する Ｆｕｒａ−２を載せたした単球を、培地（培地）またはＶ３ペプチド（Ｖ３）
を用いて３７℃で６０分間、プレインキュベートした。洗浄後、ケモカイン（１
０ｎＭ）ＲＡＮＴＳ（Ａ）、ＳＤＦ−１（Ｂ）、ＭＣＰ−１（Ｃ）またはｆＭＬ
Ｐ（１０ｎＭ）（Ｄ）に応答するＣａ2+動員に関して、細胞を測定した。平行実
験では、細胞を先ずスタウロスポリン（２．５ｎｇ／ｍｌ、３７℃で３０分）で
、その後Ｖ３ペプチド（１．５μＭ、３７℃、６０分、Ｓｔａｕｒｏ＋Ｖ３）で
処理し、次にケモカインまたはｆＭＬＰに応答するＣａ2+放出に関して測定した
。
【図１０】 図１０（Ａ〜Ｈ） Ｖ３ペプチドおよびＳＡＡは単球中のＣＣＲ５のリン酸化を誘導する パネル（Ａ）は、ＭＩＰ−１βを１００ｎＭで用いて３７℃で異なる時間（分
）処理した単球を示す。パネル（Ｂ）は、異なる濃度のＭＩＰ−１βを用いて３
７℃で１分間処理した単球を示す。パネル（Ｃ）は、Ｖ３ペプチドまたはＭＩＰ
−１（１分）で処理した単球由来の全細胞溶解産物のイムノブロットを示す。抗
ＣＣＲ５抗体を用いた。パネル（Ｄ）は、異なる濃度のＶ３ペプチドを用いて３
７℃で６０分間処理した単球を示す。ＭＩＰ−１α（１００ｎＭ）およびＭＩＰ
−１β（１００ｎＭ）を用いて１分間処理した細胞を、コントロールとして用い
た。パネル（Ｅ）は、Ｖ３ペプチド（１．５μＭ）を用いて処理した単球を経時
的に示す。ＭＩＰ−１α（１００ｎＭ）で１分間、またはｆＭＬＰ（１μＭ）で
６０分間処理した細胞をコントロールとして用いた。パネル（Ｆ）は、ＭＩＰ−
１β（１００ｎＭ、３７℃で１分）またはＶ３ペプチド（１．５μＭ、６０分）
により誘導されるＣＣＲ５リン酸化に及ぼすスタウロスポリン（Ｓｔａｕｒｏ、
２．５ｎｇ／ｍｌ、３０分）の作用を示す。パネル（Ｇ）は、ＳＡＡを１０μｇ
／ｍｌを用いて３７℃で異なる時間（分）処理した単球を示す。パネル（Ｈ）は
、異なる濃度のＳＡＡを用いて、３７℃で６０分処理した単球を示す。挿入図版
は、抗ＣＣＲ５抗体を用いた２０μｇの全単球溶解産物のイムノブロッティング
を示す。
【図１１】 図１１（ＡおよびＢ） Ｗペプチドは、食細胞の移動を誘導する 異なる濃度のＷペプチドを走化性チャンバの下部ウエルに入れて、細胞懸濁液
を上部ウエルに入れた。ポリカルボネートフィルターにより、上部および下部ウ
エルを分離した。インキュベーション後、フィルターを通って移動した細胞を染
色し、計数した。パネル（Ａ）は、Ｗペプチドに応答する単球および好中球移動
の、コントロール培地に対する増加倍数を示す。１．８より大きい走化性指数は
、化学誘引物質の非存在下での自発的な移動と比べて統計学的に有意である。パ
ネル（Ｂ）は、１００ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素（ＰＴ）またはコレラ毒素（ＣＴ
）を用いた３７℃で３０分間の細胞の前処理によりＷペプチドに応答する単球移
動の抑制を示す。ＨＩＶ−１エンベロープｇｐ４１のＦＰＲＬ１刺激ペプチドド
メインであるペプチドＴ２１をコントロールとして用いた（*Ｐ＜０．０１、培
地単独を用いてインキュベートした細胞の移動との比較）。
【図１２】 図１２（Ａ〜Ｈ） Ｗペプチドは食細胞中のカルシウム（Ｃａ2+）動員を誘導する ヒト単球または好中球にＦｕｒａ−２を載せし、次に種々の濃度のＷペプチド
パネルで刺激した（ＡおよびＥ）。３４０および３８０ｎｍ波長での蛍光の比を
記録し、ＦＬＷｉｎＬａｂプログラムを用いて算出した。Ｗペプチドの脱感作は
、単球パネル（ＢおよびＣ）または好中球パネル（ＦおよびＧ）におけるｆＭＬ
ＰによるＣａ2+放出を誘導した。この脱感作を、アゴニストおよび逆のパネル（
ＤおよびＨ）を用いて細胞を連続刺激することにより測定した。
【図１３】 図１３（Ａ〜Ｈ） ＷペプチドはＥＴＦＲおよびＦＰＲＬ１／２９３細胞中のカルシウム動員を誘
導する ＥＴＦＲ細胞（上方パネル）およびＦＰＲＬ１／２９３細胞（下方パネル）を
用いて、ｆＭＬＰ（パネル（ＡおよびＥ））またはＷペプチド（パネル（Ｂおよ
びＦ））により誘導されるＣａ2+放出を評価した。パネル（Ｃ、Ｄ、ＧおよびＨ
）は、ＷペプチドおよびｆＭＬＰ間の細胞シグナリングの交差脱感作を示す。
【図１４】 図１４（Ａ〜Ｃ） ＷペプチドはＷペプチドに応答するＦＰＲＬ１／２９３およびＥＴＦＲ細胞の
移動を誘導する パネル（ＡおよびＢ）は、コントロール培地に対する、ＷペプチドまたはｆＭ
ＬＰに応答するＦＲＰＬ１／２９３細胞またはＥＴＦＲ細胞移動の増加倍数（走
化性指数（ＣＩ））を示す。１．８より大きいＣＩは、化学誘引物質の非存在下
での自発的な細胞移動に比して統計学的に有意であった。パネル（Ｃ）は、１０
０ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素（ＰＴ）を用いた３７℃で３０分間の細胞の前処理に
よりＷペプチドに応答するＦＰＲＬ１／２９３細胞移動の抑制を示す（*Ｐ＜０
．０１、培地のみを用いてインキュベートした細胞の移動と比較）。
【図１５】 ＷペプチドはＥＴＦＲまたはＦＰＲＬ１／２９３細胞に結合される3Ｈ−ｆＭ
ＬＰを置換し得る 異なる濃度の非標識ｆＭＬＰまたはＷペプチドの存在下で3Ｈ−ｆＭＬＰ（０
．２ｎＭ）を用いて３７℃で３０分間、細胞のアリコート（２ｘ１０6／２００
μｌ）をインキュベートした。次に氷冷ＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理食塩水）で
細胞を洗浄し、ワットマンディスク上で濾過した。β係数器を用いて、細胞に関
連した放射能を測定した。３つの実験を実施し、同様の結果を得た。
【図１６】 図１６（ＡおよびＢ） ＷペプチドはＨＩＶ感染を抑制する ＣＤ４／ＣＣＲ５／ＦＰＲＬ１受容体を発現する宿主細胞を先ずＷペプチドを
用いて指定濃度で１時間処理し、その後ＨＩＶ−１JRFLを用いて１時間感染させ
た。感染細胞を培地で３回洗浄し、培養中に入れた。感染後４８時間および７２
時間目にＥＬＩＳＡによりｐ２４のレベルを測定した。パネル（Ａ）は、ＨＩＶ
感染の初期段階でのＷペプチド（１０-5Ｍ）にさらすことは、ＦＰＲＬ１トラン
スフェクタントにおけるＨＩＶ−１感染性を有意に低減するが、しかし偽トラン
スフェクト細胞ではそうでないことを示す。パネル（Ｂ）は、Ｗペプチドが１０ -11 Ｍという低い濃度でＨＩＶ−１感染性を低減し得ることを示す。これらの実
験は三重反復試験で実施したものであり、示されたデータは一実験の知見を表す
。*Ｐは０．０１またはそれ未満である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/04 Ａ６１Ｐ 37/06 ４Ｃ０８７ 37/06 43/00 １２１ ４Ｈ０４５ 43/00 １２１ Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 33/569 Ｈ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 レ，インイン アメリカ合衆国 メリーランド 21702 フレデリック ヤング プレイス 811 (72)発明者 ゴン，ワンファ アメリカ合衆国 メリーランド 21702 フレデリック リー プレイス 401 (72)発明者 リー，バオ クン アメリカ合衆国 メリーランド 21703 フレデリック ゴールドスパイア サーク ル 506 (72)発明者 ロジャーズ，トーマス ジェイ． アメリカ合衆国 ペンシルヴェニア 19454 ノース ウェールズ ウェストミ ンスター ドライブ 112 (72)発明者 マーフィー，フィリップ アメリカ合衆国 メリーランド 20850 ロックビル ハスティングス サークル 10 (72)発明者 オッペンハイム，ジュースト ジェイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20817 ベセズダ ウィンターベリー プレイス 7601 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 DA77 FB03 4B063 QA18 QQ79 QR59 QR77 QR80 QS24 QS28 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 BA01 BA02 BA08 BA09 BA18 CA59 DC50 MA13 MA17 MA28 MA31 MA43 MA52 MA55 MA56 MA60 MA66 ZB082 ZB092 ZB332 ZC752 4C085 AA38 EE06 FF13 GG02 GG03 GG04 GG05 GG06 GG08 4C087 AA01 AA02 BB33 MA13 MA17 MA28 MA31 MA43 MA52 MA55 MA56 MA60 MA66 NA14 ZB08 ZB09 ZB33 ZC75 4H045 AA10 AA30 BA14 BA18 CA40 EA22 EA50 FA20

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＦＰＲクラス受容体に結合したＶ３ペプチド（配列番号３）
    、またはその保存的バリアントもしくは機能性断片に対応する配列を有する結合
    パートナーを含む単離された複合体。
  2. 【請求項２】 ＦＰＲクラス受容体に結合したＷペプチド（配列番号１）ま
    たはその保存的バリアントもしくは機能性断片に対応する配列を有する結合パー
    トナーを含む単離された複合体。
  3. 【請求項３】 被験体において宿主免疫応答を誘導する方法であって、以下
    の工程： ＦＰＲクラス受容体と相互作用する作用物質を必要とする被験体を同定する
    工程と、 前記被験体においてＦＰＲクラス受容体に対して治療に有効な量のＶ３ペプチド
    （配列番号３）またはその保存的バリアントもしくは機能性断片を標的化する工
    程とを含む方法。
  4. 【請求項４】 被験体における宿主免疫応答の誘導方法であって、以下の工
    程： ＦＰＲクラス受容体と相互作用する作用物質を必要とする被験体を同定する
    工程と、 前記被験体においてＦＰＲクラス受容体に対して治療に有効な量のＷペプチ
    ド（配列番号１）またはその保存的バリアントもしくは機能性断片を標的化する
    工程 とを含む方法。
  5. 【請求項５】 ＣＣＲ５受容体のリン酸化の誘導方法であって、以下の工程
    ： リン酸化したＣＣＲ５受容体を誘導する量の、ＦＰＲクラス受容体に結合す
    る結合パートナーを、ＦＰＲクラス受容体およびＣＣＲ５受容体を有する細胞に
    提供する工程と、 リン酸化したＣＣＲ５受容体の量を測定する工程とを含む方法。
  6. 【請求項６】 細胞表面上のＣＣＲ５受容体の量をダウンレギュレートする
    方法であって、以下の工程： ダウンレギュレートされたＣＣＲ５受容体を誘導する量の、ＦＰＲクラス受容体
    に結合する結合パートナーを、ＦＰＲクラス受容体およびＣＣＲ５受容体を有す
    る細胞に提供する工程と、 該細胞表面でのＣＣＲ５受容体の量を測定する工程とを含む方法。
  7. 【請求項７】 ＨＩＶ融合を抑制する方法であって、以下の工程： ＨＩＶ融合を抑制する量の、ＦＰＲクラス受容体に結合する結合パートナーを
    、 ＦＰＲクラス受容体およびＣＣＲ５受容体を有する細胞に提供する工程と、 該細胞とＨＩＶとの融合の抑制を測定する工程とを含む方法。
  8. 【請求項８】 被験体における宿主免疫応答の抑制方法であって、 ＦＰＲクラス受容体と結合するが、ＦＰＲクラス受容体を活性化しないＶ３ペ
    プチド擬似体を、治療に有効な量、前記被験体に提供する工程を含む方法。
  9. 【請求項９】 被験体における宿主免疫応答の抑制方法であって、ＦＰＲク
    ラス受容体と結合するが、ＦＰＲクラス受容体を活性化しないＷペプチド擬似体
    を、治療に有効な量、前記被験体に提供することを含む方法。
  10. 【請求項１０】 ＨＩＶ感染を抑制するＦＰＲクラス受容体に対する結合パ
    ートナーを同定する方法であって、以下の工程： ＣＣＲ５受容体およびＦＰＲクラス受容体を有する細胞を提供する工程と、 前記細胞を結合パートナー候補と接触させる工程と、 仮に、該結合パートナー候補がＦＰＲクラス受容体と結合し、ＣＣＲ５のリン
    酸化を誘導する場合には、該結合パートナー候補を該結合パートナーとして同定
    する工程とを含む方法。
  11. 【請求項１１】 ＨＩＶ感染を抑制するＦＰＲクラス受容体に対する結合パ
    ートナーを同定する方法であって、以下の工程： ＣＣＲ５受容体およびＦＰＲクラス受容体を有する細胞を提供する工程と、 前記細胞を結合パートナー候補と接触させる工程と、 仮に、該結合パートナー候補がＦＰＲクラス受容体と結合し、該細胞表面でＣ
    ＣＲ５受容体のダウンレギュレーションを誘導する場合には、該結合パートナー
    候補を結合パートナーとして同定する工程とを含む方法。
  12. 【請求項１２】 ＨＩＶ感染を抑制するＦＰＲクラス受容体に対する結合パ
    ートナーを同定する方法であって、以下の工程： ＣＣＲ５受容体およびＦＰＲクラス受容体を有する細胞を提供する工程と、 前記細胞を結合パートナー候補と接触させる工程と、 仮に、該結合パートナー候補がＦＰＲクラス受容体と結合し、ＨＩＶとの融合
    を抑制する場合には、該結合パートナー候補を結合パートナーとして同定する工
    程とを含む方法。
  13. 【請求項１３】 Ｖ３ペプチド様アジュバントを同定する方法であって、以
    下の工程： ＦＰＲクラス受容体を有する細胞を提供する工程と、 前記細胞を候補Ｖ３ペプチド様アジュバントと接触させる工程と、 仮に、該候補Ｖ３ペプチド様アジュバントがＦＰＲクラス受容体を活性化する
    場合には、該候補Ｖ３ペプチド様アジュバントをＶ３ペプチド様アジュバントと
    して同定する工程とを含む方法。
  14. 【請求項１４】 Ｗペプチド様アジュバントを同定する方法であって、以下
    の工程： ＦＰＲクラス受容体を有する細胞を提供する工程と、 前記細胞を候補Ｗペプチド様アジュバントと接触させる工程と、 仮に、該候補Ｗペプチド様アジュバントがＦＰＲクラス受容体を活性化する場
    合には、該候補Ｗペプチド様アジュバントをＷペプチド様アジュバントとして同
    定する工程とを含む方法。
  15. 【請求項１５】 Ｖ３ペプチド様免疫抑制剤を同定する方法であって、以下
    の工程： ＦＰＲクラス受容体を有する細胞を提供する工程と、 前記細胞を候補Ｖ３ペプチド様免疫抑制剤と接触させる工程と、 仮に、該候補Ｖ３ペプチド様免疫抑制剤がＦＰＲクラス受容体の活性化を抑制
    する場合には、該候補Ｖ３ペプチド様免疫抑制剤をＶ３ペプチド様免疫抑制剤と
    して同定する工程とを含む方法。
  16. 【請求項１６】 Ｗペプチド様免疫抑制剤を同定する方法であって、以下の
    工程： ＦＰＲクラス受容体を有する細胞を提供する工程と、 前記細胞を候補Ｗペプチド様免疫抑制剤と接触させる工程と、 仮に、該候補Ｗペプチド様免疫抑制剤がＦＰＲクラス受容体の活性化を抑制す
    る場合には、該候補Ｗペプチド様免疫抑制剤をＷペプチド様免疫抑制剤として同
    定する工程とを含む方法。
  17. 【請求項１７】 局所投与のための薬学的担体中に、請求項１０、１１また
    は１２により同定された結合パートナーを含む医薬品。
  18. 【請求項１８】 アジュバントとして作用する医薬品の製造方法であって、
    薬学的担体中に請求項１３または１４記載のＶ３ペプチド様アジュバントまたは
    Ｗペプチド様アジュバントを組み込む工程を含む方法。
  19. 【請求項１９】 免疫抑制剤として作用する医薬品の製造方法であって、薬
    学的担体中に請求項１５または１５記載のＶ３ペプチド様アジュバントまたはＷ
    ペプチド様アジュバントを組み込むことを含む方法。
  20. 【請求項２０】 ＨＩＶ感染を抑制する医薬製品の製造方法であって、以下
    のこと： 結合パートナーを提供することと、 ＦＰＲクラス受容体およびＣＣＲ５受容体を有する細胞を提供することと、 該細胞上で該結合パートナーがＦＰＲクラス受容体と相互作用するのを可能に
    する条件下で該細胞を該結合パートナーと接触させることと、 ＣＣＲ５受容体のリン酸化の有無を同定することと、 リン酸化ＣＣＲ５が存在する場合に、医薬製中に該結合パートナーを組み込む
    こと とを含む方法。
  21. 【請求項２１】 ＨＩＶ感染を抑制する医薬品の製造方法であって、以下の
    こと： 結合パートナーを提供することと、 ＦＰＲクラス受容体およびＣＣＲ５受容体を有する細胞を提供することと、 該細胞上で該結合パートナーがＦＰＲクラス受容体と相互作用しうる条件下で
    該細胞を該結合パートナーと接触させることと、 該細胞表面でのＣＣＲ５受容体の有無を同定することと、 該細胞表面にＣＣＲ５が存在しない場合に、医薬品中に該結合パートナーを組
    み込むことを含む方法。
  22. 【請求項２２】 ＨＩＶ感染を抑制する医薬製品の製造方法であって、以下
    のこと： 結合パートナーを提供することと、 ＦＰＲクラス受容体およびＣＣＲ５受容体を有する細胞を提供することと、 該細胞上で該結合パートナーがＦＰＲクラス受容体と相互作用しうる条件下で
    該細胞を該結合パートナーと接触させることと、 ＨＩＶ感染の有無を同定することと、 ＨＩＶ感染がない場合に、医薬品中に該結合パートナーを組み込むことを含む
    方法。
  23. 【請求項２３】 ＣＣＲ５受容体およびＦＰＲクラス受容体を発現するよう
    にトランスフェクトされた細胞。
  24. 【請求項２４】 ＦＰＲクラス受容体を発現するようにトランスフェクトさ
    れたＣＣＲ５受容体を発現する細胞。
  25. 【請求項２５】 ＣＣＲ５受容体を発現するようにトランスフェクトされた
    ＦＰＲクラス受容体を発現する細胞。
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