CN1575299A - 导向多肽 - Google Patents

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Abstract

一种与滑膜组织结合的多肽，含有一个包括RLP，SPS，HSS，LSS，TWS，YSS，NQR，DRL或DRH的氨基酸基序。较佳的基序包括HPRLPFA，APNWRLP，SPSPFRA，SPSRFDQ，VSPSRTT，PLSSAQR，TWSATST，THSSATQ，HTHSSNL，PNHSSPH，ADHSSRH，SDYSSRS，QTHNQRY，TNQRLAI，KSTHDRL，PFHDRHS，HPSDRLS或DRLNHQF。也提供一种能够与来源于第一种哺乳动物的组织结合的多肽的鉴定方法，方法包括以下步骤：将来自第一种哺乳动物的组织移植到具有减弱免疫反应的第二种哺乳动物的受试动物体内；将多种多肽导入第二种动物体内；以及测定多肽在第二种动物体内的定位。

Description

导向多肽
本发明涉及人组织靶向释放系统，尤其涉及用于位点特异性释放的多肽及其鉴定方法。
非特异性系统疗法对许多病变主要发生在特定器官的病情的疗效并不理想，比如类风湿性关节炎，牛皮癣，肠炎及其它退行性或炎症类疾病。对这些情况，普遍采用的疗法不但没有明显疗效还会带来副作用。如果可以将药物直接释放到疾病位点将会极大改进现行的疗法。
微血管内皮(MVE)在类风湿性关节炎(RA)病理中起着主要作用，是一个重要的治疗靶位。RA是一种由软骨和骨头损伤导致进行性关节破坏而引发的增生性滑膜炎(参考文献目录1、2)。RA滑膜炎早期的典型症状是新血管的花状萌芽(新血管发生)，暗示这是病理学上的一个关键因素(参考文献目录3)。在疾病确立慢性期，MVE作为炎症细胞从血液流向关节的通道也很重要(参考文献目录4、5)。外渗过程是一个复合现象，它通过一系列整合粘附和信号事件来调控，包括细胞表面粘附因子(CAMs)和趋化因子(CK)的相互作用(参考文献目录6、7)。除适用于所有白细胞类型的基本机制外，有证据表明：分别表达在迁移淋巴细胞表面和不同组织MVE上的“归巢受体”和“血管地址素”的特异性配对对不同类型的白细胞募集到不同的组织发挥作用(参考文献目录8、9)。L-选择蛋白和GlyCAM两者间及α4β7和MAdCAM-1两者间的优先相互作用已被充分阐明，它们分别促进淋巴细胞迁移到外周淋巴结和肠道上的位点(参考文献目录10-13)。此外，CK和CK受体(TARC-CCR4和TECK-CCR9)的配对协同“归巢”CAMs(CLA和α4β7)分别促进淋巴细胞迁移到皮肤和胃肠道组织(参考文献目录14、15)。已知，除淋巴组织，胃肠道，肺，皮肤和关节也需要优先循环途径(参考文献目录16、17)。
然而，关节特异性MVE“地址素”的鉴定十分困难，至少一部分原因是难以分离到纯的滑膜内皮细胞群。更重要的是，体外培养MVE细胞会引起去分化，伴随着重要的组织特异性性状，如脑MVE紧密连接或胃肠道MVE表达MAdCAM-1的丢失(参考文献目录18-21)。因此，以微环境中的MVE为靶标对确定组织特异性配体十分重要。随机多肽的噬菌体展示(参考文献目录22-24)和抗体片段库(参考文献目录25-27)的发展使精确导向不同组织的MVE的设想在动物体内成为可能。而且，Ruoslahti及同事已经成功的为小鼠七个被探测的器官和肿瘤微管组织各至少得到了一种特异性归巢多肽(参考文献目录28、29)。此外，有文献报道，在体内模型中，特异性导向多肽可以作为导向手段，使药物集中于某一组织(参考文献目录29-31)。类似的方法已用单链可变区(sFv)的噬菌体展示(sFv-PDL)在小鼠体内分离其胸腺内皮特异性抗体(参考文献目录32)。最近，据报道，一种限制性环状RGD多肽，可结合到αvβ3和αvβ5(共价结合到一个14氨基酸的凋亡前体多肽)，它的噬菌体展示可以导向发炎的滑膜并抑制胶原蛋白诱导的关节炎(参考文献目录33)。
此技术应用于人体时受到了阻碍，由于技术上的原因和体内筛选带来的伦理问题。然而，将人组织移植到恶性复合免疫缺陷症(SCID)小鼠体内是一种可行的方法。发明人已成功地采用这个模型移植了人滑膜，皮肤，淋巴和胎儿肠道组织(参考文献目录34-36)。移植体存活，并通过小鼠皮下血管和移植体微管组织联结发生血管化。抗体和人的细胞经小鼠体循环释放到移植体，可见这种联结是开放性的也是有功能的(参考文献目录34)。更重要的是，移植体MVE维持人粘附分子的表达，在联结附近形成一个过渡区，相邻表达人和小鼠的CAMs，这种表达可以通过移植体内注射细胞因子上调(参考文献目录34)。最后，移植体MVE在其正常微环境中存活，促进组织特异性血管性状的维持。
上面提到的以前的工艺都没有提出一种多肽筛选方法，适用于鉴定能够导向人组织的多肽。本发明的一个目的就是提供这样一种方法及其产物。
本发明的一个方面相应提供了一种滑膜组织结合多肽，含有一个氨基酸序列基序，包括RLP，SPS，HSS，LSS，TWS，YSS，NQR，DRL或DRH。
这里的“滑膜组织结合多肽”指一种多肽，全身给药后能够特异性结合并优先定位到滑膜组织。这里的“基序”指多肽的一部分，可以用一段氨基酸序列限定，具有多肽功能上的特异性，特别是结合特异性。整个专利说明书中出现的氨基酸用标准单字母系统表示。
基序可以包括SPSRF。或者，包括(T或D)HSS(A或R)(T或H)。作为进一步可选择的基序可包括HDRL。优选的基序包括HPRLPFA，APNWRLP，SPSPFRA，SPSRFDQ，VSPSRTT，PLSSAQR，TWSATST，THSSATQ，HTHSSNL，PNHSSPH，ADHSSRH，SDYSSRS，QTHNQRY，TNQRLAI，KSTHDRL，PFHDRHS，HPSDRLS或DRLNHQF。
根据本发明的多肽，其长度较佳为3-1000个氨基酸，3-100个氨基酸更好，3-20个氨基酸最好。多肽的基序和/或多肽的其余部分可以含有化学修饰的氨基酸，前提是，对基序的任何修饰都不会影响其功能上的特征。多肽的功能同源物也属于本发明的范围。“功能同源物”指一种多肽，它保留原肽的滑膜组织结合活性，且含有一个基序，和原肽的基序相比，较佳至少有60％的同源性，更好至少有80％的同源性，甚至更好至少有90％的同源性，最好有95％的同源性。功能同源物间氨基酸的变化最好是保守的，即用同一个家族的一个氨基酸取代另一个氨基酸，这些氨基酸的支链是相关的。
多肽可以是线性的或者是环状的。当多肽是线性的，其基序的一个或两个末端可以含有一个或多个含硫氨基酸。含硫氨基酸可以是C或M。
多肽较佳是环状的。
在一些实施例中，多肽含有一对能够促进多肽发生分子内环化的氨基酸。配对的氨基酸较佳位于基序相反末端的方向上，更好位于基序相反的末端。氨基酸配对引起的多肽环化，可以是一部分多肽也可以是整个多肽。较佳地是整个基序，更好地是整个多肽环化。氨基酸对较佳是C和C，C和M或M和M。在一个较佳的实施例中，基序是C-HPRLPFA-C，C-APNWRLP-C，C-SPSPFRA-C，C-SPSRFDQ-C，C-VSPSRTT-C，C-PLSSAQR-C，C-TWSATST-C，C-THSSATQ-C，C-HTHSSNL-C，C-PNHSSPH-C，C-ADHSSRH-C，C-SDYSSRS-C，C-QTHNQRY-C，C-TNQRLAI-C，C-KSTHDRL-C，C-PFHDRHS-C，C-HPSDRLS-C或C-DRLNHQF-C，其中，C-和-C分别独立代表任何种类或数目的两侧半胱氨酸间的氨基酸基序之前或之后的氨基酸，其数目较佳小于20，更好为0。在一个特别优选的实施例中，基序是C-KSTHDRL-C。
滑膜组织结合多肽可以含有以上所列基序中的任何一个氨基酸序列。
多肽可以和一种药物试剂或诊断试剂偶联，药物试剂较佳是一种抗炎的，细胞稳态的，细胞毒性的或免疫抑制的化合物。或者，药物试剂是一种编码具有抗炎的，细胞稳态的，细胞毒性的或免疫抑制性质的多肽的基因。诊断试剂较佳适用于诊断成像，例如包括不透放射染料，荧光染料和放射性核素。
药物试剂或诊断试剂可以通过接头组与多肽偶联，该接头组较佳是一个可弯曲的部分，正如受本领域技术人员赏识的，又较佳是由一段氨基酸臂组成。该接头组较佳的是在适合条件下可水解，这样，到达滑膜上的靶位后，试剂就可以从多肽上释放出来。
本发明的多肽能够优先定位到滑膜组织，可用于建立位点特异性释放系统治疗疾病，如一般与滑膜关节有关的风湿性疾病。多肽可以用标准液相或固相多肽合成技术制备并可以偶联到如药物试剂或诊断试剂上，使这些试剂位点特异性释放。这种手段允许使用较高全身剂量的药物试剂或诊断试剂，同时将试剂在滑膜外的其它组织引起的副作用维持在耐受水平。
由于这些多肽能够定位到滑膜MVE，它们可能也通过抑制炎症细胞在滑膜区的聚集而具有内在的治疗潜力。多肽的有效剂量范围可以由本领域的普通技术人员使用标准技术方便地测定。有效剂量范围较佳是约0.005-5毫克/千克体重，更好的范围是约0.5-5毫克/千克体重。本发明的多肽较佳的通过静脉给药来释放。
因此，在另一个方面，本发明提供一种如上所述的多肽，可用于治疗。
在进一步的方面，本发明提供如上所述的多肽的应用，用于制备一种治疗或预防炎性和/或退行性关节病的药物。
在另一个方面，本发明提供如上所述的多肽的用途，用于制备一种诊断炎性和/或退行性关节病的组合物。
本发明的多肽也可通过一种标准筛选技术鉴定特异性的滑膜配体。一旦滑膜配体确定，就可能成为治疗靶点。
还在另一个方面，本发明提供一种包括如上所述多肽的药物或诊断组合物。本发明的药物或诊断组合物包括一种或多种本发明的多肽和任何药用载体，佐剂或介质。本发明的药物组合物可用的药用载体，佐剂或介质包括，但不仅仅限于，离子交换剂，铝盐，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清白蛋白，缓冲物如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾酯，部分酯化的饱和植物脂肪酸甘油酯混合物，水，盐或电解质，如鱼精蛋白硫酸盐，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，二氧化硅胶体，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素类物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂。
本发明的药物或诊断组合物可以通过口服，非胃肠道，喷雾吸入，或者通过植入储存器的方式给药。较佳是通过注射肠胃外给药。本发明的药物或诊断组合物可以含有任何常规的无毒药用载体，佐剂或介质。这儿的肠胃外包括皮下，皮内，静脉，肌内，关节内，滑膜内，胸骨内，鞘内，病灶内和颅内注射或融合技术。
药物或诊断组合物可以是一种无菌注射剂，如一种无菌注射的水或油的悬液。这种悬液可以按已知工艺的技术进行配方，使用合适的分散剂或润湿剂(如例子中用的吐温80)和悬浮剂。灭菌注射剂也可以是灭菌可注射的无毒药用稀释剂或溶剂的溶液或悬液，如1，3-丁二醇溶液。载体和溶剂可以是甘露糖醇，水，林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油类一般作为溶剂或悬浮介质。因此，任何温和的固定油均可被采用，包括合成的单或二甘油酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物均可用于制备注射剂。还有天然的药用油，如橄榄油或蓖麻油，特别是它们的聚氧乙烯酯的形式。这些油溶液或悬浮液也可以含一种长链醇稀释剂或分散剂，如Ph.Helv或类似的醇。
本发明的药物或诊断组合物可以以口服任何可接受的剂量形式给药，包括但不仅仅限于胶囊，片剂和水悬液或溶液。若为口服片剂，载体普遍使用乳糖或玉米淀粉，并加入润滑剂，如硬脂酸镁。若为口服胶囊，使用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。若为口服水悬液，活性成分与乳化剂和悬浮剂结合，需要的话可加入甜味剂和/或香味剂和/或色素。
本发明的药物或诊断组合物可通过鼻腔气雾剂或吸入剂给药。这些组合物可以根据成熟的药物配方工艺技术制备，制成生理盐水溶液，加入苄醇或其它适合的防腐剂，可提高生物利用度的助吸收剂，氟化碳，和/或其它增溶剂或分散剂。
这些组合物，特别在肠胃外给药时，优选配制为脂质体。脂质体优选含有一种或多种天然的较佳是中性的磷脂，如在卵磷脂中发现的磷脂。多肽较佳在脂质体的外表面，可以特异性导向滑膜组织。
在另一个方面，本发明也提供编码上述多肽的核苷酸序列。在相关方面，本发明也提供含这样的核苷酸序列的载体及其转化的细胞，在相关方面，也提供相应的抗体或其片段，可与本发明的多肽结合。
更在另一个方面，本发明提供一种鉴定多肽的方法，这种多肽能够结合到来自第一种动物的组织上，该方法包括以下步骤：
i).将来自第一种动物的组织移植到具有减弱免疫反应的第二种动物的受试动物体内；
ii).将多种多肽导入第二种动物体内；以及
iii).测定多肽在第二种动物体内的定位。
此方法中所用的第一种动物和第二种动物是不同的种属。
在本方法的一个较好的实施例中，多肽和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式被导入第二种动物体内。该噬菌体较佳是M13噬菌体。外壳蛋白较佳是pIII。获得这种融合蛋白的方法参见参考文献目录22-24。
本发明的方法中所用的多肽可以含有一对能够促进多肽发生分子内环化的氨基酸。配对的氨基酸较佳位于基序相反末端的方向上，更好是位于基序相反的末端。多肽的环化，可以是一部分多肽也可以是整个多肽，较佳是整个多肽环化。配对的氨基酸较佳是C和C，C和M或M和M。多肽可以在体外随机合成。
在本方法的实施例中，多肽以和噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白的形式导入，多肽较佳由噬菌体复制合成，编码多肽的核苷酸序列已事先被插入噬菌体基因组。用这种方式获得多肽的方法参见参考文献目录22-24。
动物可以是有体循环的任何动物，包括哺乳类，鸟类和两栖动物，较佳是哺乳动物。第一种动物较佳是人。组织可以包括胃肠道，皮肤，关节或淋巴组织。组织较佳包括滑膜组织。第二种动物较佳是啮齿类，最好是小鼠。受试动物较佳患有恶性复合免疫缺陷症。
本发明的方法使对能够导向特异组织类型的多肽的快速确定成为可能。因此，该法可用于鉴定某些多肽，这些多肽可针对一系列的病情，也就是病变主要定位于特定的器官，有助于治疗，或者有助于药物试剂或诊断试剂的定位。这些病情，如牛皮癣，肠炎或恶性肿瘤。有利的证据表明，每一种病情都会偏好表达组织特异性血管决定子。本法的新颖性基于这样一个事实，第一种动物，比如人的靶标，可以在移植到第二种动物体内的活的组织中鉴定。这与以前的靶标确定方法，将多肽简单注射到小鼠体内然后器官分析，是有显著不同的。
本发明将以实施例详细说明并参见下面的附图，其中：
图1显示：
a)人滑膜组织移植到SCID小鼠四周后的外观。移植体是健康的，清晰可见小鼠血管滋养移植体(箭头)
b)人滑膜特异性噬菌体体内选择。将pep-PDL(1×1011pfu)注射SCID小鼠尾静脉，此小鼠为人滑膜和皮肤组织的双移植小鼠(2+2移植体/动物)。注射15分钟后，对小鼠实施心脏灌流，从移植体和小鼠肾脏回收噬菌体。仅滑膜移植体的噬菌体被扩增，并将这些噬菌体重新注射小鼠，再富集两轮。Strep-clone-1噬菌体作为阴性对照。经3轮体内选择回收的噬菌体数目如图所示。小鼠肾脏作为鼠对照组织。误差栏显示平均值标准差，平均值由两次独立实验各三次平板计数得到(n＝2动物/实验条件)。较之第一轮选择和strep-clone-1噬菌体对照，在滑膜组织的第二，三轮富集，可以见到显著的统计学差异，ns P＝0.48，**P＝0.0004，***P＜0.0001。在皮肤移植体，小鼠肾脏中的连续富集，以及对strep-cione-1时菌体的实验，都没有显著差异，P＞0.05(不对称两侧t检验)。
c)人滑膜特异性噬菌体体内选择。将pep-PDL(1×1011pfu)注射SCID小鼠尾静脉，该小鼠为人滑膜单移植小鼠(2移植体/动物)。其它实验条件与b)相同，但体内选择循环增加到4轮。每轮循环后回收的噬菌体数目(pfu/克组织)如图所示。误差栏显示平均值标准差，平均值由两次独立实验各三次平板计数得到(n＝2动物/实验条件)。较之第一轮，第三，四轮富集可以见到显著的统计学差异，ns P＝0.25，**P＝0.0086，***P＜0.0001，在strep-clone-1噬菌体对照未见差异，P＝0.055(不对称两侧t检验)；
图2显示特异性导向噬菌体显著定位到滑膜移植体的MVE。图示多肽噬菌体在滑膜移植体和小鼠肾脏的组织学定位，通过抗M-13噬菌体外壳蛋白抗体和种属特异性微管标记物的免疫组化试验在荧光显微镜下检测。显示的是第四轮筛选后具有代表性的微观图(冷冻组织与图1b中的样品相同且等量)。(a)中清晰可见不连续的M13染色，(c)中没有显示同型匹配无关抗体染色。M13染色与用抗人vWf-FITC多抗显色的人微管结构有典型的共定位现象(b和d)。而M13免疫反应性(e)未显示用抗鼠CD31-FITC二抗显色的移植体中的小鼠微管结构(f)有共定位现象。类似的，同一小鼠的肾脏切片的肾小球毛细血管未显示M13免疫反应性(图2g)，而鼠CD31显示阳性(图2h)。标尺线＝50μm；
图3显示从滑膜移植体回收得到的多肽噬菌体在双移植动物体内也有组织导向特异性。在(a)图中，第三轮体内选择后的滑膜导向多肽噬菌体(见图1b)被注射到人皮肤和滑膜双移植的SCID小鼠的尾静脉(1×1011pfu)，样品来自一骨关节炎(OA)患者。同浓度的strep-clone-1噬菌体作为无关噬菌体对照。15分钟后从滑膜和皮肤移植体回收噬菌体，数量如图所示(pfu/克组织)。误差栏显示平均值标准差，平均值由两次实验各三次平板计数得到。在注射了滑膜导向多肽的动物体内，从滑膜移植体中回收的噬菌体数量较之于皮肤移植体有显著的统计学差异，***P＜0.0002(不对称两侧t检验)，与滑膜或皮肤移植体中回收的strep-clone-1噬菌体对照相比也有相似的差异。从皮肤移植体中回收的strep-clone-1噬菌体对照和滑膜导向噬菌体间无显著差异，P＝0.21(不对称两侧t检验)。(b)图中，第四轮体内选择后的滑膜导向多肽噬菌体(见图1c)被注射到人皮肤和滑膜双移植的SCID小鼠的尾静脉(20×108pfu)，其余实验条件同(a)。同样，可以看到噬菌体特异性定位到滑膜上，***P＜0.0001(不对称两侧t检验)。(b)所示的冷冻移植体样品经免疫组化实验分析得到M13噬菌体在各组织移植体的定位水平(c-f)。可以看到，在滑膜移植体有显著的M13染色(c)，而在皮肤移植体中的M13免疫反应性很小(e)。对照只显示背景染色(d和f)。标尺线＝50μm；
图4显示人和小鼠移植体的微管化程度。与图(3a)和(3b)的样品等量的冷冻组织，其微管化程度经免疫组化测定，用种属特异性抗人vWf抗体及抗鼠CD31抗体分别染色人和鼠的微管内皮。免疫染色的人和鼠的血管体积分数(Vv)用显微镜下点数计数，具体方法见方法中的描述。误差栏显示三个切面的平均值标准差。两个实验中，滑膜的内皮区在统计学上显著低于皮肤，在人微管结构(**P＝0.0043(c)，**P＝0.003(d))和鼠血管(**P＝0.001(c)，*P＝0.046(d))也是如此(不对称两侧t检验)。具有代表性的滑膜(c和d)和皮肤移植体(e和f)染色区如图所示，抗人vWf抗体染色(c和e)和抗鼠CD31抗体染色(d和f)。标尺线＝50μm；
图5显示滑膜导向噬菌体的多肽插入片段分析以及噬菌体克隆展示候选多肽的体内导向性。三次独立实验，每次实验最后一轮体内筛选后，随机挑选30个滑膜导向噬菌体克隆，其多肽插入片段被测序。经序列比对确定共有基序。每个实验中的共有基序展示噬菌体的完整的多肽序列如图所示(a，b，c)。划线氨基酸为候选基序，含重复基序区域的一些克隆也被列出。括号中显示在不同克隆中出现的相同基序(见正文)。带有高频率共有基序的三个独立的克隆(3.1，1.23，2.10)被扩增并重新注射(1×1011pfu)到人滑膜单移植SCID小鼠体内(2移植体/动物)。同浓度的strep-clone-1噬菌体作为无关噬菌体对照。15分钟后小鼠被灌流，测定移植体内噬菌体浓度。误差栏显示三次平板计数的平均值标准差(n＝2动物/条件)。从注射候选噬菌体克隆的小鼠滑膜移植体内回收到的噬菌体数与注射strep-clone-1噬菌体的小鼠相比在统计学上有显著的差异，***P＜0.0001(不对称两侧t检验)；
图6显示合成的生物素标记的多肽CKSTHDRLC体内特异性定位到滑膜移植体并与原来的多肽噬菌体竞争和相关组织配体的结合。人滑膜组织单移植SCID小鼠(2移植体/动物)静脉注射1×1011pfu3.1噬菌体克隆，同时分四个剂量组注射生物素标记的CKSTHRDLC合成多肽(a)(0，50，250，500μg/动物200μl剂量体积)或等量的生物素标记的CGTWSHPQC的合成多肽(b)。同浓度的strep-clone-1噬菌体作为无关噬菌体对照。15分钟后，处死小鼠，测定移植体及小鼠肾脏中(c和d)的噬菌体数。误差栏显示三次平板计数的平均值标准差(n＝3动物/剂量组)。可以看到，CKSTHDRLC合成多肽(a)剂量依赖地抑制亲代3.1噬菌体克隆定位到移植体上(最大剂量时超过80％)。相反，对照多肽(b)对3.1克隆的定位无显著影响，***p＜0.0001，*P＜0.05(不对称两侧t检验)。不同实验组，从小鼠肾脏回收到的噬菌体数目无差异。P＝0.05(不对称两侧t检验)；
图7显示生物素标记的CKSTHDRLC多肽的组织学分布，显示其在滑膜移植体中体内定位到人血管的情况。与图6中所示样品等量的冷冻组织是使用用vector red显色的碱性磷酸酶ABC检测系统的免疫组化分析。切片再用抗人vWf-FITC复染。从注射了3.1噬菌体克隆和500μg/鼠生物素标记的CKSTHDRLC合成多肽的小鼠的移植体切片可以清晰地看到与人微管结构共定位的特异免疫反应性(a和b)。ABC-AP从切片上除去后不显色(c)，尽管有人vWf-FITC阳性血管存在(d)。而对注射了500μg生物素标记的CGTWSHPQC对照多肽的小鼠的移植体进行同样的分析，没有特异的免疫反应性(e)，这说明尽管有血管存在，对照多肽并没有定位到移植体上(f)。在无ABC-AP的切片上也没有观察到染色(g)，尽管有人源vWf-FITC阳性血管存在(h)。标尺线＝50μm。
在这些实例中，我们报道了对新的滑膜导向多肽的鉴定，这些多肽从一个二硫键限制的7个氨基酸的多肽噬菌体展示文库(pep-PDL)在人/SCID小鼠移植模型经过几轮富集循环后分离得到。这是第一次有关具有人滑膜MVE特异导向性多肽的报道。用这些多肽构建导向装置能将药物/诊断试剂浓缩到滑膜，将对关节病的治疗产生深远的影响。
材料和方法
体外多肽噬菌体展示文库(pep-PDL)的验证
链霉抗生物素蛋白(streptavidin)特异的多肽噬菌体的扩增和测序。
本实验采用二硫键抑制(7个氨基酸组成的多肽两侧各接一个半胱氨酸)的环化M13噬菌体展示文库(Ph.D.C7CTM系统，New EnglandBiolabs，Hitchin，UK)。文库的正确性首先用标准试剂通过厂商提供的链霉蛋白生物素扩增技术来验证。在3轮扩增后，随机挑选10个噬菌体克隆，测定其DNA序列(采用的引物是：prime-96g III(NewEngland Biolabs)，PCR扩增选用BigDye TM终端循环测序试剂盒(Applied Biosystems，Warrington，UK)，测序仪是ABI 377 DNA测序仪)。
人/SCID鼠移植模型体内滑膜导向多肽的筛选
人组织移植入SCID动物。经道德委员会(Ethics Committee)(LREC98/11/27)的批准，征得患者同意，在RA和OA的病人做关节移植手术时获取滑膜和皮肤的样本。如前所述，将滑膜和皮肤组织单移植或双移植入SCID C.B-17小鼠皮下(参考文献目录34)。
体内筛选滑膜特异噬菌体。将人组织移植入4-6周的SCID小鼠体内，经3-4轮扩增富集，滑膜导向多肽得以分离。移植4周后，将多肽噬菌体展示文库(终浓度为：1×1011pfu/200μL盐溶液)注入麻醉动物的尾静脉。15分钟后(噬菌体体内扩增周期)，当动物处于深度麻醉(Satagal 5μg/鼠，Rhone Merieux France)，用大约50-100ml盐溶液进行左心室灌流以保证噬菌体从血液中清除。取出移植体和小鼠的不同器官，将其等分为两组，称重，分别用于噬菌体回收和组化分析。用于免疫组织化学分析的那组，包埋于光学切片温度复合物(OCT，Miles，CA)，速冻于液氮冷却的异戊烷(BDH)，存放于-70℃以便分析时取用。用于噬菌体回收的那组用TBS洗三遍(150mM NaCl，50nm Tris，pH7.4，Sigma，Poole，UK)然后用1ml含蛋白酶抑制剂cocktail(Sigma)的TBS匀浆。在图1b中所示的样品匀浆液在TBS中多洗了5遍，因此噬菌体回收较低。用1.6mL 0.1M的甘氨酸(pH2.0)孵育10分钟，然后用36μL 2M的Tris碱中和，噬菌体从组织中被提纯出来。为了便于确定被提纯的噬菌体的数量，在每轮筛选时，三倍浓度富集的样品提取物与大肠杆菌宿主ER2737(New England Biolabs)加入熔解的LB琼脂顶层(7g/L琼脂糖，1g/L MgCl2.6H2O，Sigma)，然后接种于含IPTG/Xgal的LB琼脂平板(50mg/L异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)，40mg/L 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(Xgal)，Kramel Biotech，Cramlington，UK)。37℃过夜孵育后，数出蓝色噬菌斑数，并和其组织来源一一对应。对于移植的滑膜组织，挑出剩余的噬菌斑在IPTG/Xgal的LB琼脂平板上培养扩增并测定浓度。将扩增的噬菌体与LB培养基上层胶匀浆，离心，取上清沉淀于PEG/NaCl(3.3％PEG8000/0.4M NaCl，Sigma)这样使扩增的噬菌体复原。收集上述实验得到的噬菌体并重悬于TBS，测定浓度，用于随后的体内筛选。为了增强滑膜特异性，需进行2-3轮体内筛选的循环。
多肽编码的DNA插入序列的测序。噬菌体展示的特异导向滑膜移植组织的多肽由DNA插入序列编码，测序以验证多肽噬菌体展示文库的正确性。随机挑取30个噬菌体克隆作为样本，最后一轮体内筛选后测序。做哺乳类序列同源性分析鉴定共有基序。
具有共同基序的单噬菌体克隆滑膜导向特异性的确认。三个展示共有基序的单噬菌体克隆(1.23，2.10和3.1)或对照(strep-clone-1)(终浓度为：1×1011pfu/200μL盐溶液)静脉注射入植入人体滑膜的动物(方法如前在“体内筛选滑膜特异噬菌体”中所述)。分别测定定位于滑膜移植体的实验和对照噬菌体克隆数目。
体外合成滑膜导向多肽。带有共有基序的多肽采用fMOC化学合成在自动多肽合成仪中合成(Alta Biosciences，Birmingham University，UK)，并可以被生物素标记(参考文献目录37)。合成后首先用反相层析使肽的纯度高于95％，然后以每管2ml均匀分装，干冻保存。使用前，将肽取出溶于10μL DMSO(BDH)，最终在0.1M的乙酸铵中配成4mg/ml的浓度。
母体噬菌体克隆(3.1phage)和合成生物素标记的滑膜移植组织表达多肽(CKSTHDRLC)的竞争性定位。将含不同浓度(0，50，250，和500μg/200μ/L鼠)生物素标记多肽(CKSTHDRLC)的3.1噬菌体克隆(浓度为1×1011pfu)静脉注入移植人源滑液组织的SCID小鼠，方法如前体内筛选所述。选用合成的生物素标记的多肽CGTWSHPQC作为对照，同时选取注射1×1011pfu的strep-clone-1或生物素(biotin)动物作对照。15分钟后，将小鼠灌流，用前述方法确定移植组织的噬菌体数目。随后做免疫组织化学分析。
免疫组织化学分析
M-13噬菌体组织定位的检测。如前所述(参考文献目录38)利用标准的免疫组织化学/荧光检测方法，在被注入整个噬菌体多肽展示文库，以及多个或者单个噬菌体克隆的动物移植组织中，检测到M13噬菌体外壳蛋白的表达。方法大致如下：厚度10μm的冰冻切片用丙酮固定，然后一抗(anti-M13 Mab，Pharmacia，Uppsala，Sweden)孵育，采用间接碱性磷脂酶免疫组织化学方法(LSAB，Dako，Ely，UK)可在荧光镜下看到连接的红色底物(Vector Red substrate，NovacastraLabs Ltd，Newcastle upon Tyne，UK)。然后用FITC共轭的绵羊抗人(vonWillebrand factor(vWf)-Serotec，Kidlington，UK)或鼠抗鼠CD31(clone MEC13.3，Pharmingen，San Diego，CA)抗体双标组织切片使得移植组织块中人和鼠的血管被染上。用鼠源抗体(anti-AspergillusNiger glucose oxidase[IgG2a](Dako，UK)作为类似物封闭无关抗体。所有切片样品用奥林巴斯BX-60荧光显微镜观察。
移植组织块中人和鼠源维管结构的检测和定量。为了检测移植组织块中维管化的程度，取人和鼠内皮表面做免疫组织化学检测，方法如上所述，采用种属特异性的抗人抗体(vWf)和抗鼠抗体(CD31)。在显微镜下用点数方法(前有述及)来确定免疫标记的人源鼠源的血管体积分数(Vv)(参考文献目录39)。简言之，每个组织块中2片免疫染色的切片在25倍目镜下用5×5的计数板严格计数。片与片之间染上的血管分别在显微镜的不同视野下计数。分别计算移植块中鼠，人和联结维管的平均血管体积分数(mean Vv)。
生物素标记肽移植组织块定位的检测。通过碱性磷脂酶抗生物素蛋白/生物素复合物(ABC-AP)检测系统(Dako，UK)，利用可见的红色连接底物(Novocastra，UK)，可以检测合成的生物素标记多肽(CKSTHDRLC)的移植组织定位。
数据统计分析。如未加特别说明，所有数据结果均取95％的置信区间。非参数的统计分析采用计算机统计软件包SigmaStat 2.0(Jandel Scientific)。最初，Kruskal Wallis，非参数ANOVA，单方差分析等方法都曾使用。对于显著性检验，非参数数据采用Dunn多对比较检验，参数数据采用Dunnett检验。
结果
体外验证噬菌体展示文库
在开始用人/SCID鼠移植模型做体内筛选前，根据厂商推荐，首先在体外用抗链霉抗生物素蛋白(streptavidin)生物扩增的方法验证了该噬菌体文库。通过对随机挑选的10个克隆编码多肽的DNA插入序列的测序，证实所有克隆都显示与该分子一致的序列，G-X-F/Y/W-S/N-H-P-Q(X表示任意氨基酸)。从这个实验中我们挑出一个克隆(strep-clone-1)表达特定的多肽C-G-T-W-S-H-P-Q-C作为整个实验的对照。
利用人/SCID鼠移植模型体内筛选滑液特定导向噬菌体
对人/SCID鼠移植模型进行多轮体内筛选，最终挑出对人滑膜组织有导向性质的噬菌体。在首先的一组实验里，将RA病人的滑膜和皮肤(作为对照)分别植入动物体内，注射整个文库(浓度为1×1011pfu)或者用作对照的克隆(strep-clone-1)。15分钟后，处死动物，分别计算定位于滑膜和皮肤移植组织以及鼠肾脏(用于鼠源组织对照)的噬菌体数量(方法在材料与方法中已述及)。另外，将在滑膜移植组织中复苏的噬菌体扩增至浓度1×1011pfu，重新注入第二和第三只双移植的实验动物。由此，在每轮筛选时，整个多肽噬菌体展示文库可以定位至人源的滑膜或皮肤组织。结果显示(如图1b)，每轮之后，从滑膜移植组织复原的噬菌体数目有显著增加，特别是在第三轮后，而作为对照，来源于皮肤移植组织和鼠肾的噬菌体数目未见有明显增加。与此同时，在对照文库的克隆组(strep-clone-1)，噬菌体在这三个组织定位无特异性。当我们只用单移植滑膜组织的动物，并且增加筛选轮数至4轮，可以观察到更大幅度的噬菌体富集(2移植块/只动物)。(结果见图1c)。同时，在第四轮筛选后从移植组织复原的噬菌体数目比第一轮筛选后的数目大幅提高，是前者的600倍。
特定的导向噬菌体肽显著定位于滑膜微维管内皮(MVE)
为了确定噬菌体在滑膜移植块中的解剖定位，在每轮筛选后，从处死动物中取得的移植组织复原后，用免疫染色检测M13包被蛋白。在最初两轮筛选后取出的组织块，可观察到适度的M13染色，而第三轮和第四轮后，在血管及其周围被染得很深。用种属特异的微观标记物进一步做免疫荧光染色确定了多肽的维管定位。在图2中我们给出了在第四轮筛选后显微镜下几处代表性的区域染色情况(在图1c中说明的同样实验的组织等份)。在(a)中，典型的M13染色区清晰可见，而用类似物封闭的无关抗体(c)则未见染上。最重要的是，M13染色区和用人维管标记物(anti-human vWf-FITC多克隆抗体b和d)标记的维管组织可见很好的吻合。作为对照，M13染色区(e)并未与侵入移植组织的鼠维管组织(用anti-murine CD31-FITC做二抗标记(f))有吻合。另外，滑膜导向噬菌体并未与鼠的维管组织结合，如图示，在鼠肾毛细血管可被鼠源CD31(h)清晰的染上，而在此出未见M13染上(g)。综上，通过数轮体内滑膜移植组织的定向，我们分离出专一结合人源滑膜组织而不是鼠源滑膜组织(MVE)或是人源皮肤的组织和种属特异性噬菌体。
滑膜导向噬菌体在体内维持其组织特异性，并不依赖于其来源的病理滑膜组织移植块(RA对OA)
为了检测多肽的滑膜导向特性是由滑膜组织内在特性决定的，还是与疾病状态有关(例如RA对OA)，在第三轮和第四轮筛选后，我们选取几组克隆再在体内做循环实验。选用SCID动物，移植来源于OA病人的滑膜组织和皮肤。如前，等量的strep-clone-1噬菌体被注入动物体内做对照实验。如图3a和b所示，从滑膜组织移植块复原的噬菌体数目远大于皮肤移植块。作为对照，注射strep-clone-1噬菌体的动物，在皮肤和滑液组织噬菌体的数目几乎相等，并且显著低于挑出的导向滑膜组织的噬菌体组。我们通过免疫组织化学的方法进一步确认滑膜移植组织定向的专一性。我们可以观察到在滑膜移植组织M13噬菌体包被单白有很强的免疫反应(图3c)，而在皮肤移植组织仅有很弱的免疫反应(图3e)，阴性对照并未检测到免疫反应(图3d和3f)。由此，这些实验确认了滑膜导向噬菌体保持其组织特异性，而不依赖于来自不同病人的滑膜组织造成的不同的病理特征。
滑液的导向性不依赖于移植过程中人或小鼠体内的血管形成
为了排除定位于被移植的滑液分泌组织倾向是由于移植物周围血管壁形成增加所至，我们对人和小鼠的所有血管系统内皮细胞表面区域在滑膜和皮肤移植过程中进行研究。如图4a和b所示，皮肤移植产生的内皮细胞表面增加要稍稍大于滑膜移植。这说明移植中所产生的血管形成并不影响含滑液导向的多肽噬菌体在移植滑膜的特异性定位。典型的移植组织免疫组化区域可见图4c-f。在两种组织移植中都可以发现显著的新生血管(数据未示)。
对滑液特异性噬菌体中编码多肽的DNA插入片段进行序列分析发现具有导向性的特异性共有基序的富集。为了研究在这些具有导向滑膜趋势的噬菌体所展示的多肽中是否有某些特异性的相同模体，对30个克隆(在三组不同的实验过程中，最后一轮筛选后随机选择)中的编码多肽的DNA插入片段进行测序。对这些插入序列进行比对，几个还有三个氨基酸或四个氨基酸的多肽保守区域被挑选出来。(图5a，b，c)在一些克隆中还发现了几个共用的或重叠的多肽基序。例如在1.23克隆中HSS基序(与1.30和2.6号克隆共有)分别与在2.16和1.29号克隆中发现的SSA和SAT基序重叠。此外，DRL(2.10，2.12和3.1号克隆)，和THSS(1.23和3.13号克隆)基序从不同实验中，无论是第三次筛选或是第四次筛选所收到的克隆中都得到了证实。
在SCID小鼠中移植人的滑液组织，通过体内筛选收集到的多肽序列如下：
三倍基序
  克隆编号   序列
  PC3 2.10PC3 2.12PC4 3.1PC4.14   CDRLNHQFCCHPSDRLSCCKSTHDRLCCPFHDRHSC
  PC3 2.14PC3 1.17   CAPNWRLPCCHPRLPFAC
  PC3 2.27PC3 2.29   CQTHNQRYCCTNQRLAIC
  PC3 1.29   CTWSATSTC
  PC3 1.15   CSDYSSRSC
  PC3 2.16   CPLSSAQRC
四倍基序
 克隆编号  序列
 PC3 2.15PC3 1.22PC3 2.2  CVSPSRTTCCSPSRFDQCCSPSPFRAC
 PC3 1.23PC4 1.13PC3 2.6PC3 1.30  CTHSSATQCCHTHSSNLCCPNHSSPHCCADHSSRHC
发明人接着检测含有某些这样的基序的单克隆是否保持滑膜特异性。3个克隆(1.23，2.10和3.1)，针对每个克隆设立一组实验，将其静脉注射到移植有人滑膜组织的SCID小鼠中。结果，图5d显示与对照组相比挑选出来的克隆明显富集于移植的滑膜组织上。特别是含有很强的DRL基序的3.1克隆比对照组高出10倍。因此这组克隆所含有的多肽CKSTHRDLC被挑出来进行以下的研究。
合成多肽CKSTHDRLC保留在体内导向滑膜特异性并且展示有该多肽的噬菌体可以和同源的滑膜MVE配体竞争。为了证明上述的这些候选多肽的特异性定位于移植的滑膜不依赖于噬菌体本身，我们合成了一段与3.1号克隆表达的序列CKSTHRDLC相同的序列并用生物素标记，用它移植噬菌体的定位。从strep-clone-1噬菌体所展示的多肽序列中挑选合成一段CGTWSHPQC作为无关对照。滑膜移植的小鼠预先用剂量在50ug-500ug/只动物的合成多肽CKSTHRDLC预处理，再注射1×1011pfu的3.1号克隆噬菌体。作为对照，重复上述实验，使用CGTWSHPQC合成多肽，剂量不变。噬菌体在移植组织和小鼠组织上的定位用“方法”中提到的实验步骤进行。另一组对照实验中，给小鼠注射1×1011pfu的strep-clone-1噬菌体。结果见图6。可以发现CKSTHRDLC多肽可以很明显的抑止3.1克隆噬菌体在移植组织的定位，并呈浓度依赖性(最高剂量可以抑止80％的定位)。相反，对照组的多肽对于噬菌体的定位没有显著影响。此外，3.1号克隆在移植组织的定位比strep-clone-1克隆高出了9倍，这也证明了先前在图5d中显示的实验结果。最后，c和d显示了3.1号克隆在小鼠肾脏中的分布。可以发现在小鼠肾脏中只有相当于背景级的噬菌体定位，并且不受实验组与对照组多肽的影响。
发明人接着还检查了CKSTHRDLC合成多肽在移植组织中定位。利用在实验和对照组所使用的多肽都被生物素标记，所以可以使用用Vector Red底物显色的碱性磷酸酶-ABC检测系统，采用免疫组化的方法精确检测。结果见图7，可见多肽在体内滑膜移植组织上有很强的定位(a)，并且它主要结合在人微血管内皮细胞上，使用FITC标记的抗人vWf抗体双染可以很清楚的观察到(b)。相反，在注射无关多肽的小鼠中，移植组织上并没有检测到免疫反应(e)，尽管人血管清晰可见(f)。连续的未经过ABC-AP复合物处理的切片并没有被染色(c和g)，而血管上FITC-vWf呈阳性(d和h)。
这些实验进一步证明了3.1号克隆噬菌体显著的组织和种属特异性。最为重要的是它证实了单独的多肽本身也具有导向滑膜的功能并且可以竞争性抑制3.1克隆噬菌体与移植组织上MVE配体的结合。
为了进一步验证，上图5中的多肽序列根据其功能部分氨基酸的化学本质进行比对(非极性/疏水性，非离子极性，碱性或酸性)。得到下列结果：
RLP三倍基序相关序列
    CHPRLPFAC
    CAPNWRLPC
如C-RLP-C
SPS三倍基序相关序列
    CSPSPFRAC
    CSPSRFDQC
    CVSPSRTTC
如C-SPSRF-C
HSS三倍基序相关序列
    CPLSSAQRC
    CTWSATSTC
    CTHSSATQC
    CHTHSSNLC
    CPNHSSPHC
    CADHSSRHC
    CSDYSSRSC
如C-(T/D)HSS(A/R)(T/H)-C
NQR三倍基序相关序列
    CQTHNQRYC
    CTNQRLAIC
如C-NQR-C
DRL三倍基序相关序列
    CKSTHDRLC
    CPFHDRHSC
    CHPSDRLSC
    CDRLNHQFC
如C-HDRL-C
上述序列中C-，-C各别代表任何种类或和数目的两侧半胱氨酸间的基序之前或之后的氨基酸，基序在它们之间。
讨论
通过体内噬菌体展示筛选分离人滑膜特异性导向多肽的方法已在这里被描述。通过给噬菌体所含的编码多肽的DNA插入片段测序可以确定，导向多肽优先定位到移植到SCID小鼠体内的人滑膜组织。
通过在滑膜组织单移植或滑膜和皮肤组织双移植的动物体内多次循环富集，分离这种滑膜导向噬菌体。后面的实验设计使pep-PDL在每轮筛选中定位到人滑膜组织或皮肤组织。因此，皮肤组织既可以富集识别人血管决定子的噬菌体，又作为组织特异性的对照。三轮筛选之后，发明人观察到噬菌体明显富集到滑膜移植体，皮肤对照组织则没有。类似的，尽管大量循环体液通过肾脏，但在这个组织中并未见到噬菌体富集。而且，从小鼠肾脏和皮肤移植体中回收到的噬菌体的量很相近，可能代表了结合的基线水平。此外，相同浓度的strep-clone-1噬菌体对照，定位到以上三种组织的量差不多。这些现象在第四轮体内筛选中同样存在。用人滑膜单移植动物进行实验，这些现象也被证实。第四轮富集的数量是第一轮的600多倍。因此，这些实验证实了用人/SCID小鼠移植模型体内筛选噬菌体的可行性。这些噬菌体优先定位到滑膜移植体而不是其它人的组织(皮肤)或小鼠的组织(肾脏)。这和曾经报道过的用一种“纯”小鼠体系是相似的(参考文献目录28)。这儿描述的方法的优点在于允许筛选某种噬菌体，这种噬菌体具有由移植体表达的人源组织决定子的导向特异性。
选择得到的噬菌体的滑膜导向特异性在皮肤和滑膜双移植SCID小鼠体内通过重循环试验重新检验，皮肤和滑膜来自一名患OA而非RA的病人。原本从RA滑膜移植体回收到的噬菌体克隆经第三，四轮体内选择后，优先回到OA滑膜移植体。而与皮肤对照组织的基线水平相比，噬菌体对照组显示出适中的滑膜定位。这些实验在多个方面提供了有力的证据支持滑膜导向噬菌体的组织特异性。首先，他们证明导向特异性是这些噬菌体稳定的性质。其次，他们证实这种优先的滑膜定位与移植组织的病理状态是无关的(RA对OA)，这一点提示组织特异性可能是由个体发育决定的。第三，strep-clone-1噬菌体对照组与滑膜多肽噬菌体两者比较，它们的行为模式是一致的，这说明导向特异性由多肽本身而非噬菌体成分介导。
为进一步研究这一方面，发明人从滑膜移植体回收得到的噬菌体库随机挑选了90个克隆，对其编码多肽的插入DNA序列进行测序分析。得到的特异性序列比对，鉴定出几个三拷贝和四拷贝的多肽共有基序。某些三拷贝基序在多个克隆中重复和/或重叠，有的克隆有多个基序。此外，有些基序在不同的实验中重复出现。因此，在不同实验的滑膜移植体中回收到的不同的噬菌体克隆中发现了共有基序，这个事实很可能归结于配体介导的选择过程，同时提示这些基序很可能对特异性滑膜决定子的识别相当重要。选取三个高频率发生基序的代表性克隆(1.23，2.10和3.1)，进一步检测它们的导向性。较之strep-clone-1噬菌体对照组，这三个克隆都显示出显著的滑膜移植体定位，特别是展示CKSTHDRLC的克隆3.1，含DRL共有基序，比对照几乎增加了10倍。因此，这个序列可以直接回答这样的问题：是否是多肽本身，而不依赖于其展示噬菌体，维持其导向滑膜移植体的性质。合成的多肽CKSTHDRLC不仅在体内表现出滑膜导向特异性，更重要的是，竞争性抑制亲代噬菌体与相关滑膜MVE配体的结合。
从这里展示的工作来看，由M13噬菌体及CKSTHDRLC多肽与移植体的MVE表现出的强烈的共定位及免疫反应性可以推测滑膜配体是由MVE表达的。尽管MVE配体可能仍是难以确定的滑膜特异性“地址素”(参考文献目录17)，一个有趣的方面是，参与组织特异性导向的分子并不是经典的CAMs。比如，一个膜二肽酶，特别是在体内位于肺部而非其它组织，经体内噬菌体展示确定，是肺导向多肽的受体(参考文献目录40)。
滑膜导向多肽不仅是组织特异性的(结合到滑膜上而不是皮肤上)而且是种属特异性的(结合到人的而不是小鼠的组织上)。因此，这些多肽不太可能与内皮细胞普遍表达的“普通”细胞粘附决定子结合。假设滑膜配体是炎症依赖的内皮CAM也是不成立的，因为在移植4周后的移植体微管结构中显示如ICAM-1，VCAM-1和E-选择蛋白等分子的下调(参考文献目录34)。这增大了这样一种可能，某种分子参与决定子的表达，而决定子则参与免疫监视过程的体循环部分。另一种可能性是，如果移植体的维持依赖于形成人鼠联结的新血管，那么，滑膜配体很可能代表了新血管生成的表位。尽管皮肤移植体对照较之滑膜移植体，其新血管化的程度相似甚至稍高，但滑膜导向多肽并不和皮肤移植体结合。因此，以此为基础解释以上的发现，在滑膜新血管发生中必然会有一种组织特异性的因子，这种因子在肿瘤相关血管中也被推测是存在的(参考文献目录29，31)。
这是第一次有关人滑膜MVE特异性导向的多肽被报道。通过一种新的导向人组织的方法，移植入SCID小鼠，噬菌体展示体内直接筛选，这一系列的步骤完成。这种多肽的鉴定方法，并不依赖于它们的天然配体，开创了这样的可能性，就是用这些序列构建关节特异性释放工具，能够将药物或基因载体直接或以脂质体的形式浓缩到这个组织，这在其它一些系统已经实现(参考文献目录31，41，42)。另外的实验，在多器官包括RA和OA移植的SCID动物中进行，用于进一步确证滑膜特异性。
尽管这儿所描述的方法特指噬菌体展示技术，但并不限于这个方法，多肽的体内筛选也可以与标记分子连接后进行。采用噬菌体展示的主要优点在于在多肽被回收的同时其核酸序列也得到了回收。此外，这个方法可用于鉴定能够特异性结合到非滑膜的其它组织的多肽。这些组织并不一定是人源的。
滑膜或非滑膜组织移植到小鼠体内的方法见下面的例子，使用人外周淋巴结(huPLN)。
组织收集，制备，储存和移植。主动脉旁huPLN或颈huPLN来自于血管手术的患者。
HuPLN的大小和外观都正常。样本在移植前进行常规的H&E组织学试验，在组织学外观上是正常的。整个过程得到了医院道德委员会的许可(LREC n99/03/19)。样品分为两份，一份用于免疫组化，另一份用于移植。用于免疫组织化学分析的那组，包埋于光学切片温度复合物(OCT，Miles，CA)，速冻于液氮冷却的异戊烷(BDH)，存放于-70℃以便分析时取用。用于移植的样品，切成0.5cm3的小片，冻在含20％DMSO(Sigma)的热灭活的胎牛血清中(PAA LabsGmbH，Linz，Austria，储存在液氮中直至移植(见Wahid et al.(2000).Clin.Exp.Immunol.122，133-142)。样品在手术前解冻，用生理盐水洗涤，放在生理盐水湿润的无菌纱布上，并置于冰上。米色的SCIDC.B-17(NOD/LtSz-scid/scid)小鼠在Kings College无病原体的条件下饲养，i.p注射0.2ml Dormitor(0.1mg/ml SKB)和0.1ml ketamine(0.1mg/ml SKB)麻醉。在每只SCID小鼠(鼠龄4-6周)耳后的背侧皮肤上划一刀切口，将组织皮下植入。伤口用可溶性缝合线(Ethicon)缝合。4-5周后，经免疫组化迁移试验检测，移植成功。选择这种特殊的小鼠品系，是为了使huPLN被小鼠体循环中的NK细胞杀死的可能性降为最小。NOD/LtSz-scid/scid小鼠不仅不能产生T或B细胞，也没有NK细胞活性(但能产生无功能的NK细胞)。
移植体存活率评价。在宏观或苏木精和伊红染色丙酮固定恒冷箱切片的显微镜观察的免疫组化或形态学分析之前，先评价移植体的存活率。移植体坏死或含非移植组织(如，小鼠皮肤和肌肉)被排除。
移植体内人微管结构评价。为确证人微管结构的维持与细胞粘附分子(CAM)有关，也为了评估移植体经细胞因子/趋化因子刺激后CAM表达的调节情况，需评价移植前和移植后人ICAM1，VCAM1，和E-选择蛋白的表达，采用种属特异性mAb和标准的免疫组化技术。CAM相对的表达情况用0-4的染色强度的相对值来衡量，0表示无染色，4表示最强染色。为检测人源移植体的微管结构是否是开放的并与渗入移植体的小鼠微管组织联结，给小鼠i.v注射生物素标记的抗人ICAM1抗体或生物素标记的同型匹配的对照抗体(MOPC21)。10分钟后小鼠被处死，移植体包埋在OCT中速冻。恒冷箱切片在抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(ABC-AP)中温育30分钟，然后用Vector Red底物试剂盒显影。接着，切片在FITC标记的抗人VWFVIII(Serotec，UK)中温育，用来确定人的血管，由此测定抗ICAM1抗体和对照抗体的定位。切片在浸片剂溶液，(Immunofluor，ICN Ltd)中固定，在紫外-荧光显微镜下观察。
参考文献目录：
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                            序列表
<110>伦敦王室学院
<120>导向多肽
<130>SCT048107
<140>PCT/GB02/04017
<141>2002-09-04
<150>GB 0121499.8
<151>2001-09-05
<150>GB 0217894.5
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<160>46
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<220>
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<220>
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<220>
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<220>
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>34
Cys Gln Thr His Asn Gln Arg Tyr Cys
1               5
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>35
Cys Thr Asn Gln Arg Leu Ala Ile Cys
1               5
<210>36
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>36
Cys Lys Ser Thr His Asp Arg Leu Cys
1               5
<210>37
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>37
Cys Pro Phe His Asp Arg His Ser Cys
1               5
<210>38
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>38
Cys His Pro Ser Asp Arg Leu Ser Cys
1               5
<210>39
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>39
Cys Asp Arg Leu Asn His Gln Phe Cys
1               5
<210>40
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>40
Cys Gly Thr Trp Ser His Pro Gln Cys
1               5
<210>41
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>任一氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>F，Y或W
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>S或N
<400>41
Gly Xaa Xaa Xaa His Pro Gln
1               5
<210>42
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>42
Cys Arg Leu Pro Cys
1               5
<210>43
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>43
Cys Ser Pro Ser Arg Phe Cys
1               5
<210>44
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>T或D
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>A或R
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>T或H
<400>44
Cys Xaa His Ser Ser Xaa Xaa Cys
1               5
<210>45
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>45
Cys Asn Gln Arg Cys
1               5
<210>46
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>46
Cys His Asp Arg Leu Cys
1               5

Claims (44)

1.一种与滑膜组织结合的多肽，含有一个包括RLP，SPS，HSS，LSS，TWS，YSS，NQR，DRL或DRH的氨基酸基序。
2.如权利要求1所述的多肽，其中所述的基序包括SPSRF。
3.如权利要求1所述的多肽，其中所述的基序包括(T或D)HSS(A或R)(T或H)。
4.如权利要求1所述的多肽，其中所述的基序包括HDRL。
5.如权利要求1所述的多肽，其中所述的基序包括HPRLPFA，APNWRLP，SPSPFRA，SPSRFDQ，VSPSRTT，PLSSAQR，TWSATST，THSSATQ，HTHSSNL，PNHSSPH，ADHSSRH，SDYSSRS，QTHNQRY，TNQRLAI，KSTHDRL，PFHDRHS，HPSDRLS或DRLNHQF。
6.如上述任一权利要求所述的多肽，其中所述的基序包含能够引起多肽发生分子内环化的氨基酸。
7.如权利要求6所述的多肽，其中所述的氨基酸对是C和C，C和M或M和M。
8.如权利要求7所述的多肽，其中所述的基序是CHPRLPFAC。
9.如权利要求7所述的多肽，其中所述的基序是CKSTHDRLC。
10.如权利要求6-9中任一权利要求所述的多肽，其中所述的基序是环化的。
11.包含如上述任一权利要求所述的一种氨基酸基序的多肽。
12.如上述任一权利要求所述的多肽，与一种药物试剂或诊断试剂偶联。
13.如权利要求12所述的多肽，其中的药物试剂是一种抗炎的，细胞稳态的，细胞毒性的或免疫抑制的化合物。
14.如权利要求12所述的多肽，其中的药物试剂是一种基因。
15.如权利要求12所述的多肽，其中的诊断剂适用于诊断成像。
16.如上述任一权利要求所述的多肽，可用于治疗。
17.如权利要求1-15中任一权利要求所述的多肽在制备用于治疗或预防炎性的和/或退行性的关节病药物中的应用。
18.包含如权利要求1-5中任一权利要求所述多肽的一种药物或诊断组合物。
19.如权利要求18所述的组合物配制为脂质体。
20.如权利要求19所述的组合物，其中的多肽至少位于脂质体的外表面。
21.编码如权利要求1-11中任一权利要求所述多肽的核苷酸序列。
22.能够结合到如权利要求1-15中任一权利要求所述多肽的抗体或其片段。
23.一种多肽的鉴定方法，这种多肽能够与来自第一种哺乳动物的组织结合，该方法包括以下步骤：
i)将来自第一种哺乳动物的组织移植到具有减弱免疫反应的第二种动物的受试动物体内；
ii)将多种多肽导入第二种动物体内，以及
iii)测定多肽在第二种动物体内的定位。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述的多肽以和噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白的形式被导入受试动物体内。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述的噬菌体是M13噬菌体。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述的外壳蛋白是p111。
27.如权利要求23-26中任一权利要求所述的方法，其中所述的多肽两侧是一对氨基酸，能够引起多肽的分子内环化。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述的氨基酸对是C和C，C和M或M和M。
29.如权利要求23所述的方法，其中的多肽在体外随机合成。
30.如权利要求24-28中任一权利要求所述的方法，其中的多肽由噬菌体复制合成，编码多肽的核苷酸序列已事先被插入噬菌体基因组。
31.如权利要求23-30中任一权利要求所述的方法，其中所述的第一种哺乳动物是人。
32.如权利要求23-31中任一权利要求所述的方法，其中所述的组织包括滑膜组织。
33.如权利要求23-32中任一权利要求所述的方法，其中所述的第二种动物是小鼠。
34.如权利要求23-33中任一权利要求所述的方法，其中所述的第二种动物的受试动物患有恶性复合免疫缺陷症。
35.上述权利要求中所列的一个或多个多肽。
36.具有以下所列序列中的一个的多肽
PC3 2.10 CDRLNHQFC
PC4 1.1 CKSTHDRLC
PC5 1.23 CTHSSATQC
37.具有上述权利要求中所列序列中的一个的多肽，应用于治疗炎性或退行性关节病。
38.如权利要求35-36所述的多肽，与细胞毒性药物或基因偶联。
39.如权利要求35-36所述的多肽，配制为脂质体。
40.如权利要求35-36所述的多肽，与一种成像方式结合。
41.包括如权利要求35-36所述多肽的一种药物或诊断组合物。
42.如权利要求41所述的药物组合物，用于静脉给药。
43.如权利要求42所述的药物组合物，静脉给药剂量为0.5-5毫克/千克体重。
44.一种治疗关节炎(包括类风湿性关节炎，牛皮癣关节炎血清阴性关节病)的方法，其中包括一种或多种如权利要求35-36所述多肽的给药方式。
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