CN1684593A - 酶制剂及用其生产食品的方法 - Google Patents

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Abstract

一种酶制剂包含，作为酶制剂的活性成分，在将转谷氨酰胺酶、胶原和酶制剂溶解于溶液的情况下，能够使pH值向抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围变化的酸性或碱性物质，以及利用该酶制剂生产食品的方法。

Description

酶制剂及用其生产食品的方法
技术领域
本发明涉及含有转谷氨酰胺酶的酶制剂以及使用该酶制剂生产食品的方法。更具体地，本发明涉及一种酶制剂，包含1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)当该酶制剂溶解于溶液时，使pH变化到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围的酸性或碱性物质。
在本说明书(包括权利要求书)中，术语胶原包括明胶。由于目前很难区分胶原和明胶，术语胶原一般包括明胶。因此，术语胶原如上所述加以限定。
背景技术
关于将在多种蛋白质中通过转谷氨酰胺酶进行的交联反应效果应用于食品、医药制品和化学制品领域的技术已经发表了许多报道。其中，由于可广泛地应用于技术领域，在利用组合使用胶原(如上所述包括明胶)和转谷氨酰胺酶的优势的技术上已经进行了深入的研究工作。
例如，下列发明是已知的：用于生产改进的胶原的方法，包括以下步骤：加固与转谷氨酰胺酶交联的内-胶原分子(日本专利号2897780)；具有强耐热性的明胶胶体、胶状食品和明胶膜及其生产方法的发明(JP-A-6-98743，7-227228和日本专利号2866746)；以及组合利用转谷氨酰胺酶和胶原生产具有强结合作用的重构食品的方法(JP-A-10-70961)。
此外除了食品领域，关于具有足够强度和耐热性的胶原凝胶型芳香制品及其生产方法(JP-A-9-70428)已有报道。如上所述，从组合使用转谷氨酰胺酶和胶原所获得的优点具有很高的应用价值。另外，这种技术是非常有利的。
然而，由于胶原与转谷氨酰胺酶具有极高的反应性，转谷氨酰胺酶和胶原混合物溶液的粘性增加和凝胶化速率非常迅速是特征性的。
因此当生产胶状食品或重构食品时，因为转谷氨酰胺酶与胶原混合后转谷氨酰胺酶立即进行凝胶化，因此在生产过程中出现了各种限制。
例如，当试图将固体食品材料分散到转谷氨酰胺酶和胶原的混合溶液中时，必须在凝胶化还未开始的极短时间内完成分散步骤，因此很难以质量标度生产同质的胶状食品。
进一步地，作为生产重构食品的方法，已知有将溶解于水的转谷氨酰胺酶和胶原的糊状材料加入固体食品材料以使它们混合在一起的方法。假如糊状材料在固体食品材料中混合前，糊状材料的凝胶化已经完成，就不能生产出具有任何足够结合强度的食品。
此外，有时候将胶原混合在固化剂和腌渍液体中，以用于生产加工的肉类制品，例如火腿、咸肉和烤猪肉。在制备这种腌渍液体的过程中，转谷氨酰胺酶与胶原进行反应，而不利地涉及粘性增加，从而导致不能进行灌注。
因此为了生产包含转谷氨酰胺酶和胶原的食品，重要的是必须在生产过程中极大地控制转谷氨酰胺酶反应。
作为抑制转谷氨酰胺酶的酶活性的一种方法，已知有在低温下将转谷氨酰胺酶溶解于水的方法。该方法利用转谷氨酰胺酶活性在低温下受到抑制的现象。然而，不能说该方法对于物理特性的控制具有足够的效果。此外，在生产过程中这种严格的温度控制是不实用的。更进一步地，可通过分别定时地加入转谷氨酰胺酶和胶原来控制凝胶化。然而，在生产过程中这种步骤是很费力而非优选的。
现在描述关于重构食品的单独生产。除了将溶解于水的转谷氨酰胺酶和胶原的糊状材料加入固体食品材料的步骤外，还存在将粉状或粒状的转谷氨酰胺酶和胶原直接加入固体食品材料来进行结合的步骤。
现有技术中混合有转谷氨酰胺酶的酶制剂不是广泛适用于任何两个步骤中的任一步骤的制剂。
因此，需要一种具有高度实用性的胶粘制剂，其可在任何步骤中产生高满意度效果，而不需要在特定的生产过程中应用特殊的制剂。此外，如JP-A-10-70961中所公开的，包括混合的转谷氨酰胺酶和胶原的用于结合的酶制剂可生产足够的结合强度。然而在实际的生产场所中，需要在更短的时间段内产生更强结合强度的酶制剂来进行结合。
发明公开
本发明的目的是提供具有混合的转谷氨酰胺酶和胶原、且具有高度可加工性的酶制剂，由此通过抑制混合的转谷氨酰胺酶和胶原溶液的凝胶化，无需耗费劳力工作即可生产高品质的食品(胶状食品、重构食品等)，以及提供利用该酶制剂生产食品，例如胶状食品和重构食品的方法。
为了解决这些问题，本发明人已经进行了研究。因此，本发明人已经发现通过调节包含1)转谷氨酰胺酶和2)胶原的溶液的pH到pH3以上、pH5以下的范围，或pH10以上、pH12以下的范围，可抑制溶液的凝胶化，以便于该溶液可长时间保持适合于食品生产过程的物理特性。此外，本发明人已经发现只有将具有pH缓冲效果的材料，例如可食用的肉类加入并且与包含1)转谷氨酰胺酶和2)胶原的溶液混合，调节到特定的pH范围，以将溶液的pH中和到适于转谷氨酰胺酶优化反应的pH范围，转谷氨酰胺酶的效果才可出现。由此完成了本发明。
也就是说，本发明涉及如下所描述的。
1.一种酶制剂，包括1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)当该酶制剂溶解于溶液时，使其pH变化到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围的酸性或碱性物质。
2.根据上述1所述的酶制剂，其中当该酶制剂溶解于溶液时，抑制转谷氨酰胺酶活性的表达的pH范围是pH3或以上至小于pH5，或是pH10或以上至pH12或以下。
3.根据上述1所述的酶制剂，其中酸性或碱性物质是一种或多种选自柠檬酸、苹果酸、酒石酸、碳酸钠、碳酸钾、磷酸三钠、磷酸三钾、焦磷酸四钠、焦磷酸四钾、甘氨酸钠盐、甘氨酸钾盐、氢氧化钠、氢氧化钾和氧化钙(煅烧钙)的物质。
4.根据上述1所述的酶制剂，其中胶原来源于鱼类或有壳的水生动物。
5.一种酶制剂，包括1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)当该酶制剂溶解于溶液时，使所述酶制剂的pH变化到pH9或以上至pH12或以下的范围的碱性物质，并且所述酶制剂直接与食品材料混合。
6.根据上述5所述的酶制剂，其中酸性或碱性物质是一种或多种选自碳酸钠、碳酸钾、磷酸三钠、磷酸三钾、焦磷酸四钠、焦磷酸四钾、甘氨酸钠盐、甘氨酸钾盐、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙以及氧化钙(煅烧钙)的物质。
7.根据上述5所述的酶制剂，其中胶原来源于鱼类或有壳的水生动物。
8.用于生产食品的方法，包括下列步骤：将1中所述的酶制剂溶解于溶液中，改变所得到的溶液的pH到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围，然后将该溶液与食品材料混合，以使所得到混合物的pH变回表达转谷氨酰胺酶活性的pH范围，从而进行转谷氨酰胺酶反应。
9.根据上述8所述的生产食品的方法，其中抑制转谷氨酰胺酶表达的pH范围是pH3或以上至小于pH5，或是pH10或以上至pH12或以下。
10.根据上述8所述的生产食品的方法，其中表达转谷氨酰胺酶活性的pH范围是pH5或以上至pH8或以下。
11.根据上述8所述的生产食品的方法，其中该食品是胶状食品或重构食品。
12.用于生产食品的方法，包括以下步骤：将上述1或5所述的酶制剂不溶于溶液而是直接与食品材料混合，以进行转谷氨酰胺酶反应。
13.根据上述12所述的生产食品的方法，其中该食品是重构食品。
14.用于生产食品的方法，包括以下步骤：将上述1所述的酶制剂溶解于溶液，改变所得到的溶液的pH到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的范围，然后将所得到的溶液注入食品材料，从而进行转谷氨酰胺酶反应。
15.根据上述14所述的生产食品的方法，其中抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围是pH3或以上至小于pH5，或是pH10或以上至pH12或以下。
16.根据上述14所述的生产食品的方法，其中所述食品是没有利用绞碎肉生产的完整肌肉产品。
17.用于生产食品的方法，包括将以下三种组分溶解于溶液中的步骤，所述组分为：1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)使所得到溶液的pH变化至抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围的酸性或碱性物质，以及将食品材料与所得到的溶液混合，以使所得到的混合物的DH变回表达转谷氨酰胺酶活性的pH范围，从而进行转谷氨酰胺酶反应的步骤。
转谷氨酰胺酶是催化蛋白质或肽链中谷氨酰胺残基的γ-氨甲酰基团和伯胺之间的酰基转移反应的酶，例如当该伯胺是蛋白质的赖氨酸残基时，可形成交联键ε-(γ-Glu)-Lys。
根据本发明所使用的转谷氨酰胺酶可衍生自任何来源，而没有特别的限制，只要该转谷氨酰胺酶具有转谷氨酰胺酶活性即可，包括来源于下列微生物的转谷氨酰胺酶(缩写为MTG酶)，例如链霉菌属Streptomyces(例如，茂原链霉菌 Streptomyces  mobaraensis IFO13819；链轮丝菌属 Streptoverticillium被目前的分类学划分到链霉菌属 Streptomyces中，其被划分为链轮丝菌属 Streptoverticillium)(JP-A-64-27471和美国专利号5156956)、来源于例如几内亚猪的哺乳动物的转谷氨酰胺酶(JP-A-58-14964)、来源于例如鳕鱼(NipponSuisan Gakkaishi的鱼类的转谷氨酰胺酶(Japanese Journal ofFisheries Science)，Nobuo Seki et al.，Vol.56，No.1，page 125(1990))、和存在于血液中的转谷氨酰胺酶(也称为因子XIII)，另外包括遗传工程化的转谷氨酰胺酶(例如，JP-A-1-300889、JP-A-5-199883、JP-A-6-225775和WO93/15234)。
可使用上述的任何转谷氨酰胺酶作为本发明所使用的转谷氨酰胺酶。然而，来源于微生物的转谷氨酰胺酶是优选使用的，因为该转谷氨酰胺酶是可大规模商业化生产的，并且可以低成本地轻易获得。
进一步地，一些转谷氨酰胺酶活性的表达需要钙(即，钙依赖的转谷氨酰胺酶)，而其他的转谷氨酰胺酶活性的表达不需要钙(即，非钙依赖的转谷氨酰胺酶)。可使用这些类型的任何酶。在此，不需要钙的非钙依赖的转谷氨酰胺酶是更易于操作的。
根据本发明，通过下列异羟肟酸盐法(hydroxamate method)测定转谷氨酰胺酶的活性，并且也根据异羟肟酸盐法定义其单位。具体地说，在37℃和pH6.0将转谷氨酰胺酶应用于Tris-缓冲液中的底物苄氧基羰基-L-谷氨酰基甘氨酸和羟胺的反应溶液，以产生异羟肟酸，其在三氯乙酸存在时变为铁复合物。再在525nm处测量反应溶液的吸光度利用标准曲线确定所产生的异羟肟酸。然后，将每分钟产生1μ摩尔异羟肟酸的酶的量定义为一个单位(1U)的转谷氨酰胺酶活性(JP-A-64-27471和美国专利号5156956)。
根据本发明，可使用任何类型的胶原。根据本发明可使用来自没有特别限制的任何材料的胶原。一般从例如动物和鱼类以及有壳的水生动物的骨、皮、软骨、鳞片和鳔组织来提取胶原。特别地，已知来自于鱼类和有壳的水生动物的胶原很好地溶解于水。因此，此类胶原对于需要在低温下制备胶原溶液的应用是非常有用的。
特别地，对于生产重构食品，就卫生控制和变质控制的观点来说，低温步骤是必不可少的。因此，来源于鱼类和有壳的水生动物的胶原适于生产重构食品，因为该胶原可在低温下溶解。已表明这种胶原产生较强的结合强度。因此，优选地，将来源于鱼类和有壳的水生动物的胶原用于本发明的酶制剂。
胶原的氨基酸组成决定其溶解性和熔点。据说其溶解性和熔点取决于脯氨酸和羟脯氨酸的含量。因此，下表显示出不同胶原类型(A至E)的氨基酸组成及其与结合效力的关系(参见表1和图1)。
表1.不同胶原的氨基酸组成(氨基酸残基比例的数目)
    A     B     C     D     E
   Hyp     9.5     9.8     9.6     5.3     5.8
   Asp     4.8     4.6     4.6     5.1     5.3
   Thr     1.7     1.8     1.8     2.4     2.4
   Ser     3.6     3.3     3.3     6.3     5.0
   Glu     7.3     7.2     7.3     7.2     7.5
   Pro     12.2     11.9     12.6     10.4     11.1
   Gly     34.2     33.5     33.8     36.0     36.0
   Ala     10.4     11.1     11.3     11.1     10.9
   Cys     0.0     0.0     0.0     0.2     0.3
   Val     2.2     2.3     2.3     1.9     1.7
   Met     0.5     0.4     0.4     0.9     1.0
   Ile     1.1     1.2     1.1     1.1     1.1
   Leu     2.5     2.7     2.5     2.1     1.9
   Tyr     0.3     0.3     0.0     0.0     0.0
   Phe     1.4     1.5     1.6     1.5     1.4
   Lys     2.9     2.8     2.7     2.7     2.5
   His     0.6     0.5     0.4     0.9     1.0
   Arg     4.8     5.1     4.8     5.2     5.2
   总数     100.0     100.0     100.0     100.0     100.0
   Hyp+Pro(％)     21.7     21.7     22.2     15.7     16.9
因此，发现由于脯氨酸和羟脯氨酸残基的总数占氨基酸残基总数的0.1％或以上至小于20％而导致的结合强度是特别大的，以至于这种胶原适合用于重构食品(PCT/JP02/02840)。具有这种氨基酸组成的胶原来源于鱼类和有壳的水生动物。
根据本发明，术语胶原指从动物和鱼类以及有壳的水生动物组织提取和纯化的胶原。不特别地限制所得到胶原的提取和分解方法或改变程度。在提取过程中，胶原水解为不同的程度，因此所得到胶原的分子量分布经常是非常广泛的。根据本发明，术语胶原包括狭义上所谓的明胶，其是胶原的改进物。
进一步的，胶原不必是纯化的产品，并且特别地可能包含脂肪、碳水化合物、肽、氨基酸等，除非这些产品抑制本发明预期的优点。进一步的，本发明所述的胶原不仅包括来自单个来源的胶原，也包括来自多个来源、以适当比例混合的胶原(包括明胶)。
最特征性地，本发明的酶制剂除了1)转谷氨酰胺酶、2)胶原外，还包含3)当该酶制剂溶解于溶液时，使其pH变化到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围的酸性或碱性物质。
当酶制剂溶解于溶液(该溶液一般为含水溶液，但也包括例如液体材料)时，更具体地，该酸性或碱性物质调节溶液的pH变为抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围，即pH3或以上至小于5，或是pH10或以上至pH12或以下的范围。
由于转谷氨酰胺酶在上述的pH范围内很难表达其活性，可抑制溶液的凝胶化。因此，可明显改善生产食品，例如胶状食品和重构食品的过程中的可加工性。
作为酸性或碱性物质，可使用当溶解于溶液时能够调节酶制剂到pH3至小于pH5的范围，或pH10或以上至pH12或以下的范围的任何酸性或碱性物质。通常，将酶制剂溶解于水，以大约10至25％的溶液形式使用。因此，可根据需要选择能够调节含水10至25％的酶制剂溶液到pH3以上至小于pH5的范围，或pH10或以上至pH12或以下的范围的酸性或碱性物质。此外，可组合使用两种以上的这种碱性或酸性物质。
碱性物质(使pH变化到碱性范围)包括无机酸，例如磷酸和碳酸的钠、钾、钙或镁盐。具体的，碱性物质包括碳酸钠、碳酸钾、磷酸三钠、多聚磷酸钠、焦磷酸四钠、焦磷酸三钾、焦磷酸四钠、焦磷酸四钾、甘氨酸钠盐、甘氨酸钾盐、氢氧化钠、氢氧化钾和氧化钙(也称为煅烧钙)。
此外，酸性物质(使pH变化到酸性范围)包括柠檬酸、脂肪酸、葡糖酸、乙酸、乳酸、富马酸、苹果酸、酒石酸和硫磺酸。
然而，这些实例不是为了加以限制。只要能够达到本发明的目的，任何pH-调节物质可能都是符合需要的。其中，特别优选的酸性或碱性物质包括柠檬酸、苹果酸、酒石酸、碳酸钠、碳酸钾、磷酸三钠、磷酸三钾、焦磷酸四钠、焦磷酸四钾、甘氨酸钠盐、甘氨酸钾盐、氢氧化钠、氢氧化钾和氧化钙(也称为煅烧钙)。
本发明酶制剂的必需组分，即1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)这种混合到其中的酸性或碱性物质的量没有特别的限制，但一般每1g酶制剂中，转谷氨酰胺酶是1U至200U，优选为10U至150U；而胶原是0.1g至0.9g，优选为0.2g至0.6g。此外，当混合酸性或碱性物质的量是使酶制剂的最初pH调节到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的范围，即pH3以上至小于pH5的范围，或pH10或以上至pH12或以下的范围时，不存在特别的限制。
此外对于本发明的酶制剂，组分1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)这种酸性或碱性物质不必混合到一个容器中，而是可放置到一组分开的容器中，其就是所谓的“试剂盒”形式。根据本发明，除了组分1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)当酶制剂溶解于溶液中时，使其pH变化到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围的酸性或碱性物质外，可混合入各种适当的成分。
例如，酶制剂可包含已知用于食品的下列填充剂：糖类，例如乳糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽糖醇、山梨糖醇和海藻糖、糊精、支链糊精、环糊精、增稠剂，例如淀粉、多聚糖、树胶、果胶、琼脂、鹿角菜胶和藻酸等。
此外，酶制剂可能包含酪蛋白、各种动物蛋白质，和植物蛋白质，例如大豆蛋白质和小麦蛋白质。
此外，酶制剂可适当地与调味品、砂糖、香料、色素、彩色显像催化剂、有机酸，例如抗坏血酸及其盐、乳剂、油和脂肪、二氧化硅微颗粒等混合。
进一步的，对于使用的腌渍液体，上述成分可不混合在酶制剂中，但可与本发明的酶制剂分别加入到腌渍液体中。
现在描述利用本发明的酶制剂生产食品，例如胶状食品和重构食品的方法。本发明的最显著特性是通过调节溶液的pH到pH3以上至小于pH5的范围，或pH10或以上至pH12或以下的范围来控制含有转谷氨酰胺酶和胶原的溶液的粘性。
这以转谷氨酰胺酶活性的pH依赖性和稳定性为基础来进行描述。图2显示在图表中描述的pH依赖性中，转谷氨酰胺酶的最佳pH是pH5至pH8，而在该pH范围外，转谷氨酰胺酶活性的表达显著降低，可以看到明显转谷氨酰胺酶反应极难进行。然而，本发明人也关注于图2中pH稳定性的图表所显示的结果时发现：转谷氨酰胺酶的活性在最佳pH范围外的某范围内也保持得相当好，特别是在碱性的区域中。换言之，当溶液的pH变化到较大抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围，并且随后在进行例如分散到食物材料中的操作后，变回到转谷氨酰胺酶活性的最佳pH区域时，发生转谷氨酰胺酶反应。通过这种方式，可克服相关技术问题，以便于产生令人满意的效果。
任何变化pH的方法可能都是合适的，而不加以限制，只要该方法能够变化pH到可获得转谷氨酰胺酶活性的pH范围。例如，变化pH的方法包括，将溶液与具有pH缓冲作用的食品材料混合。可食用的肉类，例如牛肉、猪肉、家禽肉、鸡肉和鱼肉，以及一般称为滴液的液体，例如动物的体液、血液、组织液等具有很大的pH缓冲作用。
通过将酶制剂溶解于溶液，并在抑制其与食品材料的凝胶化的情况下混合溶液，然后pH可变化到最佳的pH范围(pH5或以上至pH8或以下)以进行酶反应。通过这种方式，可生产所需要的食品，例如胶状食品和重构食品。
如上所述，在抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围中可抑制溶液的凝胶化。当加入猪肉等，并与溶液混合时，猪肉等的pH缓冲作用可调节所得到的混合物为pH5至pH8。通过将含有本发明酶制剂的腌渍液体灌注食品材料，如火腿、咸肉和烤肉，进一步可获得相同的效果，包括回收没有利用绞碎肉所生产的高质量的完整肌肉产品(火腿、咸肉和烤肉等)。
当食品材料没有这种pH缓冲作用时，不同于牛肉，加入酸性或碱性物质，或用酸或碱处理的食品材料可中和该溶液。通过将这种食品材料加入溶液，例如可以合理的方式生产分散于新鲜或干燥材料中的胶状食品。只要可如上所述中和该溶液，可加入任何食品材料而不必特别的限制该食品材料的大小或形状，或限制该食品材料是否为固体或液体。
作为根据本发明所使用的食品材料，不仅可使用所谓的可食用肉类，例如牛肉、猪肉、马肉、绵羊肉、山羊肉、家禽和鸡肉，也可使用各种鱼类、贝类、有壳的水生动物，例如虾和螃蟹、软体动物类，例如鱿鱼和章鱼以及鱼卵，例如单独的鲑鱼鱼卵和带状形式的鲑鱼卵。不必说也可使用除了如上所述以外的食品材料，或可按需要组合使用两种以上的这种食品材料。
因为经pH调节对抑制转谷氨酰胺酶反应的影响和对反应加速的影响取决于温度、转谷氨酰胺酶的量、底物蛋白质的类型和量、反应时间等，所产生的影响取决于每种生产条件。根据预期的终产物类型，可确定上述的各种条件。
本发明效果最明显的一种食品是重构食品。换言之，通过结合肉块来生产食品。现在如下详细描述重构食品的生产。
重构食品的生产过程分为两类；一类是(水溶解法)将用于粘附的酶制剂溶解于溶液(水或液体材料等)，并将所得到的糊状混合物加入到固体材料中用于成型和粘连的方法；另一类(洒粉法)是将用于结合的酶制剂直接加入固体食品材料，而不用将酶制剂溶解于任何溶液(水或液体材料等)的方法。
首先，描述利用本发明的酶制剂的水溶解法。在第一个步骤中，在水等中溶解酶制剂，其包含1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)当该酶制剂溶解于溶液时，使其pH变化到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围的酸性或碱性物质，调节所得到的溶液至pH3以上至小于pH5的范围，或pH10或以上至pH12或以下的范围。在该pH范围中，转谷氨酰胺酶活性的表达被抑制，不进行凝胶化。
然后、将例如牛肉的食品材料与溶液(或液体材料)混合。由于这种食品材料具有pH缓冲作用，所得到混合物的pH变化为表达转谷氨酰胺酶活性的pH范围，即通过其加入和混合变化到pH5以上至pH8以下的pH范围。假如加入和混合食品材料后，pH未达到pH5以上至pH8以下的范围时，则加入用于pH调节的反应物以使混合物的pH变化到转谷氨酰胺酶反应的最佳pH范围，即pH5以上至pH8以下的范围。
一般，转谷氨酰胺酶反应可在0至55℃按需要进行10秒至24小时。自然地，不限制反应条件。如上所述，开始转谷氨酰胺酶反应来获得重构食品。
对于这种生产，本发明的酶制剂是最适合使用的。然而，1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)使酶制剂pH的变化到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围的酸性或碱性物质可按需要分别购买和使用。在这种情况下，将转谷氨酰胺酶、胶原和酸性或碱性物质混合在一起，其保持为粉末；然后根据需要将所得到的混合物溶解于例如水的溶液。另外，首先将单独的物质溶解于水等，然后将所得到的溶液根据需要混合在一起。此外，通过将胶原溶解于水等，根据需要使用酸性或碱性物质调节加入转谷氨酰胺酶的所得到溶液的pH。
最重要的是，溶液的pH应变化为抑制转谷氨酰胺酶活性的pH范围(pH3以上至小于pH5的范围，或pH10或以上至pH12或以下的范围)。
下列步骤与使用酶制剂情况中的步骤相同。具体地，将溶液和食品材料混合在一起，以调节所得到的混合物至表达转谷氨酰胺酶活性的pH范围，即pH5或以上至pH8或以下的pH范围，以进行转谷氨酰胺酶反应来获得重构食品。
现在如下描述使用本发明酶制剂的洒粉法。洒粉法与水溶液法的不同点是将未溶解的酶制剂直接撒布在预期粘附酶制剂的食品材料上。当如上所述将酶制剂直接加入食品时，由于其pH缓冲作用，附着在一起的表面的pH被变化为适合转谷氨酰胺酶反应的pH范围。因此，形成更强的胶体，来获得更强的结合强度。
作为酶制剂，除了在水溶液法中所使用的酶制剂，可使用包含1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)当溶解于溶液时，使酶制剂变化到pH9或以上至pH12或以下范围的碱性物质的酶制剂。然而，酶制剂只可用于包括直接将酶制剂加入食品材料的步骤的洒粉法。碱性物质包括例如，碳酸钠、碳酸钾、磷酸三钠、磷酸三钾、焦磷酸四钠、焦磷酸四钾、甘氨酸钠盐、甘氨酸钾盐、氢氧化钠、氢氧化钾和氧化钙(煅烧钙)。
在将这些酶制剂混合到食品原料中后，可进行转谷氨酰胺酶反应。在此，不限制转谷氨酰胺酶反应的条件，但一般包括根据需要在0℃至55℃进行10秒至24小时。通过这种方式可获得重构食品。
进一步的根据本发明，包含1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)当该酶制剂溶解于溶液时，使其pH变化到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围的酸性或碱性物质的酶制剂，其可用于水溶液法和洒粉法。因此，该酶制剂具有广泛的实用性。此外，该酶制剂产生很强的结合强度。
优选的，通过洒粉法以简单的方式使用酶制剂来生产重构食品。然而，1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)当该酶制剂溶解于溶液时，使其pH变化到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围的酸性或碱性物质可按需要分别购买，以通过洒粉法来生产重构食品。
备选地，1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)当该酶制剂溶解于溶液时，使其pH变化到pH9以上至pH12以下的pH范围的碱性物质可按需要分别购买，以及通过洒粉法来生产重构食品。
根据本发明，包含1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)当该酶制剂溶解于溶液时，使其pH变化到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围的酸性或碱性物质的酶制剂可如上所述用于生产重构食品。此外，该酶制剂可用于除了重构食品外的胶状食品。胶状食品包括例如，胶状物(胶状物包括高度热稳定的胶状物和含有材料块，例如蔬菜块和水果块的胶状物)；豆类的甜味胶状物；胶状糖果；和鱼翅类的食品。此外，酶制剂可用于生产腌渍液体和通过使用腌渍液体所制备的不使用绞碎肉的完整肌肉产品(火腿、咸肉、烤肉等)。
一般对于任何重构食品、胶状食品、和通过使用腌渍液体所制备的不使用绞碎肉的完整肌肉产品的生产，相对于每1g本发明所述的终产物转谷氨酰胺酶的用量为0.001U至100U，优选为0.01U至10U，而胶原的用量为0.0001g至0.9g，优选为0.001g至0.5g。甚至在组合使用转谷氨酰胺酶和胶原的酶制剂形式，或分别使用转谷氨酰胺酶和胶原的情况中，也可以使用上述数量范围的酶和胶原。
附图简述
图1描绘使用不同胶原类型所产生的结合强度。
图2描绘转谷氨酰胺酶活性的pH依赖性和稳定性。
实施本发明的最佳方式
现在下列实施例中详细描述本发明。不必说本发明的技术范围不只限于这些实施例。
实施例1：利用鱼胶原检测凝胶化时间
使用来源于链霉菌属 Streptomyces(茂原链霉菌 Streptomyces mobaraensis IFO 13819)的商业化可购买的转谷氨酰胺酶(“Activa”TG的特定活性为1,000U/g产品，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)作为转谷氨酰胺酶。此外，使用由Kenny&Ross Ltd.制造的鱼胶原“HMWFish Gelatin”(商品名)作为鱼胶原。使用由Nitta Gelatin Co.制造的“APH-250”(商品名)作为动物胶原。
将水(24g)加入由Kenny & Ross Ltd.制造的鱼胶原“HMW FishGelatin”(3.2g；商品名；商品名包括术语明胶，但在此该产品是指鱼胶原)，在室温下溶解胶原。用含水27％的氢氧化钠溶液或浓盐酸将所得到的溶液调节到下列表2所示的各pH。向所得到的调节过pH的溶液加入溶解于8g水中的转谷氨酰胺酶(0.48g)，搅拌10秒以检测混合物的pH。然后使用由Haake GmbH & Co.制造的流变仪，在加入转谷氨酰胺酶后间隔地测量储存模量和损失模量，当储存模量和损失模量一致时确定凝胶化时间。作为对照，将转谷氨酰胺酶加入未调节pH的鱼胶原(HMW Fish Gelatin)的含水溶液，如上所述以相同的方式来确定凝胶化的时间。结果显示在表2中。
表2.鱼胶原和转谷氨酰胺酶凝胶化时间的pH依赖性
鱼胶原和转谷氨酰胺酶混合物的pH     凝胶化时间(分钟)
2.5     ＞60
3     ＞60
4     30
6     ＜1
7     ＜1
8     1
9     3
9.5     4
10     10
11     ＞60
12     ＞60
对照(pH5)     3
如表2所示，当将鱼胶原的水溶液调节到小于pH5的范围或pH10或以上的范围时，鱼胶原的水溶液可延迟经转谷氨酰胺酶反应的凝胶化。
实施例2：利用动物胶原检测凝胶化时间
将水(24g)加入动物胶原(由Nitta Gelatin Co.制造的“APH-250”；3.2g)，在40℃下水浴溶解胶原。用含水27％的氢氧化钠溶液或浓盐酸将所得到的溶液调节到下列表3中所示的各pH。向所得到的调节过pH的溶液加入如实施例1中所使用的溶解于8g水中后的相同转谷氨酰胺酶(0.48g；“Activa”TG的特定活性为1,000U/g产品，由Ajinomoto Co.，INC.制造)，搅拌10秒以检测混合物的pH。使用由Haake GmbH & Co.制造的流变仪，然后在加入转谷氨酰胺酶后，在40℃下间隔地测量储存模量和损失模量，当储存模量和损失模量一致时确定凝胶化时间。作为对照，将转谷氨酰胺酶加入未调节pH的动物胶原(APH-250)的含水溶液，如上所述以相同的方式来确定凝胶化的时间。结果显示在表3中。
表3.动物胶原和转谷氨酰胺酶凝胶化时间的pH依赖性
动物胶原和转谷氨酰胺酶混合物的pH   凝胶化时间(分钟)
    2.5     ＞60
    3     ＞60
    4     6
    6     1
    7     1
    8     2
    9     2.5
    10     5
    11     37
    12     ＞60
    对照(pH5)     3.5
如表3所示，当将动物胶原的水溶液调节到小于pH5的范围或pH10或以上的范围时，如鱼胶原的水溶液，动物胶原的水溶液可延迟经转谷氨酰胺酶反应的凝胶化。然而，在pH4和pH10，鱼胶原延迟凝胶化的时间更长。
实施例3：用转谷氨酰胺酶和鱼胶原生产重构的猪肉(通过水溶液法)
将实施例1中所使用的6g鱼胶原溶解于50g水中，用含水27％的氢氧化钠溶液或浓盐酸调节pH到下列表4中所示的个别pH。向胶原溶液加入如实施例1中所使用的溶解于10g水中的0.9g相同的转谷氨酰胺酶(“Activa”TG的特定活性为1,000U/g产品，由AjinomotoCo.，Inc.制造)，搅拌10秒以检测pH，然后将所得到的溶液保持10分钟以确证明胶的存在或缺乏。
当混合物溶液即使在10分钟后也未成胶，加入总量为300g的猪大腿肉块(大约2-cm的立方块)，并且与13.4g的混合物溶液充分混合，以使得胶原和转谷氨酰胺酶的混合物可与肉块彻底混合。然后转谷氨酰胺酶的用量是每1克终产物0.6U，而鱼胶原的用量是每1克终产物0.004g。
将所得到的混合物填充满合并宽度为75mm的套管，该套管在5℃下保持2小时，以进行转谷氨酰胺酶反应。反应后，套管放置于-40℃的冰箱中，并冷冻贮存直到进行评估。作为对照，使用未调节pH的鱼胶原的含水溶液。在向鱼胶原的含水溶液加入转谷氨酰胺酶后，立即通过相同的方法制备重构的猪肉。
将冷冻的重构猪肉剪切成9-mm厚和2.5-cm宽；融化后，用由Stable Micro Systems，Co.制造的结构分析仪测量结合强度。结果显示在表4中。
表4.转谷氨酰胺酶和鱼胶原结合强度的pH依赖性
    鱼胶原和转谷氨酰胺酶混合物的pH     凝胶化时间(分钟)
    2.5     19
    3     150
    4     157
    6     -(成胶)
    7     -(成胶)
    8     -(成胶)
    9     -(成胶)
    10     169
    11     115
    12     105
    12.5     0
    对照(pH5)     89
在未调节pH的含水胶原溶液的情况中，具体地，在将混合物加入猪肉块前，该混合物经转谷氨酰胺酶反应成胶，而致使该混合物不能用于任何重构食品的生产。
通过使含水胶原溶液的pH调节到pH3至pH4的范围或pH10至pH12的范围，所得到的混合物可保留适于与猪肉块混合足够的时间以用于充分混合步骤的物理特性，并且也可在终产物中获得足够的结合强度。
此外，测量与猪肉块混合后的pH。任何试验性产品中肉类表面的pH变化为pH5至pH7。在与肉块混合的所有试验性产品中，pH变化为通过与肉块混合来抑制转谷氨酰胺酶反应的pH范围。在具有pH2.5和pH12.5的含水胶原溶液的实验性产品中，在与肉块混合前转谷氨酰胺酶是失活的，以至于经转谷氨酰胺酶反应的结合强度很差或根本没有。
实施例4：用转谷氨酰胺酶和鱼胶原生产重构的牛肉(洒粉法)
根据下列表5描述的组成，制备6种类型的酶制剂。将酶制剂沉积在牛大腿肉块的表面(大约2-cm的立方块)；相邻的两个这种肉块在酶制剂沉积的一个表面上粘附在一起，然后是真空密封。转谷氨酰胺酶的用量是每1克终产物0.64U，而鱼胶原的用量是每1克终产物0.003g。
作为对照，使用未与碳酸钠混合的酶制剂(下列表1中的酶制剂1)。
在此，使用实施例1中所使用的鱼胶原和实施例1中所使用的转谷氨酰胺酶(“Activa”TG的特定活性为1,000U/g产品，由AjinomotoCo.，Inc.制造)分别作为胶原和转谷氨酰胺酶。
在将所得到的牛肉块于5℃保持2小时后，以进行转谷氨酰胺酶反应，用由Stable Micro Systems，Co.Ltd.制造的结构分析仪在张力测试中测量两个肉块的结合强度(表6)。在此，表6显示伴随单独酶制剂的含水20％溶液的pH，具有这些酶制剂的肉类表面的pH。
表5.酶制剂的组成
材料                        组成比例(％重量)
    1.(对照)     2.     3.     4.     5.     6.
转谷氨酰胺酶鱼胶原乳糖碳酸钠     630640     630631     630622     630613     630595     6305410
总数                            100
表6.使用不同酶制剂的重构牛肉的结合强度与(含水酶制剂溶液和重构肉类表面的)pH的关系
  1.(对照)   2.   3.   4.    5.      6.
结合强度(g/cm2)   241  280  320  428   395     329
含水20％酶制剂溶液的pH   5.3  9.5  9.9  10.2   10.5     10.8
沉积酶制剂的肉类表面的pH   5.5  5.9  6.2  6.7   7.1     7.8
实验性产品2至6中的酶制剂溶解于水时，为pH9或以上至pH12以下。当沉积在肉块上时，肉块的表面变化为pH5或以上至pH8或以下的范围，即经其pH缓冲作用进行转谷氨酰胺酶反应的pH范围。由于任何实验性产品中的结合强度高于对照产品1，含有碱性物质的酶制剂比未有碱性物质含量的酶制剂更大地增强结合强度。
工业实用性
根据本发明，可抑制转谷氨酰胺酶和胶原混合溶液的快速凝胶化，以改善食品，例如重构食品生产的可加工性。此外，通过使用本发明的酶制剂，食品材料可更强地粘附在一起。可将本发明所述酶制剂的一个实施方案用于使酶制剂溶解于水或液体材料来制备用作粘合剂的糊状材料的方法(水溶液法)，和另外的直接将酶制剂洒在固体食品材料上用于结合的方法(洒粉法)。因此，作为具有广泛实用性的酶制剂，这种酶制剂是极为有用的。

Claims (17)

1.一种酶制剂，包括1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)当该酶制剂溶解于溶液时，使其pH变化到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围的酸性或碱性物质。
2.根据权利要求1的酶制剂，其中当该酶制剂溶解于溶液时，抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围是pH 3或以上至小于pH 5，或是pH 10或以上至pH 12。
3.根据权利要求1的酶制剂，其中酸性或碱性物质是一种或多种选自柠檬酸、苹果酸、酒石酸、碳酸钠、碳酸钾、磷酸三钠、磷酸三钾、焦磷酸四钠、焦磷酸四钾、甘氨酸钠盐、甘氨酸钾盐、氢氧化钠、氢氧化钾和氧化钙的物质。
4.根据权利要求1的酶制剂，其中胶原来源于鱼类或有壳的水生动物。
5.一种酶制剂，包括1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)当该酶制剂溶解于溶液时，使所述酶制剂的pH变化到pH 9或以上至pH 12或以下的范围的碱性物质，并且所述酶制剂直接与食品材料混合。
6.根据权利要求5的酶制剂，其中酸性或碱性物质是一种或多种选自碳酸钠、碳酸钾、磷酸三钠、磷酸三钾、焦磷酸四钠、焦磷酸四钾、甘氨酸钠盐、甘氨酸钾盐、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙以及氧化钙的物质。
7.根据权利要求5的酶制剂，其中胶原来源于鱼类或有壳的水生动物。
8.用于生产食品的方法，包括下列步骤：将权利要求1所述的酶制剂溶解于溶液中，改变所得到的溶液的pH到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围，然后将该溶液与食品材料混合，以使所得到混合物的pH变化回表达转谷氨酰胺酶活性的pH范围，从而进行转谷氨酰胺酶反应。
9.根据权利要求8的生产食品的方法，其中抑制转谷氨酰胺酶表达的pH范围是pH 3以上至小于pH 5，或是pH 10或以上至pH 12或以下。
10.根据权利要求8的生产食品的方法，其中表达转谷氨酰胺酶活性的pH范围是pH 5或以上至pH 8或以下。
11.根据权利要求8的生产食品的方法，其中该食品是胶状食品或重构食品。
12.用于生产食品的方法，包括以下步骤：将权利要求1或5所述的酶制剂不溶于溶液而是直接与食品材料混合，以进行转谷氨酰胺酶反应。
13.根据权利要求12的生产食品的方法，其中该食品是重构食品。
14.用于生产食品的方法，包括以下步骤：将权利要求1所述的酶制剂溶解于溶液，改变所得到的溶液的pH到抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围，然后将所得到的溶液注入食品材料，再进行转谷氨酰胺酶反应。
15.根据权利要求14的生产食品的方法，其中抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围是pH 3或以上至小于pH 5，或是pH 10或以上至pH 12或以下。
16.根据权利要求14的生产食品的方法，其中所述食品是没有利用绞碎肉的完整肌肉产品。
17.用于生产食品的方法，包括将三种组分溶解于溶液中的步骤，所述组分为1)转谷氨酰胺酶、2)胶原和3)使所得到溶液的pH变化至抑制转谷氨酰胺酶活性表达的pH范围的酸性或碱性物质，以及将食品材料与所得到的溶液混合，以使所得到的混合物的pH变回表达转谷氨酰胺酶活性的pH范围，再进行转谷氨酰胺酶反应的步骤。
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