CN1662662B - 通过信号扩展和数据整合进行的核酸测序 - Google Patents

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Abstract

在此公开的方法及装置(100)涉及DNA测序。在本发明的一些具体实施方式中，所述方法包括测量标记核苷酸(220)之间的距离，所述核苷酸例如用大体积基团标记。所述方法进一步包括将相同的模板DNA(200)放入四个反应室(110，120，130，140)中，每一个含有不同标记的核苷酸前体，合成互补链(230，240，250)并检测标记核苷酸(220)。标记核苷酸(220)之间的距离可用来构建(450)各种类型标记核苷酸(220)的距离图谱(310，320，330，340)。可比对(520)距离图谱(310，320，330，340)以获得核酸序列(210)。交叠数据分析和频率分析可用来构建(450)距离图谱(310，320，330，340)，非交叠数据分析则可用来将所述距离图谱比对成为序列(210)。

Description

通过信号扩展和数据整合进行的核酸测序
技术领域
本方法、组合物及装置是涉及分子生物学及基因组学领域。更具体地说，本方法及装置是有关核酸测序。
背景技术
人类基因组计划的出现需要发展改良的测序核酸如DNA(脱氧核醣核酸)和RNA(核醣核酸)的方法。许多常见疾病，如癌症，囊肿性纤维症及镰刀状血球贫血，都至少部份地起因于DNA序列变异。人类基因组的整个3,000,000,000个碱基序列的测定提供了用来鉴别这样的疾病的遗传学基础。然而，要鉴别与每一种疾病相关的遗传变异还有大量的工作尚待完成。
现有的核酸测序方法是基于对已经按大小分离的标记核酸的检测，它们所能测序的核酸长度收到限制。一般，一次只能测定核酸序列的500至1,000个碱基。这比DNA的功能单元基因的长度短很多，基因的长度可能为数万至数十万个碱基。使用目前的方法完成一个完整基因序列的测定需要制备许多的基因拷贝，将其切成相互交叠的片断并测序，之后，再将交叠的DNA序列组装成为一个完全基因。这种方法费工，昂贵，无效率且耗时。
较新的核酸测序方法涉及芯片上特定位置的已知序列的寡核酸苷酸阵列的杂交，它们可用来推出短的核酸序列或检测样本中特定核酸的存在性。但是，它们不适合用于鉴别长的核酸序列。
附图说明
下面的附图构成了本说明书的一部分，它们在这里被用来进一步说明本发明的具体实施方式。通过参考这些附图中的一个或者多个，并结合在此提出的发明的具体实施方式的详细描述，可以更好地了解那些实施方式。
图1显示了用于对核酸模板200进行测序的示范性装置100(不按比例)和方法，其是通过确定4个分离的反应室110，120，130，140内随机标记的核苷酸220之间的距离来进行的。
图2显示了以大量互补核酸链230，240，250中标记核苷酸之间的测量距离为基础来构建一种标记核苷酸220的碱基距离图谱310，320，330，340的示范性方法。标记核苷酸220之间的距离可用来构建各种标记核苷酸的距离图谱310，320，330，340，如在此所述。图中显示了互补链230，240，250的序列210以及标记核苷酸220的示范性位置。如260所标示，在相同的核苷酸彼此相邻的位置，会在那个位置检测到标记频率的增加。
图3显示了将4份碱基距离图谱310，320，330，340进行比对而得到互补链230，240，250的序列210的示范性方法。模板核酸200为该已测序列210的准确互补。
图4显示了构建450标记核苷酸220的距离图谱310，320，330，340的示范性方法。
图5显示了比对520距离图谱310，320，330，340以获得互补链230，240，250的核酸序列210的示范性方法。
具体实施方式
公开的方法、组合物及装置100是用于核酸的快速自动测序。在本发明的特定实施方式中，所述方法、组合物及装置100适合用于获得非常长的核酸分子的序列210。与现有的核酸测序方法相比，优点包括能够在单次测序操作中读出长的核酸序列210，能够更快速地获得序列210数据(达每秒3,000,000个碱基)，减少测序成本，并且，就产生每单位序列210数据所需的操作时间而言，其效率更高。
下面的详细说明包括大量的特定细节，以便提供所公开的具体实施方式一个更加全面的理解。然而，本领域技术人员应明白，没有这些特定细节，本发明仍然可以实施。在其它例子中，在本领域已知的装置、方法、程序及个别组件在此将不作详细描述。
图1显示了本发明的特定实施方式。图1显示了一种核酸测序方法，其包括放置多个模板核酸200的拷贝于四个反应室110，120，130，140内。这些反应室110，120，130，140中的每一个皆包含合成试剂如DNA聚合酶，与所述模板分子200互补的引物以及核苷酸前体。在本发明的可供选择的具体实施方式中，所述引物分子可以被标记，以便检测用于测量标记核苷酸距离的限定性起点。所述的核苷酸前体应该包括至少一个分子的脱氧腺苷-5′-三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷-5′-三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷-5′-三磷酸(dCTP)、脱氧胸苷-5′-三磷酸(dTTP)或脱氧尿苷-5′-三磷酸(dUTP)，尽管各反应室在正常情况下会含有各种核苷酸前体的许多分子。
另外，各室110，120，130，140将含有一种类型的标记核苷酸前体。例如，第一反应室110可以包含标记dATP，第二反应室120可以包含标记dCTP，第三反应室130可以包含标记dGTP，第四反应室140可以包含标记dTTP。将小量的一种类型的标记核苷酸前体分别添加于这四个反应室110，120，130，140中可以产生随机标记的互补链230，240，250。在各室110，120，130，140中，所有的互补链230，240，250都以同种类型的核苷酸来标记。在本发明的一些具体实施方式中，标记核酸230，240，250在四个反应室110，120，130，140中合成并被分析，合成和分析是在同一室中发生。作为选择，标记互补链230，240，250可在一组容器例如在试管、微量离心管或微过滤管内制备，然后分离掉未整合的核苷酸，并在一组室110，120，130，140内进行分析，所述室与检测器在操作上偶联。
在本发明的其它可供选择的具体实施方式中，标记核酸230，240，250可以在四个不同的容器中分别合成，其中各容器含有不同类型的标记核苷酸前体。四种标记核酸230，240，250然后可以在单个反应室110，120，130，140内混合以便分析标记核苷酸220距离。这要求各种类型的标记核苷酸220被可区分地标记并能够检测。仍在其它可供选择的具体实施方式中，标记核酸230，240，250可以在单个室中合成，然后分到四个室110，120，130，140中以检测标记核苷酸220，每个室都配有检测器，经调整后可检测单一类型的独特的标记核苷酸220。在另一可供选择的具体实施方式中，含有所有四种可区分的标记核苷酸220的互补核酸链230，240，250在单个容器中合成，然后在单个室110，120，130，140内分析，其中使用了一种能够识别四种标记核苷酸中的每一种的检测器。
在本发明的特定具体实施方式中，四种标记核苷酸前体的每一种都具有独特且容易看见的光学特征，该特征能将其与未标记的核苷酸和其它类型的标记核苷酸220区分。在本发明的可供选择的具体实施方式中，标记核苷酸220可以用大体积基团(bulky groups)来标记，这样的标记也容易区分。所述具体实施方式不限于发光标记或大体积基团标记，本领域已知的任何形式的核苷酸标记，如放射性、核磁共振、电子顺磁共振、电子旋转共振等，都可用于所公开的方法的实践中。
在各种具体实施方式中，核酸聚合酶每一次添加一个核苷酸前体至引物的3′端。对于每一轮的延长，单个核苷酸前体被整合到互补链230，240，250中。核苷酸前体整合成互补链230，240，250是由与模板链200的Watson-Crick碱基对相互作用来决定的。因此，模板链200的序列可以从互补链230，240，250的序列210确定。
在本发明的特定具体实施方式中，在互补链230，240，250中的标记核苷酸220上皆附有大体积基团。所述大体积基团可通过交联或任何本领域已知的其它方法来连接。例如，含有附着的大体积基团的核苷酸前体可以在合成过程中整合成互补核酸链230，240，250。作为选择，可将含有特定的活性基团的核苷酸前体整合成互补链230，240，250，在互补链230，240，250完成合成之后通过交联来添加大体积基团。在本发明的特定具体实施方式中，所述大体积基团可为任何有机物、无机物或金属基团或任何抗体。在本发明的具体实施方式中，如果金属基团附着于标记核苷酸220，则金属可以为纯金属，如金或银，或合金。在本发明的特定具体实施方式中，金属基团可以为纳米颗粒。在本发明的特定具体实施方式中，纳米颗粒的大小约为1纳米(nm)，尽管也可以使用大约2、3、4、5、6、7、8、9或10nm或甚至更大的纳米颗粒。
在本发明特定具体实施方式中，标记核酸230，240，250可以通过一个或者多个纳米孔150。标记核苷酸220通过纳米孔150时由检测单元加以检测。在非限制性的例子中，纳米孔150可以由α溶血素分子形成。α溶血素自组装成脂质双层孔，其容许单个DNA分子无阻碍地通过(如，Akeson等，Biophysical J.77：3227-3233，1999)。在施加有电势的情况下，通过标记核苷酸220对纳米孔内的离子流的影响可以检测标记DNA通过这样的纳米孔150。要检测传导性标记如金属纳米颗粒通过纳米孔150，可以利用电检测器，如电压计、电阻计或电导率计。在本发明的可供选择的具体实施方式中，荧光或发光标记通过纳米孔可通过光学检测器来检测。在其它可供选择的具体实施方式中，检测单元可以包括扫描探针显微镜。在本发明的具体实施方式中，如果大体积基团已经附着至核苷酸，那么这样的大体积基团便可利用扫描穿隧显微术(STM)或原子力显微术(AFM)来检测。在这样的具体实施方式中，所述检测单元可以与或者不与纳米孔150在操作上相连。作为选择，用大体积基团来标记的互补核酸230，240，250可以排列在表面上，利用AFM或STM来扫描。在各种具体实施方式中，检测单元可以在操作上偶联至信息处理及控制系统，如计算机，以便记录标记核苷酸220之间的距离。
各反应室110，120，130，140的关于标记核苷酸220之间的距离的数据可以被收集和分析(图2)。构建450出各个反应室110，120，130，140的距离图谱310，320，330，340，比对520所得到的距离图谱310，320，330，340以产生核酸序列210(图3)。各反应室110，120，130，140的距离图谱310，320，330，340可通过标记核苷酸220之间距离的交叠420、频率430及信号440分析来构建450。通过分析不交叠的数据可将距离图谱310，320，330，340比对520成为序列210。距离图谱310，320，330，340可以通过信息处理及控制系统例如计算机来构建450和比对520。
本发明的特定实施方式涉及DNA互补链230，240，250的合成。模板链200可以为RNA或DNA。使用RNA模板链200时，合成试剂为反转转录酶，其例子为本领域所熟知。在使用DNA分子模板链200的具体实施方式中，合成试剂为DNA聚合酶，其例子为本领域所熟知。在本发明的其它具体实施方式中，互补链230，240，250可为RNA分子。这样需要的合成试剂为RNA聚合酶。在这些的具体实施方式中并不需要引物。然而，模板链200应该包含启动子以有效地使RNA聚合酶结合并启动RNA互补链230，240，250的转录。启动子的优化为本领域所知。本发明的具体实施方式并不限制所使用的模板分子200的类型、合成的互补链230，240，250的类型，或所使用的聚合酶的类型。实际上，能够支持与模板链200序列210互补的核酸分子230，240，250的合成的任何模板200和任何聚合酶都可使用。
在本发明的特定具体实施方式中，模板分子200可附着在表面上如功能化玻璃、硅、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、金、银、或镀有其它金属的表面、石英、塑料、PTFE(聚四氟乙烯)，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、乳胶、尼龙、硝化纤维、玻璃珠、磁珠或本领域所知的任何能附着核酸的材料。在本发明的一些具体实施方式中，核酸分子可在表面上定向，如下所述。
在本发明的一些具体实施方式中，功能性基团如标记可以共价连接于交联剂，以便模板链200、互补链230，240，250及聚合酶之间可发生相互作用而没有位置阻碍。作为选择，所述核酸可利用交联剂附着于表面。典型的交联基团包括乙二醇寡聚物及乙二胺。所述附着可以是共价或非共价结合。将核酸分子附着于表面的各种方法是本领域所熟知的，并可以加以应用。定义
出于本公开的目的，下列术语具有下列的含义。没有被定义的术语则根据其一般通用的含义来应用。
″抗体″包括多克隆和单克隆抗体及其片断。抗体也包括重组抗体、化学修饰的抗体及人源化抗体，所有的抗体可以为单链或多链。
″核酸″表示DNA或RNA，可以是单链、双链或三链，及DNA或RNA的任何修饰形式或类似物(analog)。″核酸″几乎可以为任何长度，从10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、150,000、200,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、5,000,000或甚至更多的碱基长度，直至染色体DNA分子的全长。
″核苷酸前体″是指未整合进入核酸的核苷酸。在本发明的一些具体实施方式中，核苷酸前体为核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸。可以了解，只要尚能通过聚合酶整合为互补链230，240，250，核苷酸前体的结构便可作各种取代或修饰。例如，在某些具体实施方式中，核糖或脱氧核糖部分可由其它戊糖或戊糖类似物取代。在其它具体实施方式中，磷酸酯基团可被例如膦酸酯、硫酸酯或磺酸酯替代。仍在其它具体实施方式中，只要核苷酸前体整合进入互补链230，240，250的顺序210能够反映出模板链200的序列，便可修饰嘌呤或嘧啶碱基，或用其它嘌呤或嘧啶或类似物替代。
″标签(tags)″或″标记(labels)″可交换使用，它们都是指可用来鉴定附着有标记物的核苷酸220的任何原子、分子、化合物或组合物。在本发明的各种具体实施方式中，这样的附着可以是共价或非共价的。在非限制性的具体实施方式中，标记可以是荧光、磷光、发光、电发光、化学发光，或可以显示出拉曼或其它光谱特征的任何大体积基团。可以料到，实质上可使用任何能够检测并识别标记核苷酸220的技术，包括可见光、紫外线及红外线光谱法、拉曼光谱法、核磁共振、正子发射断层成像、扫描探针显微术及其它本领域所知的方法。在特定的具体实施方式中，核苷酸前体可以于合成互补链230，240，250之后、检测标记核苷酸220之前，用大体积基团作二次标记。
实体前面的术语“一个”(″a″或″an″)表示一个或超过一个实体。
如在此使用的，″操作上偶联(operably coupled)″是指在装置100和/或系统的两个或更多个单元之间有功能性的相互作用。例如，如果计算机可以获取、处理、储存和/或传输由检测器检测到的信号的数据，则所述检测器″操作上偶联″至所述计算机。核酸
模板分子200可通过本领域普通技术人员所知的技术来制备。在本发明的某些具体实施方式中，模板分子200为自然发生的DNA或RNA分子，例如，染色体DNA或信使RNA(mRNA)。实质上，任何自然发生的核酸都可以通过在此揭露的方法来制备和测序，包括不限于染色体DNA、线粒体DNA或叶绿体DNA，或核糖体RNA、不均一核RNA或信使RNA。将要被测序的核酸可利用本领域已知的标准方法从原核生物或真核生物来源获得。
制备及分离各种形式的核酸的方法是已知的。(见，例如，1987年纽约Academic Press出版，Berger和Kimmel，″Guide to MolecularCloning Techniques″；及1989年纽约Cold Spring Harbor Press出版，Sambrook，Fritsch和Maniatis，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版″)。任何已知的制备模板核酸200的方法都可用于在此揭露的方法。标记的核苷酸前体
各反应室110，120，130，140可以包含一种标记的核苷酸前体，以便产生随机标记的互补链230，240，250。核苷酸前体共价附着于各种标记，如荧光标记，它们可从标准的商业来源获得(如，MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)。或者，可利用本领域已知的标准技术来制备标记核苷酸前体。任何已知的用以制备标记核苷酸前体的方法都可用于实施本发明所要求保护的主题。
在非限制性的实施例中，添加到反应室110，120，130，140中的标记核苷酸前体的百分率为10％，虽然标记核苷酸前体在反应室110，120，130，140中的量可以占所述室110，120，130，140中同种类型的核苷酸总量的0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％。例如，如果反应室110包含标记的腺苷核苷酸前体，室110可以包含10％的标记腺苷核苷酸和90％未标记腺苷核苷酸，以及未标记胞嘧啶、鸟嘌呤及胸腺嘧啶核苷酸。
使用较低百分率的标记核苷酸220可以使信号扩展(stretching)。两个相邻核苷酸之间的正常距离为1/3nm。如果10％的核苷酸前体被标记，则在互补核酸230，240，250中两个相邻的标记核苷酸220之间的平均距离约为13.6nm。由相邻的标记核苷酸220之间的这个距离延展开去的距离可以利用如电导率测量、分光光度分析、AFM或STM来检测。这些方法无法区分相隔1/3nm的标记。标记可利用本领域已知的任何检测器来检测，如分光光度计、发光计、NMR(核磁共振)、质谱仪、成像系统、电荷耦合器件(CCD)、CCD照相机、光电倍增管、雪崩光二极体、AFM或STM。
在本发明的各种具体实施方式中，带有整合的活性基团和/或半抗原的核苷酸前体可以附着有二次标记物，如抗体。可以使用本领域已知的任何形式的可检测标记，如，拉曼标签、荧光团、生色团、放射性同位素、酶标签、抗体、化学发光、电发光、亲和标记等。本领域技术人员会明白这些或其它未提及的已知的标记可用于在此公开的方法。
可使用的标记部份可以是荧光团，如Alexa 350、Alexa 430、AMCA(7-胺基-4-甲基香豆素-3-乙酸)、BODIPY(5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸)630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL(荧光素)、BODIPY-R6G(6-羧基若丹明)、BODIPY-TMR(四甲基若丹明)、BODIPY-TRX(得克萨斯红-X)、瀑布蓝、Cy2(花青-2)、Cy3、Cy5、5-羧基荧光素、荧光素、6-JOE(2′7′-二甲氧基-4′5′-二氯-6-羧基荧光素)、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿5、太平洋蓝、若丹明绿、若丹明红、ROX(6-羧基-X-若丹明)、TAMRA(N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基若丹明)、四甲基若丹明、和得克萨斯红。荧光或发光标记物可从标准的商业来源获得，如Molecular Probes公司(Eugene，OR)。
在本发明的某些具体实施方式中，核苷酸可以用大体积基团来标记。非限制性的这样的大体积基团的例子包括抗体、量子点及金属基团。抗体可以用可检测的标记来标记。所述的可检测的标记可选自酶、顺磁材料、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或生物素、荧光团、生色团、化学发光团、重金属和放射性同位素。
用作标记的金属基团可以组成一种类型的金属，如金或银，或金属混合物。在本发明的特定的实施方式中，金属基团可以包括纳米颗粒。制备纳米颗粒的方法是已知的(如，美国专利6,054,495；6,127,120；6,149,868；Lee和Meisel，J.Phys.Chem.86：3391-3395，1982；Jin等，2001)。纳米颗粒也可从商业来源获得(如，Nanoprobes公司，Yaphank，NY；Polysciences公司，Warrington，PA)。在一些具体实施方式中，纳米颗粒可以在附着于核苷酸之前互相交联。纳米颗粒的交联方法在本领域是已知的(如，Feldheim，″Assembly of metal nanoparticle arraysusing molecular bridges″，Electrochemical Society Interface，2001年秋，22-25页)。可以使用的交联的纳米颗粒包括，例如，单体、二聚体、三聚体、四聚体等，以便为不同类型的核苷酸提供可区分的标记。尽管可以期望纳米颗粒是任何尺寸，但在本发明的特定具体实施方式中，纳米颗粒的直径约为0.5至5nm。
用作大体积基团的抗体也可以用纳米颗粒来标记。金纳米颗粒表面可以带上马来酰亚胺功能性，这允许抗体、蛋白及肽经巯基的共价连接。(Monomaleimido NANOGOLD
Figure S03814178719960327D000101
，Integrated DNA Technologies公司，Coralville，Iowa.)。用纳米颗粒标记抗体和/或核苷酸的技术是已知的。例如，抗体在使用温和的还原剂如盐酸巯乙胺(MEA)还原铰链区的二硫键后可用金纳米颗粒标记。被还原的抗体与MEA分离后便能与Monomaleimido NANOGOLD
Figure S03814178719960327D000102
反应。可以利用凝胶排阻色谱来将偶联的抗体与游离的金纳米颗粒分离。抗体片断可以相似的方式标记。金纳米粒子也能直接附着于含有巯基的标记的核苷酸前体。引物
引物可由本领域已知的任何方法获得。一般，引物的长度在10至20个碱基长度之间，虽然较长的引物也可以使用。在本发明的某些具体实施方式中，引物是被设计成准确地与模板核酸分子200的已知部份互补。在本发明的一个具体实施方式中，引物位于靠近模板核酸200的3′端。任何序列的引物的合成方法是已知的，例如，应用亚磷酰胺化学，使用自动核酸合成仪来合成，这样的设备可从标准的来源获得，如Applied Biosystems公司(Foster City，CA)或Millipore公司(Bedford，MA)。
本发明的其它具体实施方式涉及在缺乏已知的引物结合位点的情况下对核酸进行测序。在这样的情况下，可以使用随机引物，如随机的六聚体或7、8、9、10、11、12、13、14、15个碱基或更长的随机寡聚体，从而启动互补链230，240，250的聚合。为避免单个模板链200上具有多个聚合位点，在启动合成反应之前将在于固定表面的附着位点附近与模板分子200杂交的引物以外的引物利用已知的方法移去。反应室
在本发明的某些实施方式中，使用四个反应室110，120，130，140来执行测序分析。一个反应室110，标示为″A″，包含标记dATP。第二室120标示为″C″，包含标记dCTP。第三室130标示为″G″，包含标记dGTP。第四室140标示为″T″，包含标记dTTP(或标记dUTP)。各反应室110，120，130，140被设计成能够在水环境中容纳核酸模板200、引物、聚合酶及核苷酸前体。在本发明的一些具体实施方式中，核酸可以附着在反应室110，120，130，140内的固定表面上。在本发明的某些具体实施方式中，反应室110，120，130，140被设计为温度控制，例如，通过整合Pelletier组件或通过利用本领域已知的其它方法。在核酸聚合反应中所使用的控制小容积液体温度的方法为本领域所知(如，美国专利5,038,853，5,919,622，6,054,263和6,180,372)。
在本发明的某些具体实施方式中，反应室110，120，130，140可以在操作上偶联至一个或多个流体信道，例如，提供与分子分配器、废物孔、模板200进料孔或核苷酸来源的连接。所有这些组件都可以以批量制造方法来制造，如在计算机芯片制造或毛细管芯片制造领域所知的。在本发明的一些具体实施方式中，反应室110，120，130，140及装置100的其它组件可制成单个一体化芯片。这样的芯片的制造方法为本领域所熟知，如光刻法和蚀刻。然而，制造方法并不受限，本领域所知的其它方法可以使用，如激光消蚀、注模、浇铸或压印技术。对于本发明的某些具体实施方式，可以使用纳机电系统的制造方法。(见，例如Craighead，Science 290：32-36，2000)。微制造的芯片可以作为商品获得，如购自Caliper Technologies公司(Mountain View，CA)及ACLARA BioSciences公司(Mountain View，CA)。
构成反应室110，120，130，140和装置100的其它组件的材料可选择为可以透过在检测单元所使用的激发和发射频率处的电磁辐射。玻璃、硅和任何在可见频率范围内透明的其它材料都可用来构建装置100。在本发明的其它具体实施方式中，装置100的某些部份和/或附属器件的设计容许原子力显微镜或扫描穿隧显微镜的尖端来扫描标记的互补链230，240，250，以便测量大体积基团之间的距离。DNA定向
使用大体积基团220来标记的互补核酸链230，240，250在用AFM或STM扫描之前可以先在表面上被定向。表面上定向核酸分子的技术为本领域所知(如，美国专利5,840,862；6,054,327；6,225,055；6,265,153；6,303,296；6,344,319)。在非限制性的例子中，可合成多个标记的核酸链230，240，250。表面如硅化的、涂覆有金的或其它衍生化的玻璃片，可以浸入反应室内，并容许标记核酸230，240，250的一端结合于该表面。例如，所使用的引物可以在其5′端共价连接于生物素，而所述表面可以覆有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。含有结合的标记核酸230，240，250的表面可以从溶液中缓慢提出。由于空气液体界面的凹凸性，当结合的核酸230，240，250穿过所述界面时，它们在方向上变得相互平行，这使得标记核苷酸220之间距离可以通过AFM或SPM扫描更准确地确定。纳米孔
在本发明的某些具体实施方式中，装置100可以包括一个或者多个纳米孔150。在本发明的某些具体实施方式中，纳米孔150的直径在1至10nm之间。在特定的具体实施方式中，纳米孔150位于脂质双层膜内。在非限制性的例子中，α溶血素亚基可以自组装成1.5nm的纳米孔150，其形成于脂质双层内。例如120伏的电势差可以被施加于所述的脂质双层，这使得离子可以流过纳米孔150。单链标记核酸230，240，250通过纳米孔时会阻断离子的流动，这使得可以通过阻断振幅(blockadeamplitude)或阻断动力学(blockade kinetics)来确定标记核苷酸220之间的距离。利用Axopatch 200B仪器(Axon Instruments，Foster City，CA)可以测量并记录通过纳米孔150的离子流的波动。数据可以使用pClamp6软件(Axon Instruments，Foster City，CA)来分析。
本发明的具体实施方式并不限制纳米孔150的类型。在本领域已知的任何纳米孔150都可用于在此公开的方法。直径约为2.6nm的纳米孔150容许双链核酸分子230，240，250通过。在用大体积基团来标记核苷酸220的本发明的具体实施方式中，纳米孔150可以较大以容许标记的核酸230，240，250通过。
在本发明的某些具体实施方式中，可利用下面已知的纳米微影术(nanolithography)在固态基质如硅、氧化硅、二氧化硅或锗芯片上构建纳米孔150，其包括但不限于：化学蒸汽沉积、电化学沉积、化学沉积、电镀、热扩散及蒸发、物理蒸汽沉积、溶胶沉积、聚焦电子束、聚焦离子束、分子束外延(molecular beam epitaxy)、蘸水笔纳米微影术(dip-pen nanolithography)、反应离子束蚀刻、化学辅助离子束蚀刻、微波辅助等离子体蚀刻、电氧化、扫描探针方法、化学蚀刻、激光消蚀或任何本领域所知的其它方法(如，美国专利6,146,227)。
在本发明的各种具体实施方式中，纳米孔150可以穿透芯片内的一个或者多个传感器层。传感器层可以包括半导体材料，包括但不限于硅、二氧化硅、锗、砷化镓和基于金属的物质(如金属或金属氧化物)。在本发明的一些具体实施方式中，传感器层可以通过电子束、离子束和/或激光微影术和蚀刻来产生通道、沟或孔。在本发明的其它具体实施方式中，通道、沟或孔可以涂有有机或无机沉积物以减小所述通道、沟或孔的直径，或提供特别形式的表面，如亲水性表面。含有金属的电导传感器层可以沉积在半导体表面上，其可以利用来自扫描穿隧显微术(STM)或原子力显微术(AFM)尖端或溶液的场蒸发。可以通过将半导体表面氧化为绝缘物来形成绝缘传感器层。
在本发明的某些具体实施方式中，通道或沟可以利用本领域所知的各种技术蚀刻到半导体表面，包括但不限于，在氧化物蚀刻溶液中运用STM/AFM尖端的方法。通道形成后，相对的两个半导体表面可以产生一个或多个穿透所述半导体的纳米孔150。在本发明的其它具体实施方式中，可以应用扫描探针、化学蚀刻技术和/或微加工在半导体基材中切割出微米或纳米尺寸的孔150。
在本发明的一些具体实施方式中，纳米孔150可以利用高通量的电子束微影系统制造(如，http://www.mdatechnology.net/techsearch.asp？articleid＝510)。可以使用电子束微影在硅芯片上书写小至5nm的特征。涂在硅表面上的灵敏抗蚀层如聚甲基丙烯酸酯可以生成图案而不必使用掩模。电子束阵列可以将场发射器簇与微信道放大器组合起来以增加电子束的稳定性，这容许低电流的操作。在本发明的一些具体实施方式中，可以使用SoftMaskTM计算机控制系统来控制半导体芯片基材上纳米尺寸特征的电子束微影。
在本发明的可供选择的具体实施方式中，纳米孔150可以使用聚焦原子激光来产生(如，Bloch等，″Optics with an atom laser beam″，Phys.Rev.Lett.87：123-321，2001)。聚焦原子激光可以用于微影术，非常类似于标准激光或聚焦电子束。这样的技术能于芯片上产生微米尺寸或甚至纳米尺寸的结构。在本发明的其它可供选择的具体实施方式中，使用蘸水笔纳米微影来形成纳米孔150(如，Ivanisevic等，″Dip-PenNanolithography on Semiconductor Surfaces″，J.Am.Chem.Soc.，123：7887-7889，2001)。纳米孔150可以通过应用蘸水笔纳米微影并结合常规的光蚀刻技术来形成。
在本发明的其它具体实施方式中，可以使用离子束微影术在芯片上产生纳米孔150(如，Siegel，″Ion Beam Lithography″，VLSIElectronics，Microstructure Science，Vol.16，Einspruch和Watts，AcademicPress，New York出版，1987)。可以使用精细的聚焦离子束直接在抗蚀层上书写纳米尺寸特征而不使用掩模。作为选择，可以结合使用宽的离子束和掩模来形成尺寸小至100nm的特征。举例来说，可使用氢氟酸来进行化学蚀刻，以移除暴露的硅或其它不受抗蚀层保护的芯片材料。技术人员会明白上面公开的技术并不是限制性的，纳米孔150可通过本领域所知的其它方法来形成。检测单元
本发明的具体实施方式并不受所使用的检测单元的类型的限制，任何已知的检测单元都可用于在此公开的方法和装置100。SPM检测器
在本发明的某些具体实施方式中，检测单元可以包括扫描探针显微镜(SPM)。在本发明的特定具体实施方式中，检测单元可以包括扫描穿隧显微镜(STM)。STM的恒电流模式可以测量不规则的表面，如用大体积基团标记的核苷酸220，并可测量和记录这样的标记220之间的距离。STM使用削成单原子点的窄金属尖端来扫描样本，所述尖端借助于压电材料与扫描器物理联系，以容许在原子尺度研究电传导表面。这由施加小的偏电压于尖端和样本之间而实现。如果两者之间的距离较大，则其间并无电流流动。反之，如果尖端很靠近样本而无实际接触，则二者之间有电流流动。尖端和样本之间的这种电流的测量使得DNA分子表面的原子信息可以被制成图谱，从而可以在附着有大体积基团的标记核苷酸220通过该尖端时确定所述大体积基团之间的距离。
在本发明的另一具体实施方式中，检测单元可以包括原子力显微镜(AFM)。使用传导性AFM时，尖端保持与样本接触，应用悬臂偏转信号(cantilever deflection signal)来维持尖端和样本之间的恒定力，从而产生拓扑图像。当施加一个DC偏压至尖端时，样本保持为接地电势，在扫描器头部的预放大器测量通过尖端和样本之间的电流，从而产生图像。如此便容许利用在附着至标记核苷酸220的大体积基团通过尖端时所测量到其间的距离来构建碱基距离图310，320，330，340。
在本发明的可供选择的具体实施方式中，检测单元可以包括其它SPM，如磁力显微镜、侧向力显微镜、力调制显微镜、相位检测显微镜、静电力显微镜、扫描热显微镜、近场扫描光学显微镜、脉冲力模式和微热分析。这样的检测单元的使用方法为本领域所熟知。电检测器
在本发明的一些具体实施方式中，电检测器可以在操作上偶联至一个或多个电导层、电源和与所述电导层垂直并穿过所述电导层的一个或多个纳米孔150。所述检测器包括电流计、电压计、电容计和/或电导率计，以测量感生电流、电压、电阻等。在某些具体实施方式中，其它电组件如电阻器或电容器可以包括在检测器的相关电路中。
在本发明的一些具体实施方式中，反应室110，120，130，140可以填充有低电导率的含水缓冲液。将电势施加至纳米孔150两侧的电导层。如果只有缓冲液在该纳米孔150内，电导层之间的电阻是高的。核酸的未标记区域通过纳米孔150时会造成纳米孔150内的电导率稍微增加。用具有较高电导的标记物如金属纳米颗粒进行标记的核苷酸220通过时会造成电导率大大增加，因而在检测器上产生可检测的信号。信号之间的时间间隔可以被测量，从而确定标记核苷酸220之间的距离。
在本发明的特定具体实施方式中，穿过纳米孔150的电流可以转换成电压并加以放大，其中可以利用Axopatch 200A(Axon Instruments，Foster City，CA)或Dagan 3900A片钳放大器(Dagan Instruments，Minneapolis，MN)。使用Frequency Devices(Haverhill，MA)的低通Bessel过滤器过滤信号。使用National Instruments(Austin，TX)AT-MIO-16-X 16位板和LAB WINDOWS/CVI程序将资料数据化。芯片使用钼金属盒(Amuneal，Philadelphia，PA)来屏蔽电和磁的噪声源。分光光度检测器
在本发明的可供选择的具体实施方式中，附着有发光标记的标记核苷酸220可以用光源和光检测器加以检测，如二极管激光发射器和光纤或光敏晶体管检测器。(如，Sepaniak等，J.Microcol.Separations1：155-157，1981；Foret等，Electrophoresis 7：430-432，1986；Horokawa等，J.Chromatog.463：39-49 1989；美国专利5,302,272)。其它典型的光源包括垂直共振腔表面放射激光、边射型激光、表面放射激光和量子腔激光(quantum cavity lasers)，例如，Continuum公司的Nd-YAG抽运钛：蓝宝石可调固相激光和Lambda Physik的激态原子抽运染料激光。其它的示范性光检测器包括光二极管、雪崩光二极管、光电倍增管、多阳极光电倍增管、光敏晶体管、真空光二极管、硅光二极管和电荷耦合器件(CCD)。
在本发明的一些具体实施方式中，光检测器、光源和纳米孔150可以应用已知的N-well Complementary Metal Oxide Semiconductor(CMOS)方法(Orbit Semiconductor，Sunnyvale，CA)制成半导体芯片。在本发明的可供选择的具体实施方式中，检测器、光源和纳米孔150可以应用绝缘硅CMOS方法来制作(如，美国专利6,117,643)。在本发明的其它可供选择的具体实施方式中，可以将二极管激光发射器和CCD检测器的阵列置于半导体芯片上(美国专利4,874,492和5,061,067；Eggers等，BioTechniques 17：516-524，1994)。
在本发明的特定具体实施方式中，可以使用高灵敏的冷CCD检测器。冷CCD检测器具有达80％的单光子检测能力、高的空间分辨像素尺寸(5μm)以及从可见光到近红外线光谱的灵敏性。(Sheppard，Confocal Microscopy：Basic Principles and System Performance in：Multidimensional Microscopy，P.C.Cheng等，Springer-Verlag，NewYork，NY出版，1-51页，1994)。在本发明的另一具体实施方式中，可以使用线圈图象增强耦合器件(ICCD)作为实现单光子计数水平的光检测器(美国专利6,147,198)。少量的光子引起电子雪崩而撞击到磷屏幕上，从而产生光亮的图像。此磷光图象由连接有放大器的CCD芯片经光纤耦合器来感应。在本发明的一些具体实施方式中，芯片上的CCD检测器可以感应紫外线、可见光和/或红外光谱光(美国专利5,846,708)。
在本发明的一些具体实施方式中，纳米孔150可以在操作上偶联至半导体芯片上的光源和检测器。在本发明的某些具体实施方式中，检测器的位置可以垂直于光源以减少背景光。由发光标记物的激发所产生的光子可以由光纤来收集。收集的光子传送至CCD检测器，所述光被检测并量化。检测到标记核苷酸220的时间可以被记录，核苷酸距离图谱310，320，330，340可以被构建。将光纤置于半导体芯片上并在操作上与CCD检测器接触的方法是已知的(美国专利6,274,320)。
在本发明的一些具体实施方式中，可以制作雪崩光二极管(APD)来检测较低的光水平。APD方法应用了光二极管阵列以达到电子增倍效应(美国专利6,197,503)。在本发明的其它具体实施方式中，光源如发光二极管(LED)和/或半导体激光可以整合到半导体芯片(美国专利6,197,503)。使激光或二极管光束成形的衍射光学组件也可以整合到芯片。
在本发明的某些具体实施方式中，光源产生电磁幅射，其可激发光灵敏性标记，如附着于核酸上的荧光素。在本发明的一些具体实施方式中，空气冷却的氩激光在488nm激发荧光素标记的核酸分子230，240，250。发出的光由收集光学系统来收集，所述的收集光学系统包括光纤、透镜、成像分光计和0℃热电泠却CCD相机。荧光检测器的另外例子为本领域所知(美国专利5,143,8545)。核酸序列的确定
在本发明的一些具体实施方式中，确定互补核酸230，240，250的序列210包括构建450各种类型的标记核苷酸220的距离图谱310，320，330，340，并将距离图谱310，320，330，340进行比对520以产生完整的序列210(图4及图5)。模板核酸200的序列将会与所述的已确定的序列210准确互补。在示范性的具体实施方式中，根据图4的方法来构建450各种类型的标记核苷酸220的距离图谱310，320，330，340。在互补链230，240，250进行随机的标记，并检测标记核苷酸220，这样可以得到被标记220的各链230，240，250中核苷酸的百分率分布。标记核苷酸220的百分率会随着所应用的标记程序和检测方案而有所变化。在一个具体实施方式中，互补链230，240，250上同一类型的核苷酸中有约10％被标记220，以确保能够容易地检测标记核苷酸220之间的距离。标记互补链230，240，250合成之后，获得410标记核苷酸220之间的距离(图2)。所获得的标记核苷酸220之间的距离410如图2所图示。可利用已获得的距离410来构建450各种类型标记核苷酸220的距离图谱310，320，330，340。
在本发明的各种具体实施方式中，要对所获得的距离420进行交叠分析(overlap analysis)。如此有助于对所述距离进行比对，这样互补链230，240，250可以在同一位置开始和结束。在一个具体实施方式中，交叠分析420包括将位置的交叠最大化。因为大量的互补链230，240，250被使用，所以序列210中的各核苷酸在不同的互补链230，240，250中会被标记许多次。所以，最大化交叠可以比对所获得的距离420，这样，各互补链230，240，250上标记420核苷酸220的位置便对应起来。为了比对所获得的距离，作为交叠分析的替代或者补充，还可以应用其它的方法，如独特地标记互补链230，240，250的起始或结束。在所获得的距离经比对420后，可以进行频率分析430以确定各标记位置周围的标记核苷酸220的数目。在一个具体实施方式中，由于标记和检测方法中的量大、独立及均匀的属性，可以推出，在各互补链230，240，250上各位置的标记核苷酸220被标记的概率与在单条链上被标记的概率大约相等。如此，在使用了10％的标记核苷酸220的实施例中，如果使用了1000条链230，240，250，则在单个位置处的核苷酸被标记220的次数为1000的10％，也就是100次。
应用这种结论，便能确定对于独立的检测来说靠得十分接近的标记核苷酸220的数目。例如，标记概率为10％，并使用1000条标记的互补链230，240，250，如果在给定的位置有102条链230，240，250显示有标记核苷酸220的话，便可推论该位置被一个标记核苷酸220占据，而并没有由于靠近而致使检测错误发生的别的标记核苷酸220。另一方面，如果在给定位置处有197条链230，240，250显示有标记核苷酸220的话，便可推论有两个标记核苷酸220存在，一个在所述的给定位置上，第二个因太接近而无法准确测量。同种类型的标记核苷酸220可以彼此相邻，或者由一个或多个不同类型的核苷酸间隔开。如果两个或多个同种类型的核苷酸位于相邻的位置，便可应用相同的分析。如果相邻的两个核苷酸完全相同，则可以预料该位置被标记通常情况下的两倍，如果三个相邻核苷酸都是完全相同，便被标记通常情况下的三倍，以此类推。
如果在独立的测量中确定了两个或者更多个标记核苷酸220的位置十分接近，便可以进行信号分析440以确定空间关系。例如，由被一个其它核苷酸隔开的两个标记核苷酸220所产生的信号不同于由两个相邻标记核苷酸220所产生的信号，也不同于由被二个其它核苷酸隔开的两个标记核苷酸220所产生的信号。也可以使用其它的方法来区别间隔靠近的相同核苷酸之间的空间关系。在本发明的特定具体实施方式中，可以实施频率分析430来确定标记核苷酸220的相对位置。例如，为了区别排成一行的三个标记核苷酸220与被一个其它核苷酸隔开的两个标记核苷酸220，其中一种情况的信号的发生通常只有另一种信号的2/3。频率和信号分析在所要求保护的方法中可按任意顺序执行。
如图4和图5所公开，可以构建450各种类型标记核苷酸220的距离图谱310，320，330，340。虽然所有四种类型的核苷酸220都可以被标记并构建出450距离图谱310，320，330，340，但在本发明的可供选择的具体实施方式中，可以只标记并分析四种核苷酸中的三种220。在这样的具体实施方式中，第四种类型核苷酸的位置可以通过另外三种类型核苷酸的已比对520的距离图谱310，320，330，340中的间隙来推导出。可通过比对520不同类型标记核苷酸220的距离图谱310，320，330，340来确定出完整的核酸序列210。在本发明的某些具体实施方式中，可以使用非交叠的规则来比对520距离图谱310，320，330，340。根据那个规则，两种不同的核苷酸不能占据序列210中的同一位置。
在本发明的一些具体实施方式中，距离图谱310，320，330，340可以一次一个地比对520，其中从具有最大数目的标记核苷酸220的距离图谱310，320，330，340开始。如果超过一个的可能比对被发现，可根据最小序列210长度规则来选择可产生最短序列210的比对。如果别的距离图谱310，320，330，340不能够无交叠地进行比对520，则可以反复评估所述比对直到获得无交叠的比对为止。如果距离图谱310，320，330，340的比对不存在以致于无重叠规则被完全观察到，则反复评估距离图谱310，320，330，340的另外构建450，直到获得无交叠的序列210为止。
在本发明的某些具体实施方式中，该测序方法可针对大部份核酸产生良好比对的序列210，但是一个或者多个短的片断有交叠发生或者其序列210模糊。操作者可以检查在分析中任何一个点的数据，并决定是否整个核酸序列必须重序列，或仅是核酸模板200的短的区域必须重序列。序列210分析的结果的这种评估为本领域所熟知，就像熟知现有的核酸测序方法一样。这种决定可以基于数据的统计分析由计算机自动完成或由使用者作出。
在本发明的另一具体实施方式中，涉及序列210的距离图谱310，320，330，340的开始和结束可能是已知的。在这种情况下，比对520可以包括排列所述距离图310，320，330，340的已知端。信息处理和控制系统以及数据分析
在本发明的某些具体实施方式中，测序装置100可以包括信息处理和控制系统。所述具体实施方式并不限制所使用的信息处理和控制系统的类型。示范性的信息处理和控制系统可以整合有计算机，其包括用于交流信息的总线和用于处理信息的处理器。在本发明的一个具体实施方式中，处理器是选自Pentium系列的处理器，包括但不限于Intel公司(Santa Clara，CA)的PentiumII、Pentium
Figure S03814178719960327D000203
III和Pentium
Figure S03814178719960327D000204
4处理器。在本发明的可供选择的具体实施方式中，处理器为CeleronItaniumPentium Xeon或X-级处理器(Intel Corp.，Santa Clara，CA)。在本发明的其它具体实施方式中，处理器是基于Intel
Figure S03814178719960327D000208
结构，如IntelIA-32或IntelIA-64结构。作为选择，其它处理器也可以使用。
计算机可以进一步包括随机存储器(RAM)或其它动态储存装置、只读存储器(ROM)和/或其它静态储存，以及数据储存装置如磁盘或光盘及其驱动。信息处理和控制系统也可以包括其它本领域已知的外围设备，如显示设备(如，阴极射线管或液晶显示器)、字母数字输入装置(如，键盘)、光标控制装置(如，鼠标、追踪球或光标方向键)以及通信装置(如，调制解调器、网络适配卡或用于偶联至因特网、令牌网或其它类型网络的接口设备)。
在本发明的特定实施方式中，检测单元也可以偶联至所述总线。来自检测单元的数据由处理器处理并储存于主存储器。处理器可以根据检测标记核苷酸220的时间间隔计算出标记核苷酸220之间的距离。核苷酸距离可被储存于主存储器内，并通过处理器用来构建450各反应室110，120，130，140的距离图谱310，320，330，340。处理器也可对距离图谱310，320，330，340进行比对以生成互补核酸序列210，从中可以获得模板核酸序列200。
可以了解到，其配置不同于上述例子的信息处理和控制系统也可用于特定的实施方式。所以，本发明的不同具体实施方式中的系统配置可以不同。也应该注意到，虽然在此描述的方法可在程控的处理器控制下执行，在本发明的其它可供选择的具体实施方式中，本方法可完全或部分由任何可编程逻辑或硬编码逻辑，例如，现场可编程序门阵列(FPGA)、TTL逻辑或特定用途集成电路(ASIC)，来加以执行。另外，本方法可以通过程控的通用计算机组件和/或定制的硬件组件的任何组合来加以实施。
在本发明的某些具体实施方式中，可以应用定制的软件包来分析由检测单元所获得的数据。在本发明的可供选择的具体实施方式中，可以应用信息处理和控制系统及市售的软件包来进行数据分析。用于DNA序列210分析的市售软件的例子包括但不限于PRISMTM DNA测序分析软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)、SequencherTM软件包(Gene Codes，Ann Arbor，MI)以及经National BiotechnologyInformation Facility，网址www.nbif.org/links/1.4.1.php获得的各种软件包。实施例
下列的实施例是用来说明本发明的特定的具体实施方式。然而，本领域技术人员应该明白，基于本发明，可以对在此公开的特定细节作出许多改变，它们仍能获得相同或类似的结果，而不脱离在此所要保护的主题。实施1：DNA测序
用限制性酶消化1.2μg的染色体DNA，以便能够分离出感兴趣的片断。所述的感兴趣的片断可以大约有400,000个拷贝。可以增加将要被消化的基因组DNA的量以获得400,000个拷贝。将分离出来的片断分成四个子样本(sub-samples)，分别以A、G、T和C来表示。在各反应室110，120，130，140内可以约有100,000个拷贝的感兴趣的片断。使各DNA子样本变性，然后与特定的寡核苷酸引物发生退火，在所述引物的5′端有生物素。向各反应室110，120，130，140添加200μM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和DNA聚合酶。另外，向各反应室110，120，130，140添加20μM的硫醇衍生化的核苷酸前体。例如，第一反应室110包含20μM的巯基-dATP，第二反应室120包含20μM的巯基-dCTP，第三反应室130包含20μM的巯基-dGTP，第四反应室140包含20μM的巯基-dTTP。产生整合有衍生化核苷酸前体的DNA互补链230，240，250。将1nm金颗粒与衍生化核苷酸交联，并利用清洗将与标记核苷酸220交联的金颗粒与游离的金颗粒分离。
使DNA互补链230，240，250与固定在平表面一边的链霉抗生物素蛋白结合。通过分子梳(“molecular combing”)使分子定向，使固定的DNA分子在所述的平表面上固定化(见美国专利5,840,862；6,054,327；6,225,055；6,265,153；6,303,296；6,344,319)。
利用STM或AFM扫描DNA互补链230，240，250的金颗粒，并记录标记核苷酸220上的金颗粒之间的距离。对多条标记核酸230，240，250重复这样的扫描过程，以获得在各反应室110，120，130，140内标记核苷酸220的一组有交叠的距离。每一组标记核苷酸220距离代表了对单个标记核酸230，240，250的距离测量。
将从各个反应室110，120，130，140的互补链230，240，250测到的标记核苷酸220之间的所有距离组合起来，可以构建450出所述各反应室110，120，130，140的碱基距离图谱310，320，330，340。使用一种算法来评估所有测量到的距离之间的交叠420、分析信号频率430和分析信号440本身，从而构建450出距离图谱310，320，330，340。计算机程序应该通过搜寻来找出所有被扫描的DNA互补链230，240，250中最大和最均匀的交叠。
通过比对520四个距离图谱310，320，330，340并消除交叠，可以组装出DNA序列210。可以应用计算机程序来完成该功能。当比对520距离图谱310，320，330，340时，有效的办法可以是，寻找具有最多数目的碱基的距离图谱310，320，330，340和具有第二多数目的碱基的距离图谱310，320，330，340，并对它们进行比对。当比对520所述图谱310，320，330，340时，应该利用非交叠规则和最小序列210长度规则。计算机应该只找出一个可能的匹配。接着比对520第三个距离图谱310，320，330，340。利用非交叠规则和最小序列210长度规则来将此距离图谱310，320，330，340合并到先前合并的图谱310，320，330，340。以同样的方式对第四个距离图谱310，320，330，340进行处理以产生完整的核酸序列210。如果经比对的距离图谱310，320，330，340导致两个或者更多个不同类型的核苷酸位于该序列210的相同位置，则利用不同的比对来重复比对过程。如果在产生的序列210中没有重叠碱基，序列210中也没有间隙，则完成了数据分析。
所有在此揭露和要求保护的组合物、方法和装置100都可根据在此公开的内容来制作和执行而无需过度的实验。虽然公开的组合物、方法和装置100已用本发明的具体实施方式加以描述，然而，对于本领域技术人员明显的是，可以加以改变而不背离在此所要求保护的主题的原理、精神和范围。更具体地说，显然，在化学和生理上相关的某些试剂可以取代在此所述的试剂，并能达到相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有这类类似的替代和修饰均在所附的权利要求所限定的要求保护的主题之内。

Claims (27)

1.一种方法，包括：
(a)将模板核酸分成四个样本；
(b)通过将核苷酸前体整合成链，合成与所述模板核酸序列互补的核酸链；
(c)通过将标记基团附着至至少部分的所述核苷酸前体而标记(b)的所述核苷酸前体，并且所述四个样本的每一个含有不同类型的标记核苷酸前体；
(d)在表面上定向在(b)中所产生的每一个互补核酸链；
(e)通过扫描探针显微镜术测量各样本中与各互补链结合的所述基团之间的距离；
(f)对(e)中测得的距离进行交叠分析，构建各样本的距离图谱；
(g)比对(f)的距离图谱，将所述距离图谱组合成为互补链的核酸序列；以及
(h)基于所述互补链的序列，确定所述模板核酸的序列。
2.根据权利要求1的方法，进一步包括通过交叠数据分析和频率分析来分析所测量到的距离，从而构建出距离图谱。
3.根据权利要求1的方法，其中所述距离图谱是通过非交叠数据分析而被组合为序列。
4.根据权利要求1的方法，其中所述基团是在合成互补核酸链之前或之后附着至核苷酸。
5.根据权利要求4的方法，其中所述基团选自有机基团、量子点、抗体和金属基团。
6.根据权利要求5的方法，其中所述金属基团为纳米颗粒。
7.根据权利要求6的方法，其中所述纳米颗粒为金或银，所述纳米颗粒的大小为0.5与5.0纳米之间。
8.根据权利要求1的方法，其中所述基团之间的距离通过原子力显微镜术或扫描穿隧显微镜术来测量。
9.根据权利要求1的方法，其中各样本含有100000个拷贝的模板核酸。
10.根据权利要求1的方法，进一步包括将寡核苷酸引物与所述模板核酸杂交，并且其中所述互补核酸链用聚合酶来合成。
11.根据权利要求10的方法，其中所述引物的5′端被附着有生物素。
12.根据权利要求11的方法，其中附着有生物素的所述引物被结合至覆有链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的表面。
13.一种方法，包括：
(a)将模板核酸分到四个室中；
(b)通过将核苷酸前体整合成链，合成与所述模板核酸序列互补的核酸链；
(c)通过将传导性标记附着至至少部分的所述核苷酸前体而标记(b)的所述核苷酸前体，并且所述四个样本的每一个含有不同类型的标记核苷酸前体；
(d)在表面上定向在(b)中所产生的每一个互补核酸链；
(e)移动所述的互补核酸链通过在操作上偶联至检测器的纳米孔，所述检测器检测所述传导性标记；
(f)测量各样本中的各互补链的所述标记核苷酸之间的距离；
(g)对(f)中测得的距离进行交叠分析，构建各室内所述互补核酸序列的距离图谱；
(h)比对(g)的距离图谱，将所述距离图谱组合成为互补核酸链的序列；以及
(i)确定所述模板核酸的序列。
14.根据权利要求13的方法，进一步包括通过交叠数据分析和频率分析来分析所测量到的距离，从而构建出距离图谱。
15.根据权利要求13的方法，其中所述距离图谱是通过非交叠数据分析而被组合为序列。
16.根据权利要求13的方法，其中纳米孔直径为1nm到50nm之间。
17.根据权利要求16的方法，其中纳米孔直径为3nm到10nm之间。
18.根据权利要求16的方法，其中选择纳米孔的直径以容许一次有单条标记核酸链通过单个纳米孔。
19.根据权利要求18的方法，其中所述标记核酸链与模板核酸杂交。
20.根据权利要求13的方法，其中各核酸链的至少一端附着有可区分的标记。
21.根据权利要求13的方法，其中所述传导性标记为金属纳米颗粒。
22.根据权利要求13的方法，其中所述检测器选自电压计、电阻计和电导率计。
23.一种装置，包括：
(a)四个反应室，各室含有在结构上适合附着传导性标记的核苷酸前体，并且所述核苷酸前体的类型特异于各特定室；
(b)位于各反应室内的多个纳米孔；和
(c)与各纳米孔在操作上偶联的检测器，其中所述检测器检测传导性标记。
24.根据权利要求23的装置，进一步包括：(i)信息处理系统；和(ii)数据库。
25.根据权利要求23的装置，其中所述传导性标记是附着至标记核酸链的金属纳米颗粒。
26.根据权利要求23的装置，其中所述反应室和纳米孔为一体化芯片的一部份。
27.根据权利要求23的装置，其中所述检测器选自电压计、电阻计和电导率计。
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