CN1652810A

CN1652810A - 免疫抑制化合物、方法及其相关应用

Info

Publication number: CN1652810A
Application number: CNA038110946A
Authority: CN
Inventors: Z·纳吉; T·布兰德斯特特尔
Original assignee: Agennix AG
Current assignee: Agennix AG
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2003-03-24
Publication date: 2005-08-10
Also published as: BR0308654A; CA2479939A1; WO2003082197A3; AU2003218401B2; US20060004077A1; RU2004131200A; AU2003218401A1; US7629318B2; EP1494701A2; MXPA04009228A; NZ535315A; PL373738A1; KR20040106291A; RU2334760C2; EP1494701A4; WO2003082197A2; JP2005533753A; ZA200407547B

Abstract

本发明涉及用于抑制免疫应答、例如通过抑制II类MHC介导的T细胞活化而抑制免疫应答的组合物和方法。本发明化合物和方法可以用来治疗或预防类风湿性关节炎和/或多发性硬化等疾病。

Description

免疫抑制化合物、方法及其相关应用

发明背景

MHC分子有两种形式：I类和II类，它们都在单基因复合体中编码。MHC基因是高度多态性的：在人群中大多数基因座有多达约100个等位基因(Hansen，T.H.等，1993，″Fundamental Immunology″Paul，W.E.编著，RavenPress，New Yod，NY，第577页)。

I类MHC分子是45kD跨膜糖蛋白，与另一糖蛋白—12kD β-2微球蛋白非共价缔合。后者并没有插入到细胞膜内，且在MHC外编码。人I类分子有三种不同的同种型，称为HLA-A、HLA-B和HLA-C，它们在不同的基因座中编码。I类分子的组织表达是普遍存在和共显性的。几种人和鼠I类分子的三维结构已阐明(Bjorkman，P.J.等(1987)Nature，329，506；Garrett，T.P.J.等(1989)Nature，342，692；Madden，D.R.等(1991)Nature，353，321；Fremont，D.H-等(1992)Science，257，919)。它们的第一和第二胞外结构域折叠成由邻接两个平行α-螺旋部分的β-折叠片层构成的结合部位。所述结合部位将长7-9个氨基酸的抗原肽呈递给抗细胞毒性效应T淋巴细胞(Tc)(Madden等和Fremont等，出处同上)。这些肽中的大多数源自抗原呈递细胞(APC)内合成的蛋白质，例如源自病毒或其它胞内寄生物的蛋白，或者源自错折叠的自身蛋白。根据结合部位内的多态残基，这三种I类同种型以及它们的等位基因形式都具有不同的肽结合特异性(Falk，K.等(1991)Nature，351，290；Falk，K.等(1992)Eur.J.Immunol.，22，277)。在与Tc细胞上选择性表达的CD8分子相互作用的第三种I类结构域上还存在另外的结合部位。Tc细胞活化的第一步是其抗原受体(TCR)与所呈递的肽以及CD8与其同一I类分子上受体位点的同时相互作用。

II类MHC分子是两种跨膜糖蛋白—35kD α链和28kD β链的非共价缔合的异源二聚体。在人类中，II类分子有三种不同的同种型，称为HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。DR中的多态性局限于β链，而这两条链在DP同种型和DQ同种型中都存在多态性。II类分子是共显性表达的，但与I类分子相反，它们表现出局限性组织分布：它们仅存在于免疫系统的细胞表面(在B淋巴细胞和树突细胞上组成型表达，而在T细胞和单核细胞上诱导型表达)。这三种不同的DR分子的三维结构已确定(Brown，J.H.等(1993)，Nature，364，33；Stern，L.J.等(1994)Nature，388，215；Ghosh，P.等(1995)Nature，378，457；Dessen，A.等(1997)Immunity，7，473)。总之，它们的结构与I类分子的结构非常相似。所述肽结合部位由α链和β链的第一结构域构成，这与I类分子相反，它在两侧敞开，使得较长(长12-24个残基)的肽可以结合(Chicz，R.M.等(1992)Nature，358，764)。β链的第二结构域上的另一结合部位与在辅助T(Th)细胞上选择性表达的CD4分子相互作用。该分子对Th细胞具有共同受体功能，这与CD8对Tc细胞具有共同受体功能类似。在II类异源二聚体的生物合成和胞内运输期间，它们陪伴有第三种蛋白即非多态非MHC编码的31kD蛋白(称为不变(Ii))链(Cresswell，P.(1994)Annu.Rev.Immunol.，12，259)。Ii链在II类分子在胞质溶胶内的运输期间保护其肽结合部位，直到它们到达酸性内体区室，在此Ii链被蛋白酶切割，仅留下其在结合部位中的肽，称为CLIP。CLIP与抗原肽的交换由内体中的另一MHC编码的分子(称为HLA-DM)催化(Vogt，A.B.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93，9724)。抗原肽主要来源于被胞吞的外部蛋白(Germain，R.N.(1994)Cell，76，287)。

DR分子和肽之间相互作用的性质已基本了解。在结合部位中存在一个大口袋和额外的小口袋，该大口袋对于与所述肽的疏水性锚定残基相互作用是至关重要的，而这些小口袋含有赋予肽结合一定程度的同种异型特异性的多态β链残基(Stern等，出处同上；Hammer，J.等(1993)J.Exp.Med.，176，1007；Hammer，J.等(1994)Cell.74，197；Hammer，J.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 91，4456；Hammer，J.等(1995)J.Exp.Med.，180，2353)。所述肽主链也与结合部位中的某些保守残基的侧链一起形成重要的氢键，后者决定所结合肽的总体构象和侧链取向(Stern等，出处同上)。

大量的证据证明，对许多疾病、特别是自身免疫病的敏感性与主要组织相容性复合体的特定等位基因密切相关(综述参见Tiwari，J.和Terasaki，P.(1985)，HLA and disease association(New York；SpringerVerlag))。虽然存在某些I类相关疾病，但是已发现大多数自身免疫病与II类等位基因相关。例如II类等位基因DRBl*0101、0401、0404和0405在类风湿性关节炎(RA)患者体内的存在频率增加(McMichael，S.J.等(1977)Arthritis Rheum.，20，1037；Stasny，P.(1978)N.Engl.J.Med.，298，869；Ohta，N.等(1982)Hum.Immunol.，5，123；Schiff，B.等(1982)Ann.Rheum.Dis.，41，403)，而DRB1*1501与多发性硬化(MS)相关，DQ等位基因组合DQA1*0301/B1*0302与胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)相关。在RA中，共有＞94％的类风湿因子阳性患者携带所述敏感性等位基因之一(Nepom，G.T.等(1989)Arthritis，Rheum.，32，15)。

DRB1等位基因对RA的作用以不同的方式表现出来：第一，疾病相关性显示对某一等位基因有人种依赖性偏爱(Ohta等和Schiff等，出处同上)，第二，与其它等位基因相比，DRB1*0401与所述疾病的更严重形式相关(Lanchbury，J.S.等(1991)Hum.Immunol.，32，56)，第三，可以观察到基因剂量效应，因为一个敏感性等位基因或两个敏感性等位基因的组合的纯合性使RA出现更加严重的慢性形式或在青少年中发作(Wordworth，P.等(1992)Am.J.Hum.Genet.，51，585；Nepom，B.S.(1993)Clin.Immunol.Immunopathol.，67，850)。最新的发现表明，DRB1基因座既可以控制所述疾病的发生，又可以控制所述疾病的发展。

由RA相关DRB1等位基因编码的DRB链表现出多态性差异，但全都在位置67-74处共享一段相同的或几乎相同的氨基酸序列，称为“共享表位”(Nepom等，(1989)，出处同上；Gregersen，P.K.等(1987)Arthritis Rheum.30，1205)。共享表位区内的残基促使α螺旋在肽结合沟一侧的形成(Brown等，Stern等和Dessen等，出处同上)，因此，预期所述残基影响肽结合。事实上，在RA相关DR同种异型的位置(p)71处的碱性残基Lys或Arg通过在所展示肽的残基p4上有利于负电荷而不利于正电荷来赋予对肽结合的选择性，而在p70和p71具有酸性残基Asp和Glu的RA不相关同种异型DRB1*0402则在所展示肽的残基p4上显示出相反的电荷偏爱(Hammer，J.等(1995)J.Exp.Med.，181，1847)。虽然诱发RA的自身抗原尚未了解，但是若干关节软骨蛋白都由于p4处的酸性残基而具有能选择性结合RA相关DR分子的肽序列(Dessen等，Hammer等，(1995)，出处同上)。因此，这些蛋白可能是针对引起RA病理的自身免疫应答的候选抗原(Rosloniec，E.F.等(1997)J.Exp.Med.185，1113)。已经表明，DRB1-0402的相反(正)电荷偏爱导致选择性呈递源自桥粒芯蛋白3在p4处具有碱性残基的肽，桥粒芯蛋白3是涉及0402相关自身免疫病如寻常性天疱疮的自身抗原(Wucherpfennig，K.W.等(1995)Proc.Natl.Acad，Sci.USA，92，11935)。这些数据强有力地支持这样的假说：疾病相关MHC同种异型选择性呈递自身抗原肽可能是DRB1等位基因和自身免疫病之间的遗传相关性的基础机制(Todd，J.A.等(1988)Science，240，1003)。疾病过程本身由识别所述肽的Th细胞驱动。活化自身反应性Th细胞分泌不同的促炎细胞因子，后者进而进一步将炎性细胞吸引到该部位，从而在受影响器官引起慢性炎症。

在这两类MHC分子中，II类分子由于下述原因而成为免疫抑制干预的首选靶：第一，MHC-II分子激活在免疫调节中起主要作用的T辅助(Th)细胞，因此是炎性疾病中大部分免疫病理的原因。第二，大多数自身免疫病在遗传学上与II类等位基因相关。第三，在正常正理或非病理条件下，MHC-II分子在免疫系统的细胞上选择性表达，而MHC-I存在于几乎所有的体细胞上。

与II类(例如DR)分子结合的肽需要在所展示肽的所谓“锚定位置”上存在限定的侧链，它们一起形成特定的结合基序；然而，在非锚定位置，侧链的变异是允许的，而不会影响结合(Hammer等，(1993，1994和1995)，出处同上)。这种结合机制使得给定的同种异型呈递能手许多不同的肽。锚定位置的侧链与结合部位内的特定口袋相互作用，而非锚定位置的侧链向外伸展，供Th细胞的TCR识别用。因此可以想象，由自身免疫病相关MHC分子呈递的自身抗原肽被具有相同结合基序但在非锚定位置不同的化合物置换，可以防止自身免疫T细胞的活化，从而阻断疾病过程。这样的化合物将会发挥其作用的机制是对抗原呈递位点的竞争性拮抗。因此，预期与涉及特定自身免疫病的II类分子选择性结合的化合物能特异性干预该疾病。在例如国际专利申请WO 92/02543、WO 93/05011和WO 95/07707中公开了其它结合MHC分子并抑制T细胞活化的肽。

靶向II类MHC分子的药物将提供几个优于大多数可利用的免疫抑制药的优点。第一，该药物将代表基于疾病机制的干预疗法，预期可阻断致病级联中的初始事件。第二，该药物可以设计为只对几种II类同种异型有选择性，也就是说对与疾病相关的那些同种异型有改进的亲和性，留下的抗原呈递系统剩余部分可用于针对病原体保护性应答，因此引起的免疫妥协副作用要比大多数免疫抑制药的副作用小。第三，可以使用所述方法和化合物，而无需任何有关引起该疾病的实际自身抗原的专业知识。最后，如果这种药物在某些生物学环境中显示更好的稳定性，则所述药物将是有利的。例如，在哺乳动物血浆例如大鼠血浆、小鼠血浆或人血浆中有高药物稳定性将是十分理想的，因为免疫系统的许多细胞以及活性强的肽降解酶都存在于血中。在啮齿动物血浆、尤其是大鼠血浆中的高药物稳定性尤其有利，因为大多数治疗药最初是在啮齿动物模型或系统中测试其功效、毒性和/或药代动力学的。针对组织蛋白酶降解的药物稳定性是同样理想的，这是因为基于机制的治疗干预要求靶向II类MHC分子的药物能被胞吞并可以用含组织蛋白酶的内体在细胞内运输，然后呈递给MHC II分子。

发明概述

本发明涉及用于抑制免疫应答、例如通过抑制II类MHC介导的T细胞活化而抑制免疫应答的化合物、药用组合物和方法。下面公开的化合物(包括在式II化合物中有非天然精氨酸取代)可以表现出在血浆(例如小鼠血浆和大鼠血浆)中稳定性增加，对目标MHC-II类分子(0401、0101和0404)的结合亲和性增加，与在取代氨基酸位置中含Arg的相应化合物相比，增加系数高达1.25-3。此外，下面公开的化合物包含式I化合物中的封端基团。这样的式I化合物或式II化合物也可显示T细胞应答的体内抑制增加，增加系数高达1.25-3。这样的化合物在某些免疫疾病的小鼠模型中可显示出有效的免疫抑制。主题化合物和方法可以用来治疗类风湿性关节炎和/或多发性硬化等疾病。

在某些实施方案中，主题化合物可以用来制备用于治疗动物、例如人的药用组合物，例如用于治疗或预防其特征为MHC II类介导的T细胞活化或在炎症的病理部位表达MHC II类蛋白的病症例如自身免疫病的药用组合物。主题化合物和/或组合物可以用于治疗或预防所述疾病，包括下文具体列举的那些疾病。

附图简述

图1本发明含Gpg(脒基哌啶基甘氨酸)七聚体化合物(P53)相对于含Arg等同物(P51)对MHC II类蛋白0401的改进的结合。用已发表的前导肽(P3；Falcioni等1999；Nature Biotech 17，562-567)作为阳性对照。运用标准统计学软件，使非线性逻辑斯谛回归曲线拟合到依照实施例14所产生的复制数据点。根据拟合曲线估计IC₅₀，并用相应化合物的适当线型(P53实线、P51短划线、P3点线)的垂直线表示。

图2本发明含Gpg四聚体化合物(P74)相对于含Arg等同物(P71)与MHC II类蛋白0401的改进的结合。用已发表的前导肽(P3；Falcioni等1999)作为阳性对照。运用标准统计学软件，使非线性逻辑斯谛回归曲线拟合到依照实施例14所产生的复制数据点。根据拟合曲线估计IC₅₀，并用相应化合物的适当线型(P74实线、P71短划线、P3点线)的垂直线表示。

图3本发明的优选含Gpg(脒基哌啶基甘氨酸)四聚体化合物(P69)相对于含Arg等同物(P82)与MHC II类蛋白0101的改进的结合。运用标准统计学软件，使非线性逻辑斯谛回归曲线拟合到依照实施例14所产生的复制数据点。根据拟合曲线估计IC₅₀，并用相应化合物的适当线型(P69实线、P82短划线)的垂直线表示。

图4本发明的优选含Gpg(脒基哌啶基甘氨酸)四聚体化合物(P74)相对于含Arg等同物(P71)与MHC II类蛋白0401的改进的结合。运用标准统计学软件，使非线性逻辑斯谛回归曲线拟合到依照实施例14所产生的复制数据点。根据拟合曲线估计IC₅₀，并用相应化合物的适当线型(P74实线、P71短划线)的垂直线表示。

图5本发明的优选含Gpg(脒基哌啶基甘氨酸)四聚体化合物(P101)相对于含Arg等同物(P98)与MHC II类蛋白0401的改进的结合。运用标准统计学软件，使非线性逻辑斯谛回归曲线拟合到依照实施例14所产生的复制数据点。根据拟合曲线估计IC₅₀，并用相应化合物的适当线型(P101实线、P98短划线)的垂直线表示。

图6本发明含Gpg七聚体化合物(P47)相对于含Arg等同物(P43)与LG2细胞表面表达的MHC II类蛋白的改进的结合。运用标准统计学软件，使非线性逻辑斯谛回归曲线拟合到依照实施例15所产生的复制数据点。根据拟合曲线估计IC₅₀，并用相应化合物的适当线型(P47实线、P43短划线)的垂直线表示。

图7本发明含Gpg四聚体化合物(P74)相对于含Arg等同物(P71)与Priess细胞表面表达的MHC II类蛋白的改进的结合。运用标准统计学软件，使非线性逻辑斯谛回归曲线拟合到依照实施例15所产生的复制数据点。根据拟合曲线估计IC₅₀，并用相应化合物的适当线型(P74实线、P71短划线)的垂直线表示。

图8本发明的含Gpg七聚体和四聚体化合物相对于含Arg等同物在大鼠血浆中24小时后的改进的稳定性(任意单位)。相应Gpg/Arg化合物的数据用相邻条形图所示。

图9剂量-反应曲线，证明根据T细胞活化试验测定，P53(含Gpg)即本发明优选七聚体化合物相对于含Arg肽(P51)的改进的免疫抑制特性。运用标准统计学软件，使非线性逻辑斯谛回归曲线拟合到依照实施例19所产生的复制数据点。根据拟合曲线估计IC₅₀，并用相应化合物的适当线型(P53实线、P51短划线)的垂直线表示。

图10剂量-反应曲线，证明根据T细胞活化试验测定，本发明的优选化合物(a)P69、(b)P101、(c)P74和(d)P53的免疫抑制特性。

图11剂量-反应曲线，证明根据IL-2分泌测定，P41-1(含Gpg)(方块和短划线)即本发明七聚体化合物相对于含Arg肽(P40-1)(菱形和实线)的改进的免疫抑制特性。

图12剂量-反应曲线，证明根据IL-2分泌测定，P69(含Gpg)即本发明的优选四聚体化合物相对于含Arg肽(P82)的改进的免疫抑制特性。运用标准统计学软件，使非线性逻辑斯谛回归曲线拟合到依照实施例20所产生的复制数据点。根据拟合曲线估计IC₅₀，并用相应化合物的适当线型(P69实线、P82短划线)的垂直线表示。

图13根据IL-2分泌测定，P53(含Gpg)(方块和实线)即本发明优选七聚体化合物相对于DMSO对照(菱形和点线)的免疫抑制特性。

图14用抗原共免疫后，根据T细胞增殖测定，P69(含Gpg)即本发明优选四聚体化合物相对于含Arg等同物(P82)的优异体内免疫抑制特性。

图15用抗原共免疫后，根据T细胞增殖测定，本发明优选四聚体和七聚体化合物的体内免疫抑制特性。

图16本发明优选四聚体和七聚体化合物(P69、P53和P74)相对于作为对照的溶剂在CIA小鼠类风湿性关节炎模型中的功效。

图17本发明优选四聚体和七聚体化合物(P69、P53和P74)相对于作为对照的溶剂在EAE小鼠多发性硬化预防模型中的功效。

图18本发明优选四聚体和七聚体化合物(P69和P53)相对于作为对照的溶剂在EAE小鼠多发性硬化治疗模型中的功效。

图19本发明优选含Gpc化合物(P69)相对于等同物即含Arg化合物(P82)在EAE小鼠多发性硬化模型中的优异功效。

发明详述

I.前言

本发明涉及可用于抑制不需要的免疫活性、例如通过抑制II类MHC介导的T细胞活化而抑制不需要的免疫活性的化合物例如肽模拟化合物(peptidomimetic compound)，例如用以治疗或预防自身免疫病。在某些实施方案中，这些化合物的特征在于与II类分子结合、其防止自身抗原结合的能力或置换已结合II类分子的自身抗原的能力和/或其通过替代作用模式来调节受II类MHC限制的免疫应答从而抑制T细胞活化的能力。在这样的实施方案中，本发明的化合物可以被称为“抑制剂”、“主题抑制剂”、“肽模拟物”(包括“七聚体化合物”和“四聚体化合物”)、“本发明化合物”或“本发明抑制剂”。在某些实施方案中，所述优选的II类分子是DR同种型。在优选的实施方案中，这样的抑制剂是小分子化合物，例如其分子量小于2000amu、优选小于1000amu、甚至更优选小于700amu的化合物。

抑制II类MHC活性的本发明化合物在预防或治疗各种II类MHC相关疾病或障碍中具有治疗意义。可以将本发明化合物给予患者，以治疗免疫疾病，例如涉及不需要或不适当的免疫活性的疾病，或者可以用来制备治疗药物。特别是，可以治疗性应用有效剂量的本发明抑制剂，以缓解或预防胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎等疾病。用于治疗涉及不需要或不适当的MHC活性的疾病例如自身免疫病的本发明化合物的有效剂量可以通过本领域已知的标准方法来确定，同时考虑到常规安全性研究、毒性研究、剂量浓度研究和给药方法，例如大剂量给药、连续给药或重复给药。在一个具体的实施方案中，可以给予的剂量为约0.01mg/kg至约500mg/kg。

II.定义

本文所用的术语“MHC活性”是指MHC分子刺激免疫应答、例如通过激活T细胞而刺激免疫应答的能力。MHC话性的抑制剂能够抑制这种活性，因而抑制T细胞被MHC激活。在优选的实施方案中，主题抑制剂选择性抑制特定II类MHC同种型或同种异型的激活作用。这样的抑制剂能够抑制特定不需要的MHC活性，而不干扰生物体体内的所有MHC活性，从而选择性治疗动物、例如哺乳动物、优选人的不需要的免疫应答，而不使所述动物的免疫应答总体妥协。这样的不需要的免疫应答可以是与特定疾病例如类风湿性关节炎或多发性硬化相关的免疫应答。

术语“前体药物”意指包括在生理条件下转变成本发明抑制剂的化合物。前体药物的通用制备方法是选择在生理条件下被水解以获得所需生物活性药物的部分。在其它实施方案中，所述前体药物经患者体内的酶活性而转化或者经靶病原体的酶活性而转化。本文所用的“治疗”是指至少使例如疾病或病症的一个或多个症状的严重程度减轻或者改善所述症状的效应。

本文所用的“疏水的”当指某种分子形式时，是指在分配实验中，正在研究的该分子形式中大多数分子保留在有机层而不是在水层中。优选超过约55％、75％、85％或超过约95％的分子保留在有机层。供所述分配实验用的合适有机溶剂是技术人员已知的，包括但不限于辛醇、乙醚、二氯甲烷和氯仿。当指官能团或残基时，疏水性是指所述官能团或残基当某种分子形式的结构的一部分增加所述分子形式的疏水性的性质。

本文所用的“预防”是指例如延迟或消除疾病或病症的一个或多个症状的发作。

术语“IC₅₀”是指抑制活性或特性50％的药物浓度，例如降低病症的频率，例如细胞死亡50％的药物浓度，减少竞争肽与MHC II蛋白结合50％的药物浓度，或者降低活性水平例如T细胞增殖或IL2分泌50％的药物浓度。

术语“ED₅₀”是指产生规定的反应或效应最大值的50％的药物剂量。或者，它是指使受试者或制剂的50％产生预定反应的剂量。

术语“LD₅₀”是指使受试者的50％致死的药物剂量。

术语“治疗指数”是指药物的治疗指数，定义为LD₅₀/ED₅₀。

术语“患者”是指动物，优选哺乳动物，包括人类以及牲畜或其它兽医学研究对象。

术语“结构-活性关系”或“SAR”是指其中改变药物的分子结构则将会改变药物与受体、酶等的相互作用的方式。

“小分子”是指其分子量小于约2000amu或小于约1000amu、甚至小于约700amu的分子。

术语“脂族基团”是指直链、支链或环状烷烃、烯烃或炔烃。在某些实施方案中，本发明中的脂族基团是直链或支链且具有1个至20个碳原子。

术语“烷基”是指饱和脂族基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环基)、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在某些实施方案中，直链烷基或支链烷基在其主链中具有约30个或更少的碳原子(例如对于直链为C₁-C₃₀，对于支链为C₃-C₃₀)或约20个或更少的碳原子。同样，环烷基在其环状结构中具有约3个至约10个碳原子，或者在其环状结构中具有约5个、6个或7个碳原子。

此外，术语“烷基”(或“低级烷基”)既包括“未取代的烷基”又包括“取代的烷基”，其中后者是指具有置换烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的烷基部分。这样的取代基可以包括例如卤基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫代酸酯基、硫代乙酸酯基或硫代甲酸酯基)、烷氧基、磷酰基、膦酸酯基、亚膦酸酯基、氨基、酰胺基、脒基、亚氨基、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳族或杂芳族部分。本领域技术人员将会知道，烃链上取代的部分本身必要时可再次被取代。例如，取代烷基的取代基可以包括氨基、叠氮基、亚氨基、酰胺基、磷酰基(包括膦酸酯基和亚膦酸酯基)、磺酰基(包括硫酸酯基、亚磺酰氨基、氨磺酰基和磺酸酯基)和甲硅烷基以及醚基、烷硫基、羰基(包括酮基、醛基、羧酸酯基和酯基)、-CF₃、-CN等的取代和未取代形式。示例性的取代烷基如下所述。环烷基可以进一步被烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、氨基烷基、羰基取代的烷基、-CF₃、-CN等取代。

“Ci烷基”是具有i个原子的烷基链。例如C4烷基含有4个碳原子。所含有的C4烷基可以是饱和烷基，或是具有一个或两个双键(顺式或反式)或一个三键的不饱烷基。优选的C4烷基是饱和的。优选的不饱和C4烷基具有一个双键。C4烷基可以是未取代的，或被一个或两个取代基取代。优选的取代基包括低级烷基、低级杂烷基、氰基、卤基和卤代烷基。

“杂烷基”是碳原子和至少一个杂原子的饱和或不饱和链，其中没有相邻的两个杂原子。杂烷基链在链中含有1-18个原子(碳原子和杂原子)，优选1-12个原子，更优选1-6个原子，再更优选1-4个原子。杂烷基链可以是直链或支链。优选的支链杂烷基具有一个或两个分支链，优选具有一个分支链。优选的杂烷基是饱和的。不饱和的杂烷基具有一个或多个双键和/或一个或多个三键。优选的不饱和杂烷基具有一个或两个双键或一个三键，更优选一个双键。除非另有说明，杂烷基链可以是未取代的，或者被1个至约4个取代基取代。优选杂烷基是未取代的。优选杂烷基取代基包括卤基、芳基(例如苯基、甲苯基、烷氧基苯基、烷氧基羰基苯基、卤代苯基)、杂环基、杂芳基。例如，被下列取代基取代的烷基链是杂烷基：烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基)、芳氧基(例如苯氧基、氯苯氧基、甲苯氧基、甲氧基苯氧基、苄氧基、烷氧基羰基苯氧基、酰氧基苯氧基)、酰氧基(例如丙酰氧基、苯甲酰氧基、乙酰氧基)、氨基甲酰氧基、羧基、巯基、烷硫基、酰硫基、芳硫基(例如苯硫基、氯苯硫基、烷基苯硫基、烷氧基苯硫基、苄基硫基、烷氧基羰基苯硫基)、氨基(例如氨基、一C1-C3烷基氨基和二C1-C3烷基氨基、甲基苯基氨基、甲基苄氨基、C1-C3烷基酰胺基、氨基甲酰胺基、脲基、胍基)。

“Mi杂烷基”是具有i个原子的杂烷基链。例如，M4杂烷基含有一个或两个不相邻的杂原子。含有1个杂原子的M4杂烷基可以是饱和杂烷基，或是具有一个双键(顺式或反式)或一个三键的不饱杂烷基。含有2个杂原子的优选M4杂烷基是饱和杂环烷基。优选的不饱和M4杂烷基具有一个双键。M4杂烷基可以是未取代的，或者被一个或两个取代基取代。优选的取代基包括低级烷基、低级杂烷基、氰基、卤基和卤代烷基。

术语“芳烷基”是指被芳基(例如芳族基团或杂芳族基团)取代的烷基。

术语“烯基”和“炔基”是指长度相似且可能的取代与上述烷基相似、但分别含有至少一个双键或三键的不饱和脂族基团。

除非碳数目另有说明，否则“低级烷基”是指如上定义的、但在其主链结构中具有1-10个碳原子、或1-6个碳原子的烷基。同样，“低级烯基”和“低级炔基”的链长相似。

术语“杂原子”是指除碳和氢以外的任何元素的原子。说明性的杂原子包括硼、氮、氧、磷、硫和硒，或者氧、氮或硫。

术语“氨基酸”是指带有一个羧酸基团和一个氨基、优选与同一碳原子连接或与相邻碳原子连接、最优选与同一碳原子连接的有机化合物。示例性的氨基酸是那些天然存在的氨基酸，例如用于在细胞中合成蛋白质的氨基酸，虽然也考虑了非天然氨基酸，例如实施例部分所用的或以其它方式为本领域公认的那些非天然氨基酸。“氨基酸残基”是指氨基酸的衍生物，其中氨基和羧酸基团的任一个或两个已与其它部分连接，例如形成酰胺、硫代酰胺、磺酰胺等等。

术语“氨基酸类似物”包括氨基酸样分子或它们的残基，其中羧酸基团的羰基被另一亲电子部分例如硫代羰基或磺酰基取代。该术语也包括二肽类似物，例如下面讨论的[SΨ(oxaz)L]和[SΨ(imid)L]部分以及其中内部酰胺键被烯烃取代的二肽类拟物。适合用于本发明的其它氨基酸类似物是本领域技术人员熟知的。包含一个或多个氨基酸类似物的化合物如本发明抑制剂通常被称为“肽模拟化合物”或“模拟化合物”。

术语“芳基”包括可以含有0-4个杂原子的5元、6元和7元单环芳族基团，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。那些在环状结构中具有杂原子的芳基也可以被称为“芳基杂环”或“杂芳基”。所述芳环可以在一个或多个环位置上被如上所述的这类取代基取代：例如卤基、叠氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯基、亚膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺酰基、亚磺酰氨基、酮基、醛基、酯基、杂环基、芳族或杂芳族部分、-CF₃、-CN等。术语“芳基”也包括具有两个或更多个环的多环体系，其中两个或多个碳是两个邻接环所共用的(所述环是“稠环”)，其中所述环中至少一个环是芳环，例如其它环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环基。

术语邻位、间位或对位分别适用于1，2-二取代的苯、1，3-二取代的苯和1，4-二取代的苯。例如，名称1，2-二甲基苯和邻二甲基苯是同义词。

术语“杂环基”是指3元至约10元环状结构，或指3元至约7元环，其中环状结构包括1-4个杂原子。杂环也可以是多环。杂环基包括例如噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、异苯并呋喃、苯并吡喃、咕吨、苯并氧硫杂环己二烯(phenoxathiin)、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩嗪、吡咯烷、氧杂环戊烷、硫杂环戊烷、噁唑、哌啶、哌嗪、吗啉、内酯、内酰胺例如β-丙内酰胺和吡咯烷酮、磺内酰胺、磺酸内酯等。所杂述环可以在一个或多个位置上被如上所述的这类取代基取代：例如卤基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯基、亚膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺酰基、酮基、醛基、酯基、杂环基、芳族或杂芳族部分、-CF₃、-CN等。

术语“多环基”是指其中两个或更多个碳是两个邻接环(例如所述环是“稠环”)所共用的两个或更多个环(例如环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环基)。通过非相邻原子连接的环被称为“桥”环。多环中的每个环都可以被如上所述的这类取代基取代：例如卤基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯基、亚膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺酰基、酮基、醛基、酯基、杂环基、芳族或杂芳族部分、-CF₃、-CN等。

术语“碳环”是指环中每个原子都为碳原子的芳环或非芳环。

术语“硝基”是指-NO₂；术语“卤基”是指-F、-Cl、-Br或-I；术语“巯基”是指-SH；术语“羟基”是指-OH；术语“磺酰基”是指-SO₂。

术语“胺基”和“氨基”是本领域公认的，既指未取代的胺又指取代的胺，例如可以由以下通式表示的部分：

其R₅₀、R₅₁和R₅₂各自独立代表氢、烷基、烯基、-(CH₂)_m-R₆₁，或者R₅₀和R₅₁与连接它们的N原子结合在一起形成其环状结构中具有4-8个原子的杂环；R₆₁代表芳基、环烷基、环烯基、杂环或多环；且m为0或1-8范围内的整数。在某些实施方案中，R₅₀或R₅₁中仅一个可以为羰基，例如R₅₀、R₅₁和氮一起不形成二酰亚胺。在其它实施方案中，R₅₀和R₅₁(和任选的R₅₂)各自独立代表氢、烷基、烯基或-(CH₂)_m-R₆₁。因此，术语“烷基胺”包括如上定义的、具有与其连接的取代或未取代的烷基的胺基，也就是R₅₀或R₅₁中至少一个为烷基。

术语“酰氨基”是本领域公认的，是指可以由以下通式表示的部分：

其中R₅₀如上定义，而R₅₄代表氢、烷基、烯基或-(CH₂)_m-R₆₁，其中m和R₆₁如上定义。

术语“酰胺基”是本领域公认的氨基取代的羰基，包括可由以下通式表示的部分：

其中R₅₀和R₅₁如上定义。本发明中酰胺的某些实施方案将不包括可能是不稳定的二酰亚胺。

术语“烷硫基”是指如上定义的、具有一个与其连接的硫基团的烷基。在某些实施方案中，“烷硫基”部分由-S-烷基、-S-烯基、-S-炔基和-S-(CH₂)_m-R₆₁之一表示，其中m和R₆₁如上定义。代表性的烷硫基包括甲硫基、乙硫基等。

术语“羰基”是本领域公认的，包括可由以下通式表示的部分：

其中X₅₀为化学键，或者代表氧或硫，且R₅₅代表氢、烷基、烯基、-(CH₂)_m-R₆₁或药学上可接受的盐，R₅₆代表氢、烷基、烯基或-(CH₂)_m-R₆₁，其中m和R₆₁如上定义。在X₅₀为氧且R₅₅或R₅₆不为氢的情况下，该式代表“酯”。在X₅₀为氧且R₅₆如上定义的情况下，该部分在本文被称为羧基，特别是当R₅₆为氢时，该式代表“羧酸”。在X₅₀为氧且R₅₅为氢的情况下，该式代表“甲酸酯”。一般而言，在上式中氧原子被硫原子取代的情况下，该式代表“硫代羰基”。在X₅₀为硫且R₅₅或R₅₆不为氢的情况下，该式代表“硫代酸酯”。在X₅₀为硫且R₅₆为氢的情况下，该式代表“硫代羧酸”。在X₅₀为硫且R₅₅为氢的情况下，该式代表“硫代甲酸酯”。另一方面，在X₅₀为化学键且R₅₅不为氢的情况下，上式代表“酮”基。在X₅₀为化学键且R₅₅为氢的情况下，上式代表“醛”基。

术语“烷氧基”是指如上定义的、具有与其连接的氧基团的烷基。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。“醚”是两个通过氧共价连接的烃。因此，使烷基变成醚的烷基的取代基是烷氧基或者类似于烷氧基，例如可以由下式之一表示：-O-烷基、-O-烯基、-O-炔基、-O-(CH₂)_m-R₆₁，其中m和R₆₁如上所述。

术语“磺酸酯基”是本领域公认的，包括可由以下通式表示的部分：

其中R₅₇为电子对、氢、烷基、环烷基或芳基。

术语“硫酸酯基”是本领域公认的，包括可由以下通式表示的部分：

其中R₅₇如上定义。

术语“亚磺酰氨基”是本领域公认的，包括可由以下通式表示的部分：

其中R₅₀和R₅₆如上定义。

术语“氨磺酰基”是本领域公认的，包括可由以下通式表示的部分：

其中R₅₀和R₅₁如上定义。

术语“磺酰基”是指可由以下通式表示的部分：

其中R₅₈为下列基团之一：氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。

术语“亚砜基”是指可由以下通式表示的部分：

其中R₅₈如上定义。

可以对烯基和炔基进行类似的取代，以产生例如氨基烯基、氨基炔基、酰胺基烯基、酰胺基炔基、亚氨基烯基、亚氨基炔基、硫代烯基、硫代炔基、羰基取代的烯基或炔基。

对每种表达方式例如烷基、m、n、p等的定义，当其在任一结构中不止出现一次时，意味着独立其相同结构中在另外一处的定义。

“硒烷基”是指具有与其连接的取代硒基的烷基。可以在烷基上取代的示例性“硒醚”选自-Se-烷基、-Se-烯基、-Se-炔基和-Se-(CH₂)_m-R₆₁之一，m和R₆₁如上定义。

术语三氟甲磺酰基、甲苯磺酰基、甲磺酰基和九氟甲磺酰基是本领域公认的，分别指三氟甲磺酰基、对甲苯磺酰基、甲磺酰基和九氟丁磺酰基。术语三氟甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、甲磺酸酯基和九氟甲磺酰基是本领域公认的，分别指三氟甲磺酸酯基、对甲苯磺酸酯基、甲磺酸酯基和九氟丁磺酸酯基官能团和含有所述基团的分子。

缩写Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts、Ms分别表示甲基、乙基、苯基、三氟甲磺酰基、九氟丁磺酰基、对甲苯磺酰基和甲磺酰基。本领域普通有机化学家所用的缩写的更详尽一览表参见Journal ofOrganic Chemistry每卷的第一期；该一览表通常在题为 Standard List ofAbbreviations的表中给出。

本发明的某些单体亚单元可以以特定几何形式或立体异构形式存在。另外，本发明的寡聚体也可以是旋光的。本发明考虑了所有这样的化合物，包括顺式-异构体和反式-异构体、R-对映异构体和S-对映异构体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体、其外消旋混合物及它们的其它混合物，全都属于本发明的范围之列。在取代基例如烷基中可以存在另外的不对称碳原子。所有这样的异构体以及它们的混合物都有意包括在本发明中。

如果例如本发明化合物的具体对映异构体是所需的，则它可以通过不对称合成来制备，或者通过用手性助剂衍生化，其中分离所得的非对映异构体混合物并切下所述辅助基团，以提供所需的纯对映异构体。或者，在所述分子含有一个碱性官能团(例如氨基)或酸性碱性官能团(例如羧基)的情况下，可以与合适的旋光酸或旋光碱形成非对映异构体的盐，接着通过本领域众所周知的分级分离结晶法或色谱法，对如此形成的非对映异构体进行拆分，随后回收所述纯对映异构体。

可以理解“取代”或“被……取代”包括隐含的附加条件，即这样的取代依照取代原子和取代基的允许化合价进行，并且取代产生稳定的化合物，例如不自发地例如通过重排、环化、消除或其它反应等发生转化。

术语“取代的”也意指包括有机化合物的所有容许的取代基。广义上，所述容许的取代基包括有机化合物的无环和有环、分支和不分支、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。说明性的取代基包括例如上文描述的那些取代基。容许的取代基对于合适的有机化合物可以是一种或多种以及相同或不同的取代基。对于本发明而言，诸如氮的杂原子可具有氢取代基和/或本文描述的满足杂原子化合价的有机化合物的任何容许的取代基。本发明并不以任何方式受到有机化合物的容许取代基的限制。

对于本发明而言，化学元素依照以下文献进行鉴定：the PeriodicTable of the Elements，CAS version，Handbook of Chemistry and Physics，第67版，1986-87，封二。对于本发明而言，也考虑了术语“烃”包括具有至少一个氢原子和一个碳原子的所有容许的化合物，广义上，所述容许的烃包括无环和有环、分支和不分支、碳环和杂环、芳族和非芳族的、可以被取代或者是未取代的有机化合物。

短语“保护基”是指保护潜在反应性官能团避免不需要的化学转化的临时取代基。这类保护基的实例分别包括羧酸的酯、醇的甲硅烷基醚以及醛和酮的缩醛和缩酮。保护基化学领域已有综述。Greene等， Protective Groups in Organic Synthesi，第二版；Wiley；New York，1991。

术语“吸电子基团”是本领域公认的，是指有倾向于从相邻原子吸引原子价电子的取代基，即所述取代基相对于相邻原子是电负性的。对吸电子能力水平的定量以Hammettσ(σ)常数给出。这个熟知的常数在许多参考文献中有描述，例如March， Advanced OrganicChemistry 251-59，McGraw Hill Book Company，New York，(1977)。Hammett常数值对于给电子基团来讲通常是负值(对于NH₂，σ(P)＝-0.66)，而对于吸电子基团是正值(对于硝基，σ(P)＝0.78)，σ(P)表示对位取代。示例性的吸电子基团包括硝基、酰基、甲酰基、磺酰基、三氟甲基、氰基、氯离子等。示例性的给电子基团包括氨基、甲氧基等。

考虑了上述寡聚体、亚单元和其它组合物的等同实施方案包括在其它方面符合上述化合物并且具有上述化合物相同的一般特性(例如生物相容性、抗肿瘤活性)的化合物，其中对取代基进行一种或多种不负面影响所述分子功效的简单变化，以达到其预定目标。一般而言，本发明化合物可以采用容易得到的原料、试剂和常规合成方法，通过通用反应流程举例说明的方法(例如下述方法)，或者通过其改进方法来制备。在这些反应中，也有可能利用本身已知的但此处并未提及的变异体。

III.本发明的化合物

本发明提供可抑制免疫应答、例如通过抑制II类MHC介导的T细胞活化来抑制免疫应答的肽模拟化合物。例如，合适的肽模拟物包括具有式I结构的化合物：

式I

其中，只要化合价和稳定性允许，则：

A不存在，或者代表1-4个氨基酸或氨基酸类似物残基序列，优选不存在；

B代表2-8个氨基酸或氨基酸类似物残基序列，优选2-6个氨基酸或氨基酸类似物残基序列；

X不存在，或者代表O、S或NR；

W代表封端基团，例如OR₇或NR₈R₉；

V每次出现时独立代表C＝O、C＝S或SO₂；

R每次出现时独立代表H或低级烷基，优选H；

R₁代表取代或未取代的烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基或杂环基烷基部分，优选疏水部分，最优选包含1-8个碳原子；

R₂代表取代或未取代的烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基或杂环基烷基部分，优选疏水部分，或者R₂和R结合在一起形成环，所述环具有5-7元、任选被1-5个取代基取代和/或与一个或多个其它环例如芳基、杂环基或碳环形成多环结构，例如稠合二环；

R₃代表取代或未取代的烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基或杂环基烷基部分，优选包括碱性氮原子(例如它在生理条件下可被质子化和/或其共轭酸在水溶液中的pKa介于6和12之间，优选介于7和10之间)；且

R₇、R₈和R₉独立代表选自以下的取代基：H和取代或未取代的烷基、杂烷基、芳基、芳烷基、杂芳烷基、杂芳基、环烷基、环烷基烷基、杂环基和杂环基烷基，或者其中R₈和R₉结合在一起形成环，所述环具有5-7元、任选被1-5个取代基取代和/或与一个或多个其它环例如芳基、杂环基或碳环形成多环结构。

本发明提供可抑制免疫应答、例如通过抑制II类MHC介导的T细胞活化来抑制免疫应答的肽模拟化合物。例如，合适的肽模拟物包括具有式II结构的化合物：

式II

其中，只要化合价和稳定性允许，则：

X不存在，或者代表O、S或NR；

W代表OR₇或NR₈R₉；

V每次出现时独立代表C＝O、C＝S或SO₂；

R每次出现时独立代表H或低级烷基，优选H；

i为0-1的整数，优选0；

j为1-2的整数，优选1；

k为1-3的整数，优选2；

R₆不存在，或者代表1-4个与其连接的含氮环上的取代基，选自取代或未取代的低级烷基、卤代烷基、卤基、羟基和氨基；且

R₇，R₈和R₉独立代表选自以下的取代基：H和取代或未取代的烷基、杂烷基、芳基、芳烷基、杂芳烷基、杂芳基、环烷基、环烷基烷基、杂环基和杂环基烷基，或者其中R₈和R₉结合在一起形成环，所述环具有5-7元、任选被1-5个取代基取代和/或与一个或多个其它环例如芳基、杂环基或碳环形成多环结构。

在式I的某些实施方案中，R₃代表精氨酸或赖氨酸的侧链或具有以下结构的侧链：

其中i、j、k和R₆的定义如对式II中的描述。在式I的某些实施方案中，R₃包括胍或胍盐部分，例如包括在环中或者与环连接，或者包括在链中或链的末端。在式I的某些实施方案中，R₃代表环烷基、烷基或氨基烷基，例如别异亮氨酸、环己基甘氨酸、瓜氨酸、赖氨酸或鸟氨酸的侧链，包括赖氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸的N-甲基和N，N-二甲基变体。

在式I的某些实施方案中，B代表2个氨基酸或氨基酸类似物残基，而W包括如下文更详细描述的封端基团。优选氨基酸或类似物残基通过第二个酰胺键连接在一起(即其中氮带有一个氢取代基)。

在式II的某些实施方案中，R₆不存在，而在其它实施方案中，R₆包括低级烷基取代基。

在式I和式II的某些实施方案中，R₂代表取代或未取代的环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基。

在式I和式II的某些实施方案中，B的第一个残基(与V连接的氨基酸或类似物残基)具有侧链即H或优选C1-C8烷基或M1-M8杂烷基(包括例如丙氨酸、Acm-半胱氨酸、Prm-半胱氨酸、乙酰-半胱氨酸和Nva，例如C1-C6烷基或M1-M6杂烷基)，或者取代或未取代的芳基、芳烷基、杂芳基或杂烷基(例如甲基苯基或苯基甲基)，或者B的第一个残基是包含带有C＝O、C＝S或SO₂基团、任选与苯环(例如Tic、azaTic、Disc、Thiq等)稠合的5-8元含氮杂环的氨基酸类似物。虽然在该位置上可以存在表1-3的实例中在该位置上所用的任何残基，但是该位置上优选的残基包括Tic和Disc。

在式I和式II的某些实施方案中，B的第二个残基(与V连接的氨基酸或类似物残基是第一个残基)具有侧链即H或优选C1-C6烷基、M1-M6杂烷基或环烷基、甚至更优选C3-C5烷基或M3-M5杂烷基、或者分支或者不分支、或环烷基。示例性的残基包括甘氨酸、异亮氨酸、Nle、Chg、Met(O)(氧化甲硫氨酸)和α-氨基异丁酸。在某些实施方案中，B的第二个残基是实质上与二肽(如在Odapdc或Haic残基(如下定义)上)同分异构的残基。虽然在该位置上可以存在表1-3的实例中在该位置上所用的任何残基，但是在该位置上优选的残基包括Met和Nle。

在式I和式II的某些实施方案中，R和R₂结合在一起不形成环。在其中R和R₂结合在一起形成环的实施方案中，所述环最好是6元环或7元环，或者是取代的(例如双环)5元环。

在式I和式II的某些实施方案中，R₁XV结合在一起代表烷酰基、烯酰基、芳基羰基或氨基烷酰基。在某些这样的实施方案中，所述酰基是苯甲酰基、低级烷酰基或低级氨基烷酰基，例如乙酰基、丙酰基、氨基丙酰基或氨基丁酰基。

在式I和式II的某些实施方案中，B代表2-6个氨基酸或氨基酸类似物残基，优选2-5个氨基酸或氨基酸类似物残基。在某些实施方案中，特别是其中B代表4个或更少的氨基酸或氨基酸类似物残基，优选3个或更少，W则代表封端基团。示例性的封端基团示于表1(a、b和c)，包括带有选自以下取代基的氮原子(例如与B的末端羧基形成酰胺)：H、取代和未取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳烷基、杂芳基、环烷基、环烷基烷基、杂环基和杂环基烷基，优选选自H、取代和未取代的烷基、芳基、芳烷基、环烷基和环烷基烷基。合适的取代基包括羟基、醚和氨基取代基。封端基团最好包括至少6个非氢原子(包括与B连接的氮)，优选至少8个非氢原子。封端基团W最好包括被芳烷基或杂芳烷基取代基如苄基或苯乙基取代基取代的氮。在某些这样的实施方案中，所述氮带有选自以下的第二取代基：H、低级烷基、羟基-低级烷基和羟基-低级烷基-O-低级烷基。在某些实施方案中，封端基团W是含氮杂环基取代基，优选与芳环或杂芳环稠合、通过环中的氮原子与B连接的取代基。这样的封端基团包括四氢异喹啉、二氢吲哚、异二氢吲哚、吗啉、哌啶等。

式I和式II的某些实施方案例如通过对R₁或W、优选R₇、R₈或R₉的适当选择，可以提供在生理条件下转化成本发明活性化合物的前体药物。例如，在W为酯的一部分时，所述酯可以在生理条件下被切割。

在式I和式II的某些实施方案中，R₁、R₇、R₈或R₉中至少一个为疏水残基，优选R₈或R₉。在其它实施方案中，所述化合物的疏水性例如经采用Meyan等(1995)的方法(J.Pharm Sci.84：83-92)估算，介于cLogP约2.0至约6.0之间，优选介于约3.0至约6.0之间，最优选介于约4.0至约5.5之间。然而，本发明考虑了其cLogP估计值超出该范围的化合物，例如其cLogP约3.0至约4.0的化合物。

在式I和式II的某些实施方案中，A和B一起包括2-8个、例如3-6个氨基酸或氨基酸类似物残基。优选A和B一起包括约2个或约5个氨基酸或氨基酸类似物残基。

式I和式II中邻接(但不包括)B和(VCHR₂)的部分在本文被称为“精氨酸样”残基。在其中i为0、j为1且k为2的实施方案中，所述精氨酸样残基在本文被称为Gpg残基(脒基哌啶基甘氨酸)。这样的残基是本领域已知的，描述于PCT公布号WO 00/78796及其中引用的参考文献。在优选的实施方案中，所述精氨酸样残基在所述氨基酸的α立体中心富含S-构型，例如该残基中S-对映异构体最好富含至少60％、75％、85％、90％或甚至95％或更高。在某些实施方案中，主题抑制剂表现出稳定性增加，例如其血浆半寿期比其中所述精氨酸样残基被精氨酸取代的类似肽基化合物的血浆半寿期至少长1.25倍、1.5倍或优选3倍，优选至少长5倍；以及与MHC II类分子(例如0401、0101或0404)的结合亲和性增加，例如其结合亲和性比其中所述精氨酸样残基被精氨酸取代的类似肽基化合物的结合亲和性至少高1.25倍、1.5倍或优选3倍。

描述精氨酸样残基且可用于本发明的其它参考文献包括国际申请号WO 99/61476和WO 01/27141，Jones等，Bioorg Med.Chem.Lett.1999，9，2109-2114；Cunningham等，Bioorg.Med.Chem.Lett.1997，7，19-24；Hanson等，Bioorg.Med.Chem.Lett.1996，6，1931-1936；Jones等，Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9，2115-2118，Tamura等，Bioorg Med.Chem.Lett.2000，10，745-49，Falcioni等，1999，Nature Biotech 17，562-567和Schmidt等，Proc.Am.Pept.Symp.，第16期(2000)，会议日期1999，634-635。

在式I和式II的某些实施方案中，A和/或B的氨基酸包括跨细胞多肽序列，例如在美国专利第6,495,526号中描述的跨细胞多肽序列。跨细胞多肽序列可以是内化肽，例如可以衍生自选自以下的多肽：antepennepedia蛋白、HIV反式激活(TAT)蛋白、肥大细胞脱粒肽、蜂毒肽、bombolittin、δ溶血素、摩西鱼毒肽(pardaxin)、假单胞菌外毒素A、网格蛋白、白喉毒素和C9补体蛋白或它们的片段。

在一个实施方案中，所述内化肽衍生自果蝇antepennepedia蛋白或其同系物。已证明同源异型蛋白antepennepedia的60个氨基酸长的长同源异型域通过生物膜转运，并且可以促进与其偶联的异源多肽的转运。参见例如Derossi等(1994)J Biol Chem 269：10444-10450；和Perez等(1992)J Cell Sci 102：717-722。最近，已证明该蛋白的长度小到16个氨基酸的片段足以驱动内化。参见Derossi等(1996)J BiolChem 271：18188-18193。本发明考虑了将antepennepedia蛋白(或其同系物)的至少一部分与式I或式II的肽或肽模拟物偶联，以相对于单独的化合物，所述化合物跨膜运输的增加量有统计学显著性。

内化肽的另一个实例是HIV反式激活蛋白(TAT)蛋白。该蛋白似乎被分成四个结构域(Kuppuswamy等(1989)Nucl.Acids Res.17：3551-3561)。纯化的TAT蛋白在组织培养物中被细胞摄取(Frankel和Pabo，(1989)Cell 55：1189-1193)，而肽例如对应于TAT的残基37-62的片段在体外被细胞快速摄取(Green和Loewenstein，(1989)Cell55：1179-1188)。所述高碱性区介导内化并且使内化部分靶向细胞核(Ruben等，(1989)J Virol.63：1-8)。包括高碱性区中存在的序列例如CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS或其亚序列例如YGRKKRRQRRR在内的肽或类似物可以与式I化合物或式II化合物缀合，以有助于内化和使所述化合物靶向胞内环境。

在某些这样的实施方案中，A或B的氨基酸序列比式I或式II中定义的氨基酸的长度要长，以允许足够长度的氨基酸序列连接，从而促进所述化合物的内化。

本发明特别优选的化合物是下文描述的化合物，如P53、P74、P101、P102和P69，最优选P69(参见表1a)。

本发明化合物也可以用作用于开发类似化合物的先导化合物。所述类似物应具有稳定的电子构型和分子构象，使得关键性的官能团以与先导化合物基本相同的方式呈递给例如MHC II类蛋白。特别是，所述类似化合物具有与结合区相当的空间电子特性，但可以是比先导化合物更大或更小的分子。通过应用自洽场(SCF)分析、组态相互作用(CI)分析和简正模式动力学分析等技术，可以对类似化合物进行鉴定。因此，本发明化合物作为先导化合物可被进一步修饰，以达到：

(h)改进的作用位点、活性谱、器官特异性，和/或

(i)改进的效力，和/或

(j)降低的毒性(改进的治疗指数)，和/或

(k)降低的副作用，和/或

(l)改进的治疗作用开始、作用的持续时间，和/或

(m)改进的药代动力学参数(吸收、分布、代谢和排泄)，和/或

(n)改进的理化参数(溶解度、吸湿性、颜色、味道、气味、稳定性、状态)，和/或

(o)改进的一般特异性、器官/组织特异性，和/或

(p)通过以下方式优化的应用形式和途径

(q)羧基被酯化，或

(r)羟基被碳氢酸酯化，或

(s)羟基被酯化成例如磷酸酯、焦磷酸酯或硫酸脂或半琥珀酸酯，或

(t)形成药学上可接受的盐，或

(u)形成药学上可接受的络合物，或

(v)合成药理学活性聚合物，或

(w)引入亲水部分，或

(x)引入/交换芳族基团或侧链上的取代基，改变取代基模式，或

(y)通过引入等排部分或生物等排部分而改性，或

(z)合成同系化合物，或

(aa)引入分支侧链，或

(bb)使烷基取代基转变成环状类似物，或

(cc)羟基衍生成缩酮、缩醛，或

(dd)N-乙酰化为酰胺、氨基甲酸苯酯，或

(ee)合成曼尼希碱、亚胺，或

(ff)酮或醛被转化成席夫碱、肟、缩醛、缩酮、烯醇酯、噁唑烷、噻唑烷，

或它们中任一项的组合。上面叙述的各个步骤是本领域众所周知的。例如，用于实施这些技术的计算机程序是可得到的；例如得自Rein，Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions(Alan Liss，New York，1989)。化学衍生物与类似物的制备方法是本领域技术人员熟知的，描述于例如Beilstein，Handbook of OrganicChemistry，Springer edition New York Inc.，175 Fifth Avenue，New York，N.Y.10010 U.S.A.和Organic Synthesis，Wiley，New York，USA。此外，例如，按照上述方法，可以使用肽模拟物和/或辅助设计的合适衍生物和类似物的计算机。药物发现中用以产生先导化合物的方法也包括应用蛋白质检测方法，例如质谱法(Cheng等J.Am.Chem.Soc.117(1995)，8859-8860)和某些核磁共振(NMR)方法(Fejzo等，Chem.Biol.6(1999)，755-769；Lin等，J.Org.Chem.62(1997)，8930-8931)。所述方法也可以包括或依赖于定量结构-作用关系(QSAR)分析(Kubinyi，J.Med.Chem.41(1993)，2553-2564，Kubinyi，Pharm.UnsererZeit 23(1994)，281-290)组合生物化学、经典化学等(参见例如Holzgrabe和Bechtold，Pharm.Acta Helv.74(2000)，149-155)。

本发明还涉及包含主题化合物和赋形剂例如药学上可接受的赋形剂或无菌赋形剂的治疗制剂。本发明还涉及用于治疗或预防其特征为MHC-II介导的T细胞活化的病症的方法，所述方法包括给予动物例如人包含如上所述的化合物的组合物。本发明还涉及主题化合物在制备药用组合物中的用途。这样的药用组合物可适合用于治疗或预防其特征为MHC-II介导的T细胞活化的病症。在某些实施方案中，所述病症是自身免疫病，例如类风湿性关节炎或多发性硬化。

在某些实施方案中，主题抑制剂对一种治疗同种型或同种异型例如HLA-DR或DRB1*0101相对于第二种同种型或同种异型或相对于大多数其它同种型或同种异型而言是选择性的。因此，主题抑制剂对一种同种型或同种异型相对于对一种或多种其它HLA同种型或同种异型的ED₅₀可低至少5倍或10倍，优选低至少100倍，甚至更优选低至少1000倍。同样，主题抑制剂对一种同种型或同种异型相对于对一种或多种其它HLA同种型或同种异型的ED₅₀可低至少5倍或10倍，优选低至少100倍，甚至更优选低至少1000倍。

在某些实施方案中，本发明提供经营药品生意的方法，即根据化合物结合MHC II类蛋白的能力选择出本文中公开的一种或多种化合物，确定所述化合物对动物功效和毒性的治疗分布型，制作说明应用所述化合物抑制免疫应答的包装插页，将用于抑制免疫应答的多价组合物在市场上销售。本发明也提供药盒，所述药盒包含本文公开的化合物并给予所述化合物以抑制免疫应答的说明书。

在另一个实施方案中，本发明提供进行生命科学商业活动的方法，即根据化合物结合MHC II类蛋白的能力选择出本文中公开的一种或多种化合物，以及获得专利许可、共同开发或向第三方出售生产、经营、销售或使用所述抑制免疫应答化合物的权利。

IV.治疗应用

对于各种各样的医学治疗都可以使用主题化合物。例如，主题化合物可以与实体器官移植物联合使用。优选所述器官选自心脏、肝脏、肾脏、肾上腺皮质、肺、肠、胰腺、角膜和皮肤。最优选所述靶器官选自心脏、肾脏、肝脏、角膜和皮肤。例如，患者可以在接受移植或同种异体移植之前或之后用主题化合物进行治疗，以预防或减轻可能导致移植排斥或移植物抗宿主病的免疫反应。也考虑了主题化合物的持续释放，例如从生物可降解聚合物移植物或生物可降解聚合物微粒或纳米粒中的持续释放。

本发明化合物也可用于治疗其特征为T细胞被MHC II类多肽不需要的、功能障碍性或异常激活的免疫系统疾病。这样的免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、青少年关节炎、多发性硬化、格雷夫斯病(Grave′s disease)、胰岛素依赖性糖尿病、发作性睡眠、牛皮癣、系统性红斑狼疮、关节强硬性脊椎炎、同种异体移植物排斥、桥本甲状腺炎(Hashimoto′s disease)、重症肌无力、寻常性天疱疮、甲状腺炎、肾小球性肾炎、胰岛炎、过敏性肠疾病、胰腺炎和原发性胆汁性肝硬化。可以用本发明化合物减轻症状或者治疗或预防其发生或复发的其它疾病包括例如斯耶格伦综合征(Sjogren syndrome)、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、大疱性类天疱疮、古德帕斯彻综合征(Goodpasture′s syndrome)、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、特发性血小板减少性紫癜和艾迪生病(Addison′s disease)等。对于这样的治疗，可以给予足够量的本文描述的化合物，以治疗有效量地抑制MHC-II介导的T细胞活化。

特定的自身免疫功能障碍通常与特定的MHC类型相关。人类中DQ/DR单倍型及其与自身免疫病的关系是众所周知的，例如描述于美国专利第6,045,796号。在某些实施方案中，以下做法是有利的，即确定准备用主题抑制剂进行治疗的患者的基因型和/或表型，例如以选择适合治疗与患者单倍型相关的疾病或病症的药物，或者，适当时，确定患者的基因型和/或表型，以选择具体的药物和/或开出具体的药物处方。在一个优选的实施方案中，疾病和特定MHC类型之间的关系如此密切，使得可能不需要确定患者的基因型和/或表型。测定动物例如人的单倍型的方法是本领域众所周知的，并且任何合适的技术都可以用来进行这样的测定，例如，通过采用对待检查MHC基因座特异性的DNA探针来分析DNA限制性片段长度多态性(RFLP)。MHC基因座探针的制备方法是本领域技术人员已知的。参见例如Gregersen等，(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79：5966，所述文献通过引用结合到本文中。然后将患者的单倍型与已知疾病相关性单倍型进行比较。作为一个实例，90％以上的类风湿性关节炎患者的单倍型为DR4 (Dw4)、DR4(Dw14)或DR1。特别是，青少年类风湿性关节炎(例如少关节性青少年类风湿性关节炎)与HLA-DPB2.1相关(Begovich等，1989，PNAS 86：9489-9493)。约70％的胰岛素依赖性糖尿病患者表达HLA-DQ3.2B、DQA1或DQB1，并且自身免疫性皮肤病如寻常性天疱疮的敏感性与HLA-DQB1.3的表达有关(Scharf等，1989，PNAS 86：6215-6219)。已知对豚草的过敏反应与DR2等位基因相关。Marsh等，(1989)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 54：459-70，所述文献通过引用结合到本文中。

体外试验方法

可以在各种系统中测定所述抑制剂的生物学活性，例如所述抑制剂抑制抗原特异性T细胞活化的能力。在一种方法中，将纯化的II类MHC分子通过去垢剂透析而掺入到磷脂小泡中。然后让所得小泡与清洁的盖玻片融合，在每个小泡都产生含MHC分子的平面脂质双层(Brian和McConnell，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81：6159)。将待测抑制剂进行可检测标记，然后在板上与已配制成脂质膜双层的纯化MHC蛋白一起保温。通过检测与板结合的标记而鉴定与MHC分子结合的抑制剂。

在第二个示例性方案中，将过量的抑制剂与表达目标MHC同种异型(例如目标DR)的抗原呈递细胞和识别所选肽(例如破伤风毒素830-843)和MHC分子(例如目标DR)的T细胞克隆以及抗原肽本身一起孵育。将所述测定培养物孵育足够的时间，使T细胞增殖，例如孵育4天，然后采用标准方法，例如在孵育的最后18小时给予氚标记胸苷脉冲，来测定增殖情况。然后计算与不接受抑制剂的对照相比的抑制百分率。

在美国专利第5,736,507号中描述了第三种方案。在该专利的公开内容中，采用先前描述的半定量结合测定(Joosten等，Int.Immunol.6：751，1994)的改进形式，进行肽结合研究。适合于本发明，可以将纯化MHC分子(0.5-500nM)在pH＝5.0时与50nM生物素化指示肽一起温育，可以使用不同浓度范围的抑制剂，终体积为25μl结合缓冲液(例如PBS、1mM AEBSF、1mM N-乙基马来酰亚胺、8mMEDTA、10μM胃蛋白酶抑制剂A、0.01％NaN₃、0.05％NP-40和5％DMSO)。

在室温下约温育45小时后，可以通过SDS-PAGE并结合硝酸纤维素滤膜(BioRad)上的印迹或使用硝酸纤维素滤膜(BioRad)的真空DOT印迹以及96孔Hybry Dot装置(BRL)，分离出结合和未结合的指示肽。印迹可以用0.5％DNA封闭剂(Boehringer Mannheim，德国)在0.1M马来酸pH＝7.5、150mM NaCl中进行封闭。1/2小时后，印迹在PBS、0.02％Tween 20(Sigma，St.Louis，USA)中进行洗涤，然后分别以1∶40,000或1∶5,000的稀释度与链霉抗生物素蛋白-HRPO(Southern Biotechnology)一起温育。采用蛋白质印迹ECL试剂盒(Amersham，U.K.)，按照生产商的说明，通过增强化学发光来检测DR-结合的生物素化指示肽。将Preflashed胶片(hyperfilm-ECL，Amersham，U.K.)曝光10分钟。给定肽的相对结合亲和性与指示肽的竞争有关。该相对亲和性被定义为信号减弱至50％时的抑制剂浓度(^RIC₅₀)。

下面实施例部分详细描述的相似方案基于Siklodi等(HumanImmunology，59(1998)463-471)介绍的方案，并且使用主题抑制剂的竞争性结合。任何合适的MHC-II同种异型都可以用于这样的测定中，如下所述，所述方法适合于筛选所述化合物的文库，以寻找所述化合物结合MHC-II分子的能力。

其它测定抑制剂的体外生物学活性的合适方法在下面的实施例中进行说明。

体内试验模型系统

化合物在体外测定中抑制抗原呈递的能力与所述化合物抑制体内免疫应答的能力有关。体内活性可以在动物模型中进行测定，例如通过将已知限制特定目标MHC分子的抗原与本发明的试验抑制剂一起给予一测定。随后取出所述动物的T淋巴细胞，与各种剂量的抗原一起进行培养。通过常规方法例如用³H-胸苷脉冲并将其与合适对照进行比较，来测量对刺激的抑制。最好按照下面实施例部分描述的方法，将动物模型进行遗传修饰，以表达目标人MHC II类同种异型而不表达内源MHC II类分子。某些实验细节对于技术人员而言自然是显而易见的。另见Adorini等，Nature 334：623-625(1988)和Ito等(1996)J.Exp.Med.183：2635-2644，这两个文献均通过引用结合到本文中。

下面是示例性的免疫系统疾病模型系统，所述模型系统可用于评价本发明化合物对这些病症的影响。技术人员将不超越常规实验或研究范围就能够鉴定出适合于测试本发明化合物抵抗免疫系统的这些疾病和其它疾病的其它模型。

实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是用髓鞘蛋白例如髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PP)或小鼠少突神经胶质细胞糖蛋白(MOG)，按照Ito等(1996)介绍的方法，免疫MS相关人II类同种异型转基因和小鼠II类分子有缺陷的小鼠而诱发的多发性硬化(MS)模型。

胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)是用II型胶原蛋白免疫RA相关人II类分子转基因小鼠而诱发的类风湿性关节炎(RA)模型(Rosloniec等，J.Exp.Med.185：1113(1997)和J.Immunol.160：2573-2578，(1998))。

V.药用组合物

另一方面，本发明提供包含治疗有效量的一种或多种主题化合物(例如上述化合物)的药学上可接受的组合物，所述化合物与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂配制在一起，用于治疗异常T细胞活化或自身免疫病，例如类风湿性关节炎或多发性硬化。如下文详细描述的，本发明的药用组合物可以具体配制成用于给药的固体或液体形式，包括适合于以下的那些形式：(1)口服给药，例如兽用顿服药(水性或非水性溶液剂或混悬剂)、片剂、胶囊剂、大丸剂、散剂、颗粒剂、舌用糊剂等；(2)胃肠外给药，例如皮下注射、肌内注射或静脉内注射，例如无菌溶液剂或混悬剂等；(3)局部应用，用于皮肤的乳膏剂、软膏剂或喷雾剂等；或(4)阴道内或直肠内给药，例如子宫托、乳膏剂、泡沫剂或栓剂等。在某些实施方案中，所述药用制剂可以是无热原的，即不会升高患者的体温。

本文所用的短语“治疗有效量”是指化合物、物质或包含本发明抑制剂的组合物有效产生某种所需疗效的量。这样的疗效可以由于例如对不需要的T细胞活化进行抑制而产生。

本文所用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医疗判断范围内、适合用于与人类和动物组织接触时无过度毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症、同时具有合理利益/风险比的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。

本文所用的短语“药学上可接受的载体”是指参与将本发明主题化合物从机体的一种器官或部分运送或转运到机体的另一种器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或溶媒，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料。每种载体必须在与制剂的其它组分相容的意义上是“可接受的”并且对患者不造成伤害。可用作药学上可接受的载体的材料的某些实例包括：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状西黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二元醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)Ringer氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)药用制剂中所用的其它无毒性相容的物质。

如上所述，本发明化合物的某些实施方案可含有碱性官能团，例如氨基或烷基氨基，因而能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在该方面，术语“药学上可接受的盐”是指这类MHC活性抑制剂的相对无毒性无机酸加成盐和有机酸加成盐。这些盐可以在本发明化合物的最后分离和纯化期间在现场制备，或者通过使本发明的纯化化合物以其游离碱形式与合适的有机酸或无机酸分别反应，并且分离如此形成的盐。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳二糖酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见例如Berge等(1977)″Pharmaceutical Salts(药用盐)″，J.Pharm.Sci.66：1-19)。

在其它情况下，本发明化合物可以含有一个或多个酸性官能团，因而能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指MHC活性(如T细胞活化)抑制剂的相对无毒性无机碱加成盐和有机碱加成盐。这些盐同样可以在本发明化合物的最后分离和纯化期间在现场制备，或者通过使本发明的纯化化合物以其游离酸形式与合适的碱(例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)与氨或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺分别反应。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。(参见例如Berge等，参见上文)。

在所述组合物中也可以存在润湿剂、乳化剂和润滑剂例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和香味剂、防腐剂和抗氧化剂。

药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)脂溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螫合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

本发明的制剂包括适合于经口、鼻、局部(包括口腔含化和舌下)、直肠、阴道和/或胃肠外给药的那些制剂。所述制剂可以方便地呈单位剂型，并且可以通过药学领域熟知的任何方法来制备。可以与载体材料混合以生产单剂型的活性成分的量将会根据待治疗宿主、具体的给药模式而变化。可以与载体材料混合以生产单剂型的活性成分的量一般将是产生疗效的抑制剂的量。一般而言，在100％范围以内，该量的范围将为活性成分约1％至约99％，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。

这些制剂或组合物的制备方法包括使本发明化合物与所述载体且任选与一种或多种助剂混合的步骤。一般而言，通过使本发明抑制剂与液体载体或微细固体载体或它们两者十分均匀混合，然后必要时使所述产物成形，来制备所述制剂。

适合于口服给药的本发明制剂可以为以下形式：胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用矫味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)、散剂、颗粒剂，或者为水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂，或者为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂，或者为酏剂或糖浆剂，或者为软锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油，或者蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口剂等，每种剂型都含有预定量的作为活性成分的本发明化合物。本发明化合物也可以作为大丸剂、干药糖剂或糊剂给予。

在本发明供口服给药用的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖锭剂、散剂、颗粒剂等)中，将所述活性成分与一种或多种药学上可接受的载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或任一下述物质混合：(1)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶等；(3)湿润剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液型阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收加速剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯等；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物；和(10)着色剂。就胶囊剂、片剂和丸剂而论，所述药用组合物也可以包含缓冲剂。使用如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂，相似类型的固体组合物也可以用作填充软明胶和填充硬明胶的胶囊剂中的填充剂。

片剂可以通过压制或模制、任选与一种或多种助剂一起压制或模制来制备。压制片剂可以使用以下物质来制备：粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉羟乙酸钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂。可以通过使用惰性液态稀释剂湿润的粉状抑制剂的混合物在合适的机器中塑型，制备模制片剂。

本发明药用组合物的片剂和其它固体剂型例如糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可以任选用包衣剂和壳体(例如肠溶衣或制药领域熟知的其它包衣剂)刻痕或包衣。也可以例如提供所需释放分布型的不同比例的羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、脂质体和/或微球体，将其配制成提供缓慢释放或控制释放其中的活性成分。它们可以通过例如除菌滤器来过滤除菌，或者通过在无菌固体组合物形式中掺入杀菌剂，临用前将该无菌固体组合物溶于无菌水或某些其它无菌注射用介质中。这些组合物也可以任选含有遮光剂，并且可以为它们仅释放所述活性成分或者优先在胃肠道的某一部位(例如小肠或大肠)中释放所述活性成分、任选以延迟方式释放所述活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。所述活性成分也可以为微囊化形式，适当时含有一种或多种上述赋形剂。

本发明化合物用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。所述液体剂型除含有所述活性成分，还可以含有本领域中常用的惰性稀释剂例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油类(特别是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯以及它们的混合物。

除惰性稀释剂外，所述口服组合物还可以包括辅料，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。

混悬剂除含有所述活性抑制剂外，还可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化(metahydroxide)铝、膨润土、琼脂和西黄蓍胶以及它们的混合物。

可供直肠或阴道给药用的本发明药用组合物的制剂可以为栓剂，所述栓剂可以通过将一种或多种本发明化合物与一种或多种合适的非刺激性赋形剂或载体混合来制备，所述栓剂包含例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯，所述栓剂在室温下为固体，但在体温下为液体，因此，在直肠或阴道腔内会熔化并释放所述活性抑制剂。

适用于阴道给药的本发明制剂适当时也包括含所述载体的子宫托、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂，这是本领域已知的。

用于局部或透皮给予本发明化合物的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。可以将所述活性化合物与药学上可接受的载体以及任何可能需要的防腐剂、缓冲剂或抛射剂在无菌条件下混合。

所述软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂除含有活性抑制剂外，还可以含有赋形剂例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石粉和氧化锌或它们的混合物。

散剂和喷雾剂除含有本发明化合物外，还可以含有赋形剂例如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可另外还含有常用的抛射剂(例如含氯氟烃)和挥发性未取代烃(例如丁烷和丙烷)。

透皮贴剂具有提供给机体控制传递本发明化合物的附加优点。这样的剂型可以通过将本发明抑制剂溶于或分散在合适的介质中来制备。也可以用吸收增强剂来增强所述药物对皮肤的穿透性。这样的穿透速率可以通过提供速率控制膜或本发明化合物在聚合物基质或凝胶中分散来控制。

眼用制剂、眼膏剂、散剂、溶液剂等也考虑在本发明范围内。

适用于胃肠外给药的本发明药用组合物包含一种或多种本发明抑制剂以及一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液剂、分散剂、悬浮剂或乳剂，或者临用前可以在无菌注射用溶液或分散体中重建的无菌粉针剂，还可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使所述制剂与计划受体血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。

可用于本发明药用组合物中的合适水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它们的合适混合物、植物油(例如橄榄油)和注射用有机酯(例如油酸乙酯)。可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂、就分散体而论保持所需粒径以及使用表面活性剂，来维持适当的流动性。

这些组合物也可以含有辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，来确保防止微生物的作用。在所述组合物中可能最好还包括等渗剂例如糖、氯化钠等。另外，可以通过包括延迟吸收的试剂例如一硬脂酸铝和明胶，来延长吸收所述注射药物形式。

在某些情况下，为了延长抑制剂的治疗效果，最好使皮下或肌内注射的抑制剂缓慢吸收。通过使用水溶性差的晶形或非晶形材料的液体混悬剂，可以完成这一步。所述抑制剂的吸收速率则取决于其溶解率，后者则取决于晶体大小和晶形。另一方面，通过将所述抑制剂溶于或悬浮于油性溶媒中，可完成胃肠外给予的抑制剂形式的延迟吸收。

注射用贮库(depot)形式通过使主题抑制剂在生物可降解聚合物例如聚交酯-聚乙醇酸交酯中形成微囊化基质而制备。根据药物与聚合物之比以及所用具体聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。贮库注射制剂也可通过将所述药物包封在与机体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。

在某些实施方案中，将本文描述的化合物与其它治疗剂例如其它的免疫抑制药、触发不需要的免疫应答的因子或物质(例如移植细胞)或与免疫抑制剂一起发挥作用以达到所需疗效的药物(例如抗炎药)联合给药。例如，所述化合物和因子或物质可以在一种组合物例如片剂中给药、在不同的组合物中同时给药或者在不同的组合物中在不同时间作为治疗方案的一部分给药等。

当本发明化合物作为药物给予人类和动物时，它们可以照原样给予或者作为含有例如0.1-99.5％(更优选0.5-90％)的活性成分以及药学上可接受的载体的药用组合物给予。

本发明的制剂可以经口、胃肠外、局部或直肠给予。它们当然通过适合于每种给药途径的形式给予。例如，它们以片剂或胶囊剂形式通过注射、吸入、洗眼剂、软膏剂、栓剂等给予，通过注射、输注或吸入给予；通过洗剂或软膏剂局部给予；以及通过栓剂经直肠给予。优选口服给药。

本文所用的短语“胃肠给药”是指除肠内给药和局部给药以外的给药模式，通常通过注射给药，包括但不限于静脉内、肌肉、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。

本文所用的短语“系统给药”和“外周给药”是指将化合物、药物或其它物质间接给予中枢神经系统中，致使其进入到患者的系统内，因而经过代谢和其它类似的过程，例如皮下给药。

无论选择何种给药途径，可以合适的水合形式使用可用于主题方法的抑制剂，和/或可以通过本领域技术人员已知的常规方法，将本发明药用组合物配制成药学上可接受的剂型。

本发明药用组合物中活性成分的实际剂量水平可以根据具体患者、组合物和给药模式而变化，以便获得有效达到所需治疗反应(例如缓解类风湿性关节炎或多发性硬化的症状)而对所述患者无毒的活性成分的量。

所选剂量水平将会取决于各种各样的因素，包括所用的具体抑制剂或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、待用具体化合物的排泄率、治疗持续时间、结合所用的具体抑制剂一起使用的其它药物、化合物和/或物质、待治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和先前的药物史以及药学领域熟知的其它因素。

掌握本领域常规技术的主治医师或兽医可以容易地确定所需药用组合物的有效量并开出处方。例如，主治医师或兽医可以开始以低于需要达到所需疗效的水平给予所述药用组合物中所用的本发明化合物，然后逐渐增加剂量直到达到所需的效果。

一般而言，有效抑制剂的合适日剂量(例如其EC₅₀在1mM至纳摩尔以下范围内)必将是产生疗效的最低有效剂量的化合物的剂量。一般而言，这样的有效剂量将取决于上述因素。总的来讲，对于患者，当用于指定效果时，本发明化合物的静脉内、脑室内和皮下剂量范围为每天每千克体重约0.0001mg至约1000mg，尽管优选约0.5mg/kg至约300mg/kg。

如果需要，所述活性抑制剂的有效日剂量可以在一天内、以适当的间隔、任选在单位剂型内，以独立给予的2、3、4、5、6或更多个亚剂量给药。

在一个优选的实施方案中，将所述抑制剂配制成用于口服给药，例如以固体片剂、丸剂、胶囊剂、胶囊形片剂等(在下文统称为“片剂”)或水性溶液剂或混悬剂的形式。在所述抑制剂的片剂形式的一个优选实施方案中，优选将所述片剂配制成在20片片剂中提供抑制剂的剂量，如果合起来看，将提供至少半数有效剂量(ED₅₀)的剂量，例如至少50％的个体表现出疗效的剂量。例如，对于抑制剂，疗效将是MHC II类分子介导的T细胞活化被抑制的计数效应(例如炎症统计学显著性减轻)。更优选所述片剂的配制使得在10、5、2或1片片剂中提供的抑制剂的总剂量将给患者(人或非人类哺乳动物)提供至少ED₅₀剂量。在其它实施方案中，在24小时内摄取的20、10、5或2片片剂中提供的抑制剂的剂量将提供一种给药方案，条件是抑制剂的平均血浆水平为至少ED₅₀浓度(例如抑制MHC活性的最大效应的50％的浓度)，尽管优选小于100倍ED₅₀，甚至更优选小于10倍或5倍ED₅₀。在优选的实施方案中，一剂片剂(1-20片片剂)就可提供约0.25mg至1250mg抑制剂。

同样，所述抑制剂可以配制用于胃肠外给药，例如用于皮下、肌内或静脉内注射，例如所述抑制剂可以以无菌溶液剂或混悬剂(在下文统称为“注射液”)提供。优选所述注射液的配制使得在200cc大剂量注射液中提供的抑制剂剂量将提供至少半数有效剂量的剂量，尽管优选小于100倍ED₅₀，甚至更优选小于10倍或5倍ED₅₀。更优选所述注射液的配制使得在100cc、50cc、25cc、10cc、5cc、2.5cc或1cc注射液中提供的抑制剂总剂量将给患者提供ED₅₀剂量，优选小于100倍ED₅₀，甚至更优选小于10倍或5倍ED₅₀。在其它实施方案中，在24小时内至少注射2次，在注射的总体积为100cc、50cc、25cc、5cc或2cc中提供的抑制剂剂量将提供一种给药方案，条件是抑制剂的平均血浆水平为至少ED₅₀浓度，尽管优选小于100倍ED₅₀，甚至更优选小于10倍或5倍ED₅₀。在优选的实施方案中，一剂注射液提供约0.25mg至1250mg抑制剂。

对于连续静脉内注射例如滴注或推注，所述抑制剂可以在无菌稀释溶液或混悬剂(在下文统称为“静脉内注射液”)中提供。优选所述静脉内注射液的配制使得在1升溶液中所提供的抑制剂剂量将提供一剂(如果在15分钟或少于15分钟内给药的话)的至少半数有效剂量，尽管优选小于100倍ED₅₀，甚至更优选小于10倍或5倍ED₅₀。更优选静脉内注射液的配制使得在1升溶液中所提供的在60分钟、90分钟、120分钟或240分钟内给予的抑制剂总剂量将给患者提供ED₅₀剂量，尽管优选小于100倍ED₅₀，甚至更优选小于10倍或5倍ED₅₀。在优选的实施方案中，单个静脉内“输液袋”提供每升静脉内注射液约0.25mg至5000mg抑制剂，更优选0.25mg至2500mg抑制剂，甚至更优选0.25mg至1250mg抑制剂。

对于人，ED₅₀剂量基于体重2Kg至125Kg，尽管更优选对于成人，体重在50至125Kg的范围内。

可以采用本领域众所周知的多种技术中的任一技术，例如上述技术，来评价潜在抑制剂的对任何抑制的ED₅₀值，包括例如针对类风湿性关节炎或多发性硬化的治疗活性。

VI.主题抑制剂的组合合成

本发明化合物、特别是具有各类代表性取代基的变异体的文库适合于组合化学和其它平行合成方案(参见例如PCT WO 94/08051)。结果是例如采用本文中描述的一种测定，可以在高通量测定中对相关化合物的大文库、例如对由上式I_或上式II_表示的化合物的花斑文库(variegated library)进行快速筛选，以便鉴定出潜在的先导化合物以及改进先导化合物的特异性、毒性和/或细胞毒性-动力学分布型。

仅仅用以说明，对本发明而言，组合文库是可以根据所需特性一起筛选的化学上相关化合物的混合物。在一个反应中制备许多相关化合物大大减少和简化了需要进行的多个筛选过程。可以通过常规方法对合适的物理性质进行筛选。

可以在多个不同水平上创建文库的多样性。例如，组合反应中所用的底物芳基就核心芳基部分而论可以是多样化的、例如就环状结构而论的花斑，和/或可以随其它取代基而变化。

在本领域可以利用各种各样的技术来产生有机小分子例如本发明主题抑制剂的组合文库。参见例如Blondelle等(1995)Trends Anal.Chem.14：83；the Affymax的美国专利5,359,115和5,362,899：theEllman的美国专利5,288,514：the Still等的PCT公布号WO 94/08051；Chen等(1994)JACS 116：2661：Kerr等(1993)JACS 115：252；PCT公布号WO92/10092、WO93/09668和WO91/07087；和the Lerner等的PCT公布号WO93/20242)。因此，可以合成本发明主题抑制剂数量级约100-1,000,000或更多的多样化单体(diversomer)的种类繁多的文库，并可以根据特定活性或特性进行筛选。

A)直接表征

组合化学领域的发展方向是利用挖掘出质谱法(MS)等技术的灵敏度，例如可以用来表征费摩尔量以下(sub-femtomolar amount)的化合物，及直接测定选自组合文库的化合物的化学组成。例如，当文库在不溶性支持体基质上提供时，独特的化合物群体可以首先从所述支持体中释放出来，并通过MS表征。在其它实施方案中，作为MS样品制备技术的一部分，诸如MALDI的MS技术可以用来从基质中释放出化合物，特别是在不稳定键最初用来使所述化合物束缚在基质上时。例如，选自文库的珠可以在MALDI步骤中被照射，以便从基质中释放出多样化单体，并使所述多样化单体离子化，供MS分析用。

B)多针(Multipin)合成

主题方法的文库可以采取多针文库形式。简而言之，Geysen及其同事(Geysen等(1984)PNAS 81：3998-4002)提出了一种通过在按微量滴定板形式排列的聚丙烯酸门控的聚乙烯针上平行合成而产生化合物文库的方法。Geysen技术采用多针法可以用来每周合成并筛选数千种化合物，所述束缚化合物可以在许多测定中重复使用。合适的接头部分也可以附到所述针上，致使化合物可以在合成后从所述支持体上切割下来，用以评价纯度和进一步进行评价(参见Bray等(1990)Tetrahedron Lett 31：5811-5814；Valerio等(1991)Anal Biochem197：168-177；Bray等(1991)Tetrahedron Lett 32：6163-6166)。

C)分开-偶联-重组法(Divide-Couple-Recombine)

在又一个实施方案中，化合物的花斑文库可以利用分开-偶联-重组策略在一组珠上提供(参见例如Houghten(1985)PNAS 82：5131-5135；和美国专利4,631,211、5,440,016、5,480,971)。简而言之，同其名称所暗示的一样，在其中将简并性引入所述文库的每个合成步骤中，将所述珠分成不同的组，组数与所述文库的特定位置上加入的不同取代基数目相等，不同的取代基在不同的反应中进行偶联，将所述珠重新组合成一个库(pool)，供下一个重复使用。

在一个实施方案中，可以采用与所谓的“茶袋(tea bag)”法类似的方法，进行所述分开-偶联-重组策略，所述“茶袋”法首先由Houghten开发出来，在所述方法中化合物合成在装入多孔聚丙烯袋内并密封好的树脂上进行(Houghten等(1986)PNAS 82：5131-5135)。通过将所述袋置入合适的反应溶液中，使取代基与带有化合物的树脂进行偶联，而所有共同步骤例如树脂洗涤和脱保护都同时在一个反应容器中进行。合成结束时，每个袋子都包含一种化合物。

D)空间可寻址平行化学合成

化合物的身份通过其在合成基片上的位置给出的组合合成方案被称为空间可寻址合成。在一个实施方案中，通过控制将化学试剂加入到固体支持体上的特定位置，进行组合过程。例如，本发明化合物(例如表1和表2中所示的那些化合物的类拟物)组合合成的优选方法是EP0651762中介绍的SPOT技术，该技术的改进和应用描述于WO 00/12575、WO 01/18545和Reinehe等2001(Current Opinions inBiotech 12：59-64)中。通过应用微通道创建候选化合物或变体化合物的组合阵列，例如WO 99/67024和WO 99/56878中介绍的组合阵列，提供了另一优选的方法。

或者，可以通过光控合成产生空间可寻址形式的组合化学(Dower等(1991)Annu Rep Med Chem 26：271-280；Fodor，S.P.A.(1991)Science251：767；Pirrung等(1992)的美国专利第5,143,854号；Jacobs等(1994)Trends Biotechnol 12：19-26)。光刻法的空间分辨率达到了微型化。该技术通过应用与光不稳定保护基的保护/脱保护反应来实施。

该项技术的关键点在以下文献中有说明：Gallop等(1994)J MedChem 37：1233-1251。通过被光不稳定硝基藜芦基氧基羰基(NVOC)保护的氨基接头或其它光不稳定接头的共价连接制备合成基片,以供偶联。用光选择性激活用于偶联的合成支持体的特定区。通过光除去光不稳定保护基(脱保护)导致所选区域的激活。激活后，一组氨基酸类似物的第一个，每个都在氨基末端带有光不稳定保护基，暴露于整个表面。偶联只在前一步骤中通过光寻址的区域中发生。使反应停止，洗涤各板，基片通过第二个掩膜，再次被照射，激活不同的区域，接着与第二个被保护单位的构件单元反应。掩膜的模式和反应物的次序决定了产物及其位置。由于该过程利用光刻技术，因此可以合成的化合物数目仅受到可以用合适分辨率寻址的合成位点数目的限制。可准确知道每个化合物的位置；因此可以直接评价化合物与其它分子的相互作用。

在光控化学合成中，产物取决于照射的模式和反应物加入的次序。通过改变刻蚀模式，可以同时合成多组不同的试验化合物；该特征导致产生许多不同的掩膜策略。

E)编码的组合文库

在又一个实施方案中，主题方法利用提供有编码标记系统的化合物文库。从组合文库中鉴定出活性化合物的最新改进利用化学指标化系统，所述化学指标化系统采用能独特地编码给定珠所经历的反应步骤及经推断其携带的结构的标志。从概念上讲，该方法模拟了噬菌体展示文库，在该文库中，活性源自已表达的肽，但活性肽的结构可从相应基因组DNA序列推导出。合成组合文库的第一个编码形式应用DNA作为密码。多种其它形式的编码已有报道，包括用可测序生物寡聚体(例如寡核苷酸和肽)的编码和用另外的不可测序标志的双元编码。

1)用可测序生物寡聚体标记

利用寡核苷酸编码组合合成文库的原理描述于1992年(Brenner等(1992)PNAS 89：5381-5383)，这样的文库的实例出现在第二年(Needles等(1993)PNAS 90：10700-10704)。标称7⁷(＝823,543)肽的组合文库由Arg、Gln、Phe、Lys、Val、D-Val和Thr(三字母氨基酸密码)的所有组合组成，其中每个由特定的二核苷酸(分别为TA、TC、CT、AT、TT、CA和AC)编码，该组合文库通过固体支持体上肽和寡核苷酸合成的连续交替循环来制备。在该项工作中，使珠上的胺连接官能团对肽或寡核苷酸合成特异性分化，这通过将珠与产生被保护OH基团(用于寡核苷酸合成)和被保护NH₂基团(用于肽合成)(在此，比率为1∶20)的试剂一起预保温来实现。当完成时，各标志分别由69聚体组成，其中14个单元携带密码。将珠结合的文库与荧光标记的抗体一起保温，通过荧光激活细胞分选仪(FACS)收获发强荧光的含结合抗体的珠。DNA标志通过PCR扩增并进行测序，然后合成预测肽。按照这样的技术，可以将化合物文库用于主题方法中，其中所述标志的寡核苷酸序列鉴定出特定珠所经历的序贯组合反应，因此，提供珠上化合物的身份。

寡核苷酸标志的应用使得可以精巧而灵敏地进行标记分析。虽然如此，所述方法要求对改变标志和文库成员的交替同合成所需的保护基正交组进行小心的选择。此外，标志、特别是磷酸酯和糖端基异构连接的化学不稳定性，可以限制对可用于非寡聚体文库合成的试剂和条件的选择。在优选的实施方案中，所述文库利用允许试验化合物文库成员的选择性分离以供测定的接头。

也可用肽作为组合文库的标记分子。两种示例性的方法在本领域已有描述，它们两者均应用于固相上，分支接头在固相上交替制作编码链和配体链。在第一种方法(Kerr等(1993)JACS 115：2529-2531)中，合成的正交性通过应用对编码链的酸不稳定保护以及对化合物链的碱不稳定保护而实现。

在一个替代方法(Nikolaiev等(1993)Pept Res 6：161-170)中，使用分支接头，使得编码单位和试验化合物两者都与树脂上的同一官能团连接。在一个实施方案中，可切割基团可位于分支点和珠之间，致使切割释放既含有密码又含有化合物的分子(Ptek等(1991)Tetrahedron Lett 32：389l-3894)。在另一个实施方案中，可以这样放置可切割基团，使得试验化合物可以从珠中选择性分离出来，而留下所述密码。这最后的构建体特别有价值，因为它允许筛选试验化合物而不潜在干扰编码基团。肽文库成员及其相应标志的独立切割和测序的现有技术实例已证实，所述标志可以准确预测肽结构。

2)不可测序标记：双元编码

编码试验化合物文库的替代形式利用一组用作双元密码的不可测序electrophoric标记分子(Ohlmeyer等(1993)PNAS 90：10922-10926)。示例性的标志是可通过电子俘获气相色谱法(ECGC)、用其三甲基甲硅烷基醚以低于费摩尔水平检测的卤代芳族烷基醚。烷基链长度的改变以及芳族卤取代基的性质和位置，允许合成至少40个这样的标志，理论上可编码2⁴⁰(例如超过10¹²)个不同的分子。在原始报告(Ohlmeyer等，参见上文)中，所述标志与肽文库中约1％的可利用胺基通过可光解邻硝基苄基接头结合在一起。该方法当制备肽样或其它含胺分子的组合文库时是合理而可行的。然而，已开发出一个更多用处的系统，使得可以编码基本上任何组合文库。在此，所述化合物通过可光解接头与固体支持体连接，而标志通过插入到珠基质中的碳烯而与儿茶酚醚接头连接(Nestler等(1994)J Org Chem59：4723-4724)。这种正交连接策略允许选择性分离用于在溶液中供测定用的文库成员，随后在各组标志的氧化性分离后通过ECGC解码。

虽然现有技术中若干酰胺连接的文库利用具有与胺基连接的electrophoric标志的双元编码，但使这些标志直接与珠基质连接，提供可以在所编码的组合文库中制备的结构的多得多的多用途。以这种方式进行连接，所述标志及其接头几乎同珠基质本身一样是无反应性的。两种双元编码的组合文库已有报道，其中electrophoric标志直接与固相连接(Ohlmeyer等(1995)PNAS 92：6027-6031)，从而为产生主题化合物文库提供了指导。这两种文库均采用正交连接策略来构建，其中文库成员通过光不稳定接头与固体支持体连接，标志与仅可通过剧烈氧化切割接头连接。因为所述文库成员可以从固体支持体中重复地光洗脱，所述文库成员可以用于多项测定中。连续光洗脱也允许极高通量的重复筛选策略：第一，将多个珠置于96孔微量滴定板中；第二，使化合物部分分离，然后转移到测定板中；第三，金属结合测定鉴定出活性孔；第四，相应的珠仅仅进行重排成新的微量滴定板；第五，鉴定单活性化合物；第六，对结构进行解码。

可以采用诸如上面描述的技术合成本发明的肽模拟化合物，以提供大的高度多样化的候选抑制剂文库，因为本发明化合物可以容易地通过在温和条件下连续形成一系列碳-杂原子键例如酰胺键或脲键来制备。因此，根据一组不连续的亚单元例如氨基酸和掺入了二环芳基-1，2-二氮杂环己烷亚单元的亚单元，可以快速容易地合成这些亚单元的各种组合和排列，并且对其生物学活性进行测试。

实施例部分

现在，参照以下用于具体叙述优选实施方案的实施例，说明本发明。然而，应注意到，这些实施方案是说明性的，并且不应认为是以任何方式限制本发明。

实施例1：肽模拟化合物的制备

通过采用标准固相肽化学(R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154(1963)，G.Barany，R.B.Merrifield in The Peptides，第2卷(E.Gross，J.Meienhofer主编)1-284(Academic，New York；1980))，在肽合成仪(ACT90，Advanced ChemTech)中装配各构件单元来制备肽模拟化合物，并且通过高效液相色谱(HPLC)纯化。

HPLC在Vision色谱仪(PerSeptive Biosystems)上进行。分析型HPLC使用waters μBondapak C₁₈柱(0.46×25cm，5μ或0.39×30cm，10μ)或Nucleosil C₁₈柱(0.46×25cm，5μ或0.4×30cm，10μ)以反相模式进行，这两种柱均得自CS-Chromatographie Service，Langerwehe，德国。制备型HPLC使用waters μBondapak C₁₈柱(1.9×30cm，10μ)或Nucleosil C₁₈柱(2.0×30cm，10μ)以反相模式进行，这两种柱均得自CS-Chromatographie Service。快速色谱在Merck Kieselgel 60(0.063-0.200mm，商品号1.07734，Merck Darmstadt，德国)上进行。T.L.C.在在铝片Silica gel 60 F₂₅₄(商品号1.05554，Merck Darmstadt，德国)上进行。¹H-NMR-谱采用四甲基硅烷作为内标在200MHz处测定，并用相对于四甲基硅烷的化学位移(δ)值的百万分之一表示，并如下指定：s＝单峰；m＝多重峰；d＝双重峰；t＝三重峰；q＝四重峰，sp＝七重峰，br＝宽峰。

使用以下缩写：Boc＝叔丁氧羰基，Fmoc＝9-芴基甲氧羰基，Acm＝乙酰氨基甲基，Prm＝丙酰氨基甲基，DCM＝二氯甲烷；DMF＝N，N-二甲基甲酰胺，DMAP＝4-二甲氨基吡啶，HOBt＝1-羟基苯并三唑；DIC＝二异丙基碳二亚胺，TBTU＝2-(1-H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲鎓，THF＝四氢呋喃，DIPEA＝二异丙基乙胺，TFA＝三氟乙酸，Me＝甲基，Ac＝乙酰基，tBu＝叔丁基，Bn＝苄基，Ph＝苯基，h＝小时，min＝分钟，aq.＝水溶液，r.t.＝室温(18-26℃)，Pmc＝2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基，PyBOP＝六氟合磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-鏻，Z＝苄氧羰基，EDCI＝1-乙基-3(3′-二甲氨基丙基)碳二亚胺，DBU＝1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，Cit＝(L)瓜氨酰基，Cha＝(L)-环己基丙氨酰基，Gpg＝(L)-N-脒基-4-哌啶基甘氨酰基，βPhPro＝2-(S)-3-(R)-3-苯基脯氨酰基，Tic＝(L)-四氢异喹啉-3-羰基，azaTic＝3，4-二氢-1H-酞嗪-2-羰基，Disc＝(D，L)1，2-二氢-2H-异吲哚羰基，Thiq＝(L)-四氢异喹啉-1-羰基，Hbc＝(D，L)-2，3，4，5-四氢-1H-苯并[d]吖庚因-2-羰基，Haic＝(2S，5S)-5-氨基-1，2，3，4，5，6，7-六氢-吖庚因并[3，2，1-h，i]吲哚-4-酮-2-羰基，Odapdc＝(1S，9S)-9-氨基八氢-6，10-二氧代-6H-哒嗪并-[1，2-a][1，2]二氮杂庚因-1-羰基，[SΨ(oxaz)L]＝S-L的噁唑模拟物，[SΨ(imid)L]＝S-L的咪唑模拟物，A＝Ala＝(L)-丙氨酰基，R＝Arg＝(L)-精氨酰基，C＝Cys＝(L)-半胱氨酰基，F＝Phe＝(L)-苯丙氨酰基，V＝Val＝(L)-缬氨酰基，Met＝(L)-甲硫氨酰基，Nle＝(L)-正亮氨酰基，S＝Ser＝(L)-丝氨酰基，L＝Leu＝(L)-亮氨酰基，alle＝(L)-别异亮氨酰基，Nva＝(L)-正缬氨酰基，Pya＝(L)-吡啶基丙氨酰基，Om＝(L)-鸟氨酰基，Chg＝(L)-环己基甘氨酰基，Hfe＝(L)-高苯丙氨酰基，Thi＝(L)-2-噻吩基丙氨酰基，Coa＝(L)-环辛基丙氨酰基，Nba＝(L)-降冰片基丙氨酰基。

按照文献方法(J.Barbiere，Bull.Soc.Chim.Fr.5，7，1940，621)，从2-苯乙基氯和乙醇胺制备N-(2-苯乙基)乙醇胺。市售的Fmoc氨基酸、HOBt、TBTU和PyBOP购自Advanced ChemTech，Novabiochem，Bachem，Neosystems或RSP Amino Acid Analogsues。所有其它化学药品和溶剂都购自Merck Darmstadt或Sigma-Aldrich-Fluka，并且无需进一步纯化就可直接使用。DMF经分子筛4干燥至少4周，与酸性氧化铝一起搅拌20分钟以除去痕量的胺，然后临用前通过0.2μm滤器过滤。

表1(a、b和c)列出了本发明示例性的某些式I和式II化合物。表2列出了采用本文中描述的各项测定检测其免疫调节特性及其它特性的其它化合物。对本领域技术人员显而易见的是，在读完本发明说明书后，较表1中叙述的七聚体短的肽模拟物可用于某些应用中。因此，较短的肽模拟物也构成本发明的一部分。这些较短的肽的优选长度是四聚体或五聚体。

实施例2：Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[SΨ(oxaz)L] NMe₂(P53)的制备

2.1Fmoc-βPhPro-OH的制备

将44.61g N-乙酰-反式-3(R)-苯基-(S)-脯氨酸-1-(S)-苯乙酰胺(J.Y.L.Chung，J.T.Wasicak，W.A.Arnold，C.S.May，A.N.Nadzan，M.W.Holladay，J.Org.Chem.1990，55，270-275)溶于730ml 8N HCl和360ml乙酸中。将所得溶液加热至140℃达16小时。冷却至室温后，将该溶液蒸发至干。将残余物溶于1000ml水中。水溶液用乙酸乙酯(3×200ml)洗涤，减压浓缩至终体积为300ml。加入400ml 10％Na₂CO₃水溶液，水层用乙酸乙酯(4×200ml)洗涤。加入200ml 10％Na₂CO₃水溶液，将所得溶液冷却至0℃。在1.5小时内，滴加51.22 gFmocCl的300ml二噁烷溶液，将所得悬浮液在室温下搅拌18小时。通过倾析除去沉淀。水溶液用乙醚(1×200ml)洗涤，用1N HCl酸化至pH3，然后用DCM(2×300ml)萃取。将所得沉淀溶于乙酸乙酯中。所得溶液用饱和NaHCO₃水溶液萃取。水层用浓盐酸酸化至pH3，然后用DCM萃取。合并的DCM层经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发至干。使残余物预吸收到硅胶上并用快速色谱纯化(用乙酸乙酯/己烷/乙酸150∶50∶1作为洗脱液)。将含有所需产物的流分(经T.L.C.检查)合并并蒸发。所得残余物从CHCl₃/己烷1∶2中重结晶，所获得的总收率为24.92g(55％)。

¹H-NMR(CDCl₃)：1.95-2.15(m，1H，FmocNCH₂CHH)，2.24-2.47(m，1H，FmocNCH₂CHH)，3.43-3.85(m，3H)，4.06-4.58(m，4H)，6.2(br s，1H，COOH)7.11-7.82(m，13H，arom.Hs)。

2.2 H[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe₂的制备

2.2.1二肽I的制备：

在-5℃，将10.0g N-(二苯基亚甲基)甘氨酸甲酯(M.J.O′Donnell，R.L.Polt，J.Org.Chem.1982，47，2663-2666)加入到4.87g KOtBu的100ml无水THF溶液中，将所得溶液于0℃搅拌15分钟。在3.5小时内，将该溶液于-78℃加入到7.1ml异丁酰氯的300ml无水THF溶液中。加入完成后，让所得橙色反应混合物升至室温。所得黄色溶液用200ml 1N HCl处理，然后将混合物在室温下搅拌15分钟。减压蒸发有机溶剂。水层用乙酸乙酯(4×100ml)洗涤并蒸发至干，得到10.2g残余物。

在Ar气氛下，将11.66g Z-Ser(tBu)OH溶于200ml无水THF中，然后将溶液冷却至-18℃。加入5.48ml三乙胺，接着加入5.2ml氯甲酸异丁酯。将所得悬浮液在-18℃搅拌15分钟。加入上述残余物，在1小时内滴加5.48ml三乙胺的80ml无水THF溶液。加入完成后，将所得悬浮液在-18℃再搅拌1.5小时，然后让其升至室温。加入饱和NaCl水溶液(200ml)，将混合物搅拌15分钟。分离水层，然后用乙醚(3×100ml)萃取。合并的有机层用pH7磷酸盐缓冲液(1×50ml)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发至干。残余物用快速色谱纯化(用乙酸乙酯/己烷(1∶3→1∶2)作为洗脱液)，得到14.4g(84％)的所需化合物，为非对映体的混合物。

¹H-NMR(CDCl₃)：1.09-1.28(m 15H，CHMe₂，tBu)，3.05(sp，1H，CHMe₂)，3.38-3.45(m，1H，CHHOtBu)，3.78，3.79(2s，3H，OMe)，3.75-3.88(br s，1H，CHHOtBu)，5.05-5.18(m，2H，CH₂Ph)，5.38(d，J＝6.8Hz，1H，COCHCO)，5.70(br s，1H，_{氨基甲酸酯}-NH)，7.25-7.42(m，5H，Ph)，7.95(br s，1H，_酰胺-NH)。

2.2.2 Z[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]OMe的制备

将55.0g氧化三苯基膦和31.3mlDBU于0℃加入到30.5g二肽I的38ml无水四氯化碳、38ml无水乙腈和38ml无水吡啶溶液中。将所得混合物在室温下搅拌20小时。减压除去溶剂，残余物与甲苯(4×150ml)一起共蒸发。将所得残余物溶于900ml DCM中。所得溶液用5％KHSO₄水溶液(5×200ml)和pH7磷酸盐缓冲液(2×150ml)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发至干。将残余物溶于450ml乙酸乙酯中，将所得悬浮液超声处理并过滤。浓缩滤液至终体积为100ml。加入300ml己烷，将所得悬浮液再次超声处理并过滤。将滤液蒸发至干，残余物用快速色谱纯化(用乙酸乙酯/己烷(1∶3)作为洗脱液)，得到24.7g(85％)为淡黄色油状物的标题化合物。

¹H-NMR(CDCl₃)：1.07(s，9H，tBu)，1.23-1.28(m，6H，CHMe₂)，3.64(dd，J＝，1H，4.0，9.2Hz，1H，CHHOtBu)，3.68-3.85(m，2H，CHMe₂，CHHOtBu)，3.90(s，3H，OMe)，5.00-5.11(br m，1H，CHNHCO)，5.13(s，2H，CH₂Ph)，5.79(brd，J＝7.4Hz，1H，NH)，7.25-7.41(m，5H，Ph)。

2.2.3 Z[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe₂的制备

将24.71g Z[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]OMe溶于200ml甲醇中，然后将溶液冷却至0℃。在35分钟内滴加1.84g LiOH的80ml水溶液。将混合物于0℃搅拌1.5小时，然后在室温下搅拌16小时。所得溶液用1N HCl中和，减压蒸发甲醇。所得水溶液用1N HCl酸化至pH4，然后用DCM(4×100ml)萃取。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将残余物溶于250ml无水DMF中，然后将所得溶液冷却至0℃。依次加入11.3g HOBt、14.1g EDCI、7.6ml三乙胺、13.8g二甲胺盐酸盐和15.7ml三乙胺，将所得混合物在室温下搅拌17小时。减压蒸发溶液，所得残余物与甲苯(1×100ml)一起共蒸发。将残余物溶于400ml乙酸乙酯中，将所得悬浮液过滤，滤液用5％KHSO₄水溶液(3×100ml)、饱和NaHCO₃水溶液(2×100ml)和pH7磷酸盐缓冲液(2×100ml)洗涤。有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。残余物用快速色谱纯化(用乙酸乙酯/己烷(2∶3)作为洗脱液)，得到23.3g(92％)油状标题化合物。

¹H-NMR(CDCl₃)：1.07(s，9H，tBu)，1.22-1.26(m，6H，CHMe₂)，3.03，3.18(2s，2×3H，NMe₂)，3.51(sp，J＝7.0Hz，1H，CHMe₂)，3.65(dd，J＝4.0，8.8Fz，1H，CHHOtBu)，3.78(br m，1H，CHHOtBu)，4.98-5.09(br m，1H，CHNHCO)，5.10-5.21(m，2H，CH₂Ph)，5.70(br d，J＝7.3Hz，1H，NH)，7.21-7.45(m，5H，Ph)。

2.2.4 H[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe₂的制备

在氢气氛下，将23.3g Z[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe₂的100ml乙醇溶液加入到2.35g Pd/C(10％)悬浮液中，所得混合物在室温下搅拌18小时。悬浮液通过Celite过滤，将滤液蒸发至干，得到14.5g(90％)标题化合物。

¹H-NMR(CDCl₃)：1.15(s，9H，tBu)，1.27(d，J＝7.0Hz，6H，CHMe₂)，2.04(s，2H，NH₂)，3.04，3.23(2s，2×3H，NMe₂)，3.50(sp，J＝7.0Hz，1H，CHMe₂)，3.60(dd，J＝6.5，8.8Hz，1H，CHHOtBu)，3.69(dd，J＝4.4，8.8Hz，1H，CHHOtBu)，4.14(dd，J＝4.4，6.5Hz，1H，CHNH₂)。

2.3 HβPhPro-2-氯三苯甲基树脂的制备

将7.4g Fmoc-βPhPro-OH的120ml无水DCM溶液加入到12.0g2-氯三苯甲基氯树脂(0.83mmol/g，Novabiochem)中。加入DIPEA(3.0ml)，将混合物振荡10分钟。再加入4.5ml DIPEA，继续振荡145分钟。加入甲醇(10ml)，将混合物再振荡25分钟。滤出树脂，依次用DCM(5×100ml)、甲醇(2×100ml)和DCM(4×100ml)洗涤。将小样本小心地干燥并用DCM/哌啶(1∶1)脱保护30分钟。用光度法测定所得Fmoc-哌啶加合物(在301nm的吸收)，得到0.54mmol/g树脂填料。剩余的树脂用100ml DCM和80ml哌啶在室温下处理160分钟，用DCM(10×100ml)和乙醚(4×80ml)洗涤，然后真空干燥，得到14.37g HβPhPro-2-氯三苯甲基树脂。

2.4.Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe₂(P53)的制备

从HβPhPro-2-氯三苯甲基氯树脂(2416mg，1.3mmol)开始，在底部装有玻璃料(frit)的50ml反应容器(Advanced ChemTech ACT90)中，通过Fmoc固相合成制备肽模拟物(peptididomimetic)。

通过用DMF(4×1min)处理树脂，进行树脂溶胀。用20％哌啶的DMF溶液(1×3min，1×7min，各20ml)使树脂脱保护，随后用DMF(10×20ml)洗涤。通过加入FmocNleOH(1380mg，3.9mmol)、DMF(8.2ml)、HOBt(600mg，3.9mmol)和DIC(0.61ml，3.9mmol)，进行酰化反应。让该偶联进行18小时，用DMF(7×20ml)洗涤。采用Chloranil试验(J.Blake，C.H.Li，Int.J.Peptide Protein Res.，1975，7，495)，取一小部分检查酰化反应的完成情况。使用乙酸酐(2M)和DMAP(0.1M)的DMF溶液(20ml，1×10min)给树脂封端，随后用DMF(12×20ml)洗涤。树脂如上进行脱保护、洗涤、封端和洗涤，然后用FmocTicOH(1.56g，3.9mmol)、TBTU(1.26g，3.9mmol)和DIPEA(0.71ml，4.16mmol)在8ml DMF中偶联75分钟。

树脂如上进行脱保护、洗涤、封端和洗涤，用FmocGpg(Pmc)OH(1.35g，1.95mmol)、HOBt(0.3g，1.95mmol)和DIC(0.305ml，1.95mmol)在7ml DMF中偶联16小时。

树脂如上进行脱保护、洗涤、封端和洗涤，用FmocChaOH(1.54g，3.9mmol)、HOBt(0.6g，3.9mmol)和DIC(0.61ml，3.9mmol)在8mlDMF中偶联3小时。

如上进行脱保护和洗涤，用乙酸酐(2M)和DMAP(0.1M)在20mlDMF中处理3×20分钟，进行封端。树脂用DMF(12×20ml)、MeOH(3×50ml)、Et₂O(3×40ml)洗涤，然后真空干燥。

树脂用33ml DCM/三氟乙醇/乙酸(8∶1∶1)在室温下处理45分钟，过滤，然后用65ml DCM/三氟乙醇/乙酸(8∶1∶1)和100ml DCM洗涤。向滤液中加入250ml正己烷，将所得悬浮液蒸发至干，残余物与正己烷(3×100ml)一起共蒸发，得到1.188g粗制Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-βPhPro-OH。将残余物溶于5ml无水DMF中并冷却至0℃。加入332mg HOBt、642mg H[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe₂和415mg EDCI后，将所得溶液于0℃搅拌1.5小时，然后在室温下再搅拌16小时。减压除去溶剂，将残余物溶于80ml乙酸乙酯中。所得溶液用5％KHSO₄水溶液(1×40ml)、饱和NaHCO₃水溶液和pH7磷酸盐缓冲液洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发至干。残余物用20ml TFA/水/茴香硫醚/1，2-乙二硫醇/三乙基硅烷(85.5∶5∶5∶2.5∶2)在室温下处理3.7小时。通过向溶液中加入550ml冷冻乙醚使产物沉淀。悬浮液以3300rpm离心10分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于冷冻乙醚中，再次离心，再一次弃去上清液。将沉淀溶于乙腈和0.1％TFA水溶液中。减压蒸发有机溶剂，将水溶液冷冻干燥。粗产物(931mg)用HPLC纯化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)，得到584mg纯的Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe₂ x TFA。产物经质谱法表征，MALDI-TOF MS∶M/Z＝1064.57，(MH+)，1102.53(MK+)。

实施例3：Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe₂(P51)的制备

所述肽模拟物采用与实施例2.4描述的同样方法来制备，只是在固相合成期间，在更小规模上，使用更少的树脂、25ml反应容器和7ml溶剂部分进行溶胀、洗涤、封端、脱保护和偶联。使用FmocNleOH、HOBt、DIC(各3当量)在βPhPro上偶联16小时，使用FmocTicOH(3当量)、TBTU(3当量)和DIPEA(3.2当量)在Nle上偶联1.5小时，使用FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3当量)在Tic上偶联16小时，使用FmocChaOH、HOBt、DIC(各3当量)在Arg上偶联3小时。使用H[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe₂(2当量)、PyBOP(2当量)和4-甲基吗啉(4当量)在DMF中于0℃进行溶液偶联1小时，然后在室温下进行溶液偶联16小时。将所得混合物蒸发至干，残余物用TFA/水/茴香硫醚/1，2-乙二硫醇/三乙基硅烷(85.5∶5∶5∶2.5∶2)在室温下处理3.5小时。通过加入200ml冷冻乙醚使产物沉淀。将悬浮液在0℃保持1小时，然后按照实施例2.4所述方法进行处理。粗产物用HPLC纯化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)。MALDI-TOF MS：M/Z＝1038.70(MH+)，1060.36(MNa+)，1076.61(MK+)。

实施例4：Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe₂(P33)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe₂(P60)的制备

肽模拟物P33(Arg)按照实施例3所述方法来制备，只是树脂在偶联步骤1中用FmocMetOH代替FmocNleOH进行偶联。MALDI-TOFMS：M/Z＝1057.00(MH+)，1079.01(MNa+)，1094.98(MK+)。

肽模拟物P60(Gpg)按照实施例3所述方法来制备，只是树脂在偶联步骤1中用FmocMetOH代替FmocNleOH进行偶联，而在偶联步骤3中用FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5当量)代替FmocArg(Pmc)OH、HOBt和DIC(各3当量)进行偶联。MALDI-TOF MS：M/Z＝1082.54(MH+)，1120.51(MK+)。

实施例5：Ac-Cha-Arg-Tic-Met(O)-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe₂(P43)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Met(O)-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe₂(P47)的制备

肽模拟物P43(Arg)按照实施例3所述方法来制备，只是树脂在偶联步骤1中用FmocMet(O)OH代替FmocNleOH进行偶联。MALDI-TOF MS：M/Z＝1072.57(MH+)。

肽模拟物P47(Gpg)按照实施例3所述方法来制备，只是树脂在偶联步骤1中用FmocMet(O)OH代替FmocNleOH进行偶联，而在偶联步骤3用FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5当量)代替FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3当量)进行偶联。MALDI-TOF MS：M/Z＝1098.73(MH+)，1120.70(MNa+)，1136.68(MK+)。

实施例6：Ac-Cha-Arg-Disc-Met-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe₂(P40)和Ac-Cha-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe₂(P41)的制备

肽模拟物P40(Arg)按照实施例4中P33的所述方法来制备，只是树脂在偶联步骤2中用外消旋FmocDiscOH代替FmocTicOH进行偶联。所获得的两种非对映体在最后的HPLC步骤中使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度进行分离。分离出每种立体异构体，或者以“快”流分(化合物名称中的后缀-1)表示，或者以“慢”流分(化合物名称中的后缀-2)表示，在后续生物学测定中分别对其进行测试。MALDI-TOFMS(P40-1)：M/Z＝1042.67(MH+)，1058.66(MNa+)，1080.63(MK+)。MALDI-TOF MS(P40-2)：M/Z＝1042.69(MH+)，1058.66(MNa+)，1080.62(MK+)。

肽模拟物P41(Gpg)按照实施例4中P60的所述方法来制备，只是树脂在偶联步骤2中用外消旋FmocDiscOH代替FmocTicOH进行偶联。所获得的两种非对映体在最后的HPLC步骤中使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度进行分离。分离出每种立体异构体，或者以“快”流分(化合物名称中的后缀-1)表示，或者以“慢”流分(化合物名称中的后缀-2)表示，在后续生物学测定中分别对其进行测试。

MALDI-TaOF MS(P41-1)：M/Z＝1068.43(MH+)，1106.38(MK+)。MALDI-TOF MS(P41-2)：M/Z＝1068.42(MH+)，1106.36(MK+)。

实施例7：Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-NHCH₂CH₂Ph(P69)和Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-NHCH₂CH₂Ph(P82)的制备

7.1 HNle-2-氯三苯甲基树脂的制备

树脂采用与实施例2步骤2.3中描述的同样方法来制备，从FmocNleOH(4.37g)和2-氯三苯甲基氯树脂(7.45g，0.83mmol/g，Novabiochem)开始，得到7.77g HNle-2-氯三苯甲基树脂(填料：0.50mmol/g)。

7.2 Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-OH的制备

肽模拟物采用与实施例1.4描述的同样方法来制备，即通过脱保护和偶联，使用HNle-2-氯三苯甲基树脂(2.52g)。使用TBTU(1.09g，1.35mmol)、DIPEA(0.62ml，1.44mmol)和FmocTicOH(1.36g，1.35mmol)，在7ml DMF中，偶联时间为2.5小时，在Nle上进行偶联。使用FmocGpg(Pmc)OH(1.17g，0.68mmol)、HOBt(0.26g，0.68mmol)和DIC(0.27ml，0.68mmol)，在6ml DMF中，在17小时内，在Tic上进行偶联，而使用FmocChaOH(1.34g，1.35mmol)、HOBt(0.52g，1.35mmol)和DIC(0.53ml，1.35mmol)，在6ml DMF中，在2.5小时内，在Gpg上进行偶联。分别按照Kaiser试验或Chloroanil试验(E.Kaiser等(1970)Anal.Biochem.34，595；J.Blake，C.H.Li，Int.J.PeptideProtein Res.，1975，7，495)，检查偶联的完成情况。最后的乙酰化反应、树脂切割和蒸发(与实施例1.4类似)后，分离出1.59g粗制Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-OH。

7.3 Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-NHCH₂CH₂Ph(P69)的制备

在0℃，Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-OH(730mg，0.78mmol)的5ml无水DMF溶液用HOBt(239mg，1.56mmol)、PyBOP(812mg，1.56mmol)和2-苯乙胺(0.45ml，3.65mmol)处理。将反应物在0℃搅拌1.5小时，然后在室温下搅拌13小时。减压蒸发溶剂，残余物用10ml TFA/水/茴香硫醚/1，2-乙二硫醇/三乙基硅烷(85.5∶5∶5∶2.5∶2)在室温下处理4小时。通过向溶液中加入500ml冷冻乙醚使产物沉淀。悬浮液以3300rpm离心10分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于冷冻乙醚中，再次离心，再一次弃去上清液。将沉淀溶于乙腈和0.1％TFA水溶液中。减压蒸发有机溶剂，将水溶液冷冻干燥。粗产物(767mg)用HPLC纯化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)，得到256mg纯的Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-NHCH₂CH₂Ph。产物经质谱法表征，MALDI-TOF MS：M/Z＝771.310，(MH+)，793.286(MNa+)，809.257(MK+)。

肽模拟物P82采用与实施例3描述的同样方法来制备，只是使用HNle-2-氯三苯甲基树脂(实施例7.1)代替HβPhPro-2-氯三苯甲基氯树脂。使用FmocTicOH(3当量)、TBTU(3当量)和DIPEA(3.2当量)在Nle上偶联1.5小时，使用FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3当量)在Tic上偶联14小时，用FmocChaOH、HOBt、DIC(各3当量)在Arg上偶联3小时。使用N-(2-苯乙基)胺(4当量)、HOBt(2当量)和PyBOP(2当量)，在DMF中，于0℃进行溶液偶联1小时，然后在室温下偶联15小时。所得混合物按照实施例3所述方法进行处理。粗产物用HPLC纯化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)。MALDI-TOFMS：M/Z＝745.61(MH+)，767.56(MNa+)。

实施例8：Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Me)Bn(P71)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(Me)Bn(P74)的制备

肽模拟物P71(Gpg)按照实施例7中P82的方法来制备，只是使粗制Ac-Cha-Arg(Pmc)-Tic-Nle-OH与N-甲基苄胺(4当量)反应而不是与N-(2-苯乙基)胺反应。用HPLC纯化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)，得到所需要的产物。MALDI-TOF MS：M/Z＝745.56(MH+)，783.49(MK+)。

肽模拟物P74(Gpg)按照实施例7中P69的方法来制备，只是使粗制Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-OH与N-甲基苄胺(4当量)反应而不是与2-苯乙胺反应。用HPLC纯化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)，得到所需要的产物。MALDI-TOF MS(P41-1)：M/Z＝771.63(MH+)，793.63(MNa+)。

实施例9：Ac-Cha-Arg-Disc-Nle-N(Me)Bn(P72)和Ac-Cha-Gpg-Disc-Nle-N(Me)Bn(P76)的制备

肽模拟物P72采用与实施例8中P71描述的同样方法来制备，只是在偶联步骤1中使用外消旋FmocDiscOH代替FmocTicOH。所获得的两种非对映体在最后的HPLC步骤中使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度进行分离，并如实施例6所述表示。MALDI-TOF MS(P72-1)：M/Z＝731.57(MH+)，753.55(MNa+)，769.52(MK+)。MALDI-TOFMS(P72-2)：M/Z＝731.56(MH+)，753.55(MNa+)，769.52(MK+)。

肽模拟物P76采用与实施例9中P72描述的同样方法来制备，只是在偶联步骤2中使用FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5当量)代替FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3当量)。所获得的两种非对映体在最后的HPLC步骤中使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度进行分离，并如实施例6.1所述表示。MALDI-TOF MS(P76-1)：M/Z＝757.31(MH+)，779.27(MNa+)，795.24(MK+)。MALDI-TOF MS(P76-2)：M/Z＝757.37(MH+)，779.34(MNa+)，795.31(MK+)。

实施例10：Ac-Cha-Arg-Tic-Met-NH₂(P1)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-NH₂(P67)的制备

10.1 FmocMet-Rinkamide树脂的制备：

从3.65g Fmoc-Rinkamide树脂(0.59mmol/g，Novabiochem)开始，在底部装有玻璃料的50ml反应容器(Advanced ChemTech ACT90)中，通过Fmoc固相合成制备FmocMet-Rinkamide树脂。

通过用DMF处理树脂(4×1分钟)，进行树脂溶胀。

使用20％哌啶的DMF溶液(1×3min，1×7min，各20ml)使树脂脱保护，随后用DMF(10×20ml)洗涤。通过加入FmocMetOH(2.4g，3当量)、DMF(10ml)、HOBt(990mg、3当量)以及DIC(1.01ml，3当量)和DMAP(260mg，0.1当量)，进行酰化反应。让该偶联反应进行4小时，树脂用DMF(7×20ml)洗涤。将小样本小心地干燥并用DCM/哌啶(1∶1)脱保护30分钟。用光度法测定所得Fmoc-哌啶加合物(在301nm的吸收)，得到0.43mmol/g树脂填料。剩余的树脂用乙酸酐(2M)和DMAP(0.1M)的DMF溶液(20ml，1×10min)封端，随后用DMF(12×20ml)，甲醇(3×40ml)和乙醚(3×40ml)洗涤，并真空干燥，得到3.9g FmocMet-Rinkamide树脂。

10.2 Ac-Cha-Arg-Tic-Met-NH₂(P1)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-NH₂(P67)的制备

从FmocMet-Rinkamide树脂开始，采用与实施例3中P51相同的方案，但从脱保护步骤开始，使用Fmoc固相合成制备肽模拟物P1。使用FmocTicOH(3当量)、TBTU(3当量)和DIPEA(3.2当量)在Met上偶联1.5小时，使用FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3当量)在Tic上偶联16小时，使用FmocChaOH、HOBt、DIC(各3当量)在Arg上偶联3小时。在Cha的最后乙酰化后，树脂用DMF(12×7ml)、MeOH(3×20ml)、Et₂O(3×20ml)洗涤，真空干燥，然后用TFA/水/茴香硫醚/1，2-乙二硫醇/三乙基硅烷(85.5∶5∶5∶2.5∶2)在室温下处理3.5小时。滤出树脂，用TFA洗涤，通过加入200ml冷冻乙醚沉淀出滤液中的产物。将悬浮液在0℃保持1小时，然后按照实施例2.4所述方法进行处理。粗产物用HPLC纯化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)。MALDI-TOF MS：M/Z＝659(MH+)，681(MNa+)，697(MK+)。

肽模拟物P67按照实施例10中P1所述方法来制备，只是树脂在偶联步骤2中与FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5当量)而不是与FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3当量)进行偶联。MALDI-TOF MS：M/Z＝685.29(MH+)，707.23(MNa+)，723.23(MK+)。

实施例11：Ac-Cha-Arg-Disc-Met-NH₂(P12)和Ac-Cha-Gpg-Disc-Met-NH₂(P66)的制备

肽模拟物P12按照实施例10中P1所述方法来制备，只是在偶联步骤1中使用外消旋FmocDiscOH代替FmocTicOH。所获得的两种非对映体在最后的HPLC步骤中使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度进行分离，并如实施例6所述表示。MALDI-TOF MS(P12-1)：M/Z＝645(MH+)，667(MNa+)。MALDI-TOF MS(P12-2)：M/Z＝645(MH+)，667(MNa+)。

肽模拟物P66按照实施例10中P1所述方法来制备，只是在偶联步骤1中使用外消旋FmocDiscOH代替FmocTicOH，而在偶联步骤2中使用FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5当量)代替FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3当量)。所获得的两种非对映体在最后的HPLC步骤中使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度进行分离，并如实施例6所述表示。MALDI-TOF MS(P66-1)：M/Z＝671.25(MH+)。MALDI-TOF MS(P66-2)：M/Z＝671.29(MH+)。

实施例12：Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-NH₂(P31)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-βPhProNH₂(P80)的制备

12.1 FmocβPhPro-Rinkamide树脂的制备：

按照实施例10.1对FmocMet-Rinkamide树脂描述的方法，只是在偶联步骤1中使用FmocβPhProOH代替FmocMetOH，通过Fmoc固相合成制备FmocβPhPro-Rinkamide树脂。

12.2. Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-NH₂(P31)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-βPhProNH₂(P80)的制备

从Fmoc-βPhPro-Rinkamide树脂开始，按照实施例3中对P51描述的相同方案，但从脱保护步骤开始，采用Fmoc固相合成制备肽模拟物P31。使用FmocMetOH、HOBt、DIC(各3当量)在βPhPro上偶联14小时，使用FmocTicOH(3当量)、TBTU(3当量)和DIPEA(3.2当量)在Met上偶联1.5小时，使用FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3当量)在Tic上偶联16小时，使用FmocChaOH、HOBt、DIC(各3当量)在Arg上偶联3小时。Cha的最后乙酰化后，树脂按照实施例10.2所述方法进行处理。粗产物用HPLC纯化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)。MALDI-TOF MS：M/Z＝832.64(MH+)。

肽模拟物P80如P31所述方法来制备，只是在偶联步骤3中使用FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5当量)代替FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3当量)。MALDI-TOF MS：M/Z＝859.19(MH+)，896.14(MK+)。

实施例13：Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Bn)CH₂CH₂OCH2CH₂OH(P98)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(Bn)CH₂CH₂OCH₂CH₂OH(P101)的制备

13.1：2-(2-苄基-[2-(2-羟基-乙氧基)乙基]-氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯的制备

将2-(2-氨基乙氧基)-乙醇(10ml，100mmol)溶于无水THF(80ml)中。加入苯甲醛(10.5ml，103mmol)，接着加入MS 4，将所得混合物在室温下搅拌3.5小时。将所得溶液过滤并减压浓缩，得到17.41g油状残余物(89mmol)。将该残余物溶于无水THF(180ml)中，将所得溶液冷却至0℃。加入NaBH₄(98mmol)，将混合物在室温下搅拌3小时。通过加入5N HCl水溶液(70ml)猝灭反应。通过加入Na₂CO₃将pH调至11，混合物用CH₂Cl₂(4x)萃取。合并的有机萃取液经K₂CO₃干燥，过滤并减压浓缩，得到15.3g 2-(2-苄氨基乙氧基)-乙醇，其纯度足以进行进一步反应。

将粗制2-(2-苄氨基乙氧基)-乙醇(5.27g，27.0mmol)溶于二噁烷(25ml)中。加入Na₂CO₃(10％的水溶液，35ml)，将混合物冷却至0℃。加入FmocCl(7.81g；30.2mmol)后，将所得混合物搅拌3.25小时。减压浓缩混合物，以除去二噁烷。所得含水混合物用CH₂Cl₂(3×75ml)萃取。合并的有机萃取液经Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩。残余用快速色谱纯化(用乙酸乙酯/己烷(1∶1)作为洗脱液)，得到9.1g油状标题化合物。¹H-NMR(CDCl₃)：3.05-3.35(m，3H)，3.45-3.75(m，5H)，4.20-4.30(m，1H)，4.45-4.55(m，3H)，4.69-4.68(m，1H)，7.00-7.45(m，10H)，7.55-7.80(m，3H)。

13.2：FmocN(Bn)CH₂CH₂OCH₂CH₂O-2-氯三苯甲基树脂的制备

将THF(15ml)加入到2-氯三苯甲基氯树脂(4.0g，1.2mmol/g)中，将所得混合物搅拌25分钟。加入FmocN(Bn)CH₂CH₂OCH₂CH₂OH(6.1g，14.7mmol)的THF(25ml)溶液，然后加入吡啶(850μl，10.5mmol)，将混合物加热至65℃达15小时。加入MeOH(5ml)，继续加热35分钟。将树脂过滤，用DMF(3x)、CH₂Cl₂(3x)、MeOH(3x)和Et₂O(3x)洗涤，得到5.0g。将小样本小心地干燥并用DCM/哌啶(1∶1)脱保护30分钟。用光度法测定所得Fmoc-哌啶加合物(在301nm的吸收)，得到0.45mmol/g树脂填料。

肽模拟物P98采用与实施例2.4描述的同样方法来制备，即脱保护并使用FmocN(Bn)CH₂CH₂OCH₂CH₂O-2-氯三苯甲基树脂(4.93g，2.2mmol)进行偶联，从脱保护步骤开始。使用HOBt(2.5当量)、DIC(2.5当量)和FmocNleOH(2.5当量)在HN(Bn)CH₂CH₂OCH₂CH₂O-2-氯三苯甲基树脂上偶联21小时，使用TBTU(3当量)、DIPEA(3.2当量)和FmocTicOH(3当量)，在12ml DMF中，偶联时间为1.5小时，在Nle上进行偶联。使用FmocArg(Pmc)OH(3当量)、HOBt(3当量)和DIC(3当量)，在15ml DMF中，在20小时内，在Tic上进行偶联，而使用FmocChaOH(3当量)、TBTU(3当量)和DIPEA(3.2当量)，在15ml DMF中，在1.5小时，在Arg上进行偶联。最后的乙酰化后，树脂用DMF(3x)、MeOH(3x)和Et₂O(3x)洗涤，得到6.67g。树脂用50ml TFA/水/茴香硫醚/1，2-乙二硫醇/三乙基硅烷(85.5∶5∶5∶2.5∶2)在室温下处理3.5小时。滤出树脂，用TFA洗涤，减压浓缩滤液。通过向残余物中加入450ml冷冻乙醚使产物沉淀。悬浮液以3300rpm离心10分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于冷冻乙醚中，再次离心，再一次弃去上清液。将沉淀溶于乙腈和0.1％TFA水溶液中。减压蒸发有机溶剂，将水溶液冷冻干燥，得到1.38g粗产物。该产物中的300mg用HPLC纯化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)，得到209mg纯的P98。MALDI-TOF MS：M/Z＝819.29(MH+)。

肽模拟物P101如P98所述方法来制备，只是在偶联步骤3中使用FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5当量)代替FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3当量)。MALDI-TOF MS：M/Z＝845.39(MH+)，867.38(MNa+)，883.36(MK+)。

实施例14：化合物与MHC-II蛋白DR4Dw4和DR1的竞争性结合

用6-(生物素酰氨基)-己酰-YAAFRAAASAKAAA-NH₂作为指示肽，按照Ito等(Exp.Med.1996；183：2635-2644)和Siklodi等(HumanImmunology 1998；59：463-471)的通用方案并作稍许改进，检测肽模拟化合物(1nM-100μM)对DR4Dw4(DRA1*0101 DRB1*0401)、DR1(DRA1*0101 DRB1*0101)和DR4Dw14(DRA1*0101 DRB1*0404)的竞争性结合。

在室温下用1％BSA/PBS封闭1小时的96孔聚丙烯板中，制备溶于25％(v/v)DMSO/50mM磷酸钠、150mM氯化钠，pH7.5(PBS)中的10倍连续稀释的化合物(4nM-400μM)。在同样封闭的96孔聚丙烯板中如下制备MHC-化合物互作混合物：向40μl2×缓冲液(PBS，50mM，pH7.5，2％(w/v)NP-40，3.2mM EDTA，6.25％蛋白酶抑制剂混合物：胰凝乳蛋白酶抑制剂、抗蛋白酶、胃蛋白酶抑制剂A、大豆胰蛋白酶抑制剂和亮抑制表酶肽各0.32g/l)中加入10μl 0.8μM指示肽、20μl适当稀释的化合物溶液和10μlMHC-II DRA1*0101DRB1*0401(0.06g/l)、DRA1*0101 DRB1*0101(0.03g/l)或DRA1*0101 DRB1*0404(0.015g/l)的0.5％(w/v)NP-40/PBS。用不含肽模拟化合物的互作混合物以及不含肽模拟化合物和MHC-II的互作混合物分别作为阳性对照和阴性对照。所有互作混合物使用一式两份，并在室温下保温16小时。

高结合力黑色FIA板(Greiner，捕获板)预先用100μl/孔mAbLB3.1(0.01g/l)的PBS于4℃包被过夜，然后用200μl/孔1％(w/v)BSA/PBS在室温下封闭1小时。用PBS洗涤后，将60μl MHC-II-化合物互作混合物从互作板转移到捕获板的适当孔内，然后于4℃保温2小时。各孔用200μl/孔冷却的(4-8℃)1× DELFIA洗涤液(Wallac-ADL-GmbH，Freiburg)洗涤6次，与100μl冷却的铕-链霉抗生物素蛋白缀合物(Wallac-ADL-GmbH，Freiburg；用DELFIA测定缓冲液以1/1000稀释)一起于4℃保温30分钟，再次用冷却的1×DELFIA洗涤液洗涤6次，最后，与200μl冷却的DELFIA增强溶液(Wallac-ADL-GmbH，Freiburg)一起在室温下保温1小时，然后在λ_ex Eu³⁺∶340nm和λ_em Eu³⁺：613(615)nm，读出时间分辨铕荧光(Wallac Victor² 1420Multilabel Counter，Wallac-ADL-GmbH，Freiburg)。

表3a显示(粗体)本发明含Gpg化合物对某些MHCII蛋白根据本实施例IC50测定的改进的亲和性。表3b显示式I化合物对相同MHCII蛋白的亲和性。图1显示P53(含Gpg)即本发明的优选七聚体化合物相对于含Arg肽(P51)对MHCII 0401的改进的IC₅₀，而图3显示P74(含Gpg)即本发明的优选四聚体相对于含Arg肽(P71)对MHCII 0101的改进的IC₅₀。图3显示P69(含Gpg)即本发明的优选四聚体化合物相对于含Arg肽(P82)的改进的IC₅₀。图4显示P74(含Gpg)即本发明的优选四聚体化合物相对于含Arg肽(P71)对0401的改进的IC₅₀。图5显示P101(含Gpg)即本发明的优选四聚体化合物相对于含Arg肽(P98)的改进的IC₅₀。

实施例15：化合物与在PRIESS细胞和LG2细胞上表达的MHC II蛋白的竞争性结合

用6-(生物素酰氨基)-己酰-Cha-Arg-Tic-Met-NH₂作为指示肽，检测肽模拟化合物(4nM-400μM)对Priess细胞(DR4Dw4∶DRA1*0101DRB1*0401)和LG2细胞(DR1∶DRA1*0101 DRB1*0101)的竞争性结合。将所述细胞在补充10％热灭活FCS(Biowhittaker)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸贮液(Gibco 11140-035；100×MEM)、1mM丙酮酸钠、0.1mg/ml卡那霉素和3.4ppm β-巯基乙醇的RPMI 1640(1×Gibco 42401-042)培养液中进行培养。为了供结合测定用，将所述细胞以2.5×10⁶细胞/ml的密度重悬于含有1％FCS的培养液中。

在无菌的96孔聚苯乙烯微量滴定板中进行该项测定。用含有10％DMSO/水的5mM或10mM化合物贮备液制备含有1％FCS的10倍连续稀释的化合物(16nM-1615μM)。以一式两份将50μl各化合物稀释液加入到50μl含有1％FCS的16μM指示肽溶液中。通过向各孔中加入100μl 2.5×10⁶细疱/ml 1％ FCS启动细胞结合。包括含有最高浓度化合物的溶液中存在的DMSO浓度的对照。所述细胞在37℃、6％CO₂下孵育。4小时后，所述细胞用200μlPBS洗涤，然后在200μl裂解缓冲液(50mM磷酸钠、150mM氯化钠、1％(w/v)NP-40、25mM碘乙酰胺、1mM PMSF、3.1％蛋白酶抑制剂混合物：胰凝乳蛋白酶抑制剂、抗蛋白酶、胃蛋白酶抑制剂A、大豆胰蛋白酶抑制剂和亮抑制表酶肽各0.32g/l，pH 7.5)中裂解10分钟。

高结合力黑色FIA板(Greiner，捕获板)预先用含有50mM磷酸钠、150mM氯化钠pH 7.5(PBS)的100μl/孔mAb LB3.1(0.01g/1)于4℃包被过夜，然后用200μl/孔 1％(w/v)BSA/PBS在室温下封闭1小时。用PBS洗涤后，将190μl细胞裂解液转移到捕获板的适当孔内，然后于4℃保温2小时。各孔用200μl/孔冷却的(4-8℃)1×DELFIA洗涤液(Wallac-ADL-GmbH，Freiburg)洗涤6次，与100μl冷却的铕-链霉抗生物素蛋白缀合物(Wallac-ADL-GmbH，Freiburg；用DELFIA测定缓冲液以1/1000稀释)一起于4℃保温30分钟，再次用冷却的1×DELFIA洗涤液洗涤6次，最后，与200μl冷却的DELFIA增强溶液(Wallac-ADL-GmbH，Freiburg)一起在室温下保温1小时，然后在λ_exEu³⁺∶340nm和λ_em Eu³⁺∶613(615)nm，读出时间分辨铕荧光(WallacVictor² 1420 Multilabel Counter，Wallac-ADL-GmbH，Freiburg)。

表3a显示本发明含Gpg化合物对细胞表面表达的某些MHCII蛋白根据本实施例IC₅₀测定的改进的亲和性。表3b显示式I化合物对所述细胞上表达的相同蛋白的亲和性。图6显示肽P47(含Gpg)即本发明优选七聚体化合物相对于含Arg肽(P43)与LG2细胞上表达的MHC蛋白的结合被抑制的改进的IC₅₀。图7显示肽P74(含Gpg)即本发明优选四聚体化合物相对于含Arg肽(P71)与Priess细胞上表达的MHC蛋白的结合被抑制的改进的IC₅₀。

实施例16：化合物在血浆中的稳定性

测定肽模拟化合物在大鼠血浆(Charles River Laboratories，Sulzfeld)、小鼠血浆(Charles River Laboratories，Sulzfeld)和人血浆(Bayerisches Rotes Kreuz，München)中的稳定性(E.R.Garrett和M.R.Gardner，J Pharmaceutical Sciences 71(1982)14-25)。

表3a显示本发明含Gpg化合物在血浆中的改进的稳定性(粗体)，而图8显示24小时后本发明含Gpg七聚体化合物(P53)相对于含Arg等同物(P51)在大鼠血浆中的改进的稳定性(任意单位)；本发明含Gpg四聚体化合物(P66-1)相对于含Arg等同物(P12-1)在大鼠血浆中的改进的稳定性(任意单位)；本发明含Gpg四聚体化合物(P69)相对于含Arg等同物(P82)在大鼠血浆中的改进的稳定性(任意单位)；本发明其它优选的化合物相对于其含Arg等同物在大鼠血浆中的改进的稳定性(任意单位)。表3b显示式I化合物相对于含有NH₂封端基团的化合物的改进的稳定性(粗体)。

将化合物储备液在血浆中稀释，所获得的化合物终浓度为5μM。将所得混合物在37℃保温。在0小时、6小时和24小时，取出1ml样品，通过加入3ml乙腈(p.a.)并进行涡旋混合使血浆蛋白沉淀。所得沉淀以2000g离心5分钟而成块。将上清液蒸发至干，残余物在400μl 50％乙腈的0.1％TFA水溶液中重建。

过滤(0.2μm)后，通过反相HPLC(PerSeptive Biosystems；Nucleosil 100-5 C18，12.5×0.46cm；20-50％乙腈的0.1％TFA水溶液，在30分钟内)，对200μl溶液进行分析，通过对合适峰积分，估计剩余化合物的含量。因此，制备不稳定化合物的PBS对照。

实施例17：化合物对组织蛋白酶B1和D降解的稳定性

检查肽模拟化合物对溶酶体降解的稳定性，即与组织蛋白酶B1(EC 3.4.22.1，得自牛脾；Sigma-Aldrich，Taufkirchen；以10000U/L溶于ddH₂O中)和组织蛋白酶D(EC 3.4.23.5，得自牛脾；Sigma-Aldrich，Taufkirchen；以10000U/L溶于DDH₂O中)一起于37℃保温4小时，所使用的化合物浓度为50μM，酶/底物的比率为0.4U/μmol。样品含有25ppm 4-异丙基苄醇(IPBA；Sigma-Aldrich，Taufkirchen)，作为内标。

通过将35μl 1％ IPBA的DMSO溶液和28μl 10000U/L组织蛋白酶B1或组织蛋白酶D储备液分别加入到14ml 100mM乙酸钠、1mM EDTA、1mM DTT、pH5.00或100mM乙酸钠pH4.50中，制备测定缓冲液。将8.8μl 5mM(或4.4μl 10mM)化合物储备液(溶于10％DMSO/水中)加入到1.5ml Eppendorf管中。通过向各管中加入875μl完全测定缓冲液、涡旋混合并于37℃保温，使反应开始。在0小时和4小时，取出400μl样品，通过加入40μl 50％ TFA水溶液使酶失活。将样品于-20℃冷冻保存，直到通过RP-HPLC分析(200μl注射体积；Nucleosil 100-5 C18，12.5×4.6cm；梯度：20-50％乙腈，在30分钟内)。

通过分别与Ac-Cha-RAMASL-NH₂和QYIKANSLFIGITELK保温来控制组织蛋白酶B1和组织蛋白酶D的酶活性，这两种酶均在4小时内被完全降解。

在RP-HPLC分析期间，检测化合物与内标的共洗脱，无需实施例16的标准品。

表3(a、b和c)显示本发明化合物对某些组织蛋白酶酶的稳定性。

实施例18：0401(DR4)和0404(DR14)嵌合MHCII-小鼠T细胞活化在体内被共免疫抑制

小鼠品系DR4和DR14携带有嵌合MHC-II转基因，所述转基因编码鼠II类分子I Ed的相应DR分子N-末端结构域(形成肽结合部位)和剩余结构域(第二胞外结构域、跨膜结构域和胞质内结构域)。这些小鼠品系是其它鼠II类缺陷的，因此在相应人MHC-II结合部位中存在的肽可触发所有辅助T细胞应答。根据设计与DR结合的主题抑制剂的初步体内试验，DR-转基因小鼠用预定剂量的蛋白抗原和不同剂量的待测化合物拮抗剂共同免疫。在该方案中，将抗原和化合物一起在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化，因此，对这两种组分对DR呈递的直接竞争进行测试。测定的读出是共免疫后9天移植的局部淋巴结T细胞的离体抗原特异性活化。在一个典型实验中，对抗原剂量-反应进行研究，将用抗原免疫的小鼠的曲线与用抗原+化合物共免疫的小鼠的曲线进行比较。每个实验组使用2-3只小鼠，用按等数目合并的淋巴结细胞产生剂量反应曲线。该实验系统也允许评价化合物拮抗剂的固有抗原性。研究时用不同浓度的化合物代替抗原，进行一项来自同一细胞库的剂量-反应研究，可以做到这一点。作为特异性对照，在同一细胞库中，对纯化蛋白衍生物(PPD)即CFA的主要蛋白组分进行测试。

图14显示本发明优选四聚体化合物(P69)相对于含Arg等同物(P82)的改进的体内抑制效应。图15显示本发明优选四聚体和七聚体化合物的体内抑制效应。

通过计算对照相对于三种抗原浓度即6.7μg、20μg和60μg的平均抑制百分率，求出正在研究之中的化合物的总体抑制潜力的估计值。表4显示本发明的某些化合物与某些含Arg等同物的总体抑制潜力的估计值。在所述体内模型的一个或两个中，所有含Gpg化合物全都具有显著性免疫抑制特性。含Gpg化合物也显示相对于含Arg等同物的改进的活性或改进的特异性。此外，在该项测定中，式I化合物显示有活性。

18.1共免疫用化合物的制备

本发明化合物作为用CFA(Bacto Adjuvant Complete H37 Ra，Difco，批号3113-60)、10mg/ml蛋白的PBS溶液、5μM抑制剂的10％DMSO溶液制备的乳剂注射给药。将CFA、PBS、抗原和抑制剂置于一个5-ml注射针筒(总体积不超过1ml)内。所得混合物按振辐小于40％(30-35％)进行超声处理2次，每次15秒。此时乳剂应看上去很硬但不是液态。水表面的乳滴不应散开。通过针头将所得乳剂吸到带有针头(Gr.18，26G×1″)的1ml注射器内，然后排出气泡。将100μl最终含有50μg蛋白和210nM化合物的乳剂注射到小鼠尾巴末端，共同免疫小鼠。抗原+化合物和CFA按1∶1体积/体积混合。用HEL免疫的DR 4小鼠和用OVA免疫的DR 14小鼠获得了最佳结果。

18.2小鼠的免疫

如下给小鼠尾巴末端进行注射：用大姆指和中指抓住小鼠尾巴，将食指放在小鼠尾巴的末端。将注射器的针头在距尾末端(毛发端)约1.5cm处插入皮下并推入尾中约1cm。给小鼠注射100μl乳剂。9天后，处死小鼠，取出淋巴结。

18.3共免疫后T细胞增殖测定

使用从先用鸡卵溶菌酶+化合物共免疫的嵌合DR4-IE转基因小鼠(Taconic，USA)或用卵清蛋白+化合物共免疫的DR14-IE转基因小鼠的淋巴结中分离的T细胞和抗原呈递细胞，按照标准方法(Adorini等，1988，Mueller等，1990；Current Protocols in Immunology，第2卷，7.21；Ito等，1996)，测试候选化合物对T细胞活化的抑制效应。

免疫后约9天(例如8-10天)，处死小鼠，取出淋巴结，使用逐渐增加量的已用蛋白抗原和化合物拮抗剂共免疫的小鼠淋巴结细胞上的抗原，按照实施例19.1进行T细胞增殖测定。对照系不用化合物免疫。

按照下面的测定计划，制备抗原稀释液并分配在96-U-Well-MTP上。PPD用作T细胞增殖的阳性对照。

培养基(阴性对照)

100μl HL-1

100μl细胞(2.5×10⁵细胞)

PPD(阳性对照)

100μlPPD溶液(100μg/ml)

100μl细胞(2.5×10⁵细胞)

抑制剂对照

100μl化合物溶液(100-3.125μM)

100μl细胞(2.5×10⁵细胞)

抗原-滴定(600μg/ml-0.82μg/ml)

100μl抗原溶液

100μl细胞(2.5×10⁵细胞)

洗涤培养基

97.5％RPMI

1.5％FCS

1％卡那霉素(储备液10mg/ml→终浓度0.1mg/ml)

HL-1培养基

98％HL-1培养基(Bio Wittaker Europe，批号77201)

1％L-谷氨酰胺(储备液200mM→终浓度2mM)

1％卡那霉素(储备液10mg/ml→终浓度0.1mg/ml)

无血清

储备液

HEL(溶菌酶III级：得自鸡卵白；Sigma L-7011)10mg/ml PBS

OVA(白蛋白，鸡卵；Sigma A-2512)4mg/ml PBS

PPD(结核菌素PPD；Statens Serum Institut；批号2391)1mg/ml

(待用)

所用的溶液

HEL：储备液(120μg/ml)用HL-1培养基按1∶83稀释→终浓度30μg/ml/孔。

OVA：储备液(84μg/ml)用HL-1培养基按1∶48稀释→终浓度21μg/ml/孔。

PPD：储备液(100μg/ml)用HL-1培养基按1∶10稀释→终浓度25μg/ml/孔。

实施例19：本发明化合物体外抑制T细胞活化

采用测量T细胞增殖的试验，对正在研究的化合物的免疫调节特性进行测试。表3(a和b)显示某些化合物的IC50(μM)和最大抑制(％)。图9显示剂量-反应曲线，证明根据T细胞活化试验测定，P53(含Gpg)即本发明优选七聚体化合物相对于含Arg肽(P51)的改进的免疫抑制特性。也显示了本发明的另一化合物(P41-1)的剂量-反应曲线。图10显示剂量-反应曲线，证明根据T细胞活化试验测定，本发明的各种优选化合物如P69、P74、P101和P53的免疫抑制特性。

如下测试抑制抗原致敏淋巴结细胞的增殖性T细胞应答并缺乏鼠II类分子的化合物，所述细胞来自携带具有RA相关肽结合部位的嵌合小鼠-人II类转基因的小鼠(Muller等，1990；Woods等，1994；Current Protocols in Immunology，第2卷，7.21；Ito等，1996)。在此，免疫在体内发生，但抑制和读出却是在活体外进行。表达具有RA相关分子结合部位的MHC II类分子DRB*0401的转基因小鼠是市售的。这些小鼠缺乏鼠MHC II类，因而所有Th应答都通过一种人RA相关MHC II类分子的通道(Ito等1996)。这些转基因小鼠代表一种人II类拮抗剂试验模型。

19.1 T细胞增殖测定

使用先前用鸡卵卵清蛋白免疫的嵌合0401-IE转基因小鼠(Taconic，USA)淋巴结中分离的嵌合T细胞和抗原呈递细胞(Ito等1996)，按照标准方法，对正在研究的化合物对所测量的T-细胞增殖的抑制效应进行测试。在每孔各装有0.2ml的96孔组织培养板中，在卵清蛋白(30μg/孔-半数最大刺激浓度)和连续稀释的待测化合物(约0.1μM至200μM)存在下，在含有2mM L-谷氨酰胺和0.1g/l卡那霉素的无血清HL-1培养基中，将1.5×10⁵细胞孵育3天。在培养的最后16小时期间，通过3H-甲基-胸苷(1μCi/孔)掺入测定抗原特异性增殖(Falcioni等，1999)。收获细胞，并用闪烁计数器(TopCount，WallacFinland)测定3H掺入。可以观察到与含有抗原的对照孔相比，用所述化合物处理可抑制T细胞增殖。

实施例20：本发明化合物抑制T细胞杂交瘤细胞的IL-2分泌

在测量无限增殖化T细胞的IL-2分泌的测定中，本发明含Gpg化合物表现出相当大的免疫调节特性。表3a显示Gpg化合物在该测定中的IC₅₀(μM)和最大抑制(％)。表3b显示式I的四聚体化合物相对于含有NH₂封端基团的那些化合物的改进的活性(粗体)。图11显示剂量-反应曲线，证明根据IL-2分泌测定，P41-1(含Gpg)即本发明七聚体化合物相对于含Arg肽(P40-1)的改进的免疫抑制特性，而图12显示剂量-反应曲线，证明根据IL-2分泌测定，P69(含Gpg)即本发明四聚体化合物相对于含Arg肽(P82)的改进的免疫抑制特性。图13显示P53(含Gpg)即本发明优选七聚体化合物相对于DMSO对照的免疫抑制特性。

通过测量经刺激的杂交瘤细胞系T-Hyb 1的IL-2分泌，使用DR-转基因抗原呈递细胞(APC)，在半数最大抗原刺激条件下，对正在研究的化合物的免疫调节特性进行研究。采用由Pharmingen(Torrey Pine，CA，USA)的OptiEIA小鼠IL-2试剂盒提供的标准ELISA方法，检查并测量IL-2分泌。按照标准方法，从未免疫的嵌合0401-IE转基因小鼠(Ito等1996)的脾中分离出APC。将1.5×10⁵APC加入到每孔装有0.2ml含以下添加剂(全都得自Gibco BRL和PAA)的RPMI培养基的96孔板中：10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和0.1g/l卡那霉素。加入鸡卵卵清蛋白，至终浓度为200μg/ml，终体积为100μl上述培养基，所述细胞与该抗原一起在6％CO₂下于37℃孵育30分钟。向各孔中加入不同浓度的化合物(浓度通常在0.1-200μM范围内)，将所述板在37℃/6％CO₂下保温1小时，然后加入2×10⁵T-Hyb 1细胞，得到终体积为200μl上述培养基。孵育24小时后，将100μl上清液转移到先前用IL-2捕获抗体(BDPharmingen，Torrey Pine，CA，USA)包被的ELISA板(Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp surface，Nunc，Roskilde，DK)中，使用OptiEIA小鼠IL-2试剂盒，按照生产商的说明，对IL-2含量进行定量，并且采用VictorV读出器(Wallac，Finland)读板。所分泌的IL-2(pg/ml)采用试剂盒中提供的IL-2标准品校准。

通过使胸腺瘤系BW 5147(ATCC)的T细胞受体阴性变异体和先前用鸡卵卵清蛋白(Ito等1996)免疫的嵌合0401-IE转基因小鼠的淋巴结细胞融合，建立T细胞杂交瘤系T-Hyb1。克隆T-Hyb1根据所述测定进行选择，因为该克隆对具有高IL-2分泌的抗原特异性刺激有反应。

实施例21：本发明化合物在小鼠疾病模型中的免疫调节活性

测试显示最佳分布型(结合亲和性、蛋白酶稳定性、T细胞体外和体内抑制)的化合物在以下模型中的治疗潜力：MHC-II转基因小鼠自身免疫病模型，即胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)-类风湿性关节炎模型和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)-多发性硬化模型。

按照Rosloniec等介绍的方法(J.Exp.Med.1997；185：113)，用II型胶原蛋白免疫HLA-DR1转基因小鼠，诱发CIA。疾病发作后，小鼠用最大耐受剂量的化合物治疗两周(皮下给药)，与仅用溶剂治疗的小鼠相比，疾病发展如下：

天数治疗

1 免疫(牛C-II+CFA)

19-40 疾病发作时开始皮下注射化合物，每周5次，共3周

疾病严重程度评分

1.红斑和轻度肿胀，局限于跗骨或踝关节

2.红斑和轻度肿胀，从踝关节延伸至跗骨

3.红斑和中度溶胀，从踝关节延伸至趾骨关节

4.红斑和严重溶胀，包括踝关节、足和趾

图16显示本发明的优选化合物(P96、P53和P74)相对于作为对照的溶剂在CIA小鼠模型中对类风湿性关节炎的功效。

按照Ito等(1996)介绍的方法，给DR4转基因小鼠注射髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白(MOG)，诱发EAE。疾病发作后，小鼠用化合物进行治疗并进行如下研究：

天数治疗

0 免疫(MOG+CFA)

14-36 疾病诱发或发作时开始皮下注射化合物，每周5次

疾病评分

1.尾部张力缺乏

2.后肢无力

3.后肢麻痹

4.后肢麻痹，前肢无力或麻痹

5.濒死状态

图17显示本发明的优选化合物(P69、P53和P74)相对于作为对照的溶剂在EAE小鼠模型中对多发性硬化预防的功效。

图18显示本发明的优选化合物(P69和P53)相对于作为对照的溶剂在EAE小鼠模型中对多发性硬化治疗的功效。

图19显示本发明的优选含Gpc化合物(P69)相对于等同的含Arg化合物(P82)在EAE小鼠多发性硬化模型中的功效。Gpg化合物的功效就疾病治疗而论优于Arg化合物，尽管是以Arg化合物(250nM)的一半浓度(125nM)进行治疗。

实施例22：药用组合物

为了选择出本发明最合适的化合物进入下一步实验并且评价所述化合物用于免疫系统疾病治疗的治疗组合物中的适合性，采集另外的数据。每种化合物的这类数据可包括根据体外估计的亲和性、反应性、特异性、IC50值、对IL-2分泌和T细胞增殖的抑制以及类风湿性关节炎和多发性硬化的DR-转基因模型。

对于给定疾病，可以将本发明化合物的活性与先前接受的疗法或治疗药进行比较。例如，可以将本发明的具体化合物与干扰素-β-多发性硬化已接受的疗法进行比较。

可以选择出显示合适亲和性、最佳特异性和/或T细胞增殖或IL-2分泌的最高抑制以及在合适模型中抑制类风湿性关节炎和多发性硬化有高功效的化合物做进一步实验。这样的实验可包括例如在动物中的治疗分布型和毒理学以及人体I期临床试验。

对于治疗或预防应用，可以将本发明化合物以常规药用组合物的形式给予温血动物例如人，其中的典型实例包括以下实例：注射液：将0.01-100mg活性成分溶于至多2mL水性注射溶媒中，所获得的活性成分浓度介于0.01-100mg/mL之间。水性注射溶媒用药学上可接受的缓冲剂(例如磷酸盐或醋酸盐)按需缓冲至pH 5和pH 8之间，并且含有所加入的药学上可接受的张力调节剂(例如NaCl或葡萄糖)，以达到等渗性。溶媒也任选含有其它药学上可接受的赋形剂例如增溶剂(例如DMSO、乙醇、丙二醇、聚乙二醇等)、防腐剂和抗氧化剂。所述活性成分通常可以是如上所述的化合物，并且一般为药学上可接受的盐。本发明化合物可以与一种或多种其它活性成分一起给予。这样的组合物可以是含有若干这类活性成分的单包装、丸剂或敷剂，或者这样的给药可以含包括本发明化合物在内的独立活性成分的序贯或重复给药。

等同实施方案

本领域技术人员将会认识到或者能够确定，使用不超过常规实验部分，本说明书中描述了本发明化合物的许多等同实施方案及其使用方法。这样的等同实施方案被认为在本发明范围内，并且所附权利要求书包括这样的等同实施方案。

此中引用的所有专利、公布的专利申请和出版物通过引用全部结合到本文中。

表1.本发明含Gpg化合物

a.本发明的优选含Gpg化合物

编号 Pos.2 序列

P41-1 Gpg Ac-Cha-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P41-2 Gpg Ac-Cha-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P45-1 Gpg Ac-Cha-Gpg-Disc-Met-βPhPro-OH

P45-2 Gpg Ac-Cha-Gpg-Disc-Met-βPhPro-OH

P47 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Met(O)-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P52 Gpg Ac-Phe-Gpg-Tic-Met(O)-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P53 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P54 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-N(Me)CH2CH2OH

P55 Gpg Ac-Phe-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P56 Gpg Ac-Phe-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-N(Me)CH2CH2OH

P57 Gpg Ac-Hfe-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P58 Gpg Ac-Thi-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P59 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Ile-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P60 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P61-1 Gpg Ac-Cha-Gpg-Disc-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P61-2 Gpg Ac-Cha-Gpg-Disc-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P62-1 Gpg Ac-Phe-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P62-2 Gpg Ac-Phe-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P63-1 Gpg Ac-Thi-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P63-2 Gpg Ac-Thi-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P64 Gpg Ac-Cha-Gpg-Disc-Met(O)-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P65 Gpg Ac-Thi-Gpg-Disc-Met(O)-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P66-1 Gpg Ac-Cha-Gpg-Disc-Met-NH2

P66-2 Gpg Ac-Cha-Gpg-Disc-Met-NH2

P67 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-NH2

P68 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(H)Bn

P69 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(H)CH2CH2Ph

P70 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(H)CH2CH2OCH2CH2OH

P74 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(Me)Bn

P76-1 Gpg Ac-Cha-Gpg-Disc-Nle-N(Me)Bn

P76-2 Gpg Ac-Cha-Gpg-Disc-Nle-N(Me)Bn

P77 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-四氢异喹啉

P78 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(Bn)CH2CH2OH

P80 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-βPhProNH2

P101 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(Bn)CH2CH2OCH2CH2OH

P102 Gpg Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-N(Bn)CH2CH2OCH2CH2OH

表1(续).本发明含Gpg化合物

b.式II的前导天然肽的优选模拟取代(Falcioni等；1999)

前导肽

Ac (Cha) R A M A S L -NH₂

Ac Cha Gpg Ala Met Ala Ser Leu -NH₂

优

4-氨基丁酰基 Nba C(Acm) Nle β-PhPro tLeu

选

3-氨基丙基 4-MeCha C(Prm) Chg -------N(H)CH(CH₂OH)₂-------

的

取

Coa MePhg -----Halc----- -------N(CH₃)CH₂CH₂OH-------

代

Hfe C(Ac) ----Odapdc---- --------N(H)CH₂CH₂OH--------

Phe Nva Met(O) ---[S-Ψ(oxaz)-L]-N(CH₃)₂---

Tic Ile ---[S-Ψ(lmid)-L]-N(CH₃)₂---

Disc ---------N(H)CH₂tBu---------

Thiq ----------D-Leu-ol----------

azaTic ----------D-Pro-ol----------

----------N(H)Bn------------

----------N(CH3)Bn----------

--------N(H)CH2CH2Ph--------

--------N(CH3)CH2CH2Ph------

--------N(CH3)CH2CH2OH------

--------N(Bn)CH2CH2OH-------

-----N(CH2CH2Ph)CH2CH2OH-----

-----N(H)CH2CH2OCH2CH2OH-----

-----N(Bn)CH2CH2OCH2CH2OH----

--N(CH2CH2Ph)CH2CH2OCH2CH2OH--

-----------四氢异喹啉---------

-----------异二氢吲哚---------

表1(续).本发明的其它化合物

c.式I的前导天然肽的优选四聚体模拟取代(Falcioni等；1999)

前导肽

Ac (Cha) R A M A S L -NH₂

Ac Cha Gpg Ala Met -----------N(H)Bn-----------------

优

4-氨基丁酰基 Nba Arg C(Acm) Nle ----------N(CH₃)Bn----------------

选

3-氨基丙基 4-MeCha Orn C(Prm) Chg ---------N(H)CH₂CH₂Ph-------------

的

取

Coa 4-Pya MePhg Ile --------N(CH₃)CH₂CH₂Ph------------

代

Hfe αMeOrn C(Ac) Met(O) --------N(CH₃)CH₂CH₂OH------------

Phe Cit Nva ---------N(Bn)CH₂CH₂OH------------

alle Tic -------N(CH₂CH₂Ph)CH₂CH₂OH--------

Val Disc -------N(H)CH₂CH₂OCH₂CH₂OH--------

3-Pya Thiq -------N(Bn)CH₂CH₂OCH₂CH₂OH-------

----Odapdc---- ----N(CH₂CH₂Ph)CH₂CH₂OCH₂CH₂OH----

azaTic -----------四氢异喹啉-------------

-----------异二氢吲哚-------------

表2.用本文介绍的测定所研究的其它化合物

编号 Pos.2 序列编号 Pos.2 序列

Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Haic-[S(oxaz)L]-N(CH3)2 P38-2 Arg Ac-Cha-Arg-(Et2)-Disc-Met-NH2

Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Haic-NH2 P39 Orn Ac-Cha-Orn-Tic-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]NMe2

Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Haic-Ser-MeLeu-NH2 P40-1 Arg Ac-Cha-Arg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]NMe2-Aly-Ref No：GPCG-PWO-130

Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-Ser-tLeu-NH2 P40-2 Arg Ac-Cha-Arg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P1 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-NH2 P42 Arg H-Cha-Arg-Tic-Met-NH2

P3 Arg Ac-Cha-RAMASL-NH2 P43 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met(O)-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P6 Arg Ac-Cha-Arg-Thiq-Met-NH2 P44-1 Arg Ac-Cha-Arg-Disc-Met-βPhPro-N(Me)CH2CH2OH

P8 Orn Ac-Cha-Orn-Tic-Met-NH2 P44-2 Arg Ac-Cha-Arg-Disc-Met-βPhPro-N(Me)CH2CH2OH

P9 Orn Ac-Cha-Orn-Thiq-Met-NH2 P48 N/A O，O’-Bis-(CH2-CH2-NH-CO-Cha-Arg-Tic-Met-NH2)-PEG 3400

P10 Val Ac-Cha-Val-Tic-Met-NH2 P49 Arg Ac-Phe-Arg-Tic-Met-NH2

P11 Val Ac-Cha-Val-Thiq-Met-NH2 P50 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Ile-NH2

P12-1 Arg Ac-Cha-Arg-Disc-Met-NH2 P51 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2

P12-2 Arg Ac-Cha-Arg-Disc-Met-NH2 P71 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Me)Bn

P13 alle Ac-Cha-alle-Tic-Met-NH2 P72-1 Arg Ac-Cha-Arg-Disc-Nle-N(Me)Bn

P14 alle Ac-Cha-alle-Thiq-Met-NH2 P72-2 Arg Ac-Cha-Arg-Disc-Nle-N(Me)Bn

P15-1 Val Ac-Cha-Val-Disc-Met-NH2 P73 Arg H-Cha-Arg-Tic-Nle-NMe2

P15-2 Val Ac-Cha-Val-Disc-Met-NH2 P75-1 Arg Ac-Cha-Arg-Hbc-Nle-N(Me)Bn

P16-1 Orn Ac-Cha-Orn-Disc-Met-NH2 P75-2 Arg Ac-Cha-Arg-Hbc-Nle-N(Me)Bn

P16-2 Orn Ac-Cha-Orn-Disc-Met-NH2 P79 Arg Ac-Cha-Arg-Phe-Nle-N(Me)Bn

P17-1 alle Ac-Cha-alle-Disc-Met-NH2 P81 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-N(CH2CH2OH)CH2CH2Ph

P17-2 alle Ac-Cha-alle-Disc-Met-NH2 P82 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-N(H)CH2CH2Ph

P18-1 Orn Ac-Cha-Orn-azaTicMet(O)-NH2 P83 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Me)CH2CH2Ph

P18-2 Orn Ac-Cha-Orn-azaTic-Met-NH2 P84 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-N(Me)CH2CH2Ph

P20 Arg Ac-Cha-Arg-azaTic-Met-NH2 P85 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-N(CH2CH2OH)CH2CH2Ph

P21 Arg Ac-Cha-Arg-D-Tic-Met-NH2 P86 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-N(CH2CH2Ph)CH2CH2OCH2CH2OH

P22 Cit Ac-Cha-Cit-Disc-Met-NH2 P89 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-NBu2

P24 Cit Ac-Cha-Cit-D-Tic-Met-NH2 P90 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Gly-N(Me)Bn

P25 Cit Ac-Cha-Cit-Tic-Met-NH2 P91 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Aib-N(Me)Bn

P26 Orn Ac-Cha-Orn-D-Tic-Met-NH2 P92 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Me)CH2CH2OH

P28 “Arg” Ac-YGRKKRRQRRR-(ACS)Cha-R-Tic-M-NH2 P93 Arg Z-Cha-Arg-N(Me)Bn

P30 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-OH P94 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Aib-N(Bn)CH2CH2OH

P31 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-NH2 P95 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Gly-N(Bn)CH2CH2OH

P32 3Pya Ac-Cha-3Pya-Tic-Met-NH2 P96 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-N(CH2CH2Ph)CH2CH2OCH2CH2OH

P33 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2 P97 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-N(H)Bu

P34 4Pya Ac-Cha-4Pya-Tic-Met-NH2 P98 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Bn)CH2CH2OCH2CH2OH

P35-1 aMeOrn Ac-Cha-αMeOrn-Tic-Met-NH2 P99 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-N(Bn)CH2CH2OCH2CH2OH

P35-2 aMeOrn Ac-Cha-αMeOrn-Tic-Met-NH2 P100 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-NH(C5H11)

P36 Arg Ac-Cha-Arg-(N，N′-Et2)-Tic-Met-NH2

表3.a.根据式II的本发明某些化合物的生物学特性

表3.(续)

b.本发明式I的某些化合物的生物学特性

表4.本发明某些化合物及其某些含Arg等同物的T细胞活化在体内被共免疫抑制

		应答降低(％)
		应答降低(％)				化合物	Pos.2	HEL	PPD(HEL)	OVA	PPD(OVA)
						化合物	Pos.2	HEL	PPD(HEL)	OVA	PPD(OVA)
						P51	Arg			43.1	3.5
P53	Gpg	68.4	10.2	56.3(59)	26.8(34.4)	P51	Arg			43.1	3.5
P53	Gpg	68.4	10.2	56.3(59)	26.8(34.4)
P82	Arg			25	5
P82	Arg			25	5	P69	Gpg	59(88)	2(32)	65.3(51.7)	9(15)
						P69	Gpg	59(88)	2(32)	65.3(51.7)	9(15)
						P71	Arg	78.1	62.1	48.8	21.8
P74	Gpg	51.6(52.6)	12.8(3.3)	42.5	5.8	P71	Arg	78.1	62.1	48.8	21.8
P74	Gpg	51.6(52.6)	12.8(3.3)	42.5	5.8
P41-1	Gpg			50.1	21.6
P41-1	Gpg			50.1	21.6	P57	Gpg			52.6	52.4
P60	Gpg			50.3	28.1	P57	Gpg			52.6	52.4
P60	Gpg			50.3	28.1	P61-1	Gpg	37.9	32.3	3.7	29.9
P68	Gpg	-3.2	25.1	95.3	65.9	P61-1	Gpg	37.9	32.3	3.7	29.9
P68	Gpg	-3.2	25.1	95.3	65.9	P70	Gpg			56.1	52.3
P101	Gpg	49.7(31.7)	41.1(21.8)			P70	Gpg			56.1	52.3
P101	Gpg	49.7(31.7)	41.1(21.8)			P102	Gpg	41.3	31.2

Claims

1.一种具有式II结构的化合物，

式II

其中，只要化合价和稳定性允许，则：

A不存在，或者代表1-4个氨基酸或氨基酸类似物残基序列；

B代表2-8个氨基酸或氨基酸类似物残基序列；

W代表OR₇或NR₈R₉，

V每次出现时独立代表C＝O、C＝S或SO₂；

X不存在，或者代表O、S或NR；

R每次出现时独立代表H或低级烷基；

R₁代表取代或未取代的烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基或杂环基烷基部分；

R₂代表取代或未取代的烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基或杂环基烷基部分，优选疏水部分，或者R₂和R结合在一起形成环，所述环具有5-7元、优选6-7元、任选被1-5个取代基取代和/或与一个或多个其它环例如芳环、杂环或碳环形成多环结构；

i为0-1的整数；

j为1-2的整数；

k为1-3的整数；且

R₆不存在，或者代表1-4个与其连接的含氮环上的取代基，所述取代基选自取代或未取代的低级烷基、卤代烷基、卤基、羟基和氨基。

R₇、R₈和R₉独立代表选自以下的取代基：H以及取代或未取代的烷基、杂烷基、芳基、芳烷基、杂芳烷基、杂芳基、环烷基、环烷基烷基、杂环基和杂环基烷基，或者其中R₈和R₉结合在一起形成环，所述环具有5-7元、任选被1-5个取代基取代和/或与一个或多个其它环例如芳环、杂环或碳环形成多环结构。

2.权利要求1的化合物，其中R₆不存在。

3.权利要求1的化合物，其中R₁、R₇、R₈和R₉中至少一个为疏水残基。

4.权利要求1的化合物，其中A代表0或1个氨基酸或氨基酸类似物残基。

5.权利要求1的化合物，其中B代表2-6个氨基酸或氨基酸类似物残基。

6.权利要求1的化合物，其中B代表2-4个氨基酸或氨基酸类似物残基。

7.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有免疫抑制活性。

8.权利要求1的化合物，其中所述化合物抑制MHC介导的T细胞活化。

9.权利要求1的化合物，其中所述氨基酸残基是α-氨基酸残基。

10.权利要求1的化合物，其中R₁XV结合在一起代表酰基。

11.权利要求10的化合物，其中所述酰基是烷基羰基、芳基羰基或氨基烷基羰基。

12.权利要求10的化合物，其中所述酰基是苯甲酰基、低级烷酰基或低级氨基烷酰基。

13.权利要求10的化合物，其中所述酰基是乙酰基。

14.权利要求1的化合物，所述化合物的结构选自表1a中给出的结构或由表1b的含Gpg的优选亚单元构建的结构。

15.权利要求1的化合物，其中所述化合物选自P60、P53、P47、P41-1、P69、P66-1、P76-1、P67、P74、P80、P101和P102。

16.权利要求1的化合物，其中所述化合物与MHC II类蛋白结合。

17.权利要求16的化合物，其中所述MHC II类蛋白是DR分子。

18.权利要求16的化合物，其中所述MHC II类蛋白选自0401、0101和0404。

19.权利要求16的化合物，其中所述化合物与所述MHC II类蛋白结合的IC₅₀高于选自以下的数值：4μM、2μM、1μM、500nM和200nM。

20.权利要求1的化合物，其中所述化合物显示在小鼠血清中24小时后的稳定性大于50％、60％、70％、80％和90％中的至少一个。

21.权利要求1的化合物，其中所述化合物显示在大鼠血清中24小时后的稳定性大于10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％和90％中的至少一个。

22.一种药用组合物，所述组合物包含权利要求1的化合物以及药学上可接受的赋形剂。

23.权利要求1的化合物在制备药用组合物中的用途。

24.权利要求23的用途，其中所述药用组合物用于治疗或预防以MHC II类介导的T细胞活化或MHC II类蛋白在病理性炎症部位表达为特征的病症。

25.权利要求24的用途，其中所述病症选自类风湿性关节炎、青少年关节炎、多发性硬化、格雷夫斯病、胰岛素依赖性糖尿病、发作性睡眠、牛皮癣、系统性红斑狼疮、关节强硬性脊椎炎、同种异体移植物排斥、移植排斥、移植物抗宿主病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、寻常性天疱疮、甲状腺炎、肾小球性肾炎、胰腺炎、原发性胆汁性肝硬化、斯耶格伦综合征、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、大疱性类天疱疮、古德帕斯彻综合征、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、特发性血小板减少性紫癜、胰岛炎、过敏性肠疾病和艾迪生病。

26.权利要求24的用途，其中所述病症选自类风湿性关节炎和多发性硬化。

27.一种用于抑制免疫应答的方法，所述方法包括给予动物权利要求1的化合物。

28.一种具有式I结构的化合物，

式I

其中，只要化合价和稳定性允许，则：

A不存在，或者代表1-4个氨基酸或氨基酸类似物残基序列；

B代表2-8个氨基酸或氨基酸类似物残基序列；

X不存在，或者代表O、S或NR；

W代表OR₇或NR₈R₉，

V每次出现时独立代表C＝O、C＝S或SO₂；

R每次出现时独立代表H或低级烷基；

R₂代表取代或未取代的烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基或杂环基烷基部分，或者R₂和R结合在一起形成环，所述环具有5-7元、任选被1-5个取代基取代和/或与一个具有一个或多个其它环形成多环结构；

R₃代表取代或未取代的烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基或杂环基烷基部分；且

R₇、R₈和R₉独立代表选自以下的取代基：H以及取代或未取代的烷基、杂烷基、芳基、芳烷基、杂芳烷基、杂芳基、环烷基、环烷基烷基、杂环基和杂环基烷基，或者其中R₈和R₉结合在一起形成环，所述环具有5-7元、任选被1-5个取代基取代和/或与一个或多个其它环形成多环结构；

其中W包括至少6个非氢原子。

29.权利要求30的化合物，其中R₈和R₉中至少一个选自苄基、苯乙基、2-羟乙基和-CH₂CH₂OCH₂CH₂OH。