KR20040106291A - 면역억제 화합물, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

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졸탄 나지
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Abstract

본 발명은 예로써 T 세포의 클래스 Ⅱ MHC-매개된 활성화를 저해함으로써 면역반응을 억제하는 화합물, 조성물 및 방법에 관한다. 본 발명의 화합물은 류머티스 관절염 및/또는 다발성 경화증과 같은 질환을 치료하거나 예방하는데 사용할 수 있다.

Description

면역억제 화합물, 이의 제조 방법 및 용도{IMMUNOSUPPRESSANT COMPOUNDS, METHODS AND USES RELATED THERETO}
클래스 I MHC 분자는 당단백질, 2 kD 베타-2 마이크로글로불린과 비-공유 결합된 45 kD 막통 단백질이다. 전자는 세포막에 삽입되지 않고 MHC 외부에서 인코드된다. 사람 클래스 I 분자는 별개의 좌위에 인코드된 HLA-A, -B, -C라고 하는 3가지 서로 다른 아이소타입으로 구성된다. 클래스 I 분자의 조직 발현은 편재하고 공우성(codominant)이다. 여러 사람과 뮤린 클래스 I 분자의 3차원 구조가 결정되었다(Bjorkman, P. J. , et al. (1987) Nature, 329,506; Garrett, T. P. J., et al. (1989) Nature, 342,692; Madden, D. R., et al. (1991) Nature, 353,321; Fremont, D. H., et al. (1992) Science, 257,919). 이들의 일차와 이차 세포외 도메인은 2개의 평행 α-나선 영역이 측면에서 접하는 β-주름진 시트로 구성된 결합부위로 접힌다. 이런 결합 부위는 7-9개 아미노산 길이 항원성 펩티드를 세포독성 주효체 T 림프구(Tc)에 제시한다(Madden et al. and Fremont et al., above). 이들 펩티드 대부분은 항원 제시 세포(APC) 내에서 합성된 단백질, 예를 들면 바이러스 또는 다른 세포내 기생충의 단백질, 또는 잘못 접힌 자가 단백질로부터 발생한다. 3가지 클래스 I 아이소타입 및 이들의 대립유전자 형태는 결합 부위 내에서 다형성 잔기에 따라 서로 다른 펩티드 결합 특이성을 갖는다(Falk, K., et al. (1991) Nature, 351,290; Falk, K., et al. (1992) Eur. J. Immunol., 22,277). Tc 세포에서 선택적으로 발현된 CD8 분자와 상호작용하는 세 번째 클래스 I 도메인에 추가의 결합 부위가 존재한다. Tc 세포 활성화에서 최초 단계는 동일한 클래스 I 분자에서 이들의 항원 수용체(TCR)와 제시된 펩티드 및 CD8과 이의 수용체 부위의 동시 상호작용이다.
클래스 Ⅱ MHC 분자는 2가지 막통 당단백질, 35 kD a 사슬과 28 kD β 사슬의 비-공유 결합된 헤테로이량체이다. 사람에서, 클래스 Ⅱ 분자는 서로 다른 3가지 아이소타입, HLA-DP, -DQ, -DR로 존재한다. DR에서 다형성은 β 사슬에 국한되는데, 여기서 양 사슬은 DP와 DQ 아이소타입에서 다형성이다. 클래스 Ⅱ 분자는 공우성으로 발현되긴 하지만, 클래스 I과 대조적으로 한정된 조직 분포를 보인다: 이들은 면역계 세포의 표면에만 존재한다(B 림프구와 수상돌기 세포에서 구성 발현 및 T 세포와 단핵구에서 유도 발현). 3가지 서로 다른 DR 분자의 3차원 구조가 결정되었다(Brown, J. H., et al. (1993), Nature, 364,33; Stern, L. J., et al. (1994) Nature, 388,215; Ghosh, P., et al. (1995) Nature, 378, 457; Dessen, A., et al. (1997) Immunity, 7,473). 전체적으로, 이들의 구조는 클래스 I 분자의 구조와 매우 유사하다. 펩티드 결합 부위는 α와 β 사슬의 제 1 도메인으로 구성되는데, 이는 클래스 I과 대조적으로, 양 측면이 개방되기 때문에 좀더 긴(12-24개 잔기) 펩티드의 결합이 가능하다(Chicz, R. M., et al. (1992) Nature, 358,764). β 사슬의 제 2 도메인에서 추가 결합 부위는 보조 T(Th) 세포에서 선택적으로 발현되는 CD4 분자와 상호작용한다. Th 세포에서 상기 분자는 Tc 세포에서 CD8과 동일한 수용체 기능을 갖는다. 이들의 생합성과 세포내 전달동안, 클래스 Ⅱ 헤테로이량체는 불변(Ii) 사슬로 지칭되는 세 번째 비-다형성 비-MHC-인코드된 31 kD 단백질을 동반한다(Cresswell, P. (1994) Annu. Rev. Immunol., 12, 259). Ii 사슬은 산성 엔도솜 구획에 도달할 때까지 세포질에서 전달동안 클래스 Ⅱ 분자의 펩티드 결합 부위를 보호하고, 엔도솜에서 프로테아제에 의해 절단되어 CLIP라고 하는 펩티드만을 결합 부위에 남겨둔다. CLIP와 항원성 펩티드의 교환은 엔도솜에서 HLA-DM이라고 하는 다른 MHC-인코드된 분자에 의해 촉매된다(Vogt, A. B., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 9724). 항원성 펩티드는 대부분 식작용된 외래 단백질로부터 유래된다(Germain, R. N. (1994) Cell, 76,287).
DR 분자와 펩티드간 상호작용의 성격은 거의 알려져 있다. 펩티드의 소수성 고정 잔기와의 상호작용에 중요한 메이저 포켓 및 다형성 β 사슬 잔기를 보유하는 추가의 마이너 포켓이 결합 부위에 존재하는데, 이들은 펩티드 결합에 일정 수준의 알로타입(allotype)-특이성을 제공한다(Stern et al., above; Hammer, J., et al. (1993) J. Exp. Med., 176, 1007; Hammer, J., et al. (1994) Cell. 74, 197;Hammer, J., et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91, 4456; Hammer, J., et al. (1995) J. Exp. Med., 180, 2353). 또한, 펩티드 주쇄는 결합 부위에서 특정 보존된 잔기의 측쇄와 중요한 수소 결합을 형성하는데, 이는 결합된 펩티드의 전반적인 형태 및 측쇄 배향을 결정한다(Stern et al., above).
여러 질환, 특히 자가면역 질환에 대한 감수성은 주요 조직적합성 복합체의 특정 대립유전자와 강하게 연관하는 것으로 밝혀졌다(Tiwari, J., and Terasaki, P. (1985), HLA and disease association(New York Springer Verlag)). 일부 클래스 I-연관된 질환이 존재하긴 하지만, 대부분의 자가면역 질환은 클래스 Ⅱ 대립유전자와 연관하는 것으로 밝혀졌다. 가령, 클래스 Ⅱ 대립유전자 DRB1*0101, 0401, 0404, 0405는 류머티스 관절염(RA) 환자에서 증가된 빈도로 발생하는 반면(McMichael, S. J., et al. (1977) Arthritis Rheum., 20, 1037; Stasny, P. (1978) N. Engl. J. Med., 298,869; Ohta, N., et al. (1982) Hum. Immunol., 5, 123; Schiff, B., et al. (1982) Ann. Rheum. Dis., 41,403), DRB1*1501은 다발성 경화증(MS)에 연관하고 DQ 대립유전자 조합 DQA1*0301/B1*0302 인슐린-의존성 당뇨병(IDDM)과 연관한다. RA에서, 거의 >94%의 류머티스 인자 양성 환자가 이들 감수성 대립유전자중 하나를 보유한다(Nepom, G. T., et al. (1989) Arthritis, Rheum., 32,15).
RA에 대한 DRB1 대립유전자의 효과는 상이한 방식으로 나타난다: 첫째, 이런 질환 연관(disease association)은 한 대립유전자 또는 다른 대립유전자에 인종-의존성 선호를 보인다(Ohta et al.,; Schiff et al., above); 둘째, DRB1*0401은 다른 대립유전자와 비교하여 좀더 심각한 질환 형태와 연관한다(Lanchbury, J. S., et al. (1991) Hum. Immunol., 32, 56); 셋째, 하나의 감수성 대립유전자 또는 두개의 감수성 대립유전자의 조합에 대한 동형접합성(homozygosity)이 좀더 심각한 만성형 또는 연소성 발병형 RA를 유도한다는 점에서 유전자량 효과(gene dosage effect)가 관찰될 수 있다(Wordworth, P., et al. (1992) Am. J. Hum. Genet., 51, 585; Nepom, B. S. (1993) Clin. Immunol. Immunopathol., 67, 850). 후자 발견은 DRB1 좌위가 상기 질환의 개시와 진행을 조절할 수 있음을 시사한다.
RA-연결된 DRB1 대립유전자에 의해 인코드된 DRB 사슬은 다형성 차이를 보이긴 하지만 "공유된 에피토프"로 알려진 67-74번 위치에서 동일하거나 거의 동일한 아미노산 서열을 공유한다(Nepom et al., (1989) above; Gregersen, P. K., et al. (1987) Arthritis Rheum. 30,1205). 공유된 에피토프 영역에서 잔기는 펩티드 결합 구(groove)의 한 면에서 α 나선의 형성에 기여하고(Brown et al.,; Stern et al.,; Dessen et al., above), 따라서 펩티드 결합에 영향을 줄 것으로 예상된다. 실제로, RA-연관된 DR 알로타입의 71번 위치에서 염기성 잔기 Lys 또는 Arg는 전시된 펩티드의 p4 잔기에서 음전하를 긍정하고 양전하를 부정함으로써 펩티드 결합에 선택성을 부여하는 반면, RA-무관한 알로타입 DRB1*0402의 p70과 p71번에서 산성 잔기 Asp와 Glu는 전시된 펩티드의 p4 잔기에서 반대의 전하 선호를 보인다(Hammer, J., et al. (1995) J. Exp. Med., 181, 1847). 자가항원 유도 RA는 여전히 불명이지만, 여러 관절 연골 단백질이 p4에서 산성 잔기로 인하여 RA-연관된 DR 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 펩티드 서열을 보유한다(Dessen et al., Hammeret al., (1995) above). 따라서, 이들 단백질은 RA 병리를 유발하는 자가면역 반응의 후보 항원이 될 수 있다(Rosloniec, E. F., et al. (1997) J. Exp. Med. 185,1113). DRB1-0402의 반대(양성) 전하 선호는 0402-연관된 자가면역 질환, 심상성 천포창(pemphigus vulgaris)과 관련된 자가항원인 desmoglein 3으로부터 유래된 p4에서 염기성 잔기에 펩티드의 선택적 제시를 제공하는 것으로 밝혀졌다(Wucherpfennig, K. W., et al. (1995) Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 92, 11935). 이들 데이터는 질환-연관된 MHC 알로타입에 의한 자가항원성 펩티드의 선택적 제시가 DRB1 대립유전자와 자가면역질환간 유전적 연관의 기초가 되는 기전이라는 가설을 강하게 뒷받침한다(Todd, J. A., et al. (1988) Science, 240, 1003). 질환 과정 자체는 이런 펩티드를 인식하는 Th 세포에 의해 진행된다. 활성화된 자가반응성 Th 세포는 상이한 친염증성 사이토킨을 분리하고, 이들 사이토킨은 염증 세포를 동원하고 병든 장기에서 만성 염증을 초래한다.
MHC 분자의 2가지 클래스에서, 클래스 Ⅱ은 아래의 이유로 인하여 면역억제 개입의 주요 표적이 된다: 첫째, MHC-Ⅱ 분자는 면역조절에서 중심하고 염증 질환에서 대부분의 면역병리를 책임지는 T 보조(Th)를 활성화시킨다; 둘째, 대부분의 자가면역 질환은 클래스 Ⅱ 대립유전자와 일반적으로 연관한다; 셋째, 정상적인 생리학적 또는 비-병리학적 상태에서 MHC-Ⅱ 분자는 면역계 세포에서 선택적으로 발현되는 반면, MHC-I은 대부분의 체세포에 존재한다.
클래스 Ⅱ(예, DR) 분자에 펩티드 결합은 서로 결합하여 특정 결합 모티프를 형성하는 전시된 펩티드의 "고정 위치"에서, 정의된 측쇄의 존재를 요구한다; 하지만, 비-고정 위치에서는 결합에 대한 영향없이 측쇄의 변화가 가능하다(Hammer et al., (1993, 1994, 1995), above). 이런 결합 기전은 정해진 할로타입에 의한 여러 상이한 펩티드의 제시를 가능하게 한다. 고정 위치에서 측쇄는 결하 부위 내에서 특정 포켓과 상호작용하는 반면, 비-고정 위치에서 측쇄는 외부를 지향하고 Th 세포의 TCR에 의해 인식된다. 따라서, 자가면역 질환-연관된 MHC 분자에 의해 제시되는 자가항원성 펩티드의 동일한 결합 모티프를 보유하지만 비-고정 위치에서 구별되는 화합물에 의한 치환은 자가면역 T 세포의 활성화를 예방하고, 따라서 질환 과정을 중단시킬 수 있을 것으로 생각된다. 이런 화합물이 효과를 발휘하는 기전은 항원-제시 부위에 대한 경쟁적 길항작용이다. 이런 이유로, 특정 자가면역 질환에 관여하는 클래스 Ⅱ 분자에 선택적으로 결합하는 화합물은 상기 질환을 특이적으로 간섭할 것으로 기대된다. MHC 분자에 결합하고 T 세포 활성화를 저해하는 다른 펩티드는 예로써 국제 특허 출원 WO 92/02543, WO 93/05011, WO 95/07707에서 개시하였다.
클래스 Ⅱ MHC 분자를 표적하는 제약학적 약제는 현재 가용한 면역억제제에 비하여 여러 이점을 제공한다. 첫째, 이는 질환 기전-기초한 개입으로써 병리 캐스케이드에서 최초 현상을 중단시킬 것으로 기대된다. 둘째, 이는 몇몇 클래스 Ⅱ 알로타입에만 선택성을 보이도록 설계될 수 있다, 다시 말하면 질환과 연관된 할로타입에만 향상된 친화성으로 결합하여 나머지 항원 제시 체계는 병원균에 대한 보호 반응에 이용될 수 있도록 하고, 따라서 대부분의 면역억제제와 비교하여 적은 면역약화 부작용을 유발하도록 설계될 수 있다. 셋째, 질환을 유발하는 실제 자가항원에 관한 구체적인 지식이 없이도 이런 방법과 화합물을 적용할 수 있다. 최종적으로, 이런 제약학적 약제는 특정한 생물학적 환경에서 우수한 안정성을 보이는 경우에 유리하다. 가령, 대부분의 면역계 세포가 강력한 펩티드 분해 효소와 함께 혈액에서 발견된다는 점에서, 포유동물 혈장, 예를 들면 쥐, 생쥐 또는 사람 혈장에서 높은 약물 안정성은 바람직하다. 설치류 혈장, 특히 쥐 혈장에서 높은 약물 안정성은 대부분의 치료약물의 효능, 독성 및/또는 약동학이 설치류 모델이나 시스템에서 검사된다는 점에서 특히 유리하다. 기전-기초한 치료 개입에서 클래스 Ⅱ MHC 분자를 표적하는 제약학적 약제가 식작용되고 MHC Ⅱ 분자에 전시되기에 앞서 카텝신-포함 엔도솜에 의해 세포내로 전달되어야 한다는 점에서, 카텝신(cathepsin) 분해에 대한 약물 안정성 역시 바람직하다.
본 발명의 요약
본 발명은 예로써 T 세포의 클래스 Ⅱ MHC-매개된 활성화를 저해함으로써 면역 반응을 억제하는 화합물, 제약학적 조성물, 방법에 관한다. 하기에 개시된 화합물은 화학식 Ⅱ 화합물에 비-고유 아르기닌 치환체를 포함하는데, 치환체 아미노산의 위치에서 Arg를 포함하는 상응하는 화합물과 비교하여 혈장(예, 생쥐와 쥐 혈장)에서 증가된 안정성 및 1.25-3의 계수로 목적하는 MHC-클래스 Ⅱ 분자(0401, 0101, 0404)에 증가된 결합 친화성을 보인다. 하기에 개시된 다른 화합물은 화학식 I 화합물에서 종결기(terminating group)를 보유한다. 화학식 Ⅰ또는 Ⅱ의 이런 화합물 역시 1.25-3의 계수로 T-세포 반응의 증가된 생체내 저해를 보였다. 이런 화합물은 특정 면역 질환의 생쥐 모델에서 효과적인 면역억제를 보였다. 본 발명의화합물과 방법은 류머티스 관절염 및/또는 다발성 경화증과 같은 질환을 치료하는데 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 T 세포의 MHC 클래스 Ⅱ-매개된 활성화, 또는 자가면역 질환, 예를 들면 염증의 병리학적 부위에서 MHC 클래스 Ⅱ 단백질의 발현으로 특성화되는 이상을 치료하거나 예방하기 위하여 동물, 예를 들면 사람 치료용 제약학적 조성물의 제조에 사용된다. 본 발명의 화합물 및/또는 조성물은 아래에 명시된 질환을 비롯한 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
MHC 분자는 단일 유전자 복합체 내에 인코드되는 2가지 형태, 클래스 I과 클래스 Ⅱ로 존재한다. MHC 유전자는 고도 다형성이다: 대부분의 좌위는 사람 개체군에서 최대 100개의 대립유전자를 보유한다(Hansen, T. H., et al. 1993 In"Fundamental Immunology" Ed. Paul, W. E. , RavenPress, New York, NY, p. 577).
도 1. Arg-포함 균등물(P51)과 비교하여 MHC 클래스 Ⅱ 단백질 0401에 대한 본 발명의 Gpg(구아닐피페리디닐 글리신)-포함 헵타머 화합물(P53)의 향상된 결합. 공개된 선도 펩티드(P3; Falcioni et al 1999; Nature Biotech 17,562-567)는 양성 대조로 이용한다. 표준 통계 소프트웨어를 이용하여, 비-선형 로지스틱 회귀 곡선은 실시예 14에 따라 발생된 복제 데이터 포인트에 적합시켰다. IC50은 상기 적합된 곡선으로부터 산정하고 상응하는 화합물에 대한 적절한 선형의 수직선(P53 실선, P51 굵은 점선, P3 가는 점선)으로 표시한다.
도 2. Arg-포함 균등물(P71)과 비교하여 MHC 클래스 Ⅱ 단백질 0401에 대한 본 발명의 Gpg-포함 테트라머 화합물(P74)의 향상된 결합. 공개된 선도 펩티드(P3; Falcioni et al 1999; Nature Biotech 17,562-567)는 양성 대조로 이용한다. 표준 통계 소프트웨어를 이용하여, 비-선형 로지스틱 회귀 곡선은 실시예 14에 따라 발생된 복제 데이터 포인트에 적합시켰다. IC50은 상기 적합된 곡선으로부터 산정하고 상응하는 화합물에 대한 적절한 선형의 수직선(P74 실선, P71 굵은 점선, P3 가는 점선)으로 표시한다.
도 3. Arg-포함 균등물(P82)과 비교하여 MHC 클래스 Ⅱ 단백질 0101에 대한 본 발명의 바람직한 Gpg(구아닐피페리디닐 글리신)-포함 테트라머 화합물(P69)의 향상된 결합. 표준 통계 소프트웨어를 이용하여, 비-선형 로지스틱 회귀 곡선은 실시예 14에 따라 발생된 복제 데이터 포인트에 적합시켰다. IC50은 상기 적합된 곡선으로부터 산정하고 상응하는 화합물에 대한 적절한 선형의 수직선(P69 실선, P82 굵은 점선)으로 표시한다.
도 4. Arg-포함 균등물(P71)과 비교하여 MHC 클래스 Ⅱ 단백질 0401에 대한 본 발명의 바람직한 Gpg(구아닐피페리디닐 글리신)-포함 테트라머 화합물(P74)의 향상된 결합. 표준 통계 소프트웨어를 이용하여, 비-선형 로지스틱 회귀 곡선은 실시예 14에 따라 발생된 복제 데이터 포인트에 적합시켰다. IC50은 상기 적합된 곡선으로부터 산정하고 상응하는 화합물에 대한 적절한 선형의 수직선(P74 실선, P71 굵은 점선)으로 표시한다.
도 5. Arg-포함 균등물(P98)과 비교하여 MHC 클래스 Ⅱ 단백질 0401에 대한 본 발명의 바람직한 Gpg(구아닐피페리디닐 글리신)-포함 테트라머 화합물(P101)의 향상된 결합. 표준 통계 소프트웨어를 이용하여, 비-선형 로지스틱 회귀 곡선은 실시예 14에 따라 발생된 복제 데이터 포인트에 적합시켰다. IC50은 상기 적합된 곡선으로부터 산정하고 상응하는 화합물에 대한 적절한 선형의 수직선(P101 실선, P98 굵은 점선)으로 표시한다.
도 6. Arg-포함 균등물(P43)과 비교하여 LG2 세포의 표면에서 발현되는 MHC 클래스 Ⅱ 단백질에 대한 본 발명의 Gpg(구아닐피페리디닐 글리신)-포함 헵타머 화합물(P47)의 향상된 결합. 표준 통계 소프트웨어를 이용하여, 비-선형 로지스틱 회귀 곡선은 실시예 15에 따라 발생된 복제 데이터 포인트에 적합시켰다. IC50은 상기 적합된 곡선으로부터 산정하고 상응하는 화합물에 대한 적절한 선형의 수직선(P47 실선, P43 굵은 점선)으로 표시한다.
도 7. Arg-포함 균등물(P71)과 비교하여 Priess 세포의 표면에서 발현되는 MHC 클래스 Ⅱ 단백질에 대한 본 발명의 Gpg(구아닐피페리디닐 글리신)-포함 테트라머 화합물(P74)의 향상된 결합. 표준 통계 소프트웨어를 이용하여, 비-선형 로지스틱 회귀 곡선은 실시예 15에 따라 발생된 복제 데이터 포인트에 적합시켰다. IC50은 상기 적합된 곡선으로부터 산정하고 상응하는 화합물에 대한 적절한 선형의 수직선(P74 실선, P71 굵은 점선)으로 표시한다.
도 8. 쥐 혈장에서 24시간후 Arg-포함 균등물과 비교하여 본 발명의 Gpg-포함 헵타머와 테트라머 화합물의 향상된 안정성(임의 단위). 상응하는 Gpg/Arg 화합물에 대한 데이터는 인접한 막대로 표시한다.
도 9. Arg-포함 펩티드(P51)와 비교하여 본 발명의 바람직한 (Gpg-포함) 헵타머 화합물 P53의 T-세포 활성화 분석에 의한 측정에서 향상된 면역억제 특성을입증하는 용량-반응 곡선. 표준 통계 소프트웨어를 이용하여, 비-선형 로지스틱 회귀 곡선은 실시예 19에 따라 발생된 복제 데이터 포인트에 적합시켰다. IC50은 상기 적합된 곡선으로부터 산정하고 상응하는 화합물에 대한 적절한 선형의 수직선(P53 실선, P51 굵은 점선)으로 표시한다.
도 10. 본 발명의 바람직한 화합물 (a) P69, (b) P101, (c) P74, (d) P53의 T-세포 활성화 분석에 의한 측정에서 향상된 면역억제 특성을 입증하는 용량-반응 곡선.
도 11. Arg-포함 펩티드(P40-1)(다이아몬드와 실선)와 비교하여 본 발명의 헵타머 화합물 P41-1(Gpg-포함)(정사각형과 굵은 점선)의 IL-2 분비에 의한 측정에서 향상된 면역억제 특성을 입증하는 용량-반응 곡선.
도 12. Arg-포함 펩티드(P82)와 비교하여 본 발명의 바람직한 테트라머 화합물 P69(Gpg-포함)의 IL-2 분비에 의한 측정에서 향상된 면역억제 특성을 입증하는 용량-반응 곡선. 표준 통계 소프트웨어를 이용하여, 비-선형 로지스틱 회귀 곡선은 실시예 20에 따라 발생된 복제 데이터 포인트에 적합시켰다. IC50은 상기 적합된 곡선으로부터 산정하고 상응하는 화합물에 대한 적절한 선형의 수직선(P69 실선, P82 굵은 점선)으로 표시한다.
도 13. DMSO 대조(다이아몬드와 가는 점선)와 비교하여 본 발명의 바람직한 헵타머 화합물 P53(Gpg-포함)(정사각형과 실선)의 IL-2 분비에 의한 측정에서 향상된 면역억제 특성.
도 14. Arg-포함 균등물(P82)과 비교하여 본 발명의 바람직한 테트라머 화합물 P69(Gpg-포함)의 우수한 생체내 면역억제 특성.
도 15. T-세포 증식에 의한 측정에서, 항원과의 동시-면역화이후 본 발명의 바람직한 테트라머와 헵타머 화합물의 생체내 면역억제 특성.
도 16. 류머티스 관절염의 CIA 생쥐 모델에서, 대조 용매와 비교하여 본 발명의 바람직한 테트라머와 헵타머 화합물(P69, P53, P74)의 효능.
도 17. 다발성 경화증의 EAE 생쥐 모델에서, 대조 용매와 비교하여 본 발명의 바람직한 테트라머와 헵타머 화합물(P69, P53, P74)의 효능.
도 18. 다발성 경화증의 EAE 생쥐 모델에서, 대조 용매와 비교하여 본 발명의 바람직한 테트라머와 헵타머 화합물(P69와 P53)의 효능.
도 19. 다발성 경화증의 EAE 생쥐 모델에서, 등가의 Arg-포함 화합물(P82)과 비교하여 본 발명의 바람직한 Gpg-포함 화합물(P69)의 우수한 효능.
I. 도입
본 발명은 자가면역 질환의 치료 또는 예방에서처럼 클래스 Ⅱ-매개된 T 세포 활성화를 저해함으로써 원치않는 면역활성을 억제하는데 사용될 수 있는 화합물, 예를 들면 펩티드유사 화합물에 관한다. 특정 구체예에서, 이들 화합물은 클래스 Ⅱ 분자에 대한 결합, 자가 항원의 결합을 예방하거나 클래스 Ⅱ 분자에 이미 결합된 자가 항원을 제거하는 능력 및/또는 대안적 작용 방식으로 클래스 Ⅱ MHC 한정된 면역 반응을 조절함으로써 T 세포 활성화를 저해하는 능력으로 특성화된다.이런 구체예에서, 본 발명의 화합물은 "저해물질", "저해제", "펩티드유사물질"("헵타머"와 "테트라머"화합물 포함), "본 발명의 화합물" 또는 "본 발명의 저해물질"이라고 한다. 특정 구체예에서, 바람직한 클래스 Ⅱ 분자는 DR 아이소타입이다. 바람직한 구체예에서, 이런 저해물질은 소형 분자, 예를 들면 2000 amu 미만, 적절하게는 1000 amu 미만, 좀더 적절하게는 700 미만 amu의 분자량을 갖는 화합물이다.
클래스 Ⅱ MHC 활성을 저해하는 본 발명의 화합물은 다양한 클래스 Ⅱ MHC-관련된 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 본 발명의 화합물은 바람직하지 않거나 부적절한 면역활성을 수반하는 면역 질환의 치료를 위하여 환자에 투여되거나, 또는 치료 약물을 제조하는데 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 저해물질의 효과량은 인슐린-의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 류머티스 관절염 등을 완화하거나 예방하기 위한 치료에 사용될 수 있다. 바람직하지 않거나 부적절한 MHC 활성을 수반하는 질환, 예를 들면 자가면역 질환의 치료에서 본 발명에 따른 화합물의 효과량은 일상적인 안전성 연구, 독성 연구, 용량 농도 연구, 연속되거나 반복된 전달 방법, 예를 들면 거환을 고려하여 당해 분야에 공지된 표준 수단으로 결정할 수 있다. 특정 구체예에서, 대략 0.01 내지 500 ㎎/㎏의 용량을 투여할 수 있다.
Ⅱ. 정의
본 명세서에서"MHC 활성"은 예로써 T 세포를 활성화시킴으로써 면역 반응을 촉진하는 MHC 분자의 능력을 의미한다. MHC 활성의 저해물질은 이런 활성을 억제할 수 있고, 따라서 MHC에 의한 T 세포의 활성화를 저해한다. 바람직한 구체예에서,본 발명의 저해물질은 특정 클래스 Ⅱ MHC 아이소타입 또는 할로타입에 의한 활성화를 선택적으로 저해한다. 이런 저해물질은 생물체에서 MHC 활성을 간섭하지 않으면서 바람직하지 않은 특정 MHC 활성을 억제하고, 따라서 동물의 전반적인 면역반응을 약화시키지 않으면서 동물, 예를 들면 포유동물, 특히 사람에서 원치않는 면역반응을 선택적으로 치료할 수 있다. 이런 원치않는 면역반응은 류머티스 관절염 또는 다발성 경화증과 같은 특정 질환과 연관된 면역반응이다.
용어"프로드러그(prodrug)"는 생리학적 조건하에서 본 발명의 저해제로 전환되는 화합물을 포괄한다. 프로드러그를 제조하는 통상의 방법은 목적하는 생물학적 활성 약물을 제공하도록 생리학적 조건하에서 가수분해되는 부분을 선택하는 것이다. 다른 구체예에서, 프로드러그는 환자 또는 표적 병원균의 효소 활성에 의해 전환된다. 본 명세서에서"치료"는 예로써 질환의 심각도를 감소시키거나, 또는 질환의 효과, 예를 들면 한가지이상 증상을 완화시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 분자 화학종과 관련하여"소수성"은 분할 실험에서 연구중인 분자 화학종의 대다수 분자가 수층보다는 유기층에 존재한다는 것을 의미한다. 적절하게는, 대략 55%, 75%, 85% 이상, 또는 95% 초과의 분자가 유기층에 존재한다. 이런 분할 실험에 적합한 유기 용매는 당업자에게 공지되어 있는데, 이의 무제한적 예는 옥탄올, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 클로로포름이다. 기능기 또는 잔기와 관련하여 소수성은 분자 화학종에 구조적으로 추가되면 이들 화학종의 소수성을 증가시키는 기능기 또는 잔기의 특성을 의미한다.
본 명세서에서"예방"은 질환의 한가지이상 증상의 발생을 지연시키거나 미리차단하는 것을 의미한다.
용어"IC50"은 예로써 세포 사멸의 빈도를 50% 감소시키거나, MHC Ⅱ 펩티드에 대한 경쟁 펩티드의 결합을 50% 감소시키거나, 또는 활성, 예를 들면 T-세포 증식 또는 IL-2 분비의 수준을 50% 감소시킴으로써 활성 또는 특성을 50% 저해하는 약물의 농도를 의미한다.
용어"ED50"은 최대 반응이나 효과의 50%를 유도하는 약물의 용량을 의미한다. 대안으로, 이는 검사 피험자 또는 제형의 50%에서 예정된 반응을 유도하는 용량을 의미한다.
용어"LD50"은 검사 피험자의 50%에서 치사성인 약물의 용량을 의미한다.
용어"치료지수"는 LD50/ED50으로 정의되는 약물의 치료지수를 의미한다.
용어"환자"는 동물, 바람직하게는 사람뿐만 아니라 가축과 다른 수의 피험자를 비롯한 포유류를 의미한다.
용어"구조-활성 관계" 또는"SAR" 은 약물의 분자 구조 변경이 이들과 수용체, 효소 등과의 상호작용을 변경시키는 방식을 의미한다.
"소형 분자"는 대략 2000 amu 미만, 적절하게는 대략 1000 amu 미만, 좀더 적절하게는 대략 700 미만 amu의 분자량을 갖는 화합물을 의미한다.
용어"지방족"은 직쇄, 분지쇄 또는 환형 알칸, 알켄 또는 알킨을 의미한다. 특정 구체예에서, 본 발명에서 지방족 기는 직쇄 또는 분지쇄이고 대략 1 내지 20개 탄소 원자를 보유한다.
용어"알킬"은 직쇄 알킬기, 분지쇄 알킬기, 사이클로알킬 (지방족환형)기, 알킬 치환된 사이클로알킬기 및 사이클로알킬 치환된 알킬기를 비롯한 포화 지방족기의 라디칼을 지칭한다. 바람직한 구체예에서는, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 골격에서 30개 이하의 탄소 원자(예, 직쇄인 경우에는 C1-C30, 분지쇄인 경우에는 C3-C30), 적절하게는 20개 이하의 탄소 원자를 보유한다. 유사하게, 사이클로알킬은 고리 구조에서 3 내지 10개의 탄소 원자, 적절하게는 5, 6 또는 7개의 탄소 원자를 보유한다.
더 나아가, 용어"알킬"(또는"저급 알킬")은"치환되지 않은 알킬"과"치환된 알킬" 모두를 포함하는데, 후자는 탄화수소 골격의 하나 이상의 탄소에서 수소를 대체하는 치환체를 갖는 알킬 부분을 의미한다. 이런 치환체에는 예로써, 할로겐, 하이드록실, 카르보닐(예: 카르복실, 알콕시카르보닐, 포밀 또는 아실), 티오카르보닐(예: 티오에스테르, 티오아세테이트 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설프하이드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 헤테로사이클릴, 아르알킬, 또는 방향족이나 헤테로 방향족 부분이 포함된다. 당해 분야의 평균적 기술자는 탄화수소 사슬에서 치환된 부분이 경우에 따라 자체로써 치환될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 가령, 치환된 알킬의 치환체에는 치환된 및 치환되지 않은 형태의 아미노, 아지도, 이미노, 아미도, 포스포릴(포스포네이트 및 포스피네이트 포함), 설포닐(설페이트, 설폰아미도, 설파모일 및 설포네이트 포함) 및 실릴기뿐만 아니라 에테르, 알킬티오, 카르보닐(케톤, 알데하이드, 카르복실레이트 및 에스테르 포함), -CF3, -CN 등이 포함된다. 전형적인 치환된 알킬은 아래에 기술한다. 사이클로알킬은 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 카르보닐-치환된 알킬, -CF3, -CN 등에 의해 추가로 치환될 수 있다.
'Ci 알킬'은 i개 원자를 보유하는 알킬 사슬이다. 가령, C4 알킬은 4개의 탄소 원자를 보유한다. C4 알킬은 포화되거나 1-2개의 이중 결합(cis 또는 trans) 또는 하나의 삼중 결합으로 불포화된다. 바람직한 C4 알킬은 포화된다. 바람직한 불포화된 C4 알킬은 하나의 이중 결합을 보유한다. C4 알킬은 치환되지 않거나 1-2개의 치환체로 치환될 수 있다. 바람직한 치환체에는 저급 알킬, 저급 헤테로알킬, 시아노, 할로, 할로알킬이 포함된다.
'헤테로알킬'은 탄소 원자 및 적어도 하나의 헤테로원자를 보유하는 포화되거나 불포화된 사슬인데, 여기서 헤테로원자는 서로 인접하지 않는다. 헤테로알킬 사슬은 고리에서 1 내지 18개, 적절하게는 1 내지 12개, 좀더 적절하게는 1 내지 6개, 가장 적절하게는 1 내지 4개의 원자(탄소와 헤테로원자)를 보유한다. 헤테로알킬 사슬은 직쇄 또는 분지쇄이다. 바람직한 분지쇄 헤테로알킬은 1-2개의 분지, 적절하게는 하나의 분지를 보유한다. 바람직한 헤테로알킬은 포화된다. 불포화된 헤테로알킬은 하나이상의 이중 결합 및/또는 하나이상의 삼중 결합을 보유한다. 바람직한 불포화된 헤테로알킬은 1-2개의 이중 결합 또는 하나의 삼중 결합, 적절하게는 하나의 이중 결합을 보유한다. 달리 명시하지 않는 경우에 헤테로알킬 사슬은치환되지 않거나 1 내지 4개의 치환체로 치환된다. 바람직한 헤테로알킬 치환체에는 할로, 아릴(예, 페닐, 톨릴, 알콕시페닐, 알콕시카르보닐페닐, 할로페닐), 헤테로사이클릴, 헤테로아릴이 포함된다. 가령, 아래의 치환체로 치환되는 알킬 사슬은 헤테로알킬이다: 알콕시(예, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 펜톡시), 아릴옥시(예, 페녹시, 클로로페녹시, 톨릴옥시, 메톡시페녹시, 벤질옥시, 알콕시카르보닐페녹시, 아실옥시페녹시), 아실옥시(예, 프로피오닐옥시, 벤조일옥시, 아세톡시), 카르바모일옥시, 카르복시, 멀캡토, 알킬티오, 아실티오, 아릴티오(예, 페닐티오, 클로로페닐티오, 알킬페닐티오, 알콕시페닐티오, 벤질티오, 알콕시카르보닐페닐티오), 아미노(예, 아미노, 모노-와 디-C1-C3 알킬아미노, 메틸페닐아미노, 메틸벤질아미노, C1-C3 알킬아미도, 카르밤아미도, 우레이도, 구아니디노).
'Mi 알킬'은 i개 원자를 보유하는 헤테로알킬 사슬이다. 가령, M4 헤테로알킬은 인접하지 않는 1-2개의 헤테로원자를 보유한다. 1개의 헤테로원자를 보유하는 M4 헤테로알킬은 포화되거나 하나의 이중 결합(cis 또는 trans) 또는 하나의 삼중 결합으로 불포화된다. 2개의 헤테로원자를 보유하는 바람직한 M4 헤테로알킬은 포화된다. 바람직한 불포화된 M4 헤테로알킬은 하나의 이중 결합을 보유한다. M4 알킬은 치환되지 않거나 1-2개의 치환체로 치환될 수 있다. 바람직한 치환체에는 저급 알킬, 저급 헤테로알킬, 시아노, 할로, 할로알킬이 포함된다.
용어"아르알킬"은 아릴기(예: 방향족이나 헤테로 방향족 기)로 치환된 알킬기를 의미한다.
용어"알케닐" 및" 알키닐"은 길이 및 가능 치환도 측면에서 상기 언급된 알킬과 유사하지만 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 각각 보유하는 불포화 지방족 기를 의미한다.
탄소수가 달리 명시되지 않는 경우에, "저급 알킬"은 상기 정의된 바와 같지만, 골격 구조에 1개 내지 10개, 적절하게는 1개 내지 6개의 탄소 원자를 보유하는 알킬기를 의미한다. 유사하게, "저급 알케닐" 및"저급 알키닐"은 유사한 사슬 길이를 갖는다.
용어"헤테로 원자"는 탄소 또는 수소 이외의 임의 원소의 원자를 의미한다. 전형적인 헤테로 원자는 붕소, 질소, 산소, 인, 황 또는 셀레늄, 적절하게는 산소, 질소 또는 황이다.
용어"아미노산"은 적절하게는 동일한 탄소 원자 또는 인접한 탄소 원자, 좀더 적절하게는 동일한 탄소 원자에 부착된 카르복실기와 아미노기 모두를 보유하는 유기 화합물을 의미한다. 전형적인 아미노산은 자연에서 발견되는 아미노산, 예를 들면 세포에서 단백질을 합성하는데 사용되는 아미노산이지만, 실시예 또는 당해 분야에 공지된 비-고유 아미노산 역시 사용될 수 있다. "아미노산 잔기"는 아미노산 유도체를 의미하는데, 여기서 아미노기와 카르복실산기중 하나 또는 둘 모두 다른 부분과 결합하여 예로써 아마이드, 티오아마이드, 설폰아마이드 등을 형성한다.
용어"아미노산 유사체"에는 아미노산-유사 분자 또는 이의 잔기가 포함되는데, 여기서 카르복실산기의 카르보닐은 다른 친전자성 부분, 예를 들면 티오카르보닐 또는 설포닐 기로 치환된다. 상기 용어에는 디펩티드 유사체, 예를 들면 하기에 기술된 [SΨ(oxaz)L]과 [SΨ(imid)L] 부분 및 내부 아마이드 결합이 알칸으로 치환된 디펩티드 유사체 역시 포함된다. 본 발명에 사용하기 적합한 다른 아미노산 유사체는 당업자에게 널리 알려져 있다. 하나이상의 아미노산 유사체를 보유하는 본 발명의 저해물질과 같은 화합물은"펩티드유사물질" 또는"유사" 화합물이라 한다.
용어"아릴"에는 0 내지 4개의 헤테로 원자를 보유하는 5-, 6- 또는 7-원 단일-환 방향족기가 포함되는데, 예를 들면, 벤젠, 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진 및 피리미딘 등이다. 또한, 고리 구조에 헤테로원자를 보유하는 아릴기는"아릴 헤테로사이클" 또는"헤테로 방향족"이라 한다. 방향족 고리는 하나 이상의 고리 위치에서 앞서 기술된 치환체, 예를 들면, 할로겐, 아지드, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 하이드록실, 알콕실, 아미노, 니트로, 설프하이드릴, 이미노, 아미도, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 설포닐, 설폰아미도, 케톤, 알데하이드, 에스테르, 헤테로사이클릴, 방향족이나 헤테로 방향족 부분, -CF3, -CN 등으로 치환될 수 있다. 용어"아릴"에는 둘 이상의 탄소가 2개의 인접한 고리(이들 고리는"융합된 고리"이다)에 공통으로 존재하는 둘 이상의 환형 고리를 보유하는 폴리환형 고리 시스템이 포함되는데, 여기서 이들 고리 중의 적어도 하나는 방향족이다, 예를 들면, 다른 환형 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴 및/또는 헤테로사이클릴이다.
용어 오르토, 메타, 파라는 각각 1,2-, 1,3-, 1,4-이치환된 벤젠에 적용된다. 가령, 1,2-디메틸벤젠과 오르토-디메틸벤젠은 동의어이다.
용어"헤테로사이클릴" 또는"헤테로환형 기"는 고리 구조가 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 4- 내지 10-원 고리 구조, 적절하게는 3- 내지 7-원 고리를 지칭한다. 헤테로사이클은 폴리사이클일 수도 있다. 헤테로사이클릴 기에는 예로써, 티오펜, 티안트렌, 푸란, 피란, 이소벤조푸란, 크로멘, 산텐, 페녹사틴, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 이소티아졸, 이속사졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 이소인돌, 인돌, 인다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프티리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 퀴놀린, 프테리딘, 카바졸, 카볼린, 페난트리딘, 아크리딘, 피리미딘, 페난트롤린, 페나진, 페나르사진, 페노티아진, 푸라잔, 페녹사진, 피롤리딘, 옥솔란, 티올란, 옥사졸, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린, 락톤, 락탐, 예를 들면, 아제티디논과 피롤리디논, 설탐, 설톤 등이 포함된다. 이런 헤테로환형 고리는 하나 이상의 위치에서 앞서 기술된 치환체, 예를 들면, 할로겐, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 하이드록실, 아미노, 니트로, 설프하이드릴, 이미노, 아미도, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 설포닐, 케톤, 알데하이드, 에스테르, 헤테로사이클릴, 방향족이나 헤테로 방향족 부분, -CF3, -CN 등으로 치환될 수 있다.
용어"폴리사이클릴" 또는"폴리환형 기"는 둘 이상의 탄소가 2개의 인접한 고리(예, 이들 고리는"융합된 고리"이다)에 공통으로 존재하는 둘 이상의 고리(예, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴 및/또는 헤테로사이클릴)를 의미한다. 인접하지 않은 원자를 통하여 연결되는 고리는"가교된" 고리이다. 폴리사이클의 각 고리는 앞서 기술된 치환체, 예를 들면, 할로겐, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 하이드록실, 아미노, 니트로, 설프하이드릴, 이미노, 아미도, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 설포닐, 케톤, 알데하이드, 에스테르, 헤테로사이클릴, 방향족이나 헤테로 방향족 부분, -CF3, -CN 등으로 치환될 수 있다.
용어"카르보사이클"은 고리의 각 원자가 탄소인 방향족 또는 비-방향족 고리를 의미한다.
용어"니트로"는 -NO2를 의미하고; 용어"할로겐"은 -F, -Cl, -Br 또는 -I를 의미하며; 용어"설프하이드릴"은 -SH를 의미하고; 용어"하이드록실"은 -OH를 의미하며; 용어" 설포닐"은 -SO2 -를 의미한다.
용어" 아민" 및" 아미노"는 당해 분야에 공지되어 있고, 치환된 및 치환되지 않은 아민, 예를 들면 아래의 화학식으로 대표되는 부분을 의미한다:
R50, R51, R52는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, -(CH2)m-R61이거나, 또는 R50과 R51이 N 원자와 결합하여 고리 구조에 4 내지 8개 원자를 보유하는 헤테로사이클을 형성하고; R61은 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 헤테로사이클 또는폴리사이클이고; m은 0 또는 1 내지 8의 정수이다. 특정 구체예에서, R50또는 R51중 하나만 카르보닐인데, 예를 들면, R50, R51및 질소 원자가 서로 결합하여 이미드를 형성하지 않는다. 다른 구체예에서 R50및 R51(및 임의로 R52)이 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐 또는 -(CH2)m-R61을 나타낸다. 따라서, 용어"알킬아민"은 치환되거나 치환되지 않은 알킬이 부착되어 있는 앞서 정의된 아민 기, 다시 말하면 R50및 R51중의 적어도 하나가 알킬기인 아민기를 의미한다.
용어"아실아미노"는 당해 분야에 공지되어 있고, 아래의 화학식으로 대표되는 부분을 의미한다:
R50은 상기 정의된 바와 동일하고, R54는 수소, 알킬, 알케닐 또는 -(CH2)m-R61(여기서, m과 R61은 상기 정의된 바와 동일하다)이다.
용어"아미도"는 당해 분야에서 아미노-치환된 카르보닐로써 인식되는데, 여기에는 아래의 화학식으로 대표되는 부분이 포함된다:
R50과 R51은 상기 정의된 바와 동일하다. 본 발명에서 아미드의 특정 구체예에는 불안정 이미드가 포함되지 않는다.
용어"알킬티오"는 황 라디칼이 부착되어 있는 상기 정의된 알킬기를 의미한다. 특정 구체예에서"알킬티오"부분은 -S-알킬, -S-알케닐, -S-알키닐 및 -S--(CH2)m-R61(여기서, m과 R61은 상기 정의된 바와 동일하다) 중의 한가지이다. 대표적인 알킬티오 기는 메틸티오, 에틸티오 등이다.
용어"카르보닐"은 당해 분야에 공지되어 있는데, 여기에는 아래의 화학식으로 대표되는 부분이 포함된다:
X50은 결합이거나 산소 또는 황이고; R55는 수소, 알킬, 알케닐, -(CH2)m-R61또는 제약학적으로 허용되는 염이고; R56은 수소, 알킬, 알케닐 또는 -(CH2)m-R61(여기서, m과 R61은 상기 정의된 바와 동일하다)이다. X50이 산소이고 R55또는 R56이 수소가 아니면 상기 화학식은"에스테르"를 나타낸다. X50이 산소이고 R56이 상기 정의된 바와 동일하면 상기 화학식은 카르복실기로 정의되고, 특히 R56이 수소이면 상기 화학식은"카르복실산"을 나타낸다. X50이 산소이고 R55가 수소이면 상기 화학식은"포르메이트"를 나타낸다. 일반적으로, 상기 화학식의 산소 원자가 황으로 치환되면상기 화학식은"티오카르보닐"기를 나타낸다. X50이 황이고 R55또는 R56이 수소가 아니면 상기 화학식은"티오에스테르"를 나타낸다. X50이 황이고 R56이 수소이면 상기 화학식은"티오카르복실산"을 나타낸다. X50이 황이고 R55가 수소이면 상기 화학식은"티오포르메이트"를 나타낸다. 한편, X50이 결합이고 R55가 수소가 아니면 상기 화학식은"케톤"기를 나타낸다. X50이 결합이고 R55가 수소이면 상기 화학식은"알데하이드"기를 나타낸다.
용어"알콕실" 또는"알콕시"는 산소 라디칼이 부착되어 있는 상기 정의된 알킬기를 의미한다. 대표적인 알콕실 기는 메톡시, 에톡시, 프로필옥시, 3급-부톡시 등이다. "에테르"는 산소에 의해 공유 결합된 2개의 탄화수소이다. 따라서, 알킬을 에테르로 만드는 알킬의 치환체는 알콕실이거나 이와 유사한데, 예를 들면, -O-알킬, -O-알케닐, -O-알키닐, -O-(CH2)m-R61(여기서, m과 R61은 상기 정의된 바와 동일하다)중의 하나로 나타낼 수 있다.
용어" 설포네이트"는 당해 분야에 공지되어 있는데, 여기에는 아래의 화학식으로 대표되는 부분이 포함된다:
R57은 전자쌍, 수소, 알킬, 사이클로알킬 또는 아릴이다.
용어" 설페이트"는 당해 분야에 공지되어 있는데, 여기에는 아래의 화학식으로 대표되는 부분이 포함된다:
R57은 상기 정의된 바와 동일하다.
용어" 설폰아미도"는 당해 분야에 공지되어 있는데, 여기에는 아래의 화학식으로 대표되는 부분이 포함된다:
R50및 R56은 상기 정의된 바와 동일하다.
용어" 설파모일"은 당해 분야에 공지되어 있는데, 여기에는 아래의 화학식으로 대표되는 부분이 포함된다:
R50및 R51은 상기 정의된 바와 동일하다.
용어"설포닐"은 아래의 화학식으로 대표되는 부분을 의미한다:
R58은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이다.
용어"설폭시도"는 아래의 화학식으로 대표되는 부분을 의미한다:
R58은 상기 정의된 바와 동일하다.
유사한 치환을 알케닐 및 알키닐 기에 적용하여, 예로써 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미도알케닐, 아미도알키닐, 이미노알케닐, 이미노알키닐, 티오알케닐, 티오알키닐, 카르보닐-치환된 알케닐 또는 알키닐을 생성시킬 수 있다.
본 명세서에서 각 표현, 예를 들면, 알킬, m, n, p 등의 정의는 임의의 구조에서 1회 이상 나타나는 경우에, 동일 구조에서 독립적으로 정의된다.
"셀레노알킬"은 치환된 셀레노 기가 부착되어 있는 알킬기를 의미한다. 알킬에서 치환된 "셀레노에테르"는 -Se-알킬, -Se-알케닐, -Se-알키닐, -Se-(CH2)m-R61(여기서, m과 R61은 상기 정의된 바와 동일하다)에서 선택된다.
용어 트리플릴, 토실, 메실, 노나플릴은 당해 분야에 공지되어 있고, 각각 트리플루오르메탄설포닐, p-톨루엔설포닐, 메탄설포닐, 노나플루오르부탄설포닐 기를 의미한다. 용어 트리플레이트, 토실레이트, 메실레이트, 노나플레이트는 당해 분야에 공지되어 있고, 각각 트리플루오르메탄설포네이트 에스테르, p-톨루엔설포네이트 에스테르, 메탄설포네이트 에스테르, 노나플루오르부탄설포네이트 에스테르 기능기 및 이들 기능기를 보유하는 분자를 의미한다.
약어 Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts, Ms는 각각 메틸, 에틸, 페닐, 트리플루오로메탄설포닐, 노나플루오로부탄설포닐, p-톨루엔설포닐, 메탄설포닐을 나타낸다. 당해 분야의 숙련된 유기 화학자에 의해 이용되고 있는 약어에 관한 좀더 포괄적인 목록은 문헌[the Journal of Organic Chemistry]의 각 권의 제1판에 제시되며, 이런 목록은 전형적으로 표준 약어 목록이란 제목의 표에 제시되어 있다.
본 발명의 특정 단량체 아단위는 특정 기하 또는 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 이에 더하여, 본 발명의 올리고머는 광학적으로 활성일 수도 있다. 본 발명은 cis-와 trans-이성질체, R-과 S-거울상이성질체, 부분입체이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 이의 라세미 혼합물 및 본 발명의 범주에 속하는 다른 혼합물을 비롯한 모든 화합물을 포괄한다. 부가의 비대칭 탄소 원자가 알킬기와 같은 치환체에 존재할 수 있다. 이런 모든 이성질체 및 이들의 혼합물이 본 발명에 포함된다.
가령, 본 발명에 따른 화합물의 특정한 거울상이성질체가 요망되는 경우에, 이는 비대칭 합성, 또는 키랄 보조제로의 유도체화로 제조할 수 있는데, 여기서 생성되는 부분입체이성질체성 혼합물은 분리하고 보조기를 절단하여 목적하는 순수한 거울상이성질체를 수득한다. 대안으로, 상기 분자가 아미노와 같은 염기성 작용기, 또는 카르복실과 같은 산성 작용기를 보유하는 경우에, 적당한 광학-활성 산이나 염기를 이용하여 부분입체이성질체 염을 형성하고, 이후 이렇게 형성된 부분입체이성질체를 당해 분야에 널리 공지된 크로마토그래피 방법 또는 분획결정화로 분리하고, 후속으로 순수한 거울상이성질체를 회수한다.
"치환" 또는"치환된"이란 표현에는 이런 치환이 치환된 원자 및 치환체의 허용된 원자가(valency)를 충족하고, 이런 치환이 예로써 전위, 폐환, 제거, 가수분해 등에 의한 변형이 자발적으로 진행되지 않는 안정한 화합물을 결과하는 조건을 내포하고 있다.
용어"치환된"은 유기 화합물의 허용 가능한 모든 치환체를 포함하는 것으로 간주된다. 광의(廣義)에서 허용 가능한 치환체에는 유기 화합물의 비(非)환형 및 환형, 분지된 및 분지되지 않은, 카르보환형 및 헤테로환형, 방향족 및 비-방향족 치환체가 포함된다. 전형적인 치환체에는 앞서 기술된 것들이 포함된다. 허용 가능한 치환체는 적당한 유기 화합물에서 하나 이상이고 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명에서, 질소와 같은 헤테로원자는 수소 치환체 및/또는 이런 헤테로원자의 원자가를 충족시키는 본원에 기재된 유기 화합물의 모든 허용 가능한 치환체를 보유할 수 있다.
본 발명에서, 화학 원소는 원소 주기율표[CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87, inside cover]에서 확인한다. 또한, 본 발명에서 용어"탄화수소"는 하나 이상의 수소 원자와 하나의 탄소 원자를 보유하는 모든 허용 가능한 화합물을 포함하는 것으로 간주된다. 광의(廣義)에서, 이런 허용 가능한 탄화수소에는 치환되거나 치환되지 않은 비환형 및 환형, 분지된 및 분지되지 않은, 카르보환형 및 헤테로환형, 방향족 및 비-방향족 유기 화합물이 포함된다.
용어" 보호기"는 바람직하지 못한 화학적 변형으로부터 잠재적으로 반응성인 작용기를 보호하는 일시적인 치환체를 의미한다. 이런 보호기의 예에는 카르복실산의 에스테르, 알코올의 실릴 에테르 및 알데하이드와 케톤의 아세탈과 케탈이 각각 포함된다. 보호기 화학 분야가 고찰되었다[참조: Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed. Wiley: New York, 1991].
용어 "전자 끄는 기(electron-withdrawing group)"는 당해 분야에 공지되어 있고, 이웃한 원자로부터 원자가전자(valence electron)를 끌어당기는 치환체의 경향을 표시한다. 전자 끌기 능력의 수준 정량은 Hammett 시그마(σ) 상수로 제시한다. 널리 알려진 상기 상수는 여러 참고문헌, 예를 들면 March, Advanced Organic Chemistry 251-59, McGraw Hill Book Company, New York, (1977)에서 기술한다. 일반적으로, Hammett 상수 값은 전자 주는 기(electron-donating group)에서 음(NH2에서 σ(P) = -0.66)이고, 전자 끄는 기에서 양(니트로기에서 σ(P) = 0.78)인데, σ(P)는 파라 치환을 지시한다. 전형적인 전자 끄는 기에는 니트로, 아실, 포밀, 설포닐, 트리플루오르메틸, 시아노, 클로라이드 등이 포함된다. 전형적인 전자 주는 기에는 아미노, 메톡시 등이 포함된다.
앞서 기술된 올리고머, 아단위 및 다른 조성물의 고려된 등가물에는 이들에 상응하고 이들과 동일한 일반적인 특성(예, 생체적합성, 항신생물성)을 보유하는 화합물이 포함되는데, 여기서 이런 분자가 의도한 목적을 달성하는 효능에 부정적인 영향을 주지 않는 하나 이상의 간단한 치환체 변형이 실시된다. 일반적으로, 본발명의 화합물은 용이하게 입수 가능한 출발 물질, 시약 및 통상적인 합성 과정을 이용하여, 예로써 아래에 기재된 바와 같은 반응식에 예시된 방법, 또는 이의 변형으로 제조할 수 있다. 이들 반응에는 자체로써 공지되어 있지만 본원에 언급되지 않은 변수 역시 사용할 수 있다.
Ⅲ. 본 발명의 화합물
본 발명은 예로써 T 세포의 클래스 Ⅱ MHC-매개된 활성화를 저해함으로써 면역반응을 억제할 수 있는 펩티드유사 화합물을 제시한다. 가령, 적절한 펩티드유사물질은 화학식 I 화합물이다:
결합가(valency)와 안정성(stability)이 허용되는 경우에,
A는 부재하거나 1 내지 4개의 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기의 서열, 적절하게는 부재하고;
B는 2 내지 8개 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기, 적절하게는 2 내지 6개 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기의 서열이고;
X는 부재하거나 O, S 또는 NR이고;
W는 종결기(terminating group), 예를 들면 OR7또는 NR8R9이고;
V는 각 경우에 독립적으로 C=O, C=S 또는 SO2이고;
R은 각 경우에 독립적으로 H 또는 저급 알킬, 적절하게는 H이고;
R1은 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴 또는 헤테로사이클릴알킬 부분, 적절하게는 소수성 부분, 가장 적절하게는 1 내지 8개 탄소 원자를 보유하는 소수성 부분이고;
R2는 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴 또는 헤테로사이클릴알킬 부분, 적절하게는 소수성 부분이거나, 또는 R2와 R이 서로 결합하여 1 내지 5개 치환체로 임의의 치환된 5 내지 7원 고리를 형성하거나 한가지 이상의 다른 고리, 예를 들면 아릴, 헤테로사이클릴 또는 카르보사이클릴 고리를 보유하는 폴리환형 구조, 예를 들면 융합된 이중환을 형성하고;
R3은 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴 또는 헤테로사이클릴알킬 부분, 적절하게는 염기성 질소 원자를 보유하는 부분(예, 생리 조건하에 양성자를 얻거나 짝산(conjugate acid)이 수용액에서 6 내지 12, 적절하게는 7 내지 10의 pKa를 갖는 부분)이고;
R7, R8, R9는 각각 독립적으로 H 및 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬에서 선택되는 치환체이거나, 또는 R8과 R9가 서로 결합하여 1 내지 5개 치환체로 임의의 치환된 5 내지 7원 고리를 형성하거나 한가지 이상의 다른 고리, 예를 들면 아릴, 헤테로사이클릴 또는 카르보사이클릴 고리를 보유하는 폴리환형 구조를 형성한다.
본 발명은 예로써 T 세포의 클래스 Ⅱ MHC-매개된 활성화를 저해함으로써 면역반응을 억제할 수 있는 펩티드유사 화합물을 제시한다. 가령, 적절한 펩티드유사물질은 화학식 Ⅱ 화합물이다:
결합가(valency)와 안정성(stability)이 허용되는 경우에,
A는 부재하거나 1 내지 4개의 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기의 서열, 적절하게는 부재하고;
B는 2 내지 8개 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기, 적절하게는 2 내지 6개 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기의 서열이고;
X는 부재하거나 O, S 또는 NR이고;
W는 OR7또는 NR8R9이고;
V는 각 경우에 독립적으로 C=O, C=S 또는 SO2이고;
R은 각 경우에 독립적으로 H 또는 저급 알킬, 적절하게는 H이고;
R1은 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴 또는 헤테로사이클릴알킬 부분, 적절하게는 소수성 부분, 가장 적절하게는 1 내지 8개 탄소 원자를 보유하는 소수성 부분이고;
R2는 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴 또는 헤테로사이클릴알킬 부분, 적절하게는 소수성 부분이거나, 또는 R2와 R이 서로 결합하여 1 내지 5개 치환체로 임의의 치환된 5 내지 7원 고리를 형성하거나 한가지 이상의 다른 고리, 예를 들면 아릴, 헤테로사이클릴 또는 카르보사이클릴 고리를 보유하는 폴리환형 구조, 예를 들면 융합된 이중환을 형성하고;
i는 0-1의 정수, 적절하게는 0이고;
j는 1-2의 정수, 적절하게는 1이고;
k는 1-3의 정수, 적절하게는 2이고;
R6은 부재하거나, 또는 질소-보유 고리에서, 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬, 할로알킬, 할로겐, 하이드록실, 아미노에서 선택되는 1-4개 치환체이고;
R7, R8, R9는 각각 독립적으로 H 및 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬에서 선택되는 치환체이거나, 또는 R8과 R9가 서로 결합하여 1 내지 5개 치환체로 임의의 치환된 5 내지 7원 고리를 형성하거나 한가지 이상의 다른 고리, 예를 들면 아릴, 헤테로사이클릴 또는 카르보사이클릴 고리를 보유하는 폴리환형 구조를 형성한다.
화학식 I의 특정 구체예에서, R3은 아르기닌이나 리신의 측쇄 또는 아래 화학식의 측쇄이다:
i, j, k, R6은 화학식 Ⅱ에서 정의된 바와 동일하다. 화학식 I의 특정 구체예에서 R3은 예로써 고리에 포함되거나 고리에 부착되거나 사슬에 포함되거나 사슬의 말단에 부착된 구아니딘 또는 구아니디늄 부분이다. 화학식 I의 특정 구체예에서 R3은 사이클로알킬, 알킬 또는 아미노알킬, 예를 들면 리신, 시트룰린, 오르니틴의 N-메틸과 N,N-디메틸 변이체를 비롯한 알로-이소루이신, 사이클로헥실글리신, 시트룰린, 리신 또는 오르니틴의 측쇄이다.
화학식 I의 특정 구체예에서 B는 2개의 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기이고, W는 하기에 좀더 구체적으로 기술된 종결기이다. 적절하게는, 아미노산이나 유사체 잔기는 이차 아마이드 결합을 통하여 부착된다(즉, 질소가 하나의 수소 치환체를 보유한다).
화학식 Ⅱ의 특정 구체예에서 R6은 부재하고, 다른 구체예에서 R6은 저급 알킬 치환체이다.
화학식 I과 Ⅱ의 특정 구체예에서, R2는 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 아릴 또는 아르알킬이다.
화학식 I과 Ⅱ의 특정 구체예에서 B의 제 1 잔기(V에 부착된 아미노산이나 유사체 잔기)는 H 또는, 적절하게는 C1-C8 알킬 또는 M1-M8 헤테로알킬(예로써 알라닌, Acm-시스틴, Prm-시스테인, 아세틸-시스테인, Nva, 예를 들면 C1-C6 알킬 또는 M1-M6 헤테로알킬 포함), 또는 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로알킬(예, 메틸페닐 또는 페닐메틸)인 측쇄를 보유하거나; 또는 B의 제 1 잔기는 C=O, C=S 또는 SO2기를 보유하고 벤젠 고리(예, Tic, azaTic, Disc, Thiq 등)에 임의로 융합된 5-8원 질소-보유 헤테로사이클릴 고리를 보유하는 아미노산 유사체이다. 상기 위치에서 바람직한 잔기는 Tic와 Disc이지만, 표 1-3의 실례에서 상기 위치에 이용된 임의의 잔기가 상기 위치에 존재할 수도 있다.
화학식 I과 Ⅱ의 특정 구체예에서 B의 제 2 잔기(제 1 잔기를 통하여 V에 부착된 아미노산이나 유사체 잔기)는 H, 또는 적절하게는 C1-C6 알킬, M1-M6 헤테로알킬 또는 사이클로알킬, 좀더 적절하게는 분지되거나 분지되지 않은 C3-C5 알킬또는 M3-M5 헤테로알킬, 또는 사이클로알킬인 측쇄를 보유한다. 전형적인 잔기에는 글리신, 이소루이신, Nle, Chg, Met(O)(산화된 메티오닌), 알파-아미노이소부틸산 등이 포함된다. 특정 구체예에서, B의 제 2 잔기는 Odapdc 또는 Haic 잔기에서처럼 디펩티드와 실질적으로 등척성인 잔기이다. 상기 위치에서 바람직한 잔기는 Met와 Nle이지만, 표 1-3의 실례에서 상기 위치에 이용된 임의의 잔기가 상기 위치에 존재할 수도 있다.
화학식 I과 Ⅱ의 특정 구체예에서 R과 R2는 서로 결합하여 고리를 형성하지 않는다. R과 R2가 서로 결합하여 고리를 형성하는 구체예에서, 상기 고리는 적절하게는 6- 또는 7-원 고리, 또는 치환된(예, 이중환) 5-원 고리이다.
화학식 I과 Ⅱ의 특정 구체예에서 R1XV는 서로 결합하여 알카노일, 알케노일, 아릴 카르보닐 또는 아미노알카노일 기를 나타낸다. 이런 특정 구체예에서, 아실기는 벤조일 기, 저급 알카노일 기 또는 저급 아미노알카노일 기, 예를 들면 아세틸, 프로파노일, 아미노프로파노일 또는 아미노부타노일 기이다.
화학식 I과 Ⅱ의 특정 구체예에서 B는 2 내지 6개 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기, 적절하게는 2 내지 5개 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기이다. B가 4개 이하, 적절하게는 3개 이하의 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기인 특정 구체예에서 W는 종결기이다. 전형적인 종결기는 표 1(a, b, c)에 제시하는데, 여기에는 H 및 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 적절하게는 H 및 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬에서 선택되는 치환체를 보유하는 질소 원자(예, B의 말단 카르복실과 아마이드를 형성하는 질소 원자)가 포함된다. 적절한 치환체에는 하이드록실, 에테르, 아미노 치환체 등이 포함된다. 적절하게는, 종결기는 B에 부착된 질소를 보유하는 6개 이상의 비-수소 원자, 적절하게는 적어도 8개 비-수소 원자이다. 적절하게는, 종결기 W는 벤질 또는 페네틸 치환체와 같은 아르알킬이나 헤테로아르알킬 치환체로 치환된 질소이다. 이런 특정 구체예에서 질소는 H, 저급 알킬, 하이드록시-저급 알킬, 하이드록시-저급 알킬-O-저급 알킬에서 선택되는 2차 치환체를 보유한다. 특정 구체예에서 종결기 W는 질소-보유 헤테로사이클릴 치환체, 적절하게는 고리의 질소 원자를 통하여 B에 부착된 아릴이나 헤테로아릴 고리와 융합된 치환체이다. 이런 종결기에는 테트라하이드로이소퀴놀린, 인돌린, 이소인돌린, 모르폴린, 피페리딘 등이 포함된다.
화학식 I과 Ⅱ의 특정 구체예는 예로써 R1또는 W, 적절하게는 R7, R8또는 R9의 적절한 선택으로, 생리 조건하에 본 발명의 활성 화합물로 전환되는 프로드러그를 제시한다. 가령, W가 에스테르의 일부인 경우에, 상기 에스테르는 생리 조건하에 절단될 수 있다.
화학식 I과 Ⅱ의 특정 구체예에서, R1, R7, R8또는 R9중 적어도 하나, 적절하게는 R8또는 R9는 소수성 잔기이다. 다른 구체예에서, 예로써 Meyan et al, 1995(J. Pharm Sci. 84: 83-92)의 방법을 이용한 평가에서 본 발명에 따른 화합물의 소수성은 대략 2.0 내지 6.0, 적절하게는 3.0 내지 6.0, 가장 적절하게는 4.0 내지 5.5의 cLogP에 위치한다. 하지만, 이런 범위를 벗어나는 cLogP 값을 갖는 화합물, 예를 들면 대략 3.0 내지 4.0의 cLogP를 갖는 화합물 역시 본 발명의 범주에 속한다.
화학식 I과 Ⅱ의 특정 구체예에서, A와 B는 서로 결합하여 2 내지 8개, 예를 들면 3 내지 6개 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기를 보유한다. 적절하게는, A와 B는 서로 결합하여 대략 2 내지 5개 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기를 보유한다.
B와 (VCHR2)가 측면에 접하지만 이들을 포함하지 않는 화학식 I과 Ⅱ 영역은 '아르기닌-유사'잔기라고 한다. i가 0이고, j가 1이고, k가 2인 구체예에서 아르기닌-유사 잔기는 Gpg 잔기(구아닐피페리디닐 글리신)라고 한다. 이런 잔기는 당해 분야에 공지되어 있고, PCT 출원 WO 00/78796 및 여기에 언급된 참고문헌에서 기술한다. 바람직한 구체예에서, 아르기닌-유사 잔기는 아미노산의 알파 입체중심에서 S-배열이 풍부하다, 적절하게는 이런 잔기에서 S-거울상이성질체는 적어도 60%, 75%, 85%, 90%, 또는 95% 이상이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 저해물질은 아르기닌-유사 잔기가 아르기닌으로 치환된 유사 펩티드 화합물과 비교하여 증가된 안정성, 예를 들면 적어도 1.25, 1.5, 3배, 적절하게는 적어도 5배 증가된 혈장 반감기(plasma half-life) 및 MHC 클래스 Ⅱ 분자(예, 0401, 0101 또는 0404)와 적어도 1.25, 1.5, 적절하게는 3배 증가된 결합 친화성을 보인다.
본 발명에 유용한 아르기닌-유사 잔기를 기술하는 다른 참고문헌은 아래와 같다: International Applications No. WO 99/61476과 WO 01/27141, Jones et al., Bioorg Med. Chem. Lett. 1999, 9, 2109-2114; Cunningham et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7, 19-24; Hanson et al., Bioorg. Med.Chem. Lett. 1996, 6, 1931-1936; Jones et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 2115-2118, Tamura et al., Bioorg Med. Clienz. Lett. 2000, 10, 745-49, Falcioni et al., 1999, Nature Biotech 17, 562-567; Schmidt et al., Proc. Am. Pept. Symp., 16th (2000), Meeting Date 1999,634-635.
화학식 I과 Ⅱ의 특정 구체예에서 A 및/또는 B의 아미노산은 US Patent No. 6,495,526에 기술된 세포간 폴리펩티드 서열을 보유한다. 상기 세포간 폴리펩티드 서열은 예로써 안테펜네페디아(antepennepedia) 단백질, HIV 트랜스활성화(TAT) 단백질, 마스토파란(mastoparan), 멜리틴(melittin), 봄볼리틴(bombolittin), 델타 용혈소(delta hemolysin), 파르닥신(pardaxin), 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin) A, 클라트린(clathrin), 디프테리아 독소, C9 보체 단백질 또는 이들의 단편에서 선택되는 폴리펩티드로부터 유래된 내화 펩티드(internalizing peptide)이다.
한 구체예에서, 내화 펩티드는 초파리 안테펜네페디아 단백질 또는 이의 상동체로부터 유래된다. 호메오-단백질 안테펜네페디아의 60개 아미노산 길이 호메오도메인(homeodomain)은 생물막을 통하여 전위하고, 결합된 이질성 폴리펩티드의 전위를 촉진하는 것으로 밝혀졌다(참조: Derossi et al. (1994) J Biol Chem 269:10444-10450; Perez et al. (1992) J Cell Sci 102: 717- 722). 최근에, 상기 단백질의 16개 정도의 아미노산 단편이 내재화(internalization)를 유도하는데 충분한 것으로 밝혀졌다(참조: Derossi et al. (1996) J Biol Chem 271: 18188-18193). 본 발명에서는 화학식 I이나 Ⅱ의 펩티드 또는 펩티드유사물질에 안테펜네페디아 단백질의 적어도 일부를 결합시켜, 화합물 단독과 비교하여 상기 화합물의 막통 전달을 통계학적으로 유의하게 증가시키는 전략을 고려한다.
내화 펩티드의 다른 예는 HIV 트랜스활성인자(TAT) 단백질이다. 상기 단백질은 4개의 도메인으로 분할된다(Kuppuswamy et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 3551-3561). 정제된 TAT 단백질은 조직 배양액에서 세포에 의해 흡수되고(Frankel and Pabo, (1989) Cell 55 : 1189-1193), TAT의 잔기 37-62에 상응하는 단편과 같은 펩티드는 시험관내에서 세포에 의해 신속하게 흡수된다(Green and Loewenstein, (1989) Cell 55: 1179-1188). 이런 고도 염기성 영역은 내재화(internalization) 및 내화 부분의 핵으로의 표적화(targeting)를 매개한다(Ruben et al., (1989) J. Tirol. 63: 1-8). 고도 염기성 영역에 존재하는 서열, 예를 들면 CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS, 또는 이의 하위 서열, 예를 들면 YGRKKRRQRRR을 포함하는 펩티드 또는 유사체를 화학식 Ⅰ이나 Ⅱ 화합물에 공액시켜, 이들 화합물의 세포내 환경으로의 내재화 및 표적화를 조장할 수 있다.
이런 특정 구체예에서, A 또는 B의 아미노산 서열은 화학식 Ⅰ또는 Ⅱ에서 정의된 서열보다 길게 하여 화합물의 내재화를 촉진할 만큼 충분한 길이의 아미노산 서열이 부착될 수 있도록 한다.
본 발명의 특히 바람직한 화합물은 아래에 구체적으로 기술된 P53, P74, P101, P102, P69, 가정 적절하게는 P69이다(표 1a).
본 발명의 화합물은 유사 화합물의 개발을 위한 선도 화합물로 기능할 수도 있다. 유사 화합물은 상기 선도 화합물과 실질적으로 동일한 방식으로 핵심 기능기가 예로써 MHC 클래스 Ⅱ 단백질에 제시될 수 있도록 하는 안정된 전자 배열과 분자 형태를 보유한다. 특히, 유사 화합물은 결합 영역에서 필적하는 공간적 전자 특성을 보유하고, 선도 화합물보다 좀더 크거나 작은 분자일 수 있다. 유사 화합물의 확인은 자체 일관성 장(self-consistent field)(SCF) 분석법, 배치간 상호작용(configuration interaction)(CI) 분석법, 정상 양식 역학 분석법(normal mode dynamics analysis)과 같은 기술을 이용하여 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 아래의 특성을 달성하는 선도 화합물로써 추가로 변형될 수 있다:
(h) 변경된 작용 부위, 활성 스펙트럼, 장기 특이성;
(i) 향상된 효능;
(j) 감소된 독성(향상된 치료 지수);
(k) 감소된 부작용;
(l) 변경된 치료 작용 개시, 효과의 지속 기간;
(m) 변경된 약동학적 파라미터(재흡수, 분산, 대사, 분비);
(n) 변경된 물리-화학적 파라미터(용해성, 흡습성, 색깔, 미각, 향기, 안정성, 상태);
(o) 향상된 전반적인 특이성, 장기/조직 특이성;
(p) 최적화된 적용 형태와 경로;
(q) 카르복실기의 에스테르화(esterification);
(r) 탄소 산을 이용한 하이드록실기의 에스테르화;
(s) 하이드록실기의 예로써 포스페이트, 피로포스페이트, 설페이트 또는 헤미숙시네이트로의 에스테르화;
(t) 제약학적으로 허용되는 염의 형성;
(u) 제약학적으로 허용되는 복합체의 형성;
(v) 약리학적 활성 중합체의 합성;
(w) 친수성 부분의 도입;
(x) 아로메이트(aromate) 또는 측쇄에서 치환체의 도입/교체, 치환체 패턴의 변화;
(y) 등입체성(isosteric) 또는 생체등입체성(bioisosteric) 부분의 도입에 의한 변형;
(z) 상동성 화합물의 합성;
(aa) 분지된 측쇄의 도입;
(bb) 알킬 치환체의 환형 유사체로의 전환;
(cc) 하이드록실기의 케탈, 아세탈로의 유도화;
(dd) 아마이드, 페닐카바메이트로의 N-아세틸화;
(ee) Mannich 염기, 이민의 합성;
(ff) 케톤 또는 알데하이드의 Schiffs 염기, 옥심, 아세탈, 케탈, 에놀에스테르, 옥사졸리딘, 티오졸리딘으로의 변환;
또는 이들의 임의 조합.
앞서 언급된 다양한 단계는 당분야에 널리 공지되어 있다. 가령, 이들 기술을 실행하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다; 예를 들면, Rein, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions(Alan Liss, New York, 1989). 화학적 유도체와 유사체의 제조 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예로써 Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010 U.S.A. 및 Organic Synthesis, Wiley, New York, USA에서 기술한다. 게다가, 앞서 기술된 방법에 따라 펩티드 유사물질 및/또는 적절한 유도체와 유사체의 컴퓨터 설계를 이용할 수 있다. 약물 발견에서 선도 화합물의 제조 방법에는 단백질 검출 방법, 예를 들면 질량 분광법(Cheng et al. J. Am. Chem. Soc. 117 (1995),8859-8860) 및 일부 핵 자기 공명(NMR) 방법(Fejzo et al., Chem. Biol. 6 (1999), 755-769; Lin et al., J. Org. Chem. 62 (1997), 8930-8931)을 이용하는 단계 역시 포함된다. 여기에는 또한 정량적 구조-작용 관계(QSAR) 분석(Kubinyi, J. Med. Chem. 41 (1993), 2553-2564, Kubinyi, Pharm. Unserer Zeit 23 (1994), 2 81-290), 조합 생화학, 고전 화학 등(참조: Holzgrabe and Bechtold, Pharm. Acta Helv. 74 (2000), 149-155)이 포함된다.
이에 더하여, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 무균 부형제와 같은 부형제를 함유하는 치료 제형에 관한다. 또한, 본 발명은 T 세포의 MHC Ⅱ-매개된 활성화로 특성화되는 질환을 치료하거나 예방하는 방법에관하는데, 상기 방법은 앞서 기술된 화합물을 함유하는 조성물을 동물, 예를 들면 사람에 투여하는 단계로 구성된다. 또한, 본 발명은 제약학적 조성물의 제조에서 본 발명에 따른 화합물의 용도에 관한다. 이런 제약학적 조성물은 T 세포의 MHC Ⅱ-매개된 활성화로 특성화되는 질환의 치료 또는 예방에 적합하다. 특정 구체예에서, 질환은 자가면역 질환, 예를 들면 류머티스 관절염 또는 다발성 경화증이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 저해물질은 다른 치료 아이소타입 또는 할로타입, 적절하게는 대부분의 다른 아이소타입 또는 할로타입에 비하여 한가지 치료 아이소타입 또는 할로타입, 예를 들면 HLA-DR 또는 DRB1*0101에 좀더 특이적이다. 따라서, 본 발명의 저해물질은 다른 HLA 아이소타입 또는 할로타입에 비하여 한가지 아이소타입 또는 할로타입에 적어도 5배 또는 10배, 적절하게는 적어도 100배, 좀더 적절하게는 적어도 1000배 낮은 ED50을 갖는다. 유사하게, 본 발명의 저해물질은 다른 HLA 아이소타입 또는 할로타입에 비하여 한가지 아이소타입 또는 할로타입에 적어도 5배 또는 10배, 적절하게는 적어도 100배, 좀더 적절하게는 적어도 1000배 낮은 ID50을 갖는다.
특정 구체예에서, 본 발명은 MHC 클래스 Ⅱ 단백질에 결합하는 능력의 측면에서 본원에 개시된 하나 이상의 화합물을 선별하고; 동물에서 효능과 독성에 관한 상기 화합물의 치료 프로필링(profiling)을 실시하고; 면역반응을 억제하는데 사용되는 상기 화합물의 포장 삽입물을 제조하고; 면역반응을 억제하는 다원 조성물을 시판함으로써 제약 사업을 실시하는 방법을 제시한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 MHC 클래스 Ⅱ 단백질에 결합하는 능력의 측면에서 본원에 개시된 하나 이상의 화합물을 선별하고; 면역반응을 억제하는 상기 화합물을 제조하고 시판하고 판매하고 사용할 수 있는 권리를 인가하거나 공동 개발하거나 제 3 자에게 판매함으로써 생명 과학 사업을 실시하는 방법을 제시한다.
Ⅳ. 치료 용도
본 발명의 화합물은 광범위한 의학적 치료에 사용될 수 있다. 가령, 본 발명의 화합물은 고형 장기 이식물과 병용될 수 있다. 적절하게는, 장기는 심장, 간, 신장, 부신 피질, 폐, 장, 췌장, 각막, 피부에서 선택된다. 가장 적절하게는, 표적 장기는 심장, 신장, 간, 각막, 피부에서 선택된다. 가령, 환자는 이식기관 또는 이식편 vs. 숙주 거부 질환을 초래하는 면역반응을 예방하거나 완화하기 위하여 이식기관 또는 동종이식편의 이식 전후에 본 발명의 화합물로 치료할 수 있다. 예로써 생분해가능 중합체 이식물, 또는 생분해성 중합성 미세입자/나노입자로부터 본 발명에 따른 화합물의 서방 역시 고려된다.
본 발명의 화합물은 MHC 클래스 Ⅱ 폴리펩티드에 의한 T 세포의 바람직하지 않거나 비정상적 활성화로 특성화되는 면역계 질환을 치료하는 데에도 유용하다. 이런 면역 질환에는 류머티스 관절염, 연소형 관절염, 다발성 경화증, 그레이브스 병(Grave's disease), 인슐린-의존성 당뇨병, 가면발작, 건선, 전신 홍반성 낭창, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 동종이식편 거부반응, 하시모토 병(Hashimoto's disease), 중증근무력증(myasthenia gravis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 갑상선염(thyroiditis), 사구체신염(glomerulonephritis),췌도염(insulitis), 과민성 대장 증상, 췌장염, 원발성 담증성 간경병증(primary biliary cirrhosis) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 화합물을 사용하여 증상을 완화하거나 치료하거나 발생이나 재발을 예방할 수 있는 다른 질환의 예는 쉐그렌 증후군(Sjogren syndrome), 경피증(scleroderma), 다발성근염(polymyositis), 피부근염(dermatomyositis), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 굿패스츄어 증후군(Goodpasture's syndrome), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 악성 빈혈(pernicious anemia), 특발성 혈소판 감소증 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura), 에디슨 병(Addison's disease) 등이다. 이런 치료에서, 본 발명의 화합물은 치료요법적으로 허용되는 양으로 MHC-Ⅱ 매개된 T 세포를 저해할 만큼 충분한 함량으로 투여된다.
특정 자가면역 기능장애는 특정 MHC 유형과 빈번하게 상관한다. 사람에서 DQ/DR 단상형(haplotype) 및 자가면역 질환과 이들의 연관은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(U.S. Patent No. 6,045,796). 특정 구체예에서, 환자의 단상형과 연관된 질환을 치료하는 적합한 약물을 선별하기 위하여, 또는 특정 약물의 선별 및/또는 처방에 적합하게 환자의 유전형 및/또는 표현형을 결정하기 위하여 본 발명의 저해물질로 치료할 수 있는 환자의 유전형 및/또는 표현형을 결정하는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 질병과 특정 MHC 유형이 강하게 연관하여 환자의 유전형 및/또는 표현형을 결정하는 과정이 요구되지 않는다. 동물, 예를 들면 사람의 단상형을 결정하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있는데, 임의의 적절한 기술, 예를 들면 검사되는 MHC 좌위에 특이적인 DNA 프로브로 DNA 제한 단편 길이 다형성(RFLP)을 분석함으로써 결정할 수 있다. MHC 좌위에 대한 프로브를 만드는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(참조: Gregersen et al., (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79: 5966). 이후, 환자의 단상형은 질병과의 연관이 공지된 단상형과 비교한다. 가령, 90% 이상의 류머티스 관절염 환자가 DR4(Dw4), DR4(Dw14) 또는 DR1의 단상형을 보유한다. 특히, 연소형 류머티스 관절염(예, 소수관절 연소형 류머티스 관절염)은 HLA-DPB2.1과 연관한다(Begovich et al., 1989, PNAS 86: 9489- 9493). 대략 70%의 인슐린-의존성 당뇨병 환자가 HLA-DQ3.2B, DQA1 또는 DQB1을 발현하고, 자가면역 피부 질환 심상성 천포창에 대한 감수성은 HLA-DQB1.3의 발현과 연관한다(Scharf et al., 1989, PNAS 86: 6215-6219). 호그위드에 대한 알레르기 반응은 DR2 대립유전자와 연관하는 것으로 알려져 있다(Marsh et al., (1989) Cold Spring Harb Symp Quant Biol 54: 459-70).
시험관내 검사 방법
본 발명에 따른 저해물질의 생물학적 활성, 예를 들면 항원-특이적 T 세포 활성화를 저해하는 능력은 다양한 시스템에서 분석할 수 있다. 한가지 방법에서, 정제된 클래스 Ⅱ MHC 분자는 계면활성제 투석으로 인지질 소포에 통합시킨다. 이후, 생성된 소포는 깨끗한 유리 커브 슬립에 부착시켜 MHC 분자를 포함하는 2차원 지질 이중층을 발생시킨다(Brian and McConnell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 6159). 검사되는 저해물질은 탐지가능하게 표지하고, 이후 지질막 이중층에 포획된 정제된 MHC 단백질과 함께 평판에서 배양한다. MHC 분자에 결합된 저해물질은 평판에 결합된 라벨을 탐지하여 확인한다.
2차 실험 프로토콜에서, 과량의 저해물질은 목적하는 MHC 알로타입(예, DR)을 발현하는 항원-제시 세포; 선별된 펩티드(예, 파상풍 독소 830-843)와 MHC 분자(예, DR)를 인식하는 T 세포 클론; 항원성 펩티드와 함께 배양한다. 분석 배양액은 T 세포 증식에 충분한 시간, 예를 들면 4일 동안 배양하고, 이후 표준 과정, 예를 들면 최종 18시간 배양동안 분쇄된 티미딘으로 펄싱(pulsing)하여 증식을 측정한다. 그 다음, 저해물질이 제공되지 않은 대조와 비교하여 저해 %를 산정한다.
세 번째 프로토콜은 U.S. Patent No. 5,736,507에서 기술한다. 상기 특허 공보에서 펩티드 결합 연구는 앞서 기술된 반-정량적 결합 분석법의 개선된 형태를 이용하여 실시하였다(Joosten et al., Int. Immunol. 6: 751, 1994). 본 발명에 적합된 정제된 MHC 분자(0.5-500 nM)는 pH=5.0에서 50 nM 비오틴화된 지시 펩티드와 함께 배양하고, 25 ㎕ 최종 부피의 결합 완충액(예, PBS, 1 mM AEBSF, 1 mM N-에틸 말레이미드, 8 mM EDTA, 10μM 펩스타틴 A, 0.01% NaN3, 0.05% NP-40, 5% DMSO)에서 일정 농도 범위의 저해물질을 사용한다.
실온에서 대략 45시간동안 배양한 이후, 결합된 지시 펩티드와 결합되지 않은 지시 펩티드는 SDS-PAGE와 니트로셀룰로오스 필터(BioRad)에서 블랏팅의 병행으로, 또는 니트로셀룰로오스 필터(BioRad)와 96 웰 Hybry Dot 장치(BRL)를 이용한 진공 DOT 블랏팅으로 분리한다. 블랏은 0.1 M 말레산 pH=7.5, 150 mM NaCl에서 0.5% DNA 차단 시약(Boehringer Mannheim, Germany)으로 차단한다. 1/2 시간후, 블랏은 PBS, 0.02% Tween 20(Sigma, St. Louis, USA)에서 세척하고 각각 1:40,000 또는 1:5,000 희석하여 스트렙타비딘-HRPO(Southern Biotechnology)과 함께 배양한다. DR-결합되고 비오틴화된 지시 펩티드는 제조업자의 지시에 따라 Western Blot ECL 키트(Amersham, U.K.)를 이용하여 강화된 화학발광으로 탐지한다. 미리투영된 필름(hyperfilm-ECL, Amersham, U. K.)은 10분동안 노출시킨다. 일정한 펩티드의 상대적 결합 친화성은 지시 펩티드와의 경쟁과 관련된다. 이런 상대적 친화성은 신호가 50%(RIC50)으로 감소되는 저해물질 농도로 정의된다.
하기 실시예에 구체적으로 기술된 유사한 프로토콜은 Siklodi et al., Human Immunology, 59 (1998) 463-471에 의해 교시된 프로토콜에 기초하고, 본 발명에 따른 저해물질의 경쟁적 결합을 이용한다. 임의의 적절한 MHC-Ⅱ 할로타입을 이런 분석에 이용할 수 있는데, 후술한 바와 같이 이런 방법은 MHC-Ⅱ 분자에 결합하는 능력의 측면에서 화합물 라이브러리를 스크리닝하는데 적합하다.
본 발명에 따른 저해물질의 시험관내 생물학적 활성을 결정하는데 적합한 다른 방법은 하기 실시예에 기술한다.
생체내 검사를 위한 모델 시스템
시험관내 분석에서 항원 제시를 저해하는 화합물의 능력은 생체내에서 면역반응을 저해하는 능력과 상관하였다. 생체내 활성은 예로써 본 발명의 검사 저해물질과 함께 목적하는 특정 MHC 분자에 한정되는 항원을 투여함으로써, 동물 모델에서 결정할 수 있다. 후속으로, 동물로부터 T 림프구를 떼어내고 일정 용량 범위의 항원과 함께 배양한다. 자극의 저해는 통상적인 수단, 예를 들면3H-티미딘으로 펄싱하고 적절한 대조와 비교하여 측정한다. 적절하게는, 하기 실시예에서 밝힌 바와 같이 내인성 MHC 클래스 Ⅱ 분자 대신에 목적하는 사람 MHC 클래스 Ⅱ 할로타입을 발현하도록 동물 모델을 유전적으로 변형한다. 특정 실험의 세부사항은 당업자에게 자명하다(참조: Adorini, et al., Nature 334: 623-625(1988); Ito et al. (1996) J. Exp. Med. 183:2635-2644).
아래는 면역계 질환에 대한 본 발명에 따른 화합물의 효과를 평가하는데 이용할 수 있는 전형적인 모델 시스템이다. 당업자는 과도한 실험이나 연구없이 이들 면역계 질환에 대한 본 발명에 따른 화합물의 효과를 검사하는데 적합한 다른 모델을 인지할 수 있다.
실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 Ito et al. (1996)이 밝힌 바와 같이, MS-연관된 사람 클래스 Ⅱ 할로타입이 도입되고 생쥐 클래스 Ⅱ 분자가 결핍된 생쥐에서 미엘린 단백질, 예를 들면 미엘린 염기성 단백질(MBP), 단백지질 단백질(PP) 또는 생쥐 희돌기세포 당단백질(MOG)로 면역화에 의해 유도된 다발성 경화증(MS) 모델이다.
콜라겐 유도된 관절염(CIA)은 RA-연관된 사람 클래스 Ⅱ 분자가 도입된 생쥐에서 Ⅱ형 콜라겐으로 면역화에 의해 유도된 류머티스 관절염(RA) 모델이다.
V. 제약학적 조성물
다른 관점에서, 본 발명은 비정상적 T 세포 활성화 또는 자가면역 질환, 예를 들면 류머티스 관절염 또는 다발성 경화증의 치료에 유용한 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체(첨가제) 및/또는 희석제와 함께 제제화되는 앞서 기술된 치료 효과량의 본 발명의 하나 이상의 화합물을 함유하는 제약학적으로 허용되는 조성물을 제공한다. 아래에 상세하게 기술된 바와 같이, 본 발명의 제약학적 조성물은 (1) 경구 투여, 예를 들면, 물약(수성이나 비수성 용액, 또는 현탁액), 정제, 캡슐, 환제, 분제, 과립, 혀에 적용되는 이고(泥膏); (2) 비경구 투여, 예를 들면, 무균의 용액 또는 현탁액으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주입; (3) 국소 적용, 예를 들면, 피부에 적용되는 크림, 연고 또는 스프레이; 또는 (4) 질내 또는 직장내 투여, 예를 들면, 페서리, 크림 또는 포말에 적합한 형태를 비롯한 고체 또는 액체 형태 투여를 위해서 특이적으로 제제화될 수 있다. 특정 구체예에서, 제약학적 조성물은 비-발열원성이다, 다시 말하면, 환자의 체온을 상승시키지 않는다.
본 명세서에서 "제약학적 효과량"바람직한 치료학적 효과를 유도하는데 효과적인 본 발명에 따른 저해물질을 함유하는 화합물, 재료 또는 조성물의 양을 의미한다. 이런 치료 효과는 예로써 원치않는 T 세포 활성화의 저해를 결과한다.
본 명세서에서 "제약학적으로 허용되는"은 정상적인 의학적 판단 범위내에서 합리적인 이점/단점 비율에 적합하게, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제점이나 불편이 없으면서 사람 및 동물의 조직과 접촉 사용하기에 적합한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 약형을 의미한다.
본 명세서에서 "제약학적으로 허용되는 담체"는 한 기관 또는 신체의 일부로부터 다른 기관 또는 신체의 일부에 본 발명의 화합물을 운반 또는 전달하는데 관여하는 제약학적으로 허용되는 재료, 조성물 또는 부형제, 예를 들면, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는제형의 다른 성분과 조화되는 면에서"허용되어야"하며 환자에게 유해하지 않아야 한다. 제약학적으로 허용되는 담체로 작용할 수 있는 일부의 재료의 예에는 (1) 당, 예를 들면, 락토오스, 글루코오스, 수크로오스; (2) 전분, 예를 들면, 옥수수 전분, 감자 전분; (3) 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예를 들면, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 말트; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예를 들면, 코코아 버터와 좌제용 왁스; (9) 오일, 예를 들면, 낙화생유, 면화유, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일, 대두유; (10) 글리콜, 예를 들면, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들면, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레이트와 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예를 들면, 수산화마그네슘과 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 피로겐-없는 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) 포스페이트 완충용액; (21) 제약학적 제형에 사용되는 다른 비독성 호환성 물질이 포함된다.
앞서 설명된 바와 같이, 본 발명 화합물의 특정 구체예는 염기성 작용기, 예를 들면, 아미노 또는 알킬아미노를 함유할 수 있으며, 제약학적으로 허용되는 산과 제약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이와 관련된 용어 "제약학적으로 허용되는 염"은 MHC 활성의 이런 저해물질의 상대적 비독성, 무기 및 유기 산부가염을 의미한다. 이들 염은 본 발명에 따른 화합물의 최종 분리 및 정제 동안에 동일 반응계내에서 제조되거나, 유리 염기 형태의 본 발명의 정제된 화합물을 적합한 유기 또는 무기산과 반응시키고, 이렇게 형성된 염을 분리함으로써 제조할 수 있다. 대표적인 염에는 하이드로브로미드, 하이드로클로라이드, 설페이트, 바이설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 아세테이트, 발레레이트, 올레이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토비오네이트, 라우릴설포네이트 염 등이 포함된다[참조: Berge et al. (1977)"Pharmaceutical Salts",J. Pharm. Sci. 66: 1-19].
다른 경우에, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 산성 작용기를 함유하며, 제약학적으로 허용되는 염기로 제약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이러한 경우에 "제약학적으로 허용되는 염"은 T 세포 활성화와 같은 MHC 활성의 저해제의 상대적 비독성, 무기 및 유기 염기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유사하게 펩티드 또는 펩티드유사물질의 최종 분리 및 정제 동안에 동일 반응계내에서 제조되거나, 유리 산 형태의 정제된 화합물을 적합한 염기, 예를 들면, 제약학적으로 허용되는 금속 양이온의 하이드록사이드, 카르보네이트 또는 바이카르보네이트; 암모니아; 또는 제약학적으로 허용되는 유기 일차, 이차, 삼차 아민과 별도로 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리토금속 염에는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄 등이 포함된다. 염기부가염의 형성에 유용한 대표적인 유기 아민에는 에틸아민, 디에틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진 등이 포함된다(상기, Berge et al. 참조).
습윤화제, 유화제, 윤활제, 예를 들면, 나트륨 라우릴 설페이트와 마그네슘 스테아레이트뿐만 아니라, 착색제, 방출제, 피막제, 감미제, 향미제, 방향제, 보존제, 항산화제 또한 조성물에 존재할 수 있다.
제약학적으로 허용되는 항산화제에는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 바이설페이트, 나트륨 메타바이설파이트, 나트륨 설파이트 등; (2) 지용성 항산화제, 예를 들면, 아스코르빌, 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; (3) 금속 킬레이트화제, 예를 들면, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르 산, 인산 등이 포함된다.
본 발명의 제형에는 경구, 비내, 국소(구강 및 설하 포함), 직장내, 질내 및/또는 비경구 투여에 적합한 제형이 포함된다. 제형은 통상적으로 단위 약형으로 존재할 수 있으며, 제약 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 단일 약형을 생성하도록 담체 재료와 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 처리되는 숙주, 특정의 투여 방식에 좌우된다. 담체 재료와 혼합되어 단일 약형을 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료효과를 유도하는 저해제 함량이다. 일반적으로, 백분율로 나타내면 상기 함량은 대략 1% 내지 99%의 활성 성분, 바람직하게는 대략 5% 내지 70%, 가장 바람직하게는 대략 10% 내지 30%이다.
제형 또는 조성물을 제조하는 방법에는 본 발명의 화합물을 담체 및 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 결합시키는 단계가 포함된다. 일반적으로, 이들 제형은 본 발명의 저해제를 액체 담체, 미세하게 분쇄된 고체 담체, 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 결합시키고, 필요한 경우, 산물을 성형함으로써 제조된다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은 캡슐, 교갑, 환제, 정제, 로젠지(향미료, 일반적으로 수크로오스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 사용), 분제, 과립의 형태로 존재하거나, 수성이나 비수성 액체에서 용액 또는 현탁액으로 존재하거나, 수중유 또는 유중수 액체 에멀션으로 존재하거나, 엘릭시르 또는 시럽으로 존재하거나, 알약(불활성 염기, 예를 들면, 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아를 사용)으로 존재하거나, 구강 세척액 등으로 존재할 수 있으며, 이들 각각은 소정량의 본 발명의 화합물을 활성 성분으로 함유한다. 또한, 본 발명의 저해제는 환약, 지약 또는 이고로 투여될 수 있다.
경구 투여용의 본 발명의 고체 약형(캡슐, 정제, 환제, 당제, 분제, 과립 등)에서 활성 성분은 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 나트륨 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트, 및/또는 (1) 충전제 또는 증량제, 예를 들면, 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨 및/또는 실릭산; (2) 결합제, 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로오스 및/또는 아카시아; (3) 연석제, 예를 들면, 글리세롤; (4) 붕해제, 예를 들면, 한천, 탄산칼슘, 감자 전분, 타피오카 전분, 알긴산, 특정의 실리케이트, 탄산나트륨; (5) 용해 지연제, 예를 들면, 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예를 들면, 4차 암모늄 화합물; (7) 습윤화제, 예를 들면, 세틸알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예를 들면, 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예를 들면, 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트, 이의 혼합물; (10) 착색제중 하나와 혼합된다. 캡슐, 정제,환제의 경우에, 제약학적 조성물은 완충제를 또한 함유할 수 있다. 유사한 타입의 고체 조성물은 락토오스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용함으로써 연질 및 경질 충전된 젤라틴 캡슐내의 충전제로 사용될 수 있다.
정제는 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압착 또는 성형함으로써 제조할 수 있다. 압착된 정제는 결합제(예, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스), 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 붕해제(예, 나트륨 전분 글리콜레이트 또는 가교 결합된 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스), 계면활성제 또는 분산제를 사용함으로써 제조할 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액제 희석제로 축축해진 분말 저해제의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다.
정제 및 본 발명에 따른 제약학적 조성물의 다른 고체 약형, 당제, 캡슐, 환제, 과립은 선택적으로 피복제와 외피제, 예를 들면, 장용피 및 제약학적 제제화 분야에 공지된 다른 피복제로 제제화 또는 제조될 수 있다. 이들 제형은 또한 요구되는 방출 특성, 다른 중합체 매트릭스, 리포좀 및/또는 미소구체를 제공하는 다양한 비율로 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스를 사용함으로써 활성 성분의 완만한 방출 또는 조절된 방출을 유도하도록 제제화할 수 있다. 이들은 세균 잔류 필터를 통한 여과로 살균하거나, 사용 직전에 무균수 또는 임의의 다른 무균의 주사 가능 매질에 용해될 수 있는 형태의 무균 고체 조성물에 멸균제를 혼입시킴으로써 살균할 수 있다. 이들 조성물은 또한 선택적으로 불투명화제를 함유할 수 있고, 가급적 위장관의 특정 부위에 선택적으로 지연된 방식으로 활성 성분만을 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 봉매(embedding) 조성물의 예는 중합체 물질 및 왁스이다. 활성 성분은 적절한 경우에 하나 이상의 앞서 기술된 부형제와 함께, 미세 캡슐화된 형태로 존재할 수도 있다.
본 발명 화합물의 경구 투여를 위한 액체 약형에는 제약학적으로 허용되는 에멀션, 미세에멀션, 용액, 현탁액, 시럽, 엘릭시르가 포함된다. 활성 성분 이외에, 액체 약형은 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면, 물 또는 다른 용매, 용해제, 유화제, 예를 들면, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(특히, 면화, 낙화생, 옥수수, 검, 올리브, 카스터, 참깨 오일), 글리세롤, 테트로히드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르, 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 보조제, 예를 들면, 습윤화제, 유화제와 현탁제, 감미제, 향미제, 착색제, 방향제, 보존제를 또한 함유할 수 있다.
본 발명의 활성 저해제에 추가하여, 현탁제는 현탁제, 예를 들면, 에톡실화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨과 소르비탄 에스테르, 미세결정상 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 한천, 트라가칸트, 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
직장 또는 질내 투여를 위한 본 발명의 제약학적 조성물의 제형은 하나 이상의 본 발명의 화합물을 예로써, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌제 왁스 또는 살리실레이트를 포함하는 하나 이상의 비자극성 부형제 또는 담체와 혼합함으로써제조할 수 있는데, 이는 실온에서는 고체이지만 체온에서는 액체이고, 따라서 직장이나 질내 공간에서 용융되고 활성 저해제를 방출하게 된다.
질내 투여에 적합한 본 발명의 제형에는 당해 기술분야에서 적합한 것으로 공지된 담체를 함유하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 이고, 포말, 또는 스프레이 제형 역시 포함된다.
본 발명의 화합물의 국소 또는 경피 투여용의 약형에는 분제, 스프레이, 연고, 이고, 크림, 로션, 겔, 용액, 패취, 흡입제가 포함된다. 활성 화합물은 무균 조건하에서 제약학적으로 허용되는 담체 및 요구되는 임의의 보존제, 완충제 또는 분사제(噴射劑)와 혼합될 수 있다.
연고, 이고, 크림, 겔은 활성 저해제 이외에, 부형제, 예를 들면, 동물과 식물 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실릭산, 탈크, 산화아연 또는 이의 혼합물을 함유할 수 있다.
분제 및 스프레이는 본 발명의 화합물 이외에, 부형제, 예를 들면, 락토오스, 탈크, 실릭산, 수산화알루미늄, 규산칼슘, 폴리아미드 분말, 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 통상의 추진제, 예를 들면, 클로로플루오로하이드로카본 및 휘발성의 치환되지 않은 탄화수소, 예를 들면, 부탄과 프로판을 추가로 함유할 수 있다.
경피 패취는 신체에 본 발명의 화합물을 조절하여 전달하는 추가의 이점을 갖는다. 이런 약형은 적절한 매질에 본 발명의 저해제를 용해 또는 분산시킴으로써제조할 수 있다. 피부를 통한 약물의 유입을 증가시키기 위하여 흡수 증진제 역시 사용될 수 있다. 이런 유입 속도는 속도 조절 막을 제공하거나, 중합체 매트릭스 또는 겔에 본 발명의 화합물을 분산시킴으로써 조절할 수 있다.
또한, 안구 제형, 눈 연고, 분제, 용액 등이 본 발명의 범위에 속한다.
비경구 투여에 적합한 본 발명의 제약학적 조성물은 사용 직전에 무균의 주사 가능 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있고, 항산화제, 완충제, 제균제, 제형이 치료 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질, 현탁제 또는 농후화제를 함유하는 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 무균의 등장성 수성이나 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀션, 또는 무균 분제와 함께 본 발명의 하나 이상의 저해제를 함유한다.
본 발명의 제약학적 조성물에 사용될 수 있는 수성 및 비수성 담체의 예에는 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 적합한 이들의 혼합물, 식물성 오일, 예를 들면, 올리브 오일 및 주사 가능 유기 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레이트가 포함된다. 적절한 유동성은 예로써 피복물질, 예를 들면, 레시틴을 사용함으로써, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지시킴으로써, 계면활성제를 사용함으로써 유지할 수 있다.
이들 조성물은 보존제, 습윤화제, 유화제, 분산제와 같은 보조제를 또한 함유할 수 있다. 미생물의 작용은 다양한 항균제 및 항생제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 사용함으로써 억제할 수 있다. 또한, 등장성 약물, 예를 들면, 당, 염화나트륨 등이 조성물에 포함하는 바람직하다. 이에 더하여,주입 가능 제약학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 약물을 포함시킴으로써 달성할 수 있다.
일부 경우에, 약물의 효과를 연장시키기 위해서 피하 또는 근육내 주입에 의한 약물의 흡수를 완화시키는 것이 바람직하다. 이는 수용성이 불량한 결정상 또는 무정형의 액체 현탁액을 사용함으로써 달성할 수 있다. 약물의 흡수 속도는 용해 속도에 좌우되고, 상기 용해 속도는 결정의 크기 및 결정의 형태에 좌우된다. 또한, 비경구 투여되는 약물의 연장된 흡수는 오일 운반체에 약물을 용해 또는 현탁시켜 달성한다.
주입 가능 저장 형태는 생물학적 분해 가능한 중합체, 예를 들면, 폴리락티드-폴리글리콜리드에 본 발명의 저해제의 미세캡슐화된 매트릭스를 형성시킴으로써 제조한다. 약물 대 중합체의 비율 및 사용된 특정 중합체의 특성에 따라서, 약물 방출의 속도가 조절될 수 있다. 다른 생물학적 분해 가능한 중합체의 예에는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)이 포함된다. 또한, 주입 가능 저장 제형은 신체 조직과 조화 가능한 리포좀 또는 미세에멀션에 약물을 포집시킴으로써 제조한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 다른 치료제, 예를 들면 다른 면역억제제, 원치않는 면역반응을 촉발하는 약물이나 물질(예, 이식된 세포), 또는 원하는 치료 효과를 달성하기 위하여 면역억제제와 함께 작용하는 약물, 예를 들면 소염제와 동시에 투여된다. 가령, 본 발명의 화합물 및 약물이나 물질은 정제와 같은 단일 조성물로, 개별 조성물로 동시에, 또는 치료 섭생의 일부로서 별개의 조성물로 서로 다른 시점에서 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물이 사람 및 동물에 약제로써 투여되는 경우에, 본 발명의 화합물은 자체적으로 또는, 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 0.1 내지 99.5%(좀더 적절하게는, 0.5 내지 90%)의 활성 성분을 함유하는 제약학적 조성물로써 투여될 수 있다.
본 발명의 제형은 경구, 비경구, 국소 또는 직장내 투여될 수 있다. 이들 제제는 각각의 투여 경로에 적합한 형태로 제공된다. 가령, 이들 제제는 주사, 주입 또는 흡입에 의한 정제 또는 캡슐 형태, 주사, 흡입, 안구 로션, 연고, 좌제 등으로 투여; 로션 또는 연고에 의한 국소 투여; 좌제에 의한 직장 투여로 투여된다. 경우 투여가 바람직하다.
본 명세서에서 "비경구 투여"및"비경구적으로 투여"는 일반적으로 주사에 의한 장내와 국소 투여를 제외한 투여 방식을 의미하며, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 포막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피부내, 복막내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지망막하, 척수내, 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
본 명세서에서 "전신 투여", "전신적으로 투여", "말초 투여", "말초적으로 투여"는 화합물, 약물 또는 다른 물질을 중추신경계 내로 직접 투여하는 방법이 아닌 다른 방법으로 투여하여, 이런 화합물, 약물 또는 다른 물질이 환자의 전신에 들어가고, 따라서 대사 및 다른 유사한 과정에 종속되는 투여, 예를 들면, 피하 투여를 의미한다.
선택된 투여 경로와는 무관하게, 본 발명의 방법에 유용한 저해제는 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있고, 본 발명의 제약학적 조성물은 당해 기술분야의 전문가에게 공지된 통상적인 방법으로 제약학적으로 허용되는 약형으로 제제화된다.
본 발명의 제약학적 조성물에서 활성성분의 실질적인 용량 수준을 변화시켜, 환자에게 독성을 나타내지 않으면서 특정의 환자, 조성물 및 투여 방식에서 요구되는 치료 반응, 예를 들면, 류머티스 관절염 또는 다발성 경화증의 증상 완화를 달성하기에 유효한 활성 성분의 양을 달성할 수 있다.
선택되는 용량 수준은 사용된 특정의 저해제, 또는 이의 에스테르, 염 또는 유도체의 활성, 투여경로, 투여시간, 사용되는 특정 화합물의 방출 속도, 치료 기간, 다른 약물, 사용되는 특정 저해제와 함께 사용되는 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 건강상태, 이전의 치료 및 의료 분야에 공지된 유사 인자를 포함한 다양한 인자에 좌우된다.
당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 의사 또는 수의사는 요구되는 효과량의 제약학적 조성물을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 가령, 의사 또는 수의사는 제약학적 조성물에 사용되는 본 발명 화합물의 시작 용량을 치료 효과를 달성하는데 요구되는 수준보다 낮은 수준으로 시작하고, 이후 원하는 효과가 달성될 때까지의 용량을 점진적으로 증가시킬 수 있다.
일반적으로, 예로써 1 mM 내지 나노몰(nanomole) 이하 범위의 EC50을 갖는 강력한 저해제에 적합한 일일 용량은 치료 효과를 유도하는 화합물의 최저 유효량이다. 이런 유효량은 일반적으로 앞서 기술된 인자에 좌우된다. 일반적으로, 목적 효과를 위하여 사용되는 경우에 환자에 대한 본 발명의 화합물의 정맥내, 뇌실내및 피하 용량은 일일 체중 ㎏당 약 0.0001 내지 약 1000㎎, 적절하게는 ㎏당 0.5 내지 300㎎이다.
원하는 경우, 활성 저해제의 일일 유효량은 일일 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상의 하위-용량으로 적절한 간격으로, 선택적으로 단위 약형으로 투여될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 저해제는 경구 투여용, 예를 들면 고체 정제, 환제, 캡슐 또는 캐플릿 등(이하 포괄적으로"정제"), 또는 수성 용액이나 현탁액의 형태로 제제화될 수 있다. 정제 형태의 저해제의 바람직한 구체예에서, 정제는 함께 제공되는 경우, 가급적 20정 정제로 제공된 저해제의 함량이 적어도 중간 효과량(ED50), 예를 들면, 50% 이상의 개체가 치료 효과를 나타내는 용량을 제공하도록 제제화된다. 가령, 저해제의 경우에 치료 효과는 MHC 클래스 Ⅱ 분자-매개된 T 세포 활성화의 정량적 저해 효과(예, 염증에서 통계학적으로 유의한 감소)이다. 바람직하게는, 정제는 10, 5, 2 또는 1정의 정제로 제공되는 저해제의 전체 양이 환자(사람 또는 비-사람 포유동물)에 적어도 ED50용량을 제공하도록 제제화된다. 다른 구체예에서, 24 시간동안 20, 10, 5 또는 2정의 정제로 제공되는 저해제의 양은 평균적으로 적어도 ED50농도(예, MHC 활성을 저해하는 최대 효과의 50%를 달성하는 농도), 적절하게는 ED50의 100배 미만, 좀더 적절하게는 ED50의 10 또는 5배 미만의 저해제 평균 혈장 수준을 제공하는 용량 섭생을 제공할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 정제(1 내지 20정)의 단일 용량은 약 0.25㎎ 내지 1250㎎의 저해제를 제공한다.
유사하게, 저해제는 비경구 투여, 예를 들면, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사용으로 제제화될 수 있다, 예를 들면, 저해제는 무균의 용액 또는 현탁액(이하 포괄적으로"주사 가능 용액")으로 제공될 수 있다. 바람직하게는, 주사 가능 용액은 가급적 200cc 환약 주사액으로 제공된 저해제의 양이 적어도 중간 유효량, 적절하게는 ED50의 100배 미만, 좀더 적절하게는 ED50의 10 또는 5배 미만의 용량을 제공하도록 제제화된다. 바람직하게는, 주사 가능 용액은 100, 50, 25, 10, 5, 2.5 또는 1cc 주사액으로 제공된 저해제의 전체 양이 환자에 ED50용량, 적절하게는 ED50의 100배 미만, 좀더 적절하게는 ED50의 10 또는 5배 미만을 제공하도록 제제화된다. 다른 구체예에서, 24 시간동안 2회 이상 100cc, 50, 25, 5 또는 2cc의 전체 용적으로 제공되는 저해제의 양은 평균적으로 적어도 ED50농도, 적절하게는 ED50의 100배 미만, 좀더 적절하게는 ED50의 10 또는 5배 미만의 저해제 평균 혈장 수준을 제공하는 용량 섭생을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 단일 용량 주사는 약 0.25㎎ 내지 1250㎎의 저해제를 제공한다.
연속적인 정맥내 주입, 예를 들면, 점적 또는 푸시(push)에서, 저해제는 무균의 희석 용액 또는 현탁액(이하 포괄적으로"i.v. 주사 가능 용액")으로 제공될 수 있다. 이런 i.v. 주사 가능 용액은 가급적 1ℓ 용액으로 제공되는 저해제(또는 저해제들)의 양이 15분 이하로 투여되는 경우에 적어도 중간 유효량, 적절하게는ED50의 100배 미만, 좀더 적절하게는 ED50의 10 또는 5배 미만의 용량을 제공하도록 제제화된다. 바람직하게는, i.v. 주사 가능 용액은 60, 90, 120 또는 240분 동안 1ℓ 용액으로 제공되는 저해제의 전체 양이 환자에게 ED50용량, 적절하게는 ED50의 100배 미만, 좀더 적절하게는 ED50의 10 또는 5배 미만을 제공하도록 제제화된다. 바람직한 구체예에서, 단일 i.v."백(bag)"은 1ℓ i.v. 용액당 약 0.25㎎ 내지 5000㎎, 적절하게는 0.25㎎ 내지 2500㎎, 좀더 적절하게는 0.25㎎ 내지 1250㎎의 저해제를 제공한다.
사람의 경우에 ED50용량은 2 ㎏ 내지 125 ㎏의 체중에 기초하지만, 성인의 경우에 50 내지 125 ㎏이다.
잠재적 저해제는 당해 기술분야에 공지된 다양한 기술중에서 임의의 한가지 기술을 이용하여 류머티스 관절염 또는 다발성 경화증에 대한 치료 활성을 비롯하여 임의의 저해에 대한 ED50을 평가할 수 있다.
VI. 본 발명에 따른 저해제의 조합 합성
본 발명의 화합물, 특히 다양한 대표적인 클래스의 치환기를 보유한 변이체의 라이브러리는 조합 화학 및 다른 병행 합성 반응식에 따른다[참조: PCT WO94/08051]. 관련 화합물의 거대 라이브러리, 예를 들면 상기 화학식 I로 표시되는 화합물의 변형된 라이브러리는 예로써 본원에 기술된 분석법중 한가지를 이용하여 가능한 선도 화합물을 확인하고 선도 화합물의 특이성, 독성 및/또는 세포독성-역학 프로필을 개량하기 위하여 고처리량 검정으로 신속하게 스크리닝할 수 있다.
간단하게 예시하면, 본 발명에서 목적하는 조합 라이브러리는 원하는 특성을 동시에 스크리닝할 수 있는 화학적 관련 화합물의 혼합물이다. 단일 반응에서 많은 관련 화합물의 제조는 수행을 요하는 스크리닝 과정의 횟수를 감소시키고 단순화시킨다. 적당한 물리적 성질에 대한 스크리닝은 통상적인 방법으로 수행할 수 있다.
라이브러리의 다양성은 다양한 상이한 수준으로 발생시킬 수 있다. 가령, 조합 반응에 사용된 기질 아릴기는 예로써 고리 구조의 면에서 변형과 같이 핵 아릴 부분의 측면에서 다양할 수 있고/있거나 다른 치환기에 관하여 변형될 수 있다.
본 발명의 저해제와 같은 작은 유기 분자의 조합 라이브러리를 생성하기 위한 다양한 기술을 당해 분야에서 이용할 수 있다[참조: Blondelle et al., (1995) Trends Anal. Chem. 14:83; Affymax 미국 특허 5,359,115; Ellman 미국 특허 5,288,514; Still et al., PCT WO94/08051; Chen et al., (1994) JACS 116:2661; Kerr et al., (1993) JACS 115:252; PCT WO92/10092, WO93/09668, WO91/078087; Lerner et al., PCT WO93/20242]. 따라서, 본 발명의 저해제의 대략 100 내지 1,000,000 이상의 다이버소머(diversomer)에서 다양한 라이브러리가 합성될 수 있고, 특정한 활성 또는 성질에 대하여 스크리닝될 수 있다.
A) 직접적인 특성화
조합 화학의 분야에서 증가하는 추세는 예로써 화합물의 서브-펨토몰의 양을 특성화하고, 조합 라이브러리로부터 선택된 화합물의 화학적 구성을 직접적으로 결정하는데 사용될 수 있는 질량 분광분석법(MS)과 같은 고감도 기술을 이용하는 것이다. 가령, 라이브러리가 불용성 지지 매트릭스 상에 제공되는 경우, 별개의 화합물 집단이 먼저 지지체로부터 유리되고 MS에 의해 특성화될 수 있다. 다른 구체예에서, MS 샘플 제조 기술의 일부로써, MALDI와 같은 MS 기술은 매트릭스, 특히 매트릭스와 화합물을 연결시키는데 원래부터 불안정한 결합이 존재했던 매트릭스로부터 화합물을 유리시키는데 사용될 수 있다. 가령, 라이브러리로부터 선택된 비드는 매트릭스로부터 다이버소머를 유리시키고 MS 분석을 위하여 다이버소머를 이온화하기 위하여 MALDI 단계에서 조사될 수 있다.
B) 멀티핀(Multipin) 합성
표제 방법의 라이브러리는 멀티핀 라이브러리 형태를 취할 수 있다. 간단히, Geysen 및 공동연구자들(Geyson et al. (1984) PNAS81:3998-4002)은 마이크로역가 플레이트 형태로 배열된 폴리아크릴산 격자의 폴리에틸렌 핀에서 병행 합성으로 화합물 라이브러리를 생성하는 방법을 소개하였다. Geysen 기술은 멀티핀 방법으로 주당 수천개의 화합물을 합성하고 스크리닝하는데 이용할 수 있고, 연결된 화합물은 다양한 검정에 재사용될 수 있다. 또한, 화합물이 순도 평가 및 추후 평가를 위하여 합성이후에 지지체로부터 절단될 수 있도록 적당한 링커 부분을 핀에 부착할 수 있다[참조: Brey et al. (1990) Tetrahedron Lett 31:5811-5814; Valerio et al. (1991) Anal Biochem 197:168-177; Bray et al. (1991) Tetrahedron Lett 32:6163-6166].
C) 분할-커플링-재조합
다른 구체예에서, 분할-커플링-재조합의 전략을 이용하여 한 세트의 비드에변화된 화합물 라이브러리를 제공할 수 있다[참조: Houghten (1985) PNAS 82:5131-5135; 미국 특허 4,631,211; 5,440,016; 5,480,971]. 간단히 말하면, 명칭이 암시하는 바와 같이, 라이브러리내로 축중(degeneracy)이 도입되는 각 합성 단계에서, 비드가 상이한 치환기의 수와 동등한 별개의 기로 분할되어 라이브러리내의 특정한 위치에 부가되고, 상이한 치환기가 별개의 반응에서 커플링되며, 비드가 다음 반복을 위하여 하나의 풀로 재조합된다.
한 구체예에서, 분할-커플링-재조합 전략은 화합물 합성이 다공성 폴리프로필렌 백 내에 밀봉된 수지상에서 진행되는 Houghten에 의해 최초로 개발된 소위 "티 백(tea bag)" 방법과 유사한 접근방법을 이용하여 실행할 수 있다[Houghten et al.(1986) PNAS82:5131-5135]. 치환기는 적당한 반응 용액에 백을 위치시킴으로써 화합물-보유 수지와 커플링되는데, 모든 통상적인 단계, 예를 들면 수지 세척 및 탈보호는 한 반응 용기에서 동시에 실행된다. 합성의 종결 시점에서, 각 백은 단일 화합물을 함유한다.
D) 공간적으로 어드레스가능한 병행 화학 합성
화합물의 동일성이 합성 기질상의 위치에 의해 결정되는 결합 합성 반응은 공간적으로 어드레스가능한 합성으로 지칭된다. 한 구체예에서, 결합 과정은 고체 지지체 상의 특정 위치에 화학 시약의 첨가를 제어함으로써 실행된다. 가령, 본 발명에 따른 화합물, 예를 들면 표 1과 2에 도시된 유사 화합물의 조합 합성을 위한 바람직한 방법은 WO 00/12575, WO 01/18545, Reinehe et al 2001(Current Opinion in Biotech 12: 59-64)에 기술된 기술을 개량한 SPOT 기술(EP0651762)이다. 다른바람직한 방법은 후보 또는 변이 화합물의 조합 어레이를 발생시키는 마이크로채널을 이용하는 것이다(WO 99/67024; WO 99/56878).
대안으로, 공간적으로 어드레스가능한 형태의 조합 라이브러리는 광-유도된 합성으로 만들 수 있다[Dower et al. (1991) Annu Rep Med Chem 26:271-280; Fodor, S.P.A. (1991) Science 251:767; Pirrung et al. (1992) 미국 특허 5,143,854; Jacobs et al. (1994) Trends Biotechnol 12:19-26]. 광학식각술(photolithography)의 공간적 분해는 소형화를 가능케 한다. 이런 기술은 광불안정성 보호기와의 보호/탈보호 반응을 이용하여 실행할 수 있다.
이런 기술의 중요한 점은 Gallop et al. (1994) J Med Chem 37:1233-1251에서 예시한다. 합성 기질은 광불안정성 니트로베라트릴옥시카르보닐(NVOC) 보호된 아미노 링커 또는 기타 광불안정성 링커의 공유 부착을 통한 커플링을 위하여 제조된다. 커플링을 위한 합성 지지체의 특정 영역을 선택적으로 활성화하기 위하여 광이 사용된다. 광에 의한 광불안정성 보호기의 제거(탈보호)는 선택된 영역을 활성화시킨다. 활성화이후, 각각 아미노 말단에 광불안정성 보호기를 보유하는 최초 한 세트의 아미노산 유사체가 전체 표면에 노출된다. 커플링은 이전 단계에서 광에 의해 어드레스된 영역에서만 일어난다. 반응을 중단시키고 플레이트를 세척하며 기질을 제 2 마스크를 통하여 다시 조명하여, 제 2의 보호된 빌딩 블록과의 반응을 위한 상이한 영역을 활성화시킨다. 마스크 패턴 및 반응물 순서는 생성물 및 이들의 위치를 정의한다. 이런 과정은 광학식각술을 이용하기 때문에, 합성될 수 있는 화합물의 수는 적당한 분해로 어드레스될 수 있는 합성 부위의 수에 의해서만 한정된다. 각 화합물의 위치는 정확하게 공지되어 있다; 따라서, 다른 분자와의 상호작용을 직접적으로 평가할 수 있다.
광-유도성 화학 합성에서, 생성물은 조명 패턴 및 반응물 첨가 순서에 좌우된다. 식각 패턴을 변화시킴으로써 많은 상이한 세트의 검사 화합물을 동시에 합성할 수 있다; 이런 특성은 많은 상이한 마스킹 전략을 결과한다.
E) 인코드된 조합 라이브러리
다른 구체예에서, 표제 방법은 인코드된 태깅(tagging) 시스템이 제공되는 화합물 라이브러리를 이용한다. 조합 라이브러리로부터 활성 화합물의 확인에서 최근의 개선은 소정의 비드가 겪는 반응 단계 및 이런 비드가 보유하는 추정 구조를 특이적으로 인코드하는 태그를 이용한 화학적 인덱싱 시스템을 이용하는 것이다. 개념적으로, 이런 접근법은 파지(phage) 디스플레이 라이브러리를 모방하는데, 여기서 활성은 발현된 펩티드로부터 유래하지만, 활성 펩티드의 구조는 대응하는 게놈 DNA 서열로부터 추론된다. 합성 조합 라이브러리의 최초 인코딩에서는 DNA를 코드로서 이용하였다. 서열분석가능 생체-올리고머(예, 올리고뉴클레오티드 및 펩티드)와의 인코딩 및 추가의 비-서열분석가능 태그와의 이원 인코딩을 비롯한 다양한 다른 형태의 인코딩이 보고되었다.
1) 서열분석가능 생체-올리고머를 사용하는 태깅
조합 합성 라이브러리를 인코딩하는데 올리고뉴클레오티드를 사용하는 원리는 1992년에 기술되었고[Brenner et al. (1992) PNAS 89:5381-5383], 이런 라이브러리의 예는 이듬해에 출현하였다[Needles et al. (1993) PNAS 90:10700-10704].특정 디뉴클레오티드(각각 TA, TC, CT, AT, TT, CA, AC)에 의해 인코딩되는 Arg, Gln, Phe, Lys, Val, D-Val, Thr(3문자 아미노산 코드)의 모든 조합으로 구성된 명목상 77(=823,543) 펩티드의 조합 라이브러리는 고체 지지체 상에서 펩티드 및 올리고뉴클레오티드 합성의 일련의 교대로 제조하였다. 이런 작업에서, 비드상의 아민 결합 기능성은 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 보호된 OH기 및 펩티드 합성을 위한 보호된 NH2기를 생성하는 시약과 함께 비드를 미리 배양(본원에서 1:20의 비율)함으로써 펩티드 또는 올리고뉴클레오티드 합성을 위하여 특이적으로 분화시켰다. 완료시, 태그 각각은 69-mer로 구성되었고, 이중 14개 단위는 코드를 보유하였다. 비드 조합 라이브러리는 형광표지된 항체와 함께 배양하고, 강한 형광을 나타내는 결합된 항체-포함 비드는 형광활성화 세포 소팅(FACS)으로 수집하였다. DNA 태그는 PCR로 증폭시키고 서열화하며, 예측 펩티드를 합성하였다. 이런 기술에 따라, 화합물 라이브러리는 표제 방법에 사용하기 위하여 유도할 수 있는데, 여기서 태그의 올리고뉴클레오티드 서열은 특정한 비드가 겪는 순차적 조합 반응을 확인하고, 따라서 비드 상에서 화합물의 동일성을 제공한다.
올리고뉴클레오티드 태그의 사용은 매우 예민한 태그 분석을 허용한다. 그럼에도 불구하고, 상기 방법은 태그와 라이브러리 구성원의 교대 공동-합성에 필요한 보호기 직교 집합의 신중한 선택을 요구한다. 또한, 태그, 특히 인산염 및 당 아노머성 연쇄의 화학적 불안정성은 비-올리고머 라이브러리의 합성에 이용될 수 있는 시약과 조건의 선택을 제한할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 라이브러리는 분석을위한 검사 화합물 라이브러리 구성원의 선택적 이탈을 허용하는 링커를 사용한다.
펩티드 역시 조합 라이브러리를 위한 태깅 분자로 사용되고 있다. 2가지 전형적인 접근방법이 당해 분야에서 기술되고 있는데, 이들 둘 모두 코딩과 리간드 가닥이 교대로 만들어지는 고체 지지체에 분지된 링커를 사용한다. 최초 접근방법[Kerr et al. (1993) JACS 115:2529-2531]에서, 합성에서 직교성은 코딩 가닥에 산-염기 보호 및 화합물 가닥에 염기-불안정성 보호를 이용함으로써 달성된다.
다른 접근방법(Nikolaiev et al. (1993) Pept Res 6:161 - 170)에서는 코딩 단위(cording unit) 및 검사 화합물이 수지의 동일한 작용기에 부착될 수 있도록 분지된 링커(branched linker)를 이용한다. 한 구체예에서, 절단가능 링커를 분기점(branch point) 및 비드 사이에 위치시켜, 절단에 의해 코드 및 화합물을 모두 포함하는 분자를 방출할 수 있다(Ptek et al. (1991) Tetrahedron Lett 32:3891 - 3894). 다른 구체예에서, 절단가능 링커는 검사 화합물이 비드로부터 선택적으로 분리되어 코드만 남아 있도록 위치시킬 수 있다. 이런 최종 구조물은 코딩 그룹의 잠재적 간섭없이 검사 화합물의 스크리닝이 가능하기 때문에 특히 중요한 가치를 갖는다. 펩티드 라이브러리 구성원 및 이들의 대응 태그의 독립적 절단과 서열분석 분야에서 전례는 태그가 펩티드 구조를 정확하게 예측할 수 있음을 확증하였다.
2) 서열분석 불가능 태킹(tagging): 이원 인코딩(binary encoding)
검사 화합물을 인코딩하는 대안은 이원 코드로 사용되는 일련의 서열분석 불가능 전자친화적 태깅 분자(non-sequencable electrophoric tagging molecules)를 이용한다(Ohlmeyer et al. (1993) PNAS 90:10922-10926). 전형적인 태그는 전자 포획 가스 크로마토그래피(ECGC)에 의해 펨토몰(femtomolar) 수준으로 트리메틸실릴(trimethylsilyl) 에테르로서 탐지되는 할로아로마틱(haloaromatic) 알킬 에테르이다. 방향족 할로겐화물 치환체의 성질과 위치뿐만 아니라 알킬 사슬의 길이 변화로 적어도 40개의 이런 태그를 합성할 수 있는데, 이들 태그는 원칙적으로 240(예, 1012 초과)개의 상이한 분자를 인코딩할 수 있다. 최초 보고서(Ohlmeyer et al., supra)에서, 태그는 광분열성 o-니트로벤질 링커를 통하여 펩티드 라이브러리의 가용한 아민기중 대략 1%에 결합하였다. 이런 접근방법은 펩티드-유사 분자 또는 다른 아민-포함 분자의 조합 라이브러리를 제조하는데 편리하다. 하지만, 임의의 조합 라이브러리를 필수적으로 인코딩할 수 있는 좀더 다능한 시스템이 개발되었다. 여기에서, 화합물은 광분열성 링커를 통하여 고체 지지부에 부착되고, 태그는 비드 매트릭스로의 카르벤(carbene) 삽입에 의해 카테콜(catechol) 에테르 링커를 통하여 부착된다(Nestler et al. (1994) J Org Chem 59:4723-4724). 직교 부착 전략은 용액에서 분석을 위한 라이브러리 구성원들의 선택적 이탈 및 태그 세트의 산화성 이탈이후 ECGC에 의한 후속 디코딩을 허용한다.
당해 기술분야에서 여러 아마이드-결합된 라이브러리는 아민기에 부착된 전기이동 태그에 의한 이원 인코딩을 이용하지만, 이들 태그를 비드 매트릭스에 직접 부착하는 것은 인코드된 조합 라이브러리에서 제조될 수 있는 구조에서 좀더 많은 다능성을 제공한다. 이런 방식으로 부착된 태그 및 이들의 링커는 비드 매트릭스 자체만큼 비-반응성이다. 전기이동 태그가 고체상에 직접 부착된 2가지 이원-인코드된 조합 라이브러리가 보고되었는데(Ohlmeyer etal. (1995) PNAS 92 :6027-6031), 이들은 표제 화합물 라이브러리를 발생시키는데 보도(輔導)를 제공한다. 양 라이브러리는 직교 부착 전략을 이용하여 구성하였는데, 여기서 라이브러리 구성원은 광불안전성 링커에 의해 고체 지지부에 결합되고, 태그는 급격한 산화에 의해서만 절단되는 링커를 통하여 부착되었다. 라이브러리 구성원은 고체 지지부로부터 반복적으로 부분 광용리(photoelution)될 수 있기 때문에, 다중 분석에 이용할 수 있다. 연속적인 광용리는 또한 높은 처리량 반복 스크리닝 전략을 허용한다; 첫째, 다중 비드를 96-웰 마이크로역가 평판에 위치시킨다; 둘째, 화합물은 부분적으로 이탈시키고 분석 평판으로 이전한다; 셋째, 금속 결합 분석으로 활성 웰을 확인한다; 넷째, 상응하는 비드를 새로운 마이크로역가 평판에 단일하게 재정렬시킨다; 다섯째, 단일 활성 화합물을 확인한다; 여섯째, 구조를 디코딩한다.
본 발명의 펩티드유사 화합물은 매우 다양한 대량의 후보 저해물질 라이브러리를 제공하는 전술한 기술을 이용하여 합성할 수 있는데, 그 이유는 본 발명의 화합물이 적당한 조건하에 일련의 탄소-헤테로원자 결합, 예를 들면 아마이드 또는 요소 결합을 연속적으로 형성함으로써 용이하게 제조될 수 있기 때문이다. 따라서, 일단의 개별 아단위, 예를 들면 이중환 아릴-1,2-디아자사이클로헥산 아단위를 통합하는 아미노산과 이의 아단위로부터, 이들 아단위의 다양한 조합과 치환체를 신속하고 용이하게 합성하고 생물학적 활성을 검사할 수 있다.
본 발명은 바람직한 특정 구체예를 기술하는 아래의 실시예로 예시한다. 하지만, 이들 구체예는 설명을 목적으로 하며 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1: 펩티드유사 화합물의 제조
펩티드유사 화합물은 펩티드 합성장치(ACT90, Advanced ChemTech)에서 표준 고체상 펩티드 화학(R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85,2149-2154 (1963), G. Barany, R. B. Merrifield in The Peptides, Vol. 2 (eds. E. Gross, J. Meienhofer) 1-284 (Academic, New York; 1980))을 이용한 빌딩 블록의 조립으로 만들고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 정제하였다.
HPLC는 Vision Chromatograph(PerSeptive Biosystems)에서 실시하였다. 분석 HPLC는 CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany의 Waters μBondapak C18칼럼(0.46 x 25 cm, 5μ 또는 0.39 x 30 cm, 10μ) 또는 Nucleosil C18칼럼(0.46 x 25 cm, 5μ 또는 0.4 x 30 cm, 10μ)을 이용하여 역상 방식으로 실시하였다. 예비 HPLC는 CS-Chromatographie Service의 Waters μBondapak C18칼럼(1.9 x 30 cm, 10μ) 또는 Nucleosil C18칼럼(2.0 x 30 cm, 10μ)을 이용하여 역상 방식으로 실시하였다. 플래시 크로마토그래피는 Merck Darmstadt, Germany의 Merck Kieselgel 60 (0.063-0.200 mm, Art No. 1.07734)에서 실시하였다. T.L.C.는 Merck Darmstadt, Germany의 알루미늄 시트 실리카 겔 60 F254(Art No. 1.05554)에서 실시하였다.1H-NMR-스펙트럼은 테트라메틸실란을 내부 기준으로 하여 200 MHz에서 측정하고 테트라메틸실린과 비교하여 화학적 이동(δ) 값(ppm)으로 표시하며 s = 단일요소; m =다중요소; d = 이중요소; t = 삼중요소; q = 사중요소, sp = 칠중요소, br = broad로 지정한다.
아래와 같은 약어가 이용된다: Boc = tert-부톡시카르보닐, Fmoc = 9-플루오르에닐메톡시카르보닐, Acm = 아세트아미도메틸, Prm = 프로필아미도메틸, DCM = 디클로로메탄, DMF = N,N-디메틸포름아마이드, DMAP = 4-디메틸아미노 피리딘, HOBt = 1-하이드록시벤조트리아졸, DIC = 디이소프로필카르보디이미드, TBTU = -2- (1-H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오르보레이트, THF = 테트라하이드로푸란, DIPEA = 디이소프로필에틸아민, TFA = 트리플루오르아세트산, Me = 메틸, Ac = 아세틸, tBu = tert-부틸, Bn = 벤질, Ph = 페닐, h = 시간, min = 분, aq. = 수성, r.t. = 실온(18-26℃), Pmc = 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐, PyBOP = 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오르포스페이트, Z = 벤질옥시카르보닐, EDCI = 1-에틸-3(3'-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드, DBU = 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔, Cit= (L) 시트룰리닐, Cha = (L)-사이클로헥실알라니닐, Gpg = (L)-N-아미디노-4-피페리디닐글리시닐, βPhPro = 2-(S)-3-(R)-3-페닐프롤리닐, Tic = (L)-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카르보닐, azaTic = 3,4-디하이드로-1H-프탈라진-2-카르보닐, Disc = (D,L) 1,2-디하이드로-2H-이소인돌 카르보닐, Thiq = (L)-테트라하이드로이소퀴놀린-1-카르보닐, Hbc = (D,L) -2,3,4,5-테트라하이드로-1H-벤조[d]아제핀-2-카르보닐, Haic = (2S,5S)-5-아미노-1,2,3,4,5,6,7-헥사하이드로-아제피노[3,2,1-h,i] 인돌-4-원-2-카르보닐, Odapdc = (1S,9S)-9-아미노옥타하이드로-6,10-디옥소-6H-피리다지노-[1,2-a][1,2]디아제핀-1-카르보닐, [SΨ(oxaz)L] = S-L의 옥사졸 유사물질, [SΨ(imid)L] = S-L의 이미다졸 유사물질, A = Ala = (L)-알라니닐, R = Arg = (L)-아르기니닐, C = Cys = (L)-시스테이닐, F = Phe = (L)-페닐알라니닐, V = Val = (L)-발리닐, Met = (L)-메티오닐, Nle = (L)-노르루시닐, S = Ser = (L)-세리닐, L = Leu = (L)-루이시닐, aIle = (L)-알로이소루시닐, Nva= (L)-노르발리닐, Pya = (L)-피리딜알라니닐, Orn = (L)-오르니티닐, Chg = (L)-사이클로헥실글리시닐, Hfe = (L)-호모페닐알라니닐, Thi = (L)-2-티에닐알라니닐, Coa = (L)-사이클로옥틸알라니닐, Nba =(L)-노르보르닐알라니닐.
N-(2-페닐에틸) 에탄올아민은 기존 문헌(J. Barbiere, Bull. Soc. Chim. Fr. 5,7, 1940,621)에 기술된 과정에 따라 2-페닐에틸 클로라이드와 에탄올아민으로부터 만들었다. 상업적으로 입수가능한 Fmoc 아미노산, HOBt, TBTU, PyBOP는 Advanced ChemTech, Novabiochem, Bachem, Neosystems 또는 RSP Amino Acid Analogues로부터 구입하였다. 모든 다른 화학약품과 용매는 Merck Darmstadt 또는 Sigma-Aldrich-Fluka로부터 구입하고 추가 정제없이 사용하였다. DMF는 적어도 4주동안 분자체 4Å에서 건조시키고, 20분동안 산성 산화알루미늄에서 교반하여 미량의 아민을 제거하며, 사용에 앞서 0.2 ㎛ 필터에 여과하였다.
표 1(a, b, c)에서는 본 발명에 따른 화학식 I과 Ⅱ의 전형적인 화합물을 기재한다. 표 2에서는 본원에 기술된 분석법으로 면역조절 및 다른 특성을 검사한 다른 화합물을 기재한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 표 1에 기재된 헵타머보다 짧은 펩티드유사물질이 특정 용도에 유용하다. 따라서, 좀더 짧은 펩티드유사물질역시 본 발명에 속한다. 좀더 짧은 이들 펩티드의 바람직한 길이는 테트라머 또는 펜타머이다.
실시예 2: Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe 2 (P53)의 제조
2.1 Fmoc-βPhPro-OH의 제조
44.61 g N-아세틸-트랜스-3(R)-페닐-(S)-프롤린-1-(S)-페닐에틸 아마이드 (J. Y. L. Chung, J. T. Wasicak, W. A. Arnold, C. S. May, A. N. Nadzan, M. W. Holladay, J. Org. Chem. 1990,55, 270-275)는 730 ㎖ 8 N HCl과 360 ㎖ 아세트산에 용해시켰다. 생성 용액은 16시간동안 140℃로 가열하였다. 실온으로 냉각한 이후, 용액은 증발 건조시켰다. 잔류물은 1000 ㎖ 물에 넣었다. 수용액은 에틸 아세테이트(3 x 200 ㎖)로 세척하고 감압하에 300 ㎖ 최종 부피로 농축하였다. 400 ㎖ aq. 10% Na2CO3-용액을 첨가하고, 수층은 에틸 아세테이트(4 x 200 ㎖)로 세척하였다. 200 ㎖ aq. 10% Na2CO3-용액을 첨가하고, 용액은 0℃로 냉각하였다. 300 ㎖ 디옥산에 녹인 51.22 g FmocCl 용액을 1.5시간동안 방울방울 첨가하고, 생성 현탁액은 실온에서 18시간동안 교반하였다. 침전물은 상층액분리로 제거하였다. 수용액은 디에틸 에테르(1 x 200 ㎖)로 세척하고 1 N HCl로 pH 3으로 산성화시키고 DCM(2 x 300 ㎖)로 추출하였다. 침전물은 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 생성 용액은 aq.NaHCO3포화 용액으로 추출하였다. 수층은 conc. HCl로 pH 3으로 산성화시키고 DCM로 추출하였다. 모아진 DCM 층은 Na2SO4에서 건조시키고 여과하고 증발 건조시켰다. 잔류물은 실리카에 미리 흡수시키고 에틸 아세테이트/헥산/아세트산 150:50:1을 용리액으로 하는 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 목적 산물(T.L.C.로 검사)을 함유하는 분획물은 모으고 증발시켰다. 생성 잔류물은 CHCl3/헥산 1:2로부터 결정화시켜 24.92 g(55%)의 전체 수율을 달성하였다.
1H-NMR(CDCl3): 1.95-2.15(m, 1 H, FmocNCH2CHH), 2.24-2.47(m, 1 H, FmocNCH2CHH), 3.43-3.85(m, 3H), 4.06-4.58(m, 4H), 6.2(br s, 1H, COOH) 7.11-7.82(m, 13 H, arom. Hs).
2.2 H[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe2의 제조.
2.2.1 디펩티드 I의 제조:
10.0 g 메틸 N-(디페닐메틸렌)글리시네이트(M.J. O'Donnell, R. L. Polt, J. Org. Chem. 1982, 47, 2663-2666)는 100 ㎖ 건조 THF에 녹인 4.87 g KOtBu 용액에 -5℃에서 첨가하고, 생성 용액은 0℃에서 15분동안 교반하였다. 상기 용액은 300 ㎖ 건조 THF에 녹인 7.1 ㎖ 이소부틸산 클로라이드 용액에 -78℃에서 3.5시간동안첨가하였다. 첨가가 완결된 이후, 유기 반응 혼합물은 실온으로 데웠다. 생성된 황색 용액은 200 ㎖ 1 N HCl로 처리하고, 혼합물은 실온에서 15분동안 교반하였다. 유기 용매는 감압하에 증발시켰다. 수층은 에틸 아세테이트(4 x 100 ㎖)로 세척하고 증발 건조시켜 10.2 g 잔류물을 얻었다.
11.66 g Z-Ser(tBu)OH는 Ar 대기하에 200 ㎖ 건조 THF에 용해시키고, 용액은 -18℃로 냉각하였다. 5.48 ㎖ 트리에틸아민 및 5.2 ㎖ 이소부틸클로로포르메이트를 순차적으로 첨가하였다. 현탁액은 -18℃에서 15분동안 교반하였다. 상기 잔류물을 첨가하고, 80 ㎖ 건조 THF에 녹인 5.48 ㎖ 트리에틸아민 용액을 방울방울 1시간동안 첨가하였다. 첨가가 완결된 이후, 현탁액은 -18℃에서 추가로 1.5시간동안 교반하고, 이후 실온으로 데웠다. aq. NaCl 포화 용액(200 ㎖)을 첨가하고, 혼합물은 15분동안 교반하였다. 수층은 분리하고 디에틸 에테르(3 x 100 ㎖)로 추출하였다. 모아진 유기층은 pH 7 포스페이트 완충액(1 x 50 ㎖)으로 세척하고 Na2SO4에서 건조시키고 여과하고 증발 건조시켰다. 잔류물은 에틸 아세테이트/헥산 (1:3 → 1:2)을 용리액으로 하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 부분입체이성질체의 혼합물로 14.4 g (84%)의 목적 화합물을 수득하였다.
1H-NMR(CDCl3): 1.09-1.28(m, 15 H, CHMe 2 , tBu), 3.05(sp, 1 H, CHMe2), 3.38-3.45(m, 1 H, CHHOtBu), 3.78, 3.79(2 s, 3 H, OMe), 3.75-3.88(br s, 1 H, CHHOtBu), 5.05-5.18(m, 2 H, CH 2Ph), 5.38(d, J = 6.8 Hz, 1 H, COCHCO), 5.70(br s,1 H, 카바메이트-NH), 7.25-7.42(m, 5 H, Ph), 7.95 (br s, 1 H, 아마이드-NH).
2.2.2 Z[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]OMe의 제조
55.0 g 트리페닐포스핀옥사이드와 31.3 ㎖ DBU는 38 ㎖ 건조 탄소테트라클로라이드, 38 ㎖ 건조 아세토니트릴, 38 ㎖ 건조 피리딘에 녹인 30.5 g 디펩티드 I 용액에 0℃에서 첨가하였다. 생성혼합물은 실온에서 20시간동안 교반하였다. 용매는 감압하에 제거하고, 잔류물은 톨루엔(4 x 150 ㎖)으로 동시-증발시켰다. 생성 잔류물은 900 ㎖ DCM에 용해시켰다. 용액은 aq. 5% KHS04-용액(5 x 200 ㎖)과 pH 7 포스페이트 완충액(2 x 150 ㎖)으로 세척하고 Na2SO4에서 건조시키고 여과하고 증발 건조시켰다. 잔류물은 450 ㎖ 에틸 아세테이트에 넣고, 현탁액은 초음파처리하고 여과하였다. 여과액은 100 ㎖ 최종 부피로 농축하였다. 300 ㎖ 헥산을 첨가하고, 생성 현탁액은 다시 초음파처리하고 여과하였다. 여과액은 증발 건조시키고, 잔류물은 에틸 아세테이트/헥산(1:3)을 용리액으로 하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 약한 황색 오일로 24.7 g(85%)의 표제 화합물을 수득하였다.
1H-NMR(CDCl3): 1.07(s, 9 H, tBu), 1.23-1.28(m, 6 H, CHMe 2 ), 3.64(dd, J=, 1 H, 4.0, 9.2 Hz, 1 H, CHHOtBu), 3.68-3.85(m, 2 H, CHMe 2 , CHHOtBu), 3.90(s, 3 H, OMe), 5.00-5.11(br m, 1 H, CHNHCO), 5.13(s, 2 H, CH2Ph), 5.79(br d, J=7.4Hz, 1 H, NH), 7.25-7.41(m, 5 H, Ph).
2.2.3 Z[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe 2 의 제조
24.71 g Z[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]OMe는 200 ㎖ 메탄올에 용해시키고, 상기 용액은 0℃로 냉각하였다. 80 ㎖ 물에 녹인 1.84 g LiOH 용액을 35분동안 방울방울 첨가하였다. 혼합물은 0℃에서 1.5시간동안, 실온에서 16시간동안 교반하였다. 용액은 1 N HCl로 중화시키고, 메탄올은 감압하에 증발시켰다. 생성된 수용액은 1 N HCl로 pH 4로 산성화시키고 DCM(4 x 100 ㎖)으로 추출하였다. 모아진 유기층은 Na2SO4에서 건조시키고 여과하고 증발시켰다. 잔류물은 250 ㎖ 건조 DMF에 용해시키고, 상기 용액은 0℃로 냉각하였다. 11.3 g HOBt, 14.1 g EDCl, 7.6 ㎖ 트리에틸아민, 13.8 g 디메틸아민 하이드로클로라이드 및 추가로 15.7 ㎖ 트리에틸아민을 첨가한 이후, 혼합물은 실온에서 17시간동안 교반하였다. 용액은 감압하에 증발시키고, 생성 잔류물은 톨루엔(1 x 100 ㎖)으로 동시-증발시켰다. 잔류물은 400 ㎖ 에틸 아세테이트에 넣고, 생성 현탁액은 여과하고, 여과액은 aq. 5% KHS04-용액(3 x 100 ㎖), aq. NaHCO3포화 용액(2 x 100 ㎖), pH 7 포스페이트 완충액(2 x 100 ㎖)으로 세척하였다. 유기층은 Na2SO4에서 건조시키고 여과하고 증발시켰다. 잔류물은에틸 아세테이트/헥산(2:3)을 용리액으로 하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 오일로 23.3 g(92%)의 표제 화합물을 수득하였다.
1H-NMR(CDCl3): 1.07(s, 9 H, tBu), 1.22-1.26(m, 6 H, CHMe 2 ), 3.03, 3.18(2 s, 2 x 3 H, NMe2), 3.51(sp, J=7.0 Hz, 1 H, CHMe 2 ), 3.65(dd, J=4.0, 8.8 Hz, 1 H, CHHOtBu), 3.78(br m, 1 H, CHHOtBu), 4.98-5.09(br m, 1 H, CHNHCO), 5.10-5.21(m, 2 H, CH 2 Ph), 5.70(br d, J=7.3 Hz, 1 H, NH), 7.21-7.45(m, 5 H, Ph).
2.2.4 H[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe 2 의 제조
100 ㎖ 에탄올에 녹인 23.3 g Z[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe2용액은 수소 대기하에 2.35 g Pd/C(10%) 현탁액에 첨가하고, 혼합물은 실온에서 18시간동안 교반하였다. 현탁액은 셀리트를 통하여 여과하고, 여과액은 증발 건조시켜 14.5 g (90%)의 표제 화합물을 수득하였다.
1H-NMR(CDCl3): 1.15(s, 9 H, tBu), 1.27 (d, J = 7.0 Hz, 6 H, CHMe 2 ), 2.04 (s, 2 H, NH2), 3.04, 3.23 (2 s, 2 x 3 H, NMe2), 3.50 (sp, J = 7.0 Hz, 1 H,CHMe 2 ), 3.60 (dd, J = 6.5, 8.8 Hz, 1 H, CHHOtBu), 3.69 (dd, J = 4.4, 8.8 Hz, 1 H, CHHOtBu), 4.14 (dd, J = 4.4, 6.5 Hz, 1 H, CHNH2).
2.3. HβPhPro-2-클로로트리틸 수지의 제조
120 ㎖ 건조 DCM에 녹인 7.4 g Fmoc- βhPro-OH 용액은 12.0 g 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(0.83 mmol/g, Novabiochem)에 첨가하였다. DIPEA(3.0 ㎖)를 첨가하고, 혼합물은 10분동안 교반하였다. 추가로 4.5 ㎖ DIPEA를 첨가하고, 145분동안 교반하였다. 메탄올(10 ㎖)을 첨가하고, 혼합물은 추가로 25분동안 교반하였다. 수지는 여과하고 DCM(5 x 100 ㎖), 메탄올(2 x 100 ㎖), DCM(4 x 100 ㎖)으로 세척하였다. 소형 샘플은 조심스럽게 건조시키고 DCM/피페리딘(1:1)으로 30분동안 탈보호하였다. 생성 Fmoc-피페리딘 부산물의 광도계 측정(301 nm에서 흡수도)으로 0.54 mmol/g의 수지 로딩(loading)을 얻었다. 남아있는 수지는 실온에서 160분동안 100 ㎖ DCM과 80 ㎖ 피페리딘으로 처리하고 DCM(10 x 100 ㎖)과 디에틸 에테르(4 x 80 ㎖)로 세척하고 진공에서 건조시켜 14.37 g HβPhPro-2-클로로트리틸 수지를 수득하였다.
2.4. Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe 2 (P53)의 제조
상기 펩티드유사물질은 바닥에 유리 원료가 깔린 50 ㎖ 반응 용기(Advanced ChemTech ACT90)에서 HβPhPro-2-클로로트리틸 클로라이드 수지(2416 ㎎, 1.3 mmol)로 시작하는 Fmoc 고체 상 합성으로 만들었다.
수지 팽창은 DMF(4 x 1 min.)로 수지를 처리하여 실시하였다. 수지는DMF(1x3 min, 1x7 min, 20 ㎖ 각각)에 녹인 20% 피페리딘 용액으로 탈보호하고, 이후 DMF(10x20 ㎖)로 세척하였다. 아실화는 FmocNleOH(1380 ㎎, 3.9 mmol), DMF (8.2 ㎖), HOBt(600 ㎎, 3.9 mmol), DIC(0.61 ㎖, 3.9 mmol)를 첨가하여 실시하였다. 커플링은 18시간동안 방치하고 DMF(7x20 ㎖)로 세척하였다. 적은 분량에서 Chloranil 검사를 이용하여 아실화의 완결을 확인하였다(J. Blake, C. H. Li, Int. J. Peptide Protein Res., 1975, 7, 495). 수지는 DMF(20 ㎖, 1x10 min)에 녹인 아세트산 무수물(2 M)과 DMAP(0.1 M)의 용액을 이용하여 표면을 덮고, 이후 DMF(12x20 ㎖)로 세척하였다. 수지는 전술한 바와 같이 탈보호하고 세척하고 표면을 덮고 세척하고 8 ㎖ DMF에서 FmocTicOH(1.56 g, 3.9 mmol), TBTU(1.26 g, 3.9 mmol), DIPEA(0.71 ㎖, 4.16 mmol)와 75분동안 결합시켰다.
수지는 전술한 바와 같이 탈보호하고 세척하고 표면을 덮고 세척하고 7 ㎖ DMF에서 FmocGpg(Pmc)OH(1.35 g, 1.95 mmol), HOBt(0.3 g, 1.95 mmol), DIC(0.305 ㎖, 1.95 mmol)와 16시간동안 결합시켰다.
수지는 전술한 바와 같이 탈보호하고 세척하고 표면을 덮고 세척하고 8 ㎖ DMF에서 FmocChaOH(1.54 g, 3.9 mmol), HOBt(0.6 g, 3.9 mmol), DIC(0.61 ㎖, 3.9 mmol)와 3시간동안 결합시켰다.
탈보호와 세척은 전술한 바와 같이 실시하고, 캡핑(capping)은 20 ㎖ DMF에 녹인 아세트산 무수물(2 M)과 DMAP(0.1 M)로 3x20분동안 처리하여 실시하였다. 수지는 DMF(12x20 ㎖), MeOH(3x50 ㎖), Et2O(3x40 ㎖)로 세척하고 진공에서 건조시켰다.
수지는 실온에서 45분동안 33 ㎖ DCM/트리플루오르에탄올/아세트산(8:1:1)으로 처리하고 여과하고 65 ㎖ DCM/트리플루오르에탄올/아세트산(8:1:1)과 100 ㎖ DCM으로 세척하였다. 250 ㎖ n-헥산을 여과액에 첨가하고, 생성 현탁액은 증발 건조시키고, 잔류물은 n-헥산(3 x 100 ㎖)으로 동시-증발시켜 1.188 g의 가공되지 않은 Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-βPhPro-OH를 얻었다. 잔류물은 5 ㎖ 건조 DMF에 용해시키고 0℃로 냉각하였다. 332 ㎎ HOBt, 642 ㎎ H[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe2, 415 ㎎ EDCI를 첨가한 이후, 용액은 0℃에서 1.5시간동안, 실온에서 16시간동안 교반하였다. 용매는 감압하에 제거하고, 잔류물은 80 ㎖ 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 용액은 aq. 5% KHS04용액(1 x 40 ㎖), aq. NaHCO3포화 용액, pH 7 포스페이트 완충액으로 세척하고 Na2SO4에서 건조시키고 여과하고 증발 건조시켰다. 잔류물은 실온에서 3.7시간동안 20 ㎖ TFA/물/티오아니솔/1,2-에탄디티올/트리에틸실란 85.5:5:5:2.5:2로 처리하였다. 산물은 550 ㎖ 냉각된 디에틸 에테르를 용액에 첨가하여 침전시켰다. 현탁액은 3300 rpm에서 10분동안 원심분리하고, 상층액은 버리고, 침전물은 냉각된 에테르에 재부유시키고 원심분리하며, 상층액은 버렸다. 침전물은 아세토니트릴과 0.1% aq TFA에 용해시켰다. 유기 용매는 감압하에 증발시키고, 수용액은 동결 건조시켰다. 가공되지 않은 산물(931 ㎎)은 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 HPLC로 정제하여 584 ㎎의 순수한 Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe2x TFA를 수득하였다. 상기 산물은 질량 분광법으로 특성화시켰다. MALDI-TOF MS: M/Z = 1064.57,(MH+), 1102.53(MK+).
실시예 3: Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe 2 (P51)의 제조
상기 펩티드유사물질은 고체 상 합성동안 팽창, 세척, 캡핑, 탈보호, 커플링에서 좀더 적은 수지, 25 ㎖ 반응 용기, 7 ㎖ 용매 분량의 축소된 규모를 제외하고 실시예 2.4에 기술된 방법과 유사한 방법으로 만들었다. βPhPro에서 커플링은 FmocNleOH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq)를 이용하여 16시간동안 실시하고, Nle에서 커플링은 FmocTicOH(3 eq), TBTU(3 eq), DIPEA(3.2 eq)를 이용하여 1.5시간동안 실시하고, Tic에서 커플링은 FmocArg(Pmc)OH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq)를 이용하여 16시간동안 실시하고, Arg에서 커플링은 FmocChaOH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq)를 이용하여 3시간동안 실시하였다. 용액 커플링은 DMF에서 H[S(OtBu)Ψ(oxaz) L]NMe2(2 eq), PyBOP(2 eq.), 4-메틸모르폴린(4 eq)을 이용하여 0℃에서 1시간동안, 실온에서 16시간동안 실시하였다. 생성혼합물은 증발 건조시키고, 잔류물은 실온에서 3.5시간동안 TFA/물/티오아니솔/1,2-에탄디티올/트리에틸실란 85.5:5:5:2.5:2로 처리하였다. 산물은 200 ㎖ 냉각된 디에틸 에테르를 용액에 첨가하여 침전시켰다. 현탁액은 0℃에서 1시간동안 유지시키고, 이후 실시예 2.4에 기술된 바와 같이 처리하였다. 가공되지 않은 산물은 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 HPLC로 정제하였다. MALDI-TOF MS: M/Z = 1038.70(MH+), 1060.36(MNa+), 1076.61(MK+).
실시예 4: Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe 2 (P33) & Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe 2 (P60)의 제조
펩티드유사물질 P33(Arg)은 수지가 커플링 단계 1에서 FmocNleOH 대신에 FmocMetOH와 결합하는 점을 제외하고, 실시예 3에 기술된 바와 동일하게 만들었다. MALDI-TOF MS: M/Z = 1057.00(MH+), 1079.01(MNa+), 1094.98(MK+).
펩티드유사물질 P60(Gpg)은 수지가 커플링 단계 1에서 FmocNleOH 대신에 FmocMetOH와 결합하고 커플링 단계 3에서 FmocArg(Pmc)OH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq) 대신에 FmocGpg(Pmc)OH(1.5 eq), HOBt(1.5 eq), DIC(1.5 eq)와 결합하는 점을 제외하고, 실시예 3에 기술된 바와 동일하게 만들었다. MALDI-TOF MS: M/Z = 1082.54(MH+), 1120.51(MK+).
실시예 5: Ac-Cha-Arg-Tic-Met(O)-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe 2 (P43) & Ac-Cha-Gpg-Tic-Met(O)-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe 2 (P47)의 제조
펩티드유사물질 P43(Arg)은 수지가 커플링 단계 1에서 FmocNleOH 대신에 FmocMet(O)OH와 결합하는 점을 제외하고, 실시예 3에 기술된 바와 동일하게 만들었다. MALDI-TOF MS: M/Z = 1072.57(MH+).
펩티드유사물질 P47(Gpg)은 수지가 커플링 단계 1에서 FmocNleOH 대신에 FmocMet(O)OH와 결합하고 커플링 단계 3에서 FmocArg(Pmc)OH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq) 대신에 FmocGpg(Pmc)OH(1.5 eq), HOBt(1.5 eq), DIC(1.5 eq)와 결합하는 점을 제외하고, 실시예 3에 기술된 바와 동일하게 만들었다. MALDI-TOF MS: M/Z= 1098.73(MH+), 1120.70(MNa+), 1136.68(MK+).
실시예 6: Ac-Cha-Arg-Disc-Met-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe 2 (P40) & Ac-Cha-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe 2 (P41)의 제조
펩티드유사물질 P40(Arg)은 수지가 커플링 단계 2에서 FmocTicOH 대신에 라세미 FmocDiscOH와 결합하는 점을 제외하고, 실시예 4의 P33에서와 동일하게 만들었다. 생성된 2개의 부분입체이성질체는 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 최종 HPLC 단계에서 분리하였다. 분리된 각 입체이성질체는 "신속"분획물(화합물 이름에서 -1로 표시됨) 또는 "지연"분획물(화합물 이름에서 -2로 표시됨)로 표시하고 별도의 생물학적 분석에서 개별 검사하였다. MALDI-TOF MS(P40-1): M/Z = 1042.67(MH+), 1058. 66(MNa+), 1080.63(MK+). MALDI-TOF MS(P40-2): M/Z = 1042.69(MH+), 1058. 66(MNa+), 1080.62(MK+).
펩티드유사물질 P41(Gpg)은 수지가 커플링 단계 2에서 FmocTicOH 대신에 라세미 FmocDiscOH와 결합하는 점을 제외하고, 실시예 4의 P60에서와 동일하게 만들었다. 생성된 2개의 부분입체이성질체는 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 최종 HPLC 단계에서 분리하였다. 분리된 각 입체이성질체는 "신속"분획물(화합물 이름에서 -1로 표시됨) 또는 "지연"분획물(화합물 이름에서 -2로 표시됨)로 표시하고 별도의 생물학적 분석에서 개별 검사하였다. MALDI-TaOF MS(P41-1): M/Z = 1068.43(MH+), 1106.38(MK+). MALDI-TOF MS(P41-2): M/Z= 1068.42(MH+), 1106.36(MK+).
실시예 7: Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-NHCH 2 CH 2 Ph(P69) & Ac- Cha-Arg-Tic-Nle-NHCH 2 CH 2 Ph(P82)의 제조
7.1 HNle-2-클로로트리틸 수지의 제조
상기 수지는 FmocNleOH(4.37 g)와 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(7.45 g, 0.83 mmol/g, Novabiochem)로부터 실시예 2 단계 2.3에 기술된 방법과 유사한 방법으로 제조하여 7.77 g HNle-2-클로로트리틸 수지(로딩: 0.50 mmol/g)를 수득하였다.
7.2 Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-OH의 제조
상기 펩티드유사물질은 탈보호 및 HNle-2-클로로트리틸 수지(2.52 g)를 이용한 커플링으로 실시예 1.4에 기술된 방법과 유사한 방법으로 만들었다. Nle에서 커플링은 7 ㎖ DMF에서 TBTU(1.09 g, 1.35 mmol), DIPEA(0.62 ㎖, 1.44 mmol), FmocTicOH(1.36 g, 1.35 mmol)을 이용하여 2.5시간의 커플링 시간동안 실시하였다. Tic에서 커플링은 6 ㎖ DMF에서 FmocGpg(Pmc)OH(1.17 g, 0.68 mmol), HOBt(0.26 g, 0.68 mmol), DIC(0.27 ㎖, 0.68 mmol)를 이용하여 17시간동안 실시하고, Gpg에서 커플링은 6 ㎖ DMF에서 FmocChaOH(1.34 g, 1.35 mmol), HOBt(0.52 g, 1.35 mmol), DIC(0.53 ㎖, 1.35 mmol)를 이용하여 2.5시간동안 실시하였다. 커플링의 완결은 각각 Kaiser 검사 또는 Chloroanil 검사로 확인하였다(E. Kaiser, et al.(1970) Anal. Biochem. 34,595; J. Blake, C. H. Li, Int. J. Peptide Protein Res., 1975,7, 495). 최종 아세틸화, 수지 절단, 증발(실시예 1.4에서와 유사)이후, 1.59 g 가공되지 않은 Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-OH를 분리하였다.
7.3 Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-NHCH 2 CH 2 Ph(P69)의 제조
5 ㎖ 건조 DMF에 녹인 Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-OH(730 ㎎, 0.78 mmol) 용액은 0℃에서 HOBt(239 ㎎, 1.56 mmol), PyBOP(812 ㎎, 1.56 mmol), 2-페닐에틸아민(0.45 ㎖, 3.65 mmol)으로 처리하였다. 반응물은 0℃에서 1.5시간동안, 실온에서 13시간동안 교반하였다. 용매는 감압하에 증발시키고, 잔류물은 실온에서 4시간동안 10 ㎖ TFA/물/티오아니솔/1,2-에탄디티올/트리에틸실란 85.5:5:5:2.5:2로 처리하였다. 산물은 500 ㎖ 냉각된 디에틸 에테르를 용액에 첨가하여 침전시켰다. 현탁액은 3300 rpm에서 10분동안 원심분리하고, 상층액은 버리고, 침전물은 냉각된 에테르에 재부유시키고 원심분리하며, 상층액은 버렸다. 침전물은 아세토니트릴과 0.1% aq TFA에 용해시켰다. 유기 용매는 감압하에 증발시키고, 수용액은 동결 건조시켰다. 가공되지 않은 산물(767 ㎎)은 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 HPLC로 정제하여 256 ㎎의 순수한 Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-NHCH2CH2Ph를 수득하였다. 상기 산물은 질량 분광법으로 특성화시켰다. MALDI-TOF MS:M/Z= 771.310(MH+), 793.286(MNa+), 809.257(MK+).
펩티드유사물질 P82는 HβPhPro-2-클로로트리틸 클로라이드 수지 대신에 HNle-2-클로로트리틸 수지(실시예 7.1)를 사용하는 점을 제외하고 실시예 3에 기술된 방법과 유사한 방법으로 만들었다. Nle에서 커플링은 FmocTicOH(3 eq), TBTU(3 eq), DIPEA(3.2 eq)를 이용하여 1.5시간동안 실시하고, Tic에서 커플링은 FmocArg(Pmc)OH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq)를 이용하여 14시간동안 실시하고,Arg에서 커플링은 FmocChaOH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq)를 이용하여 3시간동안 실시하였다. 용액 커플링은 DMF에서 N-(2-페닐에틸)아민(4 eq), HOBt(2 eq), PyBOP(2 eq)를 이용하여 0℃에서 1시간동안, 실온에서 15시간동안 실시하였다. 생성혼합물은 실시예 3에 기술된 바와 같이 처리하였다. 가공되지 않은 산물은 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 HPLC로 정제하였다. MALDI-TOF MS: M/Z = 745.61(MH+), 767.56(MNa+).
실시예 8: Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Me)Bn(P71) & Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(Me) Bn(P74)의 제조
펩티드유사물질 P71(Gpg)은 가공되지 않은 Ac-Cha-Arg(Pmc)-Tic-Nle-OH를 N-(2-페닐에틸)아민 대신에 N-메틸벤질아민(4 eq)과 반응시킨 점을 제외하고 실시예 7의 P82에서와 동일하게 만들었다. 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 HPLC로 원하는 산물을 수득하였다. MALDI-TOF MS: M/Z = 745.56(MH+), 783.49(MK+).
펩티드유사물질 P74(Gpg)는 가공되지 않은 Ac-Cha-Arg(Pmc)-Tic-Nle-OH를 2-페닐에틸아민 대신에 N-메틸벤질아민(4 eq)과 반응시킨 점을 제외하고 실시예 7의 P69에서와 동일하게 만들었다. 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 HPLC로 원하는 산물을 수득하였다. MALDI-TOF MS(P41-1): M/Z = 771.63(MH+), 793.63(MNa+).
실시예 9: Ac-Cha-Arg-Disc-Nle-N(Me)Bn(P72) & Ac-Cha-Gpg-Disc-Nle-N(Me) Bn(P76)의 제조
펩티드유사물질 P72는 커플링 단계 1에서 FmocTicOH 대신에 라세미 FmocDiscOH를 사용하는 점을 제외하고, 실시예 8의 P71에서와 동일하게 만들었다. 생성된 2개의 부분입체이성질체는 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 최종 HPLC 단계에서 분리하고 실시예 6에 기술된 바와 같이 표시하였다. MALDI-TOF MS(P72-1): M/Z = 731.57(MH+), 753.55(MNa+), 769.52(MK+). MALDI-TOF MS(P72-2): M/Z = 731.56(MH+), 753.55(MNa+), 769.52(MK+).
펩티드유사물질 P76은 커플링 단계 2에서 FmocArg(Pmc)OH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq) 대신에 FmocGpg(Pmc)OH(1.5 eq), HOBt(1.5 eq), DIC(1.5 eq)를 사용하는 점을 제외하고, 실시예 9의 P72에서와 동일하게 만들었다. 생성된 2개의 부분입체이성질체는 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 최종 HPLC 단계에서 분리하고 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 표시하였다. MALDI-TOF MS(P76-1):M/Z = 757.31(MH+), 779.27(MNa+), 795.24(MK+). MALDI-TOF MS(P76-2):M/Z = 757.37(MH+), 779.34(MNa+), 795.31(MK+).
실시예 10: Ac-Cha-Arg-Tic-Met-NH 2 (P1) & Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-NH 2 (P67)의 제조
10.1 FmocMet-Rinkamide 수지의 제조:
FmocMet-Rinkamide 수지는 바닥에 유리 원료가 깔린 50 ㎖ 반응 용기(Advanced ChemTech ACT90)에서 3.65 g Fmoc-Rinkamide 수지(0.59 mmol/g, Novabiochem)로 시작하는 Fmoc 고체 상 합성으로 만들었다.
수지 팽창은 DMF(4 x 1 min.)로 수지를 처리하여 실시하였다.
수지는 DMF(1x3 min, 1x7 min, 20 ㎖ 각각)에 녹인 20% 피페리딘 용액으로 탈보호하고, 이후 DMF(10x20 ㎖)로 세척하였다. 아실화는 FmocMetOH(2.4 g, 3 eq), DMF(10 ㎖), HOBt(990 ㎎, 3 eq), DIC(1.01 ㎖, 3 eq), DMAP(260 ㎎, 0.1 eq)를 첨가하여 실시하였다. 커플링은 4시간동안 방치하고, 수지는 DMF(7x20 ㎖)로 세척하였다. 소형 샘플은 조심스럽게 건조시키고 DCM/피페리딘(1:1)으로 30분동안 탈보호하였다. 생성 Fmoc-피페리딘 부산물의 광도계 측정(301 nm에서 흡수도)으로 0.43 mmol/g의 수지 로딩(loading)을 얻었다. 남아있는 수지는 DMF(20 ㎖, 1x10 min)에 녹인 아세트산 무수물(2 M)과 DMAP(0.1 M)의 용액을 이용하여 표면을 덮고, 이후 DCM(12 x 20 ㎖), 메탄올(3 x 40 ㎖), 디에틸 에테르(3 x 40 ㎖)로 세척하고 진공에서 건조시켜 3.9 g FmocMet-Rinkamide 수지를 수득하였다.
10.2 Ac-Cha-Arg-Tic-Met-NH 2 (P1) & Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-NH 2 (P67)의 제조
펩티드유사물질 P1은 탈보호 단계로 시작하는 점을 제외하고, 실시예 3의 P51에서와 동일한 프로토콜을 이용하여 FmocMet-Rinkamide 수지로 시작하는 Fmoc 고체 상 합성으로 만들었다. Met에서 커플링은 FmocTicOH(3 eq), TBTU(3 eq), DIPEA(3.2 eq)를 이용하여 1.5시간동안 실시하고, Tic에서 커플링은 FmocArg(Pmc)OH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq)를 이용하여 16시간동안 실시하고, Arg에서 커플링은 FmocChaOH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq)를 이용하여 3시간동안 실시하였다. Cha의 최종 아세틸화이후, 수지는 DMF(12x7 ㎖), MeOH(3x20 ㎖),Et20(3x20 ㎖)로 세척하고 진공에서 건조시키고 실온에서 3.5시간동안 TFA/물/티오아니솔/1,2-에탄디티올/트리에틸실란 85.5:5:5:2.5:2로 처리하였다. 수지는 여과하고 TFA로 세척하며, 산물은 200 ㎖ 냉각된 디에틸 에테르를 첨가하여 여과액으로부터 침전시켰다. 현탁액은 0℃에서 1시간동안 유지시키고, 이후 실시예 2.4에 기술된 바와 같이 처리하였다. 가공되지 않은 산물은 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 HPLC로 정제하였다. MALDI-TOF MS:M/Z = 659(MH+), 681(MNa+), 697(MK+).
펩티드유사물질 P67은 수지가 커플링 단계 2에서 FmocArg(Pmc)OH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq) 대신에 FmocGpg(Pmc)OH(1.5 eq), HOBt(1.5 eq), DIC(1.5 eq)와 결합하는 점을 제외하고, 실시예 10의 P1에서와 동일하게 만들었다. MALDI-TOF MS:M/Z = 685.29(MH+), 707.23(MNa+), 723.23(MK+).
실시예 11: Ac-Cha-Arg-Disc-Met-NH 2 (P12) & Ac-Cha-Gpg- Disc-Met-NH 2 (P66)의 제조
펩티드유사물질 P12는 커플링 단계 1에서 FmocTicOH 대신에 라세미 FmocDiscOH를 사용하는 점을 제외하고, 실시예 10의 P1에서와 동일하게 만들었다. 생성된 2개의 부분입체이성질체는 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 최종 HPLC 단계에서 분리하고 실시예 6에 기술된 바와 같이 표시하였다. MALDI-TOF MS(P12-1): M/Z = 645(MH+), 667(MNa+). MALDI-TOF MS(P12-2): M/Z = 645(MH+), 667(MNa+).
펩티드유사물질 P66은 커플링 단계 1에서 FmocTicOH 대신에 라세미 FmocDiscOH를 사용하고 커플링 단계 2에서 FmocArg(Pmc)OH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq) 대신에 FmocGpg(Pmc)OH(1.5 eq), HOBt(1.5 eq), DIC(1.5 eq)를 사용하는 점을 제외하고, 실시예 10의 P1에서와 동일하게 만들었다. 생성된 2개의 부분입체이성질체는 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 최종 HPLC 단계에서 분리하고 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 표시하였다. MALDI-TOF MS(P66-1):M/Z = 671.25(MH+). MALDI-TOF MS(P66-2):M/Z = 671.29(MH+).
실시예 12: Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-NH 2 (P31) & Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-βPhProNH 2 (P80)의 제조
12.1 FmocβPhPro-Rinkamide 수지의 제조:
FmocβPhPro-Rinkamide 수지는 커플링 단계 1에서 FmocMetOH 대신에 FmocβPhProOH를 사용하는 점을 제외하고 실시예 10의 FmocMet-Rinkamide 수지에서와 동일한 Fmoc 고체 상 합성으로 만들었다.
12.2. Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-NH 2 (P31) & Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-β PhProNH 2 (P80)의 제조
펩티드유사물질 P31은 탈보호 단계로 시작하는 점을 제외하고, 실시예 3의 P51에서와 동일한 프로토콜을 이용하여 Fmoc-βPhPro-Rinkamide 수지로 시작하는 Fmoc 고체 상 합성으로 만들었다. βPhPro에서 커플링은 FmocMetOH(3 eq), HOBT(3 eq), DIPEA(3 eq)를 이용하여 14시간동안 실시하고, Met에서 커플링은 FmocTicOH(3eq), TBTU(3 eq), DIPEA(3.2 eq)를 이용하여 1.5시간동안 실시하고, Tic에서 커플링은 FmocArg(Pmc)OH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq)를 이용하여 16시간동안 실시하고, Arg에서 커플링은 FmocChaOH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq)를 이용하여 3시간동안 실시하였다. Cha의 최종 아세틸화이후, 수지는 실시예 10.2에 기술된 바와 같이 처리하였다. 가공되지 않은 산물은 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 HPLC로 정제하였다. MALDI-TOF MS:M/Z = 832.64(MH+).
펩티드유사물질 P80은 커플링 단계 3에서 FmocArg(Pmc)OH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq) 대신에 FmocGpg(Pmc)OH(1.5 eq), HOBt(1.5 eq), DIC(1.5 eq)를 사용하는 점을 제외하고, P31에서와 동일하게 만들었다. MALDI-TOF MS: M/Z = 859.19(MH+), 896.14(MK+).
실시예 13: Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Bn)CH 2 CH 2 0CH 2 CH 2 0H(P98) & Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(Bn)CH 2 CH 2 0CH 2 CH 2 0H(P101)의 제조
13.1: 2-(2-벤질-[2-(2-하이드록시-에톡시)에틸]-카르밤산 9H-플루오렌-9-일메틸에스테르의 제조
2-(2-아미노에톡시)-에탄올(10 ㎖, 100 mmol)은 건조 THF(80 ㎖)에 용해시켰다. 벤즈알데하이드(10.5 ㎖, 103 mmol) 및 MS 4Å를 순차적으로 첨가하고, 혼합물은 실온에서 3.5시간동안 교반하였다. 생성 용액은 여과하고 감압하에 농축하여17.41 g 오일성 잔류물(89 mmol)을 얻었다. 상기 잔류물은 건조 THF(180 ㎖)에 용해시키고, 용액은 0℃로 냉각하였다. NaBH4(98 mmol)를 첨가하고, 혼합물은 실온에서 3시간동안 교반하였다. 반응은 5 N aq. HCl(70 ㎖)을 첨가하여 급랭시켰다. Na2SO3을 첨가하여 pH를 11로 조정하고, 혼합물은 CH2Cl2(4x)로 추출하였다. 모아진 유기 추출물은 K2CO3에서 건조시키고 여과하고 감압하에 농축하여 후속 반응을 위하여 충분히 순수한 15.3 g 2-(2-벤질아미노에톡시)-에탄올을 얻었다.
가공되지 않은 2-(2-벤질아미노에톡시)-에탄올(5.27 g, 27.0 mmol)은 디옥산(25 ㎖)에 용해시켰다. Na2CO3(물에서 10%, 35 ㎖)을 첨가하고, 혼합물은 0℃로 냉각하였다. FmocCl(7.81 g, 30.2 mmol)를 첨가한 이후, 혼합물은 3.25 시간동안 교반하였다. 혼합물은 감압하에 농축하여 디옥산을 제거하였다. 생성 aq.혼합물은 CH2C12(3 x 75 ㎖)로 추출하였다. 모아진 유기 추출물은 Na2SO4에서 건조시키고 여과하고 감압하에 농축하였다. 잔류물은 에틸 아세테이트/헥산(1:1)을 용리액으로 하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 오일로 9.1 g 표제 화합물을 수득하였다.
1H-NMR(CDCl3): 3.05-3.35(m, 3 H), 3.45-3.75(m, 5H), 4.20-4.30(m, 1 H), 4.45-4.55(m, 3 H), 4.69-4.68(m, 1 H), 7.00-7.45(m, 10H), 7.55-7.80(m, 3 H).
13.2: FmocN(Bn)CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 O- 2 -클로로트리틸 수지의 제조
THF(15 ㎖)를 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(4.0 g, 1.2 mmol/g)에 첨가하고, 혼합물은 25분동안 진탕하였다. THF(25 ㎖)에 녹인 FmocN(Bn)CH2CH2OCH2CH2OH(6.1 g, 14.7 mmol) 및 피리딘(850 ㎕, 10.5 mmol)을 순차적으로 첨가하고, 혼합물은 15시간동안 65℃로 가열하였다. MeOH(5 ㎖)를 첨가하고, 35분동안 가열하였다. 수지는 여과하고 DMF(3x), CH2C12(3x), MeOH(3x), Et2O(3x)로 세척하여 5.0 g을 얻었다. 소형 샘플은 조심스럽게 건조시키고 DCM/피페리딘(1:1)으로 30분동안 탈보호하였다. 생성 Fmoc-피페리딘 부산물의 광도계 측정(301 nm에서 흡수도)으로 0.45 mmol/g의 수지 로딩(loading)을 얻었다.
펩티드유사물질 P98은 탈보호 및 FmocN(Bn)CH2CH2OCH2CH2O-2-클로로트리틸 수지를 이용한 커플링으로, 탈보호 단계로 시작하여 실시예 2.4에서 기술된 방법과 유사한 방법으로 만들었다. HN(Bn)CH2CH2OCH2CH2O-2-클로로트리틸 수지에서 커플링은 HOBt(2.5eq), DIC(2.5 eq), FmocNleOH(2.5 eq)를 이용하여 21시간동안 실시하였다. Nle에서 커플링은 12 ㎖ DMF에서 FmocTicOH(3 eq), TBTU(3 eq), DIPEA(3.2 eq)를 이용하여 1.5시간의 커플링 시간동안 실시하였다. Tic에서 커플링은 15 ㎖ DMF에서FmocArg(Pmc)OH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq)를 이용하여 20시간동안 실시하고, Arg에서 커플링은 15 ㎖ DMF에서 FmocChaOH(3 eq), TBTU(3 eq), DIPEA(3.2 eq)를 이용하여 1.5시간동안 실시하였다. 최종 아세틸화이후, 수지는 DMF(3x), MeOH(3x), Et20(3x)로 세척하여 6.67 g을 얻었다. 수지는 실온에서 3.5시간동안 TFA/물/티오아니솔/1,2-에탄디티올/트리에틸실란 85.5:5:5:2.5:2로 처리하였다. 수지는 여과하고TFA로 세척하며, 여과액은 감압하에 농축하였다. 산물은 450 ㎖ 냉각된 디에틸 에테르를 잔류물에 첨가하여 침전시켰다. 현탁액은 3300 rpm에서 10분동안 원심분리하고, 상층액은 버리고, 침전물은 냉각된 에테르에 재부유시키고 원심분리하며, 상층액은 버렸다. 침전물은 아세토니트릴과 0.1% aq TFA에 용해시켰다. 유기 용매는 감압하에 증발시키고, 수용액은 동결 건조시켜 1.38 g 가공되지 않은 산물을 얻었다. 상기 산물중에서 300 ㎎은 0.1% aq TFA에서 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 HPLC로 정제하여 209 ㎎의 순수한 P98를 수득하였다. MALDI-TOF MS: M/Z = 819.29(MH+).
펩티드유사물질 P101은 수지가 커플링 단계 3에서 FmocArg(Pmc)OH(3 eq), HOBt(3 eq), DIC(3 eq) 대신에 FmocGpg(Pmc)OH(1.5 eq), HOBt(1.5 eq), DIC(1.5 eq)를 사용하는 점을 제외하고, P98에서와 동일하게 만들었다. MALDI-TOF MS: M/Z = 845.39(MH+), 867.38(MNa+), 883.36(MK+).
실시예 14: MHC-Ⅱ 단백질 DR4Dw4와 DR1의 경쟁적 결합
펩티드유사 화합물(1nM - 100μM)의 경쟁적 결합은 Ito et al.(Exp. Med. 1996; 183: 2635-2644)과 Siklodi et al.(Human Immunology 1998; 59:463-471)의 프로토콜에서 약간 변형된 프로토콜에 따라, 6-(비오틴아미도)-헥사노일-YAAFRAAASAKAAA-NH2를 지시 펩티드로 이용하여 DR4Dw4(DRA1*0101 DRB1*0401), DR1(DRA1*0101 DRB1*0101), DR4Dw14(DRA1*0101 DRB1*0404)에서 검사하였다.
25%(v/v) DMSO/50 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 7.5(PBS)에서 10배희석된 일련의 화합물(4nM - 400μM)은 1% BSA/PBS로 차단된 96 웰 폴리프로필렌 평판에서 실온에서 1시간동안 준비하였다. MHC-화합물 상호작용 혼합물은 아래와 같이 유사하게 차단된 96 웰 폴리프로필렌 평판에서 준비하였다; 40㎕ 2x 완충액(PBS, 50 mM, pH 7.5, 2%(w/v) NP-40, 3.2 mM EDTA, 6.25% 프로테아제 저해물질 칵테일: 각각 0.32 g/ℓ 키모스타틴, 안티페인, 펩스타틴 A, 대두 트립신 저해물질, 레우펩틴)에 0.5%(w/v) NP-40/PBS에 녹인 10 ㎕ 0.8 μM 지시 펩티드, 적절히 희석된 20 ㎕ 화합물 용액 및 10㎕ MHC-Ⅱ DRA1*0101 DRB1*0401(0.06 g/ℓ), DRA1*0101 DRB1*0101(0.03 g/ℓ) 또는 DRA1*0101 DRB1*0404(0.015 g/ℓ)를 첨가하였다. 펩티드유사 화합물이 부재하는 상호작용 혼합물 및 펩티드 유사 화합물과 MHC-Ⅱ는 각각 양성 대조와 음성 대조로 이용하였다. 모든 상호작용 혼합물은 복수로 준비하고 실온에서 16시간동안 배양하였다.
높은 결합 능력 블랙 FIA 평판(Greiner, 포획 평판)은 PBS에 녹인 100 ㎕/웰 mAb LB3.1(0.01 g/ℓ)로 4℃에서 하룻밤동안 미리 피복하고, 이후 실온에서 1시간동안 200 ㎕/웰 1%(w/v) BSA/PBS로 차단하였다. PBS로 세척한 이후, 60 ㎕ MHC-Ⅱ-화합물 상호작용 혼합물은 상호작용 평판으로부터 포획 평판의 적절한 웰로 이전하고 4℃에서 2시간동안 배양하였다. 웰은 200 ㎕/웰의 냉각된(4 내지 8℃) 1x DELFIA 세척액(Wallac-ADL-GmbH, Freiburg)으로 6회 세척하고 100 ㎕의 냉각된 유로퓸(Europium)-스트렙타비딘 공액체(Wallac-ADL-GmbH, Freiburg; DELFIA 분석 완충액으로 1/1000 희석)와 함께 4℃에서 30분동안 배양하며 냉각된 1x DELFIA 세척액으로 다시 세척하고, 최종적으로 200 ㎕ 냉각된 DELFIA 강화 용액(Wallac-ADL-GmbH, Freiburg)과 함께 실온에서 1시간동안 배양하고, 이후 λexEu3+: 340 nm 및 λemEu3+: 613(615) nm(Wallac Victor21420 Multilabel Counter, Wallac-ADL-GmbH, Freiburg)에서 시분해 유로퓸 형광(time-resolved europium fluorescence)을 판독하였다.
표 3a에서는 본 실시예에 따른 IC50측정에서 특정 MHCⅡ 단백질에 대한 본 발명에 따른 Gpg-포함 화합물의 향상된 친화성을 보여준다(굵은 글씨). 표 3b에서는 동일한 MHCⅡ 단백질에 대한 화학식 I 화합물의 친화성을 보여준다. 도 1에서는 Arg-포함 균등물(P51)과 비교하여 MHC 클래스 Ⅱ 단백질 0401에 대한 본 발명의 바람직한 헵타머 화합물 P53(Gpg-포함)의 향상된 IC50을 도시하고, 도 2에서는 Arg-포함 펩티드(P71)와 비교하여 MHC 클래스 Ⅱ 단백질 0401에 대한 본 발명의 바람직한 테트라머 화합물 P74(Gpg-포함)의 향상된 IC50을 도시한다. 도 3에서는 Arg-포함 펩티드(P82)와 비교하여 MHC 클래스 Ⅱ 단백질 0101에 대한 본 발명의 바람직한 테트라머 화합물 P69(Gpg-포함)의 향상된 IC50을 도시한다. 도 4에서는 Arg-포함 펩티드 (P71)와 비교하여 MHC 클래스 Ⅱ 단백질 0401에 대한 본 발명의 바람직한 테트라머 화합물 P74(Gpg-포함)의 향상된 IC50을 도시한다. 도 5에서는 Arg-포함 펩티드(P98)와 비교하여 MHC 클래스 Ⅱ 단백질 0401에 대한 본 발명의 바람직한 테트라머 화합물 P101(Gpg-포함)의 향상된 IC50을 도시한다.
실시예 15: PRIESS와 LG2 세포에서 발현된 MHC Ⅱ 단백질에 대한 화합물의 경쟁적 결합
펩티드유사 화합물(4nM - 400μM)의 경쟁적 결합은 6-(비오틴아미도)-헥사노일-Cha-Arg-Tic-Met-NH2를 지시 펩티드로 이용하여 Priess(DR4Dw4: DRA1*0101 DRB1*0401) 및 LG2(DR1: DRA1*0101 DRB1*0101) 세포에서 검사하였다. 이들 세포는 10% 열-불활화된 FCS(Biowhittaker), 2 mM L-글루타민, 1% 비-필수 아미노산 원액(Gibco 11140-035; 100x MEM), 1 mM 소디움 피루베이트, 0.1 ㎎/㎖ 카나마이신, 3.4 ppm β-멀캡토에탄올로 보충된 RPMI 1640(1x Gibco 42401-042) 배지에서 배양하였다. 결합 분석에 사용하기 위하여 이들 세포는 2.5x106세포/㎖ 밀도로 1% FCS를 포함하는 배지에서 재-부유시켰다.
분석은 무균 96 웰 폴리스티렌 마이크로역가 평판에서 실시하였다. 1% FCS에서 10배 희석된 일련의 화합물(16nM - 1615μM)은 10% DMSO/물에서 5 또는 10 mM 화합물 원액으로부터 준비하였다. 50 ㎕ 각 화합물 희석액은 1% FCS에 녹인 50 ㎕의 16 μM 지시 펩티드 용액에 중복 첨가하였다. 세포 결합은 100 ㎕의 2.5x106세포/㎖ 1% FCS를 각 웰에 첨가하여 개시시켰다. 대조는 DMSO 농도가 용액에서 최대 화합물 농도로 존재하였다. 세포는 37℃, 6% CO2에서 배양하였다. 4시간후, 세포는 200 ㎕ PBS로 세척하고 200 ㎕ 용해 완충액(50 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, 1%(w/v) NP-40, 25 mM 요오드아세트아마이드, 1 mM PMSE, 3.1% 프로테아제 저해물질 칵테일: 각각 0.32 g/ℓ 키모스타틴, 안티페인, 펩스타틴 A, 대두 트립신 저해물질, 레우펩틴, pH 7.5)에서 10분동안 용해시켰다.
높은 결합 능력 블랙 FIA 평판(Greiner, 포획 평판)은 50 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 7.5(PBS)에 녹인 100 ㎕/웰 mAb LB3.1(0.01 g/ℓ)로 4℃에서 하룻밤동안 미리 피복하고, 이후 실온에서 1시간동안 200 ㎕/웰 1%(w/v) BSA/PBS로 차단하였다. PBS로 세척한 이후, 190 ㎕ 세포 용해질은 포획 평판의 적절한 웰로 이전하고 4℃에서 2시간동안 배양하였다. 웰은 200 ㎕/웰의 냉각된(4 내지 8℃) 1x DELFIA 세척액(Wallac-ADL-GmbH, Freiburg)으로 6회 세척하고 100 ㎕의 냉각된 유로퓸(Europium)-스트렙타비딘 공액체(Wallac-ADL-GmbH, Freiburg; DELFIA 분석 완충액으로 1/1000 희석)와 함께 4℃에서 30분동안 배양하며 냉각된 1x DELFIA 세척액으로 다시 세척하고, 최종적으로 200 ㎕ 냉각된 DELFIA 강화 용액(Wallac-ADL-GmbH, Freiburg)과 함께 실온에서 1시간동안 배양하고, 이후 λexEu3+: 340 nm 및 λemEu3+: 613(615) nm(Wallac Victor21420 Multilabel Counter, Wallac-ADL-GmbH, Freiburg)에서 시분해 유로퓸 형광(time-resolved europium fluorescence)을 판독하였다.
표 3a에서는 본 실시예에 따른 IC50측정에서 세포의 표면에서 발현되는 특정 MHCⅡ 단백질에 대한 본 발명에 따른 Gpg-포함 화합물의 향상된 친화성을 보여준다(굵은 글씨). 표 3b에서는 상기 세포에서 발현되는 동일한 단백질에 대한 화학식 I 화합물의 친화성을 보여준다. 도 6에서는 Arg-포함 펩티드(P43)와 비교하여 LG2 세포의 표면에서 발현되는 MHC 단백질에 본 발명의 바람직한 헵타머 화합물 P47(Gpg-포함)의 향상된 IC50을 도시한다. 도 7에서는 Arg-포함 펩티드(P71)와 비교하여 Priess 세포의 표면에서 발현되는 MHC 단백질에 대한 본 발명의 테트라머 화합물P74(Gpg-포함)의 향상된 IC50을 도시한다.
실시예 16: 혈장에서 화합물의 안정성
펩티드유사 화합물의 안정성은 쥐(Charles River Laboratories, Sulzfeld), 생쥐(Charles River Laboratories, Sulzfeld), 사람(Bayerisches Rotes Kreuz, Mnchen) 혈장에서 측정하였다(E. R. Garrett and M. R. Gardner, J Pharmaceutical Sciences 71(1982) 14-25).
표 3a에서는 혈장에서 본 발명의 Gpg-포함 화합물의 향상된 안정성(굵은 글씨)을 보여주고, 도 8에서는 쥐 혈장에서 24시간후 Arg-포함 균등물(P51)과 비교하여 본 발명의 Gpg-포함 헵타머 화합물(P53); Arg-포함 균등물(P12-1)과 비교하여 본 발명의 Gpg-포함 테트라머 화합물(P66-1); Arg-포함 균등물(P82)과 비교하여 본 발명의 Gpg-포함 테트라머 화합물(P69); 이들 Arg-포함 균등물과 비교하여 본 발명의 다른 바람직한 화합물의 향상된 안정성(임의 단위)을 보여준다. 표 3b에서는 NH2종결기를 갖는 화합물과 비교하여 화학식 I 화합물의 향상된 안정성(굵은 글씨)을 보여준다.
화합물 원액은 혈장에 희석하여 5 μM의 최종 화합물 농도를 제공하고, 혼합물은 37℃에서 배양하였다. 0시, 6시, 24시에, 1 ㎖ 샘플을 채집하고, 혈장 단백질은 3 ㎖ 아세토니트릴 p.a.를 첨가하여 침전시키고 회전 혼합하였다. 침전물은 2000 g에서 5분동안 원심분리로 펠렛하였다. 상층액은 증발 건조시키고, 잔류물은 400 ㎕ 50% 아세토니트릴, 물에 녹인 0.1% TFA에서 재구성하였다.
여과(0.2 ㎛)이후, 200 ㎕ 용액은 역상 HPLC(PerSeptive Biosystems; Nucleosil 100-5 C18, 12.5 x 0.46 cm; 0.1% 수성 TFA에서 20-50% 아세토니트릴; 30분)로 분석하고, 남아있는 화합물의 양은 적절한 피크의 적분으로 산정하였다. 따라서, 불안정한 화합물에 대한 PBS 대조를 준비하였다.
실시예 17: 카텝신 B1과 D에 의한 분해에 대한 화합물의 안정성
리소좀 분해에 대한 펩티드유사 화합물의 안정성은 50 μM의 화합물 농도 및 0.4 U/μmol의 효소/기질 비율을 이용하여 37℃에서 4시간동안 카텝신 B1(소 비장으로부터 EC 3.4.22.1; Sigma-Aldrich, Taufkirchen; ddH20에서 10000 U/1로 용해됨)과 D(소 비장으로부터 EC 3.4.23.5; Sigma-Aldrich, Taufkirchen; ddH20에서 10000 U/1로 용해됨)와의 배양으로 검사하였다. 이들 샘플은 내부 기준으로 25 ppm 4-이소프로필 벤질 알코올(IPBA; Sigma-Aldrich,Taufkirchen)을 포함하였다.
분석 완충액은 DMSO에 녹인 35 ㎕ 1% IPBA 용액 및 28 ㎕의 10000U/l 카텝신 B1 또는 카텝신 D 원액을 각각 14 ㎖의 100 mM 아세트산나트륨, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 5.00 또는 100 mM 아세트산나트륨, pH 4.50에 첨가하여 준비하였다. 8.8 ㎕의 5 mM(또는 4.4 ㎕의 10 mM) 화합물 원액(10% DMSO/물에서)은 1.5 ㎖Eppendorf 튜브에 위치시켰다. 반응은 875 ㎕ 완전 보충된 분석 완충액을 각 튜브에 첨가하고 회전 혼합하며 37℃에서 배양하여 개시시켰다. 0시와 4시에, 400 ㎕ 샘플을 채집하고, 효소는 40 ㎕ 50% TFA aq 첨가로 불활화시켰다. 샘플은 RP-HPLC(200 ㎕ 주입 용적; Nucleosil 100-5 C18, 12.5 x 4.6 cm; 농도 구배: 20-50% 아세토니트릴; 30 min)에 의한 분석 때까지 -20℃에 동결 보관하였다.
카텝신 B1과 카텝신 D의 효소 활성은 각각 Ac-Cha-RAMASL-NH2와 QYIKANSLFIGITELK의 배양으로 조절하는데, 이들 둘 모두 4시간이내에 완전히 분해되었다.
RP-HPLC 분석동안 내부 기준과 동시-용리하는 화합물은 실시예 16에서처럼 기준 없이 검사하였다.
표 3(a, b, c)에서는 특정 카텝신 효소에 대한 본 발명에 따른 화합물의 안정성을 보여준다.
실시예 18: 동시-면역화에 의한 0401(DR4)과 0404(DR14) 키메라 MHCⅡ-생쥐로부터 T 세포 활성화의 생체내 저해
생쥐 균주 DR4와 DR14는 뮤린 클래스 Ⅱ 분자 IEd의 개별 DR 분자(펩티드 결합 부위를 형성)의 N-말단 도메인 및 나머지 부분(두 번째 세포외 도메인, 막통 도메인, 세포질내 도메인)을 인코드하는 키메라 MHC-Ⅱ 외래유전자를 보유한다. 이들 균주는 다른 뮤린 클래스 Ⅱ가 결핍되고, 따라서 모든 보조 T 세포 반응은 개별 사람 MHC-Ⅱ 결합 부위에서 제시되는 펩티드에 의해 유도된다. DR에 결합하도록 설계된 표제 저해제의 최초 생체내 검사에서, DR-유전자도입 생쥐는 소정량의 단백질 항원 및 서로 다른 함량의 검사 화합물 길항제로 동시-면역시켰다. 이런 설정에서, 항원과 화합물 모두 완전 Freund 어쥬번트(CFA)에서 동시에 유화시켜, DR에 의한 전시에서 2가지 구성 요소간 경쟁을 검사하였다. 이런 분석의 리드아웃(readout)은 동시-면역화이후 9일에, 외식된 지역 림프절로부터 T 세포의 생체외 항원-특이적 활성화이다. 전형적인 실험에서 항원 용량-반응을 조사하고, 항원으로 면역된 생쥐의 곡선은 항원 + 화합물로 동시-면역된 생쥐의 곡선과 비교하였다. 이들 용량 반응 곡선은 실험군당 2-3마리의 균일한 개체수의 생쥐로부터 모아진 림프절 세포를 이용하여 발생시켰다. 이런 실험 시스템은 화합물 길항제의 내재된 항원성의 평가가 가능하다. 이는 항원 대신에 서로 다른 농도의 연구 화합물을 이용하여 동일 세포 풀로부터 용량-반응 연구를 설정함으로써 달성하였다. 특이성 대조로써, CFA의 주요 단백질 성분인 정제된 단백질 유도체(PPD)에 대한 반응을 동일 세포 풀에서 검사하였다.
도 14에서는 Arg-포함 균등물(P82)과 비교하여 본 발명의 바람직한 테트라머 화합물 P69의 우수한 생체내 저해 효과를 보여준다. 도 15에서는 본 발명의 바람직한 테트라머와 헵타머 화합물의 생체내 저해 효과를 보여준다.
연구 화합물에 대한 전반적인 저해 잠재력은 2가지 농도의 항원; 6.7, 20, 60 ㎍과 비교하여 대조로부터 평균 % 저해를 산정하여 평가하였다. 표 4에서는 특정 Arg-포함 균등물과 함께, 본 발명의 특정 화합물의 전반적인 저해 잠재력에 관한 평가를 보여준다. 모든 Gpg-포함 화합물은 생체내 모델중 하나 또는 둘 모두에서 현저한 면역억제 특성을 나타낸다. 또한, Gpg-포함 화합물은 Arg-포함 균등물과 비교하여 향상된 활성 또는 향상된 특이성을 보인다. 게다가, 화학식 I 화합물이 이런 분석에서 활성을 보인다.
18.1 동시-면역화를 위한 화합물의 준비
본 발명의 화합물은 CFA(Bacto Adjuvant Complete H37 Ra, Difco, Order-No. 3113-60); PBS에서 단백질 10 ㎎/㎖, 10% DMSO에서 저해물질 5 μM를 이용하여 준비된 에멀젼으로 주사하였다. CFA, PBS, 항원, 저해물질은 5-㎖ 주사기의 몸통에 위치시켰다(전체 용적 1 ㎖ 이하). 혼합물은 2회 반복된 15초 기간동안 40 %(30-35%) 미만의 폭으로 초음파처리하였다. 이 시점에서 에멀젼은 딱딱하고 액체가 아니다. 물 표면에 위치된 에멀젼 방울은 녹지 않는다. 생성된 에멀젼은 바늘을 통하여 바늘이 달린 1 ㎖ 주사기(Gr.18, 26G x 1")에 밀어 넣고, 기포를 제거하였다. 생쥐는 최종 100 ㎕ 에멀젼에 녹인 50 ㎍ 단백질과 210 nM 화합물로 꼬리 기부에 동시-면역시켰다. 항원 + 화합물 및 CFA는 1:1 vol/vol로 혼합한다. 최적 결과는 HEL로 면역된 DR 4 생쥐 및 OVA로 면역된 DR 14 생쥐에서 달성되었다.
18.2 생쥐의 면역화
생쥐는 아래와 같이 꼬리-기부에 주사하였다: 엄지와 중지로 생쥐의 꼬리를 잡고, 검지는 생쥐 꼬리의 기부 아래에 위치시켰다. 주사기 바늘은 꼬리 기부로부터 1.5 ㎝ 지점에 피부 아래에 삽입하고 꼬리에서 1 ㎝ 정도 밀어 넣었다. 100 ㎕ 에멀젼을 생쥐에 주사하였다. 9일후, 생쥐는 죽이고 림프절을 떼어냈다.
18.3 동시-면역화이후 T 세포 증식 분석
T 세포 활성화에 대한 후보 화합물의 저해 효과는 표준 과정(Adorini et al., 1988, Mueller et al., 1990; Current Protocols in Immunology, Vol. 2,7. 21; Ito et al., 1996)에 따라, 계란 라이소자임 + 화합물로 미리 동시-면역된 키메라 DR4-IE 유전자도입 생쥐(Taconic, USA) 또는 난알부민 + 화합물로 동시-면역된 DR14-IE 유전자도입 생쥐의 림프절로부터 분리된 T-세포와 항원-제시 세포를 이용하여 검사하였다.
면역화이후 대략 9일(예, 8-10일)에, 생쥐는 죽이고 림프절을 떼어내며, 단백질 항원과 화합물 길항제로 동시-면역된 생쥐로부터 분리된 림프절 세포에 항원의 양을 증가시켜 실시예 19.1에 따라 T 세포 증식 분석을 실시하였다.
아래의 분석 계획에 따라 항원 희석액을 준비하고 96-U-웰-MTP에 분산시켰다. PPD는 T-세포 증식에 대한 양성 대조로 이용한다.
배지(음성 대조)
100 ㎕ HL-1
100 ㎕ 세포(2.5 x 105세포)
PPD(양성 대조)
100 ㎕ PPD 용액(100 ㎍/㎖)
100 ㎕ 세포(2.5 x 105세포)
저해물질 대조
100 ㎕ 화합물 용액(100 - 3.125 μM)
100 ㎕ 세포(2.5 x 105세포)
항원-적정(600 ㎍/㎖ - 0.82 ㎍/㎖)
100 ㎕ 항원 용액
100 ㎕ 세포(2.5 x 105세포)
세척 배지
97.5 % RPMI
1.5 % FCS
1% 카나마이신(원액 10 ㎎/㎖ → 최종 0.1 ㎎/㎖)
HL-1 배지
98% HL-1 배지(BioWittaker Europe Order-no. 77201)
1% L-글루타민(원액 200 mM → 최종 2 mM)
1% 카나마이신(원액 10 ㎎/㎖ → 최종 0.1 ㎎/㎖)
혈청 없음
원액
HEL(라이소자임 등급 III: 계란 흰자; Sigma L-7011) 10 ㎎/㎖ PBS
OVA(계란 알부민; Sigma A-2512) 4 ㎎/㎖ PBS
PPD(투베르쿨린 PPD; Statens Serum Institut; Order-no. 2391) 1 ㎎/㎖(사용 준비)
사용 용액
HEL: HL-1 배지(120 ㎍/㎖)로 1:83 희석 원액 → 웰에서 최종 농도 30 ㎍/㎖.
OVA: HL-1 배지(84 ㎍/㎖)로 1:48 희석 원액 → 최종 21 ㎍/㎖.
PPD: HL-1 배지(100 ㎍/㎖)로 1:10 희석 원액 → 최종 25 ㎍/㎖.
실시예 19: 본 발명의 화합물에 의한 T 세포 활성화의 시험관내 저해
연구 화합물의 면역조절 특성은 T 세포 증식을 측정하는 분석으로 검사하였다. 표 3(a와 b)은 특정 화합물의 IC50(μM)과 최대 저해(%)를 보여준다. 도 9에서는 Arg-포함 펩티드(P51)와 비교하여 본 발명의 바람직한 헵타머 화합물 P53(Gpg-포함)의 T-세포 활성화 분석에 의한 측정에서 향상된 면역억제 특성을 입증하는 용량-반응 곡선을 보여준다. 본 발명의 다른 화합물(P41-1)의 용량-반응 곡선 역시 도시한다. 도 10에서는 본 발명의 다양한 바람직한 화합물: P69, P101, P74, P53의 T-세포 활성화 분석에 의한 측정에서 향상된 면역억제 특성을 입증하는 용량-반응곡선을 보여준다.
화합물은 RA-연관된 펩티드 결합 부위가 존재하는 키메라 생쥐-사람 클래스 Ⅱ 외래유전자를 보유하지만 뮤린 클래스 Ⅱ 분자가 결핍된 생쥐로부터 분리된 항원-기폭된 림프절 세포에서 증식성 T 세포 반응의 저해를 아래와 같이 검사하였다(Muller et al., 1990; Woods et al., 1994; Current Protocols in Immunology, Vol. 2,7.21 ; Ito et al., 1996). 여기에서, 면역화는 생체내에서 진행되는 반면, 저해와 리드아웃은 생체외에서 진행된다. RA 연관된 분자의 결합 부위가 존재하는 MHC 클래스 Ⅱ를 발현하는 유전자도입 생쥐, DRB*0401은 상업적으로 입수하였다. 이들 생쥐는 뮤린 MHC 클래스 Ⅱ가 결핍되고, 따라서 모든 Th 반응이 단일 사람 RA-연관된 MHC 클래스 Ⅱ 분자를 통해 진행된다(Ito et al. 1996). 이들 유전자도입 생쥐는 사람 클래스 Ⅱ 길항제를 검사하는 모델을 대표한다.
19.1 T 세포 증식 분석
연구 화합물의 저해 효과는 표준 과정에 따라 계란 알부민으로 미리 면역된 0401-IE 유전자도입 생쥐(Taconic, USA)로부터 분리된 키메라 T-세포와 항원 제시 세포를 이용하여 측정된 T-세포 증식에서 검사하였다(Ito et al. 1996). 1.5x105세포는 2 mM L-글루타민과 0.1 g/ℓ 카나마이신을 함유하는 혈청 없는 HL-1 배지에서 오브알부민(30 ㎍/웰 - 반-극대 촉진 농도)과 희석된 일련의 검사 화합물(대략 0.1 내지 200 μM)의 존재하에 96-웰 조직 배양 평판의 0.2 ㎖ 웰에 3일동안 배양한다. 항원 특이적 증식은 최종 16시간 배양동안 3H-메틸-티미딘(1 μCi/웰) 함입으로 측정한다(Falcioni et al., 1999). 세포는 수확하고, 3H 함입은 신틸레이션 계수기(TopCount, Wallac Finland)로 측정하였다. 화합물 처리에 따른 T-세포 증식의 저해는 항원을 포함하는 대조 웰과 비교하여 관찰한다.
실시예 20: 본 발명의 화합물에 의한 T-세포 하이브리도마 세포로부터 IL-2 분비의 저해
본 발명의 Gpg-포함 화합물은 영속화된 T-세포로부터 IL-2 분비를 측정하는 분석에서 현저한 면역조절 특성을 보였다. 표 3a에서는 상기 분석에서 Gpg 화합물의 IC50(μM)과 최대 저해(%)를 보여준다. 표 3b에서는 NH2종결기를 보유하는 화합물과 비교하여 화학식 I에 따른 테트라머 화합물의 향상된 활성(굵은 글씨)을 보여준다. 도 11에서는 Arg-포함 펩티드(P40-1)와 비교하여 본 발명의 헵타머 화합물 P41-1(Gpg-포함)의 IL-2 분비에 의한 측정에서 향상된 면역억제 특성을 입증하는 용량-반응 곡선을 도시하고, 도 12에서는 Arg-포함 펩티드(P82)와 비교하여 본 발명의 바람직한 테트라머 화합물 P69(Gpg-포함)의 IL-2 분비에 의한 측정에서 향상된 면역억제 특성을 입증하는 용량-반응 곡선을 도시한다. 도 13에서는 DMSO 대조와 비교하여 본 발명의 바람직한 헵타머 화합물 P53(Gpg-포함)의 면역억제 특성을 도시한다.
연구 화합물의 면역조절 특성은 반-극대 항원 자극의 조건하에 DR-유전자도입 항원 제시 세포(APC)로 자극된 하이브리도마 세포주 T-Hyb1로부터 IL-2 분비를 측정하여 조사하였다. IL-2 분비는 OptiEIA 생쥐 IL-2 키트(Pharmingen, TorreyPine, CA, USA)에 의해 제공되는 표준 ELISA 방법을 이용하여 탐지하고 측정하였다. APC는 표준 과정에 따라 면역되지 않은 키메라 0401-IE 유전자도입 생쥐의 비장으로부터 분리하였다(Ito et al. 1996). 1.5x105APC는 아래의 첨가물(Gibco BRL과 PAA에서 구입): 10 % FCS, 2 mM L-글루타민, 1% 비-필수 아미노산, 1 mM 소디움 피루베이트, 0.1 g/ℓ 카나마이신을 함유하는 RPMI 배지에서 96-웰의 0.2 ㎖ 웰에 첨가하였다. 계란 오브알부민은 최종 100 ㎕ 용적의 상기 배지에서 200 ㎍/㎖ 최종 농도로 첨가하고, 세포는 6% C02하에 37℃에서 상기 항원과 함께 30분동안 배양하였다. 화합물은 다양한 농도(전형적으로 0.1 내지 200 μM)로 각 웰에 첨가하고, 평판은 37℃/6% CO2에서 1시간동안 배양하고 2x105T-Hyb1 세포를 첨가하여 상기 배지에 200 ㎕의 최종 용적을 제공하였다. 24시간동안 배양한 이후, 100 ㎕ 상층액은 IL-2 포획 항체(BDPharmingen, Torrey Pine, CA, USA)로 미리 피복된 ELISA 평판(Nunc-Immuno Plate MaxiSorp surface, Nunc, Roskilde, DK)에 이전하고, IL-2 함량은 제조업자의 지시에 따라 OptiEIA 생쥐 IL-2 키트를 이용하여 정량하고, 평판은 Victor V 판독기(Wallac, Finland)를 이용하여 판독하였다. 분비된 IL-2(pg/㎖)는 상기 키트에 제공된 IL-2 기준에 기초하여 측정하였다.
T-세포 하이브리도마 세포주 T-Hyb1은 흉선종 세포주 BW 5147(ATCC)의 T-세포 수용체 음성 변이체 및 계란 오브알부민으로 미리 면역된 키메라 O401-IE 유전자도입 생쥐의 림프절 세포의 융합으로 확립시켰다(Ito et al. 1996). 클론 T-Hyb1은 높은 IL-2 분비로 항원 특이적 자극에 반응하기 때문에, 분석용으로 선택되었다.
실시예 21: 생쥐 질환 모델 내에서 본 발명에 따른 화합물의 면역조절 활성
최적 프로필(시험관내와 생체내에서 결합 친화성, 프로테아제 안정성, T 세포 저해)을 보이는 화합물은 자가면역 질환, 다시 말하면 콜라겐 유도된 관절염(CIA)(류머티스 관절염 모델) 및 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)(다발성 경화증 모델)의 MHC-Ⅱ 유전자도입 생쥐 모델에서 치료 잠재력을 검사하였다.
CIA는 HLA-DR1 유전자도입 생쥐에서 Ⅱ형 콜라겐 면역화로 유도한다(Rosloniec et al., J. Exp. Med. 1997; 185: 113). 발병이후, 생쥐는 최대 허용량의 화합물로 2주동안 s.c. 처리하고 용매 단독으로 치료된 생쥐와 아래와 같이 병의 진행을 비교한다:
일자 처리
1 면역화(소 C-Ⅱ+CFA)
19-40 발병 시점에서 3주동안 주(week) 5x 화합물 s.c. 주사
질환 심각도 스코어
1. 부골 또는 발목 관절에 국한된 홍반 및 경등도 종기
2. 발목으로부터 부골로 확대된 홍반 및 경등도 종기.
3. 발목으로부터 척골 관절로 확대된 홍반 및 중등도 종기.
4. 발목, 발, 발가락으로 확대된 홍반 및 중증도 종기.
도 16에서는 류머티스 관절염의 CIA 생쥐 모델에서, 대조 용매와 비교하여 본 발명의 바람직한 화합물(P69, P53, P74)의 효능을 도시한다.
EAE는 미엘린 희돌기세포 당단백질(MOG)의 주사로 DR4 유전자도입 생쥐에서 유도한다(Ito et al. 1996). 발병 이후, 생쥐는 화합물로 처리하고 아래와 같이 검사한다:
일자 처리
1 면역화(MOG+CFA)
14-36 질환 유도 또는 발병 시점에서 주(week) 5x 화합물 s.c. 주사
질환 스코어
1. 꼬리 이완
2. 뒷다리 약화
3. 뒷다리 마비
4. 뒷다리 마비 및 앞다리 약화 또는 마비
5. 활동 중지
도 17에서는 다발성 경화증의 EAE 생쥐 모델에서, 대조 용매와 비교하여 본 발명의 바람직한 화합물(P69, P53, P74)의 효능을 도시한다.
도 18에서는 다발성 경화증의 EAE 생쥐 모델에서, 대조 용매와 비교하여 본발명의 바람직한 화합물(P69와 P53)의 효능을 도시한다.
도 19에서는 다발성 경화증의 EAE 생쥐 모델에서, 등가의 Arg-포함 화합물(P82)과 비교하여 본 발명의 바람직한 Gpg-포함 화합물(P69)의 우수한 효능을 도시한다. Gpg 화합물은 Arg 화합물(250 nM)의 절반 농도(125 nM)에서도 Arg 화합물보다 치료 효과가 우월하다.
실시예 22: 제약학적 조성물
후속 실험을 실시하기 위한 본 발명의 최적 화합물을 선별하고 면역계 질환의 치료에서 치료 조성물의 사용 적합성을 평가하기 위하여, 추가적인 데이터를 수집한다. 각 화합물에 대한 이런 데이터에는 친화성, 반응성, 특이성 및 시험관내와 류머티스 관절염과 다발성 경화증의 DR-유전자도입 생쥐에서 측정된 IL-2 분비와 T-세포 증식의 저해에 대한 IC50 값 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물의 활성은 특정 질환에 대한 이미 인정된 치료제와 비교한다. 가령, 본 발명의 특정 화합물은 다발성 경화증에 대한 인정된 치료제인 인터페론-베타와 비교한다.
적절한 친화성, 최적 특이성 및/또는 T-세포 증식 또는 IL-2 분비의 최대 저해, 적절한 모델에서 류머티스 관절염과 다발성 경화증의 높은 저해 효능을 보이는 화합물은 후속 실험을 위하여 선별한다. 이런 실험에는 예로써 동물에서 치료 프로필링(profiling)과 독물학 및 사람에서 I기 임상이 포함된다.
본 발명의 화합물은 통상적인 제약학적 조성물의 형태로 치료 또는 예방 목적으로 온혈 동물에 투여될 수 있는데, 이런 조성물의 전형적인 예는 아래와 같다:주사 용액: 0.01 내지 100 ㎎ 활성 성분을 최대 2 ㎖ 수성 주사 운반체에 용해시켜 0.01 내지 100 ㎎/㎖ 농도의 활성 성분을 제공한다. 상기 수성 주사 운반체는 필요한 경우에, 제약학적으로 허용되는 완충액(예, 포스페이트 또는 아세테이트)으로 pH를 5 내지 8로 완충하고, 등장성(isotonicity)을 달성하기 위하여 제약학적으로 허용되는 등장성 조절 약물(예, NaCl 또는 덱스트로스)을 함유한다. 또한, 상기 운반체는 다른 제약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들면 안정화제(예, DMSO, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 보존제, 항산화제를 선택적으로 함유할 수 있다. 전형적으로, 활성 성분은 본원에 기술된 화합물이고 제약학적으로 허용되는 염의 형태로 존재한다. 본 발명의 화합물은 한가지이상의 다른 활성 성분과 함께 투여할 수 있다. 이런 조성물은 단일 포장, 알약 또는 이런 활성을 함유하는 바르는 약이고, 투여는 본 발명의 화합물을 포함하는 개별 활성 성분의 순차적 또는 반복적 투여이다.
균등물
당업자는 일상적인 실험만을 수행하여 본원에 기술된 화합물 및 이의 사용 방법에 대한 다수의 균등물을 인식하거나 확인할 수 있다. 이런 균등물은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주되며, 하기 특허 청구 범위에 포섭된다.
본원에 인용된 모든 참고문헌과 간행물은 본원에 순전히 참조로 한다.
표 1. 본 발명의 Gpg-포함 화합물
a. 본 발명의 바람직한 Gpg-포함 화합물
b. 화학식 Ⅱ의 선도적 고유 펩티드(Falcioni et al; 1999)의 바람직한 의사(擬似) 치환
c. 화학식 I의 선도적 고유 펩티드(Falcioni et al; 1999)의 바람직한 의사(擬似) 치환
표 2. 본원에 기술된 분석으로 조사된 다른 화합물
표 3. a. 본 발명의 특정 화학식 Ⅱ 화합물의 생물학적 특성
표 3. b. 본 발명의 특정 화학식 I 화합물의 생물학적 특성
표 4. 본 발명의 특정 화합물 및 이들의 Arg-포함 균등물의 동시-면역화에 의한 T 세포 활성화의 생체내 저해

Claims (29)

  1. 화학식 Ⅱ 화합물:
    화학식 Ⅱ
    결합가(valency)와 안정성(stability)이 허용되는 경우에,
    A는 부재하거나 1 내지 4개의 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기의 서열이고;
    B는 2 내지 8개 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기의 서열이고;
    W는 OR7또는 NR8R9이고;
    V는 각 경우에 독립적으로 C=O, C=S 또는 SO2이고;
    X는 부재하거나 O, S 또는 NR이고;
    R은 각 경우에 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고;
    R1은 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴 또는 헤테로사이클릴알킬 부분이고;
    R2는 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴 또는 헤테로사이클릴알킬 부분, 적절하게는 소수성 부분이거나, 또는 R2와 R이 서로 결합하여 1 내지 5개 치환체로 임의의 치환된 5 내지 7원, 적절하게는 6 내지 7원 고리를 형성하거나 한가지 이상의 다른 고리, 예를 들면 아릴, 헤테로사이클릴 또는 카르보사이클릴 고리를 보유하는 폴리환형 구조를 형성하고;
    i는 0-1의 정수이고;
    j는 1-2의 정수이고;
    k는 1-3의 정수이고;
    R6은 부재하거나, 또는 질소-보유 고리에서, 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬, 할로알킬, 할로겐, 하이드록실, 아미노에서 선택되는 1-4개 치환체이고;
    R7, R8, R9는 각각 독립적으로 H 및 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬에서 선택되는 치환체이거나, 또는 R8과 R9가 서로 결합하여 1 내지 5개 치환체로 임의의 치환된 5 내지 7원 고리를 형성하거나 한가지 이상의 다른 고리, 예를 들면 아릴, 헤테로사이클릴 또는 카르보사이클릴 고리를 보유하는 폴리환형 구조를 형성한다.
  2. 제 1 항에 있어서, R6은 부재하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, R1, R7. R8, R9중 적어도 하나는 소수성 잔기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서, A는 0 또는 1개의 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제 1 항에 있어서, B는 2 내지 6개 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제 1 항에 있어서, B는 2 내지 4개 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제 1 항에 있어서, 화합물은 면역억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제 1 항에 있어서, 화합물은 T 세포의 MHC-매개된 활성화를 저해하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제 1 항에 있어서, 아미노산 잔기는 알파-아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제 1 항에 있어서, R1XV는 서로 결합하여 아실기를 형성하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제 10 항에 있어서, 아실기는 알킬 카르보닐기, 아릴 카르보닐기, 또는 아미노알킬 카르보닐기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 제 10 항에 있어서, 아실기는 벤조일기, 저급 알카노일기, 또는 저급 아미노알카노일기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 제 10 항에 있어서, 아실기는 아세틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 제 1 항에 있어서, 표 1a에 제시된 구조에서 선택되거나 표 1b의 Gpg-포함 아단위로부터 구성되는 구조를 보유하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 제 1 항에 있어서, P60, P53, P47, P41-1, P69, P66-1, P76-1, P67, P74,P80, P101, P102에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 제 1 항에 있어서, MHC 클래스 Ⅱ 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 제 16 항에 있어서, MHC 클래스 Ⅱ 단백질은 DR 분자인 것을 특징으로 하는 화합물.
  18. 제 16 항에 있어서, MHC 클래스 Ⅱ 단백질은 0401, 0101, 0404에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 제 16 항에 있어서, 4 μM, 2 μM, 1 μM, 500 nM 또는 200 nM보다 우월한 IC50으로 MHC 클래스 Ⅱ 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  20. 제 1 항에 있어서, 생쥐 혈청에서 24시간후 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%보다 높은 안정성을 보이는 것을 특징으로 하는 화합물.
  21. 제 1 항에 있어서, 쥐 혈청에서 24시간후 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%보다 높은 안정성을 보이는 것을 특징으로 하는 화합물.
  22. 제 1 항에 따른 화합물 및 제약학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 제약학적 조성물.
  23. 제약학적 조성물의 제조에 사용되는 제 1 항에 따른 화합물의 용도.
  24. 제 23 항에 있어서, 제약학적 조성물은 T 세포의 MHC 클래스 Ⅱ-매개된 활성화 또는 병적 염증 부위에서 MHC 클래스 Ⅱ 단백질의 발현으로 특성화되는 질환을 치료하거나 예방하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  25. 제 24 항에 있어서, 질환은 류머티스 관절염, 연소형 관절염, 다발성 경화증, 그레이브스 병(Grave's disease), 인슐린-의존성 당뇨병, 가면발작, 건선, 전신 홍반성 낭창, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 동종이식편 거부반응, 이식장기 거부반응, 이식편 vs. 숙주 질환, 하시모토 병(Hashimoto's disease), 중증근무력증(myasthenia gravis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 갑상선염(thyroiditis), 사구체신염(glomerulonephritis), 췌장염, 원발성 담증성 간경병증(primary biliary cirrhosis), 쉐그렌 증후군(Sjogren syndrome), 경피증(scleroderma), 다발성근염(polymyositis), 피부근염(dermatomyositis), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 굿패스츄어 증후군(Goodpasture's syndrome), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 악성 빈혈(pernicious anemia),특발성 혈소판 감소증 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura), 췌도염(insulitis), 과민성 대장 증상, 에디슨 병(Addison's disease)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  26. 제 24 항에 있어서, 질환은 류머티스 관절염과 다발성 경화증에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  27. 제 1 항에 따른 화합물을 동물에 투여하여 면역반응을 억제하는 방법.
  28. 화학식 I 화합물:
    화학식 I
    결합가(valency)와 안정성(stability)이 허용되는 경우에,
    A는 부재하거나 1 내지 4개의 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기의 서열이고;
    B는 2 내지 8개 아미노산이나 아미노산 유사체 잔기의 서열이고;
    X는 부재하거나 O, S 또는 NR이고;
    W는 OR7또는 NR8R9이고;
    V는 각 경우에 독립적으로 C=O, C=S 또는 SO2이고;
    R은 각 경우에 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고;
    R1은 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴 또는 헤테로사이클릴알킬 부분이고;
    R2는 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴 또는 헤테로사이클릴알킬 부분이거나, 또는 R2와 R이 서로 결합하여 1 내지 5개 치환체로 임의의 치환된 5 내지 7원 고리를 형성하거나 한가지 이상의 다른 고리를 보유하는 폴리환형 구조, 예를 들면 융합된 이중환을 형성하고;
    R3은 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴 또는 헤테로사이클릴알킬 부분이고;
    R7, R8, R9는 각각 독립적으로 H 및 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬에서 선택되는 치환체이거나, 또는 R8과 R9가 서로 결합하여 1 내지 5개 치환체로 임의의 치환된 5 내지 7원 고리를 형성하거나 한가지 이상의 다른 고리를 보유하는 폴리환형 구조를 형성하고;
    여기서 W는 적어도 6개의 비-수소 원자를 보유한다.
  29. 제 30 항에 있어서, R8과 R9중 적어도 하나는 벤질, 페네틸, 2-하이드록시에틸, -CH2CH2OCH2CH2OH에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
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