CN1643134A - 制备假胰岛的方法 - Google Patents
制备假胰岛的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1643134A CN1643134A CNA038067404A CN03806740A CN1643134A CN 1643134 A CN1643134 A CN 1643134A CN A038067404 A CNA038067404 A CN A038067404A CN 03806740 A CN03806740 A CN 03806740A CN 1643134 A CN1643134 A CN 1643134A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- insular
- artificial insular
- artificial
- diabetes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1323—Adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Abstract
本发明涉及制备假胰岛的方法。另外,本发明还涉及通过施用按照本发明的方法识别的化合物来治疗糖尿病和糖尿病相关病症的方法。
Description
本申请要求的优先权为U.S.临时专利系列号60/366,728,申请日为2002年3月22日,此处全文引用作为参考。
发明领域
本发明涉及制备功能性假胰岛(pseudo islet)的方法。另外,本发明还涉及通过施用按照上述确定识别的化合物来治疗糖尿病和糖尿病相关病症的方法。
发明背景
糖尿病以糖尿病患者糖代谢障碍,血糖水平升高为其主要特征。按照障碍,可以将糖尿病分为两种类型:1型糖尿病,或者胰岛素依赖型糖尿病(IDDM),当病人缺乏β-细胞(在胰腺,β-细胞产生胰岛素)时发生此病症,和2型糖尿病,或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM),当病人β-细胞功能受损和胰岛素效应变化时发生此病症。
2型糖尿病更为普遍,90-95%的高血糖病人罹患此型糖尿病。2型糖尿病的发病机理是胰岛素抵抗和胰岛素缺乏。只要胰腺β-细胞保持释放足够量胰岛素的能力来弥补胰岛素抵抗,胰岛素抵抗病人就能保持血糖正常而不发展成显性糖尿病。然而,β-细胞不能一直保持胰岛素的高输出,最终,葡萄糖诱导的胰岛素分泌下降,导致葡萄糖内环境稳态失衡,进而发展成显性糖尿病。高胰岛素血症还与胰岛素抵抗、高甘油三酯血症、低的高密度脂蛋白(HDL)胆固醇和血浆低密度脂蛋白(LDL)浓度的升高相关联。胰岛素抵抗以及高胰岛素血症与相关的代谢病症的组合称为“X综合症”,其与提高的患高血压和冠状动脉疾病的风险十分相关。
糖尿病药物治疗的一个方法是提高胰岛的功能,尤其是增强葡萄糖刺激的胰岛素释放。即施用引起分泌葡萄糖依赖的胰岛素的药物会降低与疾病相关的高血糖而不导致低血糖或引起不适当的高胰岛素水平。然而,促胰岛素化合物的识别和发展需要高效有力的方法来评价葡萄糖依赖的胰岛素的释放。
除影响胰岛素分泌外,治疗糖尿病(例如1型、2型、受损的葡萄糖耐量)的另一个方法是保存或恢复β-细胞量。最近的研究表明GLP-1及其类似物,如exendin-4,通过提高β-细胞的新生和增殖而引起β-细胞量的增加((De Leon等,Diabetes 52:365-371,2003;Farilla等,Endocrinology 143:4397-4408,2002)。通过影响凋亡、新生或者增殖来影响β-细胞量的药物是治疗1型和2型糖尿病的有用药剂。因而,识别提高胰岛素生物合成的药物,对于通过防止或延缓β-细胞衰竭来治疗糖尿病及其相关病症是非常有益的。
目前,多数培养的胰腺β-细胞系对生理浓度的葡萄糖不产生应答,因此不适于鉴定靶向于葡萄糖调节的胰岛素释放的化合物。分离的原代胰岛保留了葡萄糖应答性;然而,这些细胞的利用受限于:(1)胰岛的异质性,导致不同组间的胰岛有较大的差异;和(2)可分离的功能胰岛的数量有限。
通过使用胰蛋白酶将胰岛组织分散成单个细胞等尝试来降低胰岛间的变异。然而,这些分散的胰岛细胞丧失了在葡萄糖及其它促分泌素刺激下释放胰岛素的能力。已证实一些细胞-细胞间的相互作用对功能来讲是必须的。因而,分散的胰岛细胞间的重新聚集是恢复其拓扑结构及保持生理调节胰岛素释放性能的一个途径。
分散的胰岛细胞重新聚合形成假胰岛可以通过许多方法来实现,例如,将胰岛细胞培养几天(Weir等,Metabolism 33:447-453,1984),将该细胞机械旋转2小时(Pipeleers等,Endocrinology117:806-816,1985),或者通过将细胞与珠子混合Hopcroft等,Endocrinology 117:2073-2080,1985)。但是,这些方法非常耗时,且所产生的假胰岛在大小及产量方面均有较大变化。由于这些限制,这些方法不适于发现药物。
本发明提供了一种新的产生均匀分布假胰岛的方法。本发明的方法还可以用于筛选靶向于胰腺β-细胞的化合物并且评价这些化合物对胰岛素释放的效力。
发明概述
本发明提供了一种新的制备均匀分布假胰岛的方法。在一个实施方案中,本发明的方法包括将胰岛用酶消化以及将分散的胰岛接种到容器中,容器的表面积从顶部到底部逐渐减少(例如“V-底”板,离心管,锥形管)。在另一个实施方案中,制备假胰岛的方法包括进一步的离心步骤。尤其是,在将分散的胰岛细胞加入容器后,进行离心。在另一个实施方案中,用于消化胰岛的酶包括,例如,胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶I。另一方面,消化的胰岛细胞在接种至容器前,进行过滤。
另一方面,假胰岛可以从新鲜或冷冻的胰岛分离。另外,假胰岛可以从任何动物,包括哺乳动物中分离。
用本发明的方法制备的假胰岛可以用于多种分析。一方面,假胰岛可以用于例如筛选和评价促胰岛素或其它化合物。在另一个实施方案中,假胰岛可以用于例如测定胰岛素浓度及分析胰岛素的生物合成。在另一个实施方案中,用本发明的方法制备的假胰岛可以用于表征化合物对第二信使活性(Second messenger actirity)的影响(例如,cAMP、三磷酸肌醇(IP3)、钙)。本发明的另一个实施方案涉及利用假胰岛来检测胰岛细胞代谢物。而且,用本发明的方法制备的假胰岛可以用于检测胰高血糖素和促生长素抑制素释放以及各种化合物对胰高血糖素和促生长素抑制素的调节。
另一方面,本发明的假胰岛可以与其它类型细胞(如成纤维细胞)共培养。
本发明还涉及通过给需要的病人施用通过本发明的方法识别的化合物来治疗糖尿病和糖尿病相关病症的方法。
本发明的另一个实施方案涉及制备假胰岛的试剂盒。在本发明的一个实施方案中,该试剂盒可以包括,例如,消化酶和容器(如“V-底”板)。在另一个实施方案中,试剂盒还可以包括,例如,滤膜(尼龙滤膜)和缓冲溶液。
附图说明
图1.图1表示对用本发明的方法制备的假胰岛的表征。具体地说,用葡萄糖(A栏)、乙酰胆碱(B栏)、GLP-1(C栏)以及优降糖(D栏)孵育假胰岛,然后评价这些化合物对胰岛素释放的影响。
图2.图2表示对用本发明的方法制备的假胰岛的表征。具体地说,用胰岛素释放促分泌素(毛喉素和IBMX)以及胰岛素释放抑制剂(促生长素抑制素和去甲肾上腺素)孵育假胰岛,然后评价这些化合物对胰岛素释放的影响。
图3.表示对与成纤维细胞共培养的假胰岛的表征。将假胰岛与成纤维细胞共培养,然后用量增加的GLP-1孵育,评价共培养对胰岛素释放的影响。
图4.图4表示利用本发明的方法制备的假胰岛,来评价未知化合物对胰岛素分泌的影响。具体地讲,在有或无GLP-1存在的条件下,用未知化合物孵育假胰岛,然后评价这些化合物对胰岛素释放的影响。
发明内容
本发明不局限于特定的方法、实验设计、细胞系、动物种或属以及所述试剂等,因为上述条件可能会改变。并且,本文所用的术语仅是为了描述特定的实施方案,不应理解为对本发明的范围的限制,发明的范围仅由权利要求限定。
必须指出,除非上下文另有清楚的规定,否则作为在此处的应用,单数形式“一”、“和”以及“这(个)”也包括复数形式。这样,例如,“一个细胞”表示一个或多个细胞,也包括本领域技术人员公知的它的等同物等等。
另外,除非特别指明,本文所用的科技术语的含义是本领域所通用的含义。
定义
为方便起见,将说明书、实施例以及权利要求中所使用的特定术语和词组的含义定义如下。
术语胰岛指任何小微粒状内分泌细胞的群体,其在胰腺的小管和胰泡间形成吻合的小梁,分泌胰岛素、胰高血糖素以及促生长素抑制素。
假胰岛指被重新聚集的分散的假胰岛细胞。
完整的胰岛指保留天然拓扑结构的分离的胰岛。
术语促胰岛素指刺激或影响胰岛素的产生和活性。
术语动物包括所有的哺乳动物如啮齿类(例如大鼠、小鼠、豚鼠和仓鼠)、灵长类包括人和猴、绵羊、犬(如狗)、猫、牛以及猪(如猪)。
术语容器指任何表面积从顶端到底部逐渐减少的容器。例如,容器可以是但不局限于“V”-底板、“U”-底板、离心管、锥形管、培养管、96孔板以及384孔板)。
术语化合物包括但不局限于激动剂(agonist)、拮抗剂、小分子以及抗体。例如,术语“激动剂”指模拟或上调(例如加强或补充)蛋白的生物活性的物质。激动剂可以是野生型蛋白或其衍生物,该衍生物具有野生型蛋白的至少一种生物活性。激动剂也可以是上调基因表达或提高蛋白的至少一种生物活性的化合物。激动剂还可以是提高多肽与另一种分子,例如,靶肽或核酸的相互作用的化合物。
“拮抗剂”是指下调(阻断或抑制)蛋白的至少一种生物活性的物质。拮抗剂可以是抑制或减弱蛋白质与另一种分子,例如,靶肽或酶解物的相互作用的化合物。拮抗剂还可以是下调基因表达或减少已表达蛋白的量的化合物。
“小分子”指核酸、肽、多肽、模拟肽(Peptidomimetics)、碳水化合物、脂类或其它无机或有机分子。
术语“抗体”包括任何同种型(IgG,IgA,IgM,IgE等)的全抗体及其片段。抗体可以用常规的技术片段化,片段可以按应用进行筛选。因而,该术语包括能与某种蛋白选择性相互作用的抗体分子的蛋白酶刀割或重组制备的片段。此种蛋白水解和/或重组片段的例子包括但不局限于Fab、F(ab′)2、Fab′、Fv以及含有通过肽接头连接的V[L]和/或V[H]的单链抗体(scFv)。这些单链抗体可以通过共价或非共价连接,形成具有两个或多个结合位点的抗体。本发明包括多克隆、单克隆或其它纯化制备的抗体及重组抗体。
本发明描述了均匀分布的假胰岛的制备及其在促胰岛素化合物的研究和开发中的应用。
迄今为止,利用细胞培养板中的胰岛细胞来研究胰岛素释放的多种努力的失败主要归因于两个方面:1)胰岛拓扑结构的缺失,因而缺乏对胰岛素促分泌素的应答;和2)延长培养后,细胞对培养板粘附的缺失。
为了解决这些问题,本发明提供了新的利用胰岛细胞孵育方法的途径。该方法的关键步骤是将分散的胰岛细胞接种到容器,其中该容器的表面积从顶部到底部逐渐减少(例如,“V底”板)。接着离心后产生假胰岛。使用此类容器的优点是分散的胰岛细胞收集在容器的底部,形成细胞簇。细胞簇形成假胰岛。此细胞收集步骤不能在平底板完成,因为离心只将细胞沿着板底部分散,因此细胞不能形成假胰岛。
离心是该制备假胰岛方法的另一关键步骤。在分散的细胞接种于容器后,单个细胞会在容器底部不均匀的分布。这些不均匀的细胞簇在大小上不同,因而在胰岛素释放方面也会有较大差异。此种表面积从容器顶部到底部逐渐减小的容器与离心步骤的结合使相似假胰岛的产生成为可能。因此,这种假胰岛的制备方法是非常高效并有力的。过夜培养后,胰岛素释放恢复,假胰岛对葡萄糖及其它促分泌素产生应答。而且,该方法还使得培养基更换过程中细胞的损失最小化,其中培养基的更换在实验中可能会有多次。
与传统的静态胰岛孵育方法相比,本发明的胰岛细胞孵育方法有两个主要的优点。首先,该方法大大降低了完整胰岛的胰岛素释放的变异。胰岛由α-、β-和δ细胞组成,这些细胞类型的组成在不同的胰岛有很大的差异。另外,每个胰岛的细胞总量的范围在1,000-10,000。因而,胰岛是非同质的器官。尽管在相同的条件下进行处理,但是胰岛的异质性仍会引起不同胰岛在胰岛素释放上的较大差异(Hopcroft等,Hormon.Metab.Res.17:559-561,1985;Colella等,LIfe Sci.37:1059-1065,1985)。这种差异极大地限制了静态胰岛孵育在药学工业上的应用。在本发明的方法中,用胰蛋白酶将胰岛组织分散成单个的细胞,然后将这些细胞接种到容器中以形成假胰岛。从而克服了胰岛的异质性,大大提高了实验的质量。
其次,本发明方法极大提高了分析能力。传统的静态胰岛孵育需要在每个孵育孔加至少5个胰岛(Liang等,Biochim.Biophys.Acta1405:1-13,1998),然而,本发明的方法仅需要2,500个胰岛细胞(其大小大约相当于一个小胰岛)。另外,用完整胰岛需要相似大小的数组胰岛,而且由于分离的胰岛只有一部分可以使用,从而限制了实验的规模。但是,本发明的方法利用分散的胰岛细胞,因此所有分离的胰岛均可以用于研究中。而且,本发明的方法避免了对每个胰岛的人工筛选,在样品制备上节省了大量时间。
总之,本发明的方法是对目前使用的胰岛细胞纯化方法的改进,显著提高了胰岛细胞的制备效率以及特定实验的分析能力。
这种新方法已被用来对在传统的胰岛系统中激活或抑制胰岛素分泌的化合物和肽进行表征。例如,葡萄糖是胰岛素从胰岛β细胞释放的主要生理调节剂。当血糖水平低于或等于5mM时,基础胰岛素释放是很低的。然而,血糖水平从5mM升高到15mM时,会增加胰岛素释放,从而使血浆胰岛素水平升高。分离的胰岛细胞仍很好保留了这种葡萄糖应答性,这是评价胰岛制备和静态胰岛孵育质量的关键。利用本发明的方法,用浓度为2.5-20mM的葡萄糖孵育分散的胰岛细胞。随着培养基中葡萄糖浓度的升高,胰岛素从β-细胞中的释放逐渐增加,在葡萄糖浓度为15mM时达到平台(见图1,A)。该结果表明,由本发明的分散的胰岛细胞方法制备的假胰岛保留了葡萄糖应答性和胰岛素释放。
在另外的研究中,用本发明的方法制备的假胰岛来分析乙酰胆碱、GLP-1以及优降糖对胰岛素释放的影响。乙酰胆碱(Ach)是能以葡萄糖依赖方式刺激胰岛素释放的神经递质,GLP-1是增强葡萄糖刺激的胰岛素释放的肠促胰岛素。用含8mM葡萄糖以及Ach或GLP-1的培养基孵育按照本发明的方法制备的分散的胰岛细胞。结果发现,在Ach和GLP-1存在的情况下,观察到对胰岛素分泌的显著的刺激效应,两者的EC50值分别为10.1μM和4.8μM(图1,B和C)。这一数据表明,按照本发明的方法制备的分散的胰岛细胞对Ach和GLP-1的应答与在完整的胰岛细胞观察到的相似(Gilon等,Endocr.Rev.22:565-604,2001;Siege等,Eur.J.Clin.Invest.29:610-614,1999)。
优降糖通过阻断KATP通道以及提高细胞内钙水平刺激胰岛素释放。这种促胰岛素效应在低(3mM)和高(≥8mM)葡萄糖浓度时均可发生。这种特征性效应在完整胰岛的研究中已有报道(Boyd等,Am.J.Med.89:3S-10S,1990)。按照本发明的方法制备的分散的胰岛细胞显示与文献报道相似的胰岛素释放应答(Sako等,Metabolism35:944-949,1986)。优降糖对于胰岛素释放的EC50值在葡萄糖浓度为8mM时为0.37μuM(图1,D)。
细胞第二信使,环腺苷酸(cAMP)在葡萄糖刺激的胰岛素释放中发挥重要作用。在用完整胰岛进行的研究中,毛喉素和IBMX都增加胰岛组织中cAMP的含量,并刺激胰岛素释放(Gromada等,PflugersArch.435:583-594,1998;Ammon等,Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol.326:364-367,1984;Ziegler等,Acta Biol.Med.Ger.41:117-1177,1982)。按照本发明的方法制备的分散的胰岛细胞对胰岛素的释放也表现出相似的毛喉素和IBMX效应(图2,A)。当葡萄糖浓度为8mM时,毛喉素和IBMX对于分散胰岛细胞的胰岛素释放的EC50值分别为0.9μuM和21.9μM。
在完整胰岛的研究中已证明,葡萄糖刺激的胰岛素释放受到神经递质去甲肾上腺素(NE)或促生长素抑制素,一种肠道激素的明显抑制(Yamazaki等,Mol.Pharmacol.21:648-653,1982;Claro等,Acta Endrocrinol.(Copenh)85:379-388,1977)。按照本发明的方法制备的分散的胰岛细胞表明NE和促生长素抑制素以剂量依赖的方式抑制葡萄糖刺激的胰岛素释放,其IC50分别为56.7nM和0.9nM(图2,B)。
胰岛β-细胞的存活及其在组织培养中的功能可以通过将胰岛与其它细胞共培养而得到促进,这一点在胰岛细胞单层培养物中已有报道(Rabinovitch等,Diabetes 28(12):1108-13,1979)。按照本发明的方法制备的分散的胰岛细胞表明,当假胰岛与成纤维细胞共培养时,GLP-1介导的胰岛素分泌增强(图3)。
在按照本发明的方法制备的分散的胰岛中可以评价促胰岛素化合物在有葡萄糖存在以及有或无GLP-1存在下对胰岛素分泌的促进作用(图4)。
总之,上述研究的结果证实,按照本发明的方法制备的分散的胰岛细胞与用完整的胰岛细胞所得数据相似。因而,按照本发明的方法制备的分散的胰岛细胞适于替代传统的静态胰岛孵育方法,可以用于筛选和评价促胰岛素化合物。而且,按照本发明的方法制备的假胰岛还可以用于检测胰岛素含量、胰岛素生物合成以及化合物对例如cAMP(例如,Direct SPA Screening Biotrak Assay Kit,Amersham,Piscataway,NJ)的影响,还可以用来检测胰岛细胞的代谢物(例如,光谱或荧光酶分析或者其它任何本领域技术人员已知的方法)。
另外,在按照本发明的方法制备的假胰岛中有大量的α-细胞。因而,这些假胰岛细胞可以用于检测胰高血糖素的释放。高胰高血糖素血症在2型糖尿病是常见的现象。胰高血糖素的主要生理效应是提高肝脏葡萄糖的产生。2型糖尿病患者循环胰高血糖素水平的升高是空腹高血糖的主要原因。因此,胰高血糖素释放的抑制或胰高血糖素对靶组织效应的降低是治疗糖尿病的另一种方法。按照本发明的方法制备的分散的胰岛细胞提供了检测胰高血糖素释放及其被多种化合物调节的有力方法。
本发明的方法可以用来识别有效治疗2型糖尿病(包括伴随的糖尿病异常脂血症和其它糖尿病并发症)以及其它糖尿病相关病症如高血糖、高胰岛素血症、糖耐受损、空腹血糖受损、异常脂血症、高甘油三酯血症、X综合征、胰岛素抵抗、肥胖、动脉硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、低HDL水平、高血压、心血管疾病(包括动脉粥样硬化症、冠心病、冠状动脉疾病和高血压)、脑血管疾病、外周血管疾病、狼疮、多囊性卵巢综合症、癌症发生和增生等的化合物。
本发明的方法识别的化合物的活性可以通过大量的本领域公知的体内分析方法来验证。例如,为了验证治疗糖尿病及其相关病症例如X综合症、糖耐量受损、空腹血糖受损以及高胰岛素血症或动脉粥样硬化症和相关的疾病,例如高甘油三酯血症和高胆固醇血症的药剂的功能,可以使用如下方法:
检测血糖水平的方法db/db小鼠(购自Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)取血(通过眼或尾静脉),然后按照相等的平均血糖水平分组。口服给予(用可药用载体中的管饲法给予)待测化合物,每日一次,持续14天。然后再通过眼或尾静脉给动物取血,并检测血糖水平。各种情况下,血糖水平的检测均使用Glucometer Elite XL(Bayer Corporation,Elkhart,IN)。
检测甘油三酯水平的方法hApoAl小鼠(购自JacksonLaboratories,Bar Harbor,ME)取血(通过眼或尾静脉),然后按照相等的平均血清甘油三酯水平分组。口服给予(与可药用载体结合,以管饲法给予)待测化合物,每日一次,持续8天。然后再通过眼或尾静脉给动物取血,并检测血清甘油三酯水平。各种情况下,甘油三酯水平的检测都使用Technicon Axon Autoanalyzer(Bayer Corporation,Tarrytown,NY)。
检测HDL-胆固醇水平的方法为检测血浆HDL-胆固醇水平,给hApoA1小鼠取血,并按照相等的平均血浆HDL-胆固醇水平分组。口服给予载体或待测化合物,每日一次,持续7天。第8天取血。血浆HDL-胆固醇水平的检测用Synchron Clinical System(CX4)(BeckmanCoulter,Fulletyon,CA)。
检测总胆固醇、HDL-胆固醇、甘油三酯和葡萄糖水平的方法在另一个体内分析中,给肥胖的猴取血,然后口服给予载体或待测化合物,每日一次,连续4周,然后取血。用Synchron Clinical System(CX4)(Beckman Coulter,Fullerton,CA)分析血清总胆固醇、HDL-胆固醇、甘油三酯以及葡萄糖。脂蛋白亚类分析通过Oliver等,(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:5306-5311,2001)所述的NMR光谱学方法进行。
检测对心血管参数影响的方法
对心血管参数(如心率和血压)也进行了评价。口服给予SHR大鼠载体或待测化合物,每日一次,持续2周。通过利用Grinsell等(Am.J.Hypertens.13:370-375,2000)所述的尾部加套方法(tail-cuff method)来测量血压和心率。对猴子,血压和心率的测定利用Shen等(J.Pharmacol.Exp.Therap.278:1435-1443,1996)所述的方法。
按照上述方法或其它已知的用于评价哺乳动物上述病症治疗效果的方法,通过将这些结果与用于治疗这些病症的已知药剂的结果进行对比,可以很容易地确定治疗每种目的病症的化合物的有效剂量。治疗这些病症之一时所要给予的活性组分的量固所用化合物和剂量单位、给药方式、疗程、治疗患者的年龄和性别以及待治疗病症的性质和程度的不同而有很大的区别。
要给予的活性组分的总量通常在约0.001mg/kg-约200mg/kg,优选约0.01mg/kg-约200mg/kg体重/天。每单位剂量可以含有约0.05mg-1500mg活性组分,可以在一天内分一或多次给予。通过注射包括静脉内、肌肉内、皮下和胃肠外注射以及输液技术给予的日剂量为约0.01-约200mg/kg。日直肠剂量可以为0.01-200mg/kg总体重。透皮浓度应能保持日剂量在0.01-200mg/kg的范围。
当然,对每个患者的起始和持续剂量应根据主治医师确定的病情、所用化合物的活性、患者的年龄、患者的饮食、给药的时间、给药途经、药物的排泄率、药物的组合等的不同而有所不同。治疗的理想模式以及化合物的剂量可以由本领域技术人员通过常规的治疗实验确定。
可以将按照本发明的方法鉴定的化合物通过适当调配的药物组合物形式给予需要的患者从而达到理想的疗效。本发明所指的患者是需要对特定病情进行治疗的哺乳动物,包括人。因此,本发明包括药物组合物,所述药物组合物由可药用载体和按照本文所述方法识别的药用有效量的化合物组成。所述可药用载体是指任何以与活性组分的有效活性相一致的浓度给予时,由其所引起的副作用不致损害活性组分的药效且对患者来说相对无毒无害的载体。化合物的药用有效量是指能对治疗的特定病症产生效果或影响的量。按照本发明方法识别的化合物可以用任何有效的常规剂量单位形式与可药用载体一起给予,其中所述剂量单位形式包括,例如,直接和定时释放的制剂,口服、胃肠外、局部应用等等。
如果口服给药,则可以将化合物制成固态或液态的制剂如胶囊、丸剂、药片、锭剂、糖锭、含片、粉剂、溶液、悬浮液或乳液,可以按照药物组合物制备领域已知的方法制备。固态剂量单位形式可以是具有普通的硬或软壳的明胶型胶囊,其中含有例如表面活性剂、润滑剂和惰性填料如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。
在另一实施方案中,按照本发明的方法识别的化合物可以用常规的片剂基质制成片剂:如与粘合剂如阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶组合的乳糖、蔗糖和玉米淀粉;服用后辅助片剂给药后破碎和溶解的崩解剂如土豆淀粉、褐藻酸、玉米淀粉以及香口胶;提高片剂颗粒的流动性并防止片剂材料粘附于所冲击表面的润滑剂,如滑石粉、硬脂酸或硬脂酸镁、钙或锌;染料、着色剂和改善片剂的品质使其易被患者接受的矫味剂等等。适于口服液体剂型使用的合适的赋形剂包括稀释剂如水和醇类如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇,加或不加可药用表面活性剂、悬浮剂或乳化剂。各种其它材料可以作为包衣或改变剂量单位外观的物质使用。例如,片剂、丸剂或胶囊可以被紫胶、糖或两者所包裹。
可分散的粉剂和颗粒适于含水悬浮液的制备。其提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂及一或多种防腐剂混合的活性组分。合适的分散或润湿剂以及悬浮剂已在前面有示例。其它赋形剂如上述的甜味剂、矫味剂和着色剂也可以使用。
本发明的药物组合物也可以是水包油乳液形式。油相可以是植物油如液体石蜡或植物油的混合物。合适的乳化剂可以是(1)自然生产的胶如阿拉伯树胶和黄芪胶,(2)自然生产的磷脂如大豆和卵磷脂,(3)来源于脂肪酸和己糖醇酐的酯或部分酯,例如脱水山梨糖醇一油酸酯,和(4)所述部分酯与环氧乙烷的缩合产品,例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。乳剂还可以含有甜味剂和矫味剂。
油悬浮液可以通过将活性组分悬浮在植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或可可油;或矿物油如液体石蜡而制得。油悬浮液可以包含增稠剂如蜂蜡、硬石蜡或十六烷醇。悬浮液还可以含有一或多种防腐剂,例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯;一或多种着色剂;一或多种矫味剂以及一或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
糖浆和酏剂可以用甜味剂如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖制得。这样的配方还可以含有湿润剂、防腐剂、矫味剂和着色剂。
本发明的方法识别的化合物可以通过胃肠外给予,即皮下、静脉内、肌内或腹膜内注射,注射剂量的化合物与可药用载体在生理可接受的稀释剂中混合,其中所述可药用载体包括灭菌液体或液体混合物如水、生理盐水、葡萄糖水溶液及相关的糖溶液;醇类如乙醇、异丙醇或十六(烷)醇;二醇如丙二醇或聚乙二醇;甘油酮缩醇如2,2-二甲基-1,1-二氧戊环-4-甲醇,醚如聚(乙二醇)400;油;脂肪酸;脂肪酸酯或甘油酯;或乙酰化脂肪酸甘油酯,其中加或不加药用表面活性剂如肥皂或洗涤剂,悬浮剂如胶质、卡波姆、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素或羧甲基纤维素或乳化剂和其它药用佐剂。
可用于本发明胃肠外制剂的示例性的油是石油、动物、植物和合成来源的,例如花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂和矿物油。合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。合适的脂肪酸酯是,例如,乙基油酸酯和异丙基豆蔻酸酯。合适的肥皂包括脂肪碱性金属、铵和三乙醇胺盐以及合适的洗涤剂包括阳离子剂,例如,二甲基二烷基卤化铵、烷基卤化吡啶鎓、烷基乙酸胺;阴离子洗涤剂,例如,烷基、芳基和烯属磺酸盐、烷基、烯烃、醚和甘油一硫酸酯盐及磺基丁二酸盐;非离子洗涤剂,例如,氧化脂肪胺、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧烯聚丙烯共聚物;和两性洗涤剂,例如烷基-β-氨基丙酸盐和2-烷基咪唑啉季铵盐及其混合物。
本发明的胃肠外组合物溶液中按重量通常含有约0.5%-约25%的活性组分。防腐剂和缓冲液也可以有利地使用。为了使注射点的疼痛最小化或将其完全去除,该组合物可以含有具有约12-约17的亲水-亲脂平衡(HLB)值的非离子表面活性剂。该制剂中表面活性剂按重量占约5%-约15%。表面活性剂可以是具有上述HLB的单组分或具有所需HLB的两种或多种组分的混合物。
可用于胃肠外制剂的例证性表面活性剂是聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯族,例如,脱水山梨糖醇单油酸酯和带有疏水基的环氧乙烷的高分子量加合物,该加合物由环氧丙烷和丙二醇缩合而成。
药用组合物可以是灭菌注射水悬浮液。这样的悬浮液可以按照已知的方法使用合适的分散或润湿剂和悬浮剂制得,悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯树胶;分散或润湿剂可以是自然产生的磷脂如卵磷脂、烯烃氧化物与脂肪酸的缩合物,例如聚氧乙烯硬脂酸酯、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物,例如十七烷乙烯氧基十六烷醇、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合产物,如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯,或者环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合产物,如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。
无菌注射剂还可以是存在于无毒性的胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的灭菌注射溶液或悬浮液。此处可用的稀释剂或溶剂是,例如,水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外,灭菌的固定油也常用作溶剂或悬浮介质。为达此目的,任何刺激性小的固定油都可以使用,包括合成的一甘油酯或二甘油酯。另外,脂肪酸如油酸也可以用于注射剂的制备。
本发明的组合物还可以栓剂的形式用于直肠给药。这些组合物可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合制备,赋形剂在常温下是固态,但在直肠温度下变为液态,从而在直肠中融化释放出药物。这样的材料是,例如可可脂和聚乙二醇。
本发明方法中所用的另一种制剂利用透皮输送装置(“皮片(Patch)”)。此种透皮皮片可以用来按照控制的量提供本发明化合物的连续或不连续输注。用来输送药物的透皮皮片的结构和应用在现有技术中是已知的(参见,例如,美国专利No.5,023,252,此处引用作为参考)。这种皮片可以制备成连续地、脉动地(Pulsatile)或按需地释放药物的结构。
将药物组合物经由机械输送装置导入患者体内是理想的或必要的。输送药物的机械输送装置的构造和使用是本领域公知的。例如,将药物直接输送到脑部的直接技术通常涉及将药物输送导管放置到病人的脑室内,从而不必经过血脑屏障。这样一种用于将药物输送到机体的特定的解剖区域的可植入的输送系统在美国专利No.5,011,472中有描述,此处引入作为参考。
如果必要或需要的话,本发明的组合物还可以包含其它常规可药用的化合物组分,通常指载体或稀释剂。本发明的任何组合物均可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸或其它合适的防腐剂来保存。可以利用常规的工序将组合物制备成合适的剂型。
常用的可以用于配制药物组合物使其按照预想的途径给药的可药用成分包括:酸化剂,例如但不局限于乙酸、柠檬酸、反丁烯二酸、盐酸、硝酸和碱化剂,例如但不局限于氨水、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化钾、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、三乙醇胺和三乙醇胺(trolamine)。
其它药用组分包括,例如,但不局限于吸附剂(如粉状纤维素和活性炭);气雾剂推进剂(例如二氧化碳、CCl2F2、F2ClC-CClF2和CClF3);空气置换剂(例如氮和氩);抗真菌防腐剂(例如,苯甲酸、对-羟基苯甲酸丁酯、对-羟基苯甲酸乙酯、对-羟基苯甲酸甲酯、对-羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠);抗菌防腐剂(例如,苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、十六烷基氯化吡啶鎓、氯代丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞和乙基汞硫代水杨酸钠);抗氧化剂(例如,抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸、丁基化羟基苯甲醚、丁化羟基甲苯、次磷酸、一硫代甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、硫酸氢钠、甲醛合次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠);结合材料(例如,嵌段聚合物、天然和合成橡胶、聚丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、硅氧烷和苯乙烯-丁二烯共聚物);缓冲剂(例如,偏磷酸钾、一代磷酸钾、醋酸钠、无水柠檬酸钠和二水柠檬酸钠);载体剂(例如,阿拉伯树胶糖浆、芳香糖浆、芳香酏剂、樱桃糖浆、可可糖浆、柑桔糖浆、糖浆、玉米油、矿物油、花生油、芝麻油、无菌注射用氯化钠和无菌注射用水);螯合剂(例如,乙二胺四乙酸钠和乙二胺四乙酸);着色剂(例如,FD&C Red No.3、FD&C Red No.20、FD&C Yellow No.6、FD&C Blue No.2、D&C Green No.5、D&C OrangeNo.5、D&C Red No.8、焦糖和铁锈红);澄清剂(例如膨润土);乳化剂(但不局限于阿拉伯树胶、cetomacrogol、十六烷醇、硬脂酸甘油酯、卵磷脂、失水山梨糖醇一油酸酯、聚乙烯50硬脂酸酯);胶囊化剂(例如,明胶和邻苯二甲酸醋酸纤维素);调味剂(例如,茴香油、肉桂油、可可油、薄荷醇油、柑桔油、薄荷油和香兰素);保湿剂(例如甘油、丙二醇、和山梨醇);研磨剂(如矿物油和甘油);油(例如落花生油、矿物油、橄榄油、花生油、芝麻油和植物油);软膏基料(例如羊毛脂、亲水软膏、聚乙二醇软膏、矿脂、亲水矿脂、白软膏、黄软膏、玫瑰水软膏);渗透增强剂(透皮输送)(例如,单羟基醇或多羟基醇、饱和或不饱和脂肪醇、饱和或不饱和脂肪酯、饱和或不饱和二羧酸、精油、磷脂酰衍生物、脑磷脂、萜、酰胺、醚类、酮类和脲);增塑剂(例如,邻苯二甲酸二乙酯和甘油);溶剂(例如,醇、玉米油、棉花籽油、甘油、异丙醇、矿物油、油酸、花生油、纯净水、注射用水、灭菌注射用水和灭菌冲洗用水);硬化剂(例如十六醇、十六醇酯蜡、微晶蜡、石蜡、十八烷醇、白蜡和黄蜡);栓剂基料(例如,可可黄油和聚乙二醇(混合物));表面活性剂(例如,苯扎氯铵、nonoxynol10,oxtoxynol 9,多乙氧基醚,十二烷基硫酸钠和失水山梨糖醇甘油一棕榈酸酯);悬浮剂(如琼脂、膨润土、卡波姆(carbomer)、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、高岭土(kaolin)、甲基纤维素、黄芪胶和veegum);甜味剂(例如天冬甜素、葡萄糖、甘油、甘露醇、丙二醇、糖精钠、山梨醇和蔗糖);片剂抗粘着剂(例如硬脂酸镁和滑石粉);片剂粘合剂(例如阿拉伯胶、藻酸、羧甲基纤维素钠、可压缩的蔗糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(povidone)和预胶凝化淀粉);片剂和胶囊的稀释剂(例如磷酸氢钙、高岭土、乳糖、甘露糖醇、微晶纤维素、粉状纤维素、沉淀的碳酸钙、碳酸钠、磷酸钠、山梨醇和淀粉);片剂包衣剂(例如,液体葡萄糖、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素和紫胶);片剂直接压缩赋形剂(例如磷酸氢钙);片剂崩解剂(例如藻酸、羧甲基纤维素钙、微晶纤维素、polacrillin potassium、藻酸钠、乙醇酸淀粉钠和淀粉);片剂滑动剂(glidant)(胶态二氧化硅、玉米淀粉和滑石粉);片剂润滑剂(例如硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、硬脂酸和硬脂酸锌);片剂/胶囊遮光剂(opaquant)(例如二氧化钛)、片剂抛光剂(例如棕榈蜡和白蜡);增稠剂(例如蜂蜡、十六醇和石蜡);张度剂(例如葡萄糖和氯化钠);增粘剂(例如藻酸、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(povidone)、藻酸钠和黄芪胶);润湿剂(例如,十七乙烯基氧代十六烷醇、卵磷脂、聚乙烯山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯和聚氧乙烯硬脂酸酯)。
按照本发明方法所识别的化合物可以作为单独的药剂施用也可以与一或多种其它药剂组合使用,只要这种组合不引起难以接受的副作用。例如,本发明的组合物可以与已知的抗肥胖或与已知的抗糖尿病或其它适应症的药剂(indication agent)等联合,也可以与其混合物和组合物等联合使用。
按照本发明方法识别的化合物也可以用于研究和诊断或作为分析参考标准等等。因此,本发明包括组合物,该组合物由惰性载体和有效量的按照本发明方法识别的化合物或其盐或酯组成。惰性载体是指不与所携带的化合物相互作用但为其提供支持、运送方式、容积和示踪材料的物质。化合物的有效量是指会对所作用的特定过程产生结果或施加影响的量。
适于皮下、静脉内、肌肉内等方式的制剂;合适的可药用载体;以及制备和施用技术可以按照现有技术中公知的方法准备(参见,例如,Remington′s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,20th edition,2000)。
以下实施例对本发明进行示例性说明,不应理解为对本发明的限制。
胶囊配制
胶囊按以下配制:
活性组分 40mg
淀粉 109mg
硬脂酸镁 1mg
将这些组分混合,通过适当的网筛,然后填充到硬的明胶胶囊内。
片剂配制
片剂按以下配制
活性组分 25mg
纤维素,微晶 200mg
胶状二氧化硅 10mg
硬脂酸 5.0mg
将这些组分混合压缩形成片剂。可以使用适当的含水和无水包衣来改善适口性、外观和稳定性或延缓吸收。
无菌IV溶液
用无菌注射用水配制活性组分为5mg/ml的溶液,必要的话调节pH值。用5%的无菌葡萄糖将溶液稀释到适于给药的1-2mg/ml,以IV滴注给药60分钟以上。
肌内悬浮液
配制下述肌内悬浮液:
活性组分 50mg/ml
羧甲基纤维素钠 5mg/ml
TWEEN80 4mg/ml
氯化钠 9mg/ml
苯甲醇 9mg/ml
该悬浮液通过肌内施用。
硬壳胶囊
大量的单位胶囊通过用100mg粉状活性组分、150mg乳糖、50mg纤维素和6mg硬脂酸镁充填标准的两片硬明胶胶囊而制备。
软明胶胶囊
制备活性组分与可消化的油如大豆油、棉籽油或橄榄油的混合物,然后通过正排代泵注射入融化的明胶来形成含有100mg活性组分的软的明胶胶囊。将胶囊洗涤和干燥。将活性组分溶解于聚乙二醇、甘油和山梨醇的混合物中来制备易与水混合的药物混合物。
速释片剂/胶囊
这些是按照常规和新方法制备的固体口服剂型。这些药物单位可以不用水口服即迅速溶解和输送。这些活性组分在含液体的组分如糖、明胶、胶质和甜味剂等组分的液体中混合。这些液体通过冷冻干燥和固态提取技术被固化形成固体药片或囊片。这些药物化合物可以与粘弹性和热弹性糖和聚合物或泡腾剂组分压缩来形成多孔基质以用于迅即释放,而不需要水。
实施例
本发明进一步通过以下实施例来进行示例性说明,不应理解为对本发明的限制。所有引用内容(包括文献资料、公布的专利、公布的专利申请和同时待审的专利申请)均引入作为参考。
实施例1:在96孔板中制备假胰岛
将来自Sprague Dawley大鼠的胰岛分成大小为约1mm2或更小的小块。然后,将组织用Hanks-Hepes缓冲液(127mM NaCl,5.4mMKCl,0.34mMNa2HPO4,4.4mMKH2PO4,20mM HEPES,1.2mM CaCl2/5mM葡萄糖)冲洗3次,接着在37℃水浴摇动器用胶原酶消化10分钟(Liberase,0.25mg/ml,Roche Diagnostic Corp.,Indianapolis,IN)。
用50ml Hanks-Hepes缓冲液冲洗消化的胰腺组织3次,除去胶原酶。然后将组织团块通过250μm的过滤器过滤,将过滤物与在Hanks-Hepes缓冲液中16ml 27%的Ficoll(Sigma,St.Louis,MO)w/v混合。将3层Ficoll(分别为23%,20.5%和11%;每个浓度8ml)置于处于27%Ficoll中的胰岛组织混合物的顶部,形成梯度。
然后将Ficoll梯度在室温下以1,600rpm离心10分钟。胰岛组织根据胰岛大小,在11%和20.5%以及20.5%和23%之间的界面浓缩。然后,从这两个界面收集胰岛,用无Ca++的Hanks-Hepes缓冲液冲洗两次。然后将胰岛悬浮于含1mM EDTA的5ml无Ca++的Hanks-Hepes缓冲液中,并在室温下孵育8分钟。
将胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶I加入胰岛悬浮液,终浓度分别为25μg/ml和2μg/ml。将该悬浮液在30℃振摇下孵育10分钟。通过加入40ml含有10%FBS的RPMI 1640(GIBCO LifeTechnologies,Invitrogen,Carlsbad,CA)使胰蛋白酶消化终止。将胰蛋白酶消化过的胰岛细胞通过63μm的尼龙膜过滤(PGCScientific,Frederick,MD)以除去大的细胞簇。
将分散的胰岛细胞洗涤,用血细胞计数仪在显微镜下计数,然后接种到“V-底”96-孔板(每个孔2,500个细胞)。不过,每孔细胞范围在1000-10000个也可使用。将分散的胰岛细胞悬浮液以1,000rpm离心5分钟。除去Hanks-Hepes缓冲液,置换为含10%FBS、1%青霉素-链霉素和2mM L-谷氨酰胺的200μl RPMI 1640培养基。然后,将96孔板在1,000rpm离心5分钟以收集聚集在板V底部的形成假胰岛的分散的胰岛细胞。将这些假胰岛在37℃含5%CO2的细胞培养箱中过夜培养,然后用于分析。
实施例2:用成纤维细胞孵育假胰岛
将分散的胰岛细胞(按照实施例1的方法制备的)用含10%FBS的常规RPMI1640培养基洗涤,在显微镜下用血细胞计数仪计数,然后与成纤维细胞一起接种到“V-底”96孔板(每孔2,500个胰岛细胞和1,250个成纤维细胞)。将细胞悬浮液以1,000rpm离心5分钟,收集聚集在板的V底部的形成假胰岛的分散的胰岛细胞。将这些假胰岛与成纤维细胞在37℃含5%CO2的细胞培养箱中过夜共培养,用于分析。
实施例3:假胰岛的冷冻和融化
将分散的胰岛细胞(按照实施例1的方法制备的)按照上述方法计数,然后用含10%FBS和10%DMSO的常规RPMI1640培养基稀释到浓度为2×105细胞/ml。将一部分(1ml)转移到冷冻管,在液氮中冷冻前,先将冷冻管置于液氮罐的气相中的支架上。
将细胞解冻,然后用常规的培养基洗涤,再将其接种到“V-底”96孔板(每孔5,000个细胞)。接着,将96孔板以1,000rpm离心5分钟,收集聚集在板的V底部的形成假胰岛的分散的胰岛细胞。将这些假胰岛在37℃含5%CO2的细胞培养箱中过夜培养,然后用于分析。
实施例4:用于胰岛素释放分析的静态胰岛孵育
按照实施例1所述的方法制备假胰岛。过夜孵育后,除去RPMI 1640培养基,将其置换为100μl Krebs-Ringer-Hepes缓冲液115mM NaCI,5.0mM KCl,24mM NaHCO3,2.2mMCaCl2,1mM MgCl2,20mM HEPES,0.25%BSA,0.002%酚红,pH7.35-7.40)。细胞悬浮液以1,000rpm离心5分钟,使分散的胰岛细胞成丸。
将96-孔板中的假胰岛在37℃连续用95%O2/5%CO2充气的水浴中预孵育30分钟。然后除去预孵育缓冲液,置换成含有各种测试基质的50μl孵育缓冲液(Krebs-Ringer-Hepes缓冲液,pH7.35-7.40)。
再将96孔板以1,000rpm离心5分钟,形成假胰岛。将96-孔板中的假胰岛在37℃水浴中静止孵育60分钟,该水浴连续用95%O2/5%CO2充气。60分钟孵育后,收集孵育缓冲液(25μl)用于胰岛素含量分析(ELISA分析,ALPCO,NH)。
实施例5:用于胰岛素生物合成的静态假胰岛孵育
按照实施例1所述制备假胰岛。过夜培养后,将该假胰岛在含有3mM葡萄糖的KRBH(135mM NaCl,3.6mMKCl,10mM HEPES,5mMNaHCO3,0.5mM NaH2PO4,0.5mM MgCl2,1.5mMCaCl2,0.1%牛血清白蛋白)中在37℃预孵育30分钟,然后在37℃用测试化合物和2μM3H-亮氨酸(100μl)(Amersham,Piscataway,NJ)孵育90分钟。接着,将假胰岛用含有1mM亮氨酸(Sigma,St.Louis,MO)的KRBH洗涤3次,并溶解于2mM乙酸(100μl)中,超声15秒,随后用10NNaOH(20μl)中和。加入含有0.1%Triton X-100的HEPES(50mM),使体积达到1ml,将样品在1750×g自旋10分钟。将蛋白A琼脂糖(每样品50μl)用抗-胰岛素抗体(Linco,St.Charles,MO)(每样品100μl)预孵育2小时,洗涤两次。将抗体珠混合物(50μl)加入到750ul样品中,在4℃过夜孵育。用含有0.1%Triton X-100的HEPES(50mM)洗涤免疫沉淀物3次,然后用闪烁计数仪对珠计数。
实施例6:用于胰高血糖素释放的静态假胰岛孵育
按照实施例1所述制备假胰岛。过夜培养后,除去RPMI 1640培养基,替换成100μl的Krebs-Ringer-Hepes缓冲液(115mM NaCl,5.0mM KCl,24mM NaHCO3,2.2mM CaCl2,1mM MgCl2,20mM HEPES,0.25%BSA,0.002%酚红,pH7.35-7.40)。将细胞悬浮液以1,000rpm离心5分钟以使分散的胰岛细胞成丸。
将96-孔板中的假胰岛在37℃水浴中预孵育30分钟,该水浴连续用95%O2/5%CO2充气。除去预孵育缓冲液,替换成含有各种测试化合物的50μl孵育缓冲液(Krebs-Ringer-Hepes缓冲液,pH7.35-7.40)
再将96孔板以1,000rpm离心5分钟以形成假胰岛。将96-孔板中的假胰岛在37℃水浴中静止孵育60分钟,该水浴连续用95%O2/5%CO2充气。60分钟孵育后,收集孵育缓冲液(25μl)用于胰高血糖素含量分析(Glucagon RIA kit;Linco,St。Charles,MO)。
实施例7:鉴定促胰岛素化合物的方法
按照实施例1所述制备假胰岛。洗涤分散的胰岛细胞,用血细胞计数仪计数,然后用200μl含10%FBS、1%青霉素-链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基将胰岛接种到“V-底”96-孔板(每个孔2,500个细胞)。接着,将96孔板以1,000rpm离心5分钟,收集聚集在板的“V-底”形成假胰岛的分散的胰岛细胞。将这些胰岛在37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养过夜。
过夜培养后,除去RPMI 1640培养基,替换成100μl含有3mM葡萄糖的Krebs-Ringer-Hepes缓冲液(115mM NaCl,5.0mM KCl,24mM NaHCO3,2.2mM Cal2,1mM MgCl2,20mM HEPES,0.25%BSA,0.002%酚红,pH7.35-7.40)。将细胞悬浮液以1,000rpm离心5分钟以使分散的胰岛细胞成丸。
将96-孔板中的假胰岛在37℃水浴中预孵育30分钟,该水浴连续用95%O2/5%CO2充气。除去预孵育缓冲液,替换成含有测试化合物的50μl孵育缓冲液(Krebs-Ringer-Hepes缓冲液,pH7.35-7.40)。再将96孔板以1,000rpm离心5分钟以形成假胰岛。将96-孔板中的假胰岛在37℃水浴中静止孵育60分钟,该水浴连续用95%O2/5%CO2充气。30分钟孵育后,收集孵育缓冲液(25μl)用于胰岛素含量分析。
在不背离本发明范围和精神的前提下,对本发明的方法和系统进行各种调整和变化对本领域技术人员来说是显而易见的。尽管本发明描述了特异的优选实施方案,但这些实施方案不应理解为对本发明的限制。事实上,对本领域技术人员显而易见的本发明实施方式的各种调整都应在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (22)
1.一种制备假胰岛的方法,该方法包括用消化酶处理胰岛;以及将消化后的胰岛接种到容器中的步骤,其中所述容器的表面积从容器顶部到底部逐渐减小。
2.权利要求1的方法,其进一步包括将所述胰岛离心以使胰岛聚集的步骤。
3.权利要求2的方法,其进一步包括将所述假胰岛冷冻的步骤。
4.权利要求1的方法,其中所述酶是胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I或分散酶。
5.权利要求1的方法,其中将所述消化后的胰岛在接种前过滤。
6.权利要求1的方法,其中所述假胰岛分离自哺乳动物胰腺组织。
7.权利要求5的方法,其中所述哺乳动物胰腺组织是人的。
8.权利要求5的方法,其中所述假胰岛分离自新鲜的胰腺组织。
9.权利要求5的方法,其中所述假胰岛分离自冷冻的胰腺组织。
10.权利要求1的方法,其中所述容器是V-底板。
11.权利要求1的方法,其进一步包括将假胰岛与成纤维细胞共培养的步骤。
12.一种识别促胰岛素化合物的方法,其包括如下步骤:按照权利要求1的方法分离假胰岛;将测试化合物加入到分离的假胰岛中;检测所述化合物对胰岛素分泌的影响。
13.一种治疗糖尿病或糖尿病相关病症的方法,该方法通过给予需要的患者以有效量的按照权利要求10的方法识别的化合物进行。
14.权利要求11的方法,其中所述的糖尿病相关病症选自高血糖、高胰岛素血症、糖耐量受损、空腹血糖受损、异常脂血症、高甘油三酯血症、X综合征、胰岛素抵抗、肥胖、动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、低HDL水平、高血压、心血管疾病、脑血管疾病、外周血管疾病、狼疮、多囊性卵巢综合症、癌症发生和增生。
15.一种药物组合物,其包含有效量的按照权利要求10的方法识别的化合物与一种可药用载体。
16.一种用于制备假胰岛的试剂盒,其包括消化酶和容器,所述容器的表面积从容器顶部到容器底部逐渐减小。
17.一种分析胰岛素生物合成的方法,其包括如下步骤:按照权利要求1的方法分离假胰岛;将一种测试化合物加入到分离的假胰岛中;检测所述化合物对胰岛素含量的影响。
18.一种治疗糖尿病或糖尿病相关病症的方法,该方法通过给予需要的患者以有效量的按照权利要求17的方法识别的化合物进行。
19.一种检测胰高血糖素释放的方法,其包括如下步骤:按照权利要求1的方法分离假胰岛;将测试化合物加入到分离的假胰岛中;检测所述化合物对胰高血糖素含量的影响。
20.一种治疗糖尿病或糖尿病相关病症的方法,该方法通过给予需要的患者以有效量的按照权利要求19的方法识别的化合物进行。
21.一种检测促生长素抑制素释放的方法,其包括如下步骤:按照权利要求1的方法分离假胰岛;将测试化合物加入到分离的假胰岛中;检测所述化合物对促生长素抑制素含量的影响。
22.一种治疗糖尿病或糖尿病相关病症的方法,该方法通过给予需要的患者以有效量的按照权利要求21的方法识别的化合物进行。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US36672802P | 2002-03-22 | 2002-03-22 | |
US60/366,728 | 2002-03-22 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1643134A true CN1643134A (zh) | 2005-07-20 |
Family
ID=28675278
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA038067404A Pending CN1643134A (zh) | 2002-03-22 | 2003-03-21 | 制备假胰岛的方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040005299A1 (zh) |
EP (1) | EP1490474A4 (zh) |
JP (1) | JP2005527203A (zh) |
KR (1) | KR20050000375A (zh) |
CN (1) | CN1643134A (zh) |
AU (1) | AU2003215023A1 (zh) |
BR (1) | BR0308753A (zh) |
CA (1) | CA2474512A1 (zh) |
MX (1) | MXPA04007064A (zh) |
PL (1) | PL372313A1 (zh) |
WO (1) | WO2003082189A2 (zh) |
ZA (1) | ZA200408436B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109406769A (zh) * | 2018-09-28 | 2019-03-01 | 李军 | Akr在min6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2314694T3 (es) * | 2004-07-28 | 2009-03-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Factor 1 promotor de la insulina como elemento de referen-cia/marcador de la insuficiencia de celulas beta. |
BR112013009299B1 (pt) * | 2010-10-22 | 2022-02-01 | Cell & Tissue Systems, Inc | Método para preparar ilhotas pancreáticas |
JP2016202172A (ja) * | 2015-04-16 | 2016-12-08 | 国立大学法人京都大学 | 疑似膵島の製造方法 |
CN109957539A (zh) * | 2017-12-14 | 2019-07-02 | 深圳先进技术研究院 | 一种人造胰岛组织及其制备和应用 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5804178A (en) * | 1986-11-20 | 1998-09-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue |
US6001360A (en) * | 1988-12-13 | 1999-12-14 | University Of Florida | Method and compositions for early detection and treatment of insulin dependent diabetes mellitus |
US6001387A (en) * | 1992-05-29 | 1999-12-14 | The Reguents Of The University Of California | Spin disk encapsulation apparatus and method of use |
US5510263A (en) * | 1993-04-05 | 1996-04-23 | Desmos, Inc. | Growth of pancreatic islet-like cell clusters |
US5876742A (en) * | 1994-01-24 | 1999-03-02 | The Regents Of The University Of California | Biological tissue transplant coated with stabilized multilayer alginate coating suitable for transplantation and method of preparation thereof |
IL113484A0 (en) * | 1994-04-28 | 1995-07-31 | Immunex Corp | Viral proteins pharmaceutical compositions containing them their preparation and use |
US5695998A (en) * | 1995-02-10 | 1997-12-09 | Purdue Research Foundation | Submucosa as a growth substrate for islet cells |
US5679565A (en) * | 1995-04-10 | 1997-10-21 | The Regents Of The University Of California | Method of preserving pancreatic islets |
AU6496996A (en) * | 1996-02-23 | 1997-09-10 | Circle Biomedical, Inc. | Novel artificial pancreas |
MY128450A (en) * | 2000-05-24 | 2007-02-28 | Upjohn Co | 1-(pyrrolidin-1-ylmethyl)-3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives |
US6864069B2 (en) * | 2001-10-05 | 2005-03-08 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Peptides acting as both GLP-1 receptor agonists and glucagon receptor antagonists and their pharmacological methods of use |
-
2003
- 2003-03-21 BR BR0308753-0A patent/BR0308753A/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-03-21 PL PL03372313A patent/PL372313A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2003-03-21 WO PCT/US2003/008712 patent/WO2003082189A2/en not_active Application Discontinuation
- 2003-03-21 JP JP2003579732A patent/JP2005527203A/ja not_active Withdrawn
- 2003-03-21 CA CA002474512A patent/CA2474512A1/en not_active Abandoned
- 2003-03-21 MX MXPA04007064A patent/MXPA04007064A/es unknown
- 2003-03-21 US US10/394,902 patent/US20040005299A1/en not_active Abandoned
- 2003-03-21 EP EP03711665A patent/EP1490474A4/en not_active Withdrawn
- 2003-03-21 AU AU2003215023A patent/AU2003215023A1/en not_active Abandoned
- 2003-03-21 KR KR10-2004-7014880A patent/KR20050000375A/ko not_active Application Discontinuation
- 2003-03-21 CN CNA038067404A patent/CN1643134A/zh active Pending
-
2004
- 2004-10-19 ZA ZA200408436A patent/ZA200408436B/xx unknown
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109406769A (zh) * | 2018-09-28 | 2019-03-01 | 李军 | Akr在min6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20050000375A (ko) | 2005-01-03 |
WO2003082189A2 (en) | 2003-10-09 |
BR0308753A (pt) | 2005-01-11 |
MXPA04007064A (es) | 2004-10-29 |
CA2474512A1 (en) | 2003-10-09 |
AU2003215023A1 (en) | 2003-10-13 |
EP1490474A2 (en) | 2004-12-29 |
JP2005527203A (ja) | 2005-09-15 |
PL372313A1 (en) | 2005-07-11 |
US20040005299A1 (en) | 2004-01-08 |
WO2003082189A3 (en) | 2003-11-27 |
ZA200408436B (en) | 2005-10-19 |
EP1490474A4 (en) | 2005-05-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101947306B (zh) | T-细胞介导的疾病的治疗 | |
CN1142783C (zh) | 用于治疗高危葡萄糖耐量降低的药剂 | |
CN102036662B (zh) | 利用肉豆蔻衣木脂素预防和治疗ppar介导的疾病的方法 | |
EP2992881B1 (en) | Pharmaceutical composition for inhibiting immune response through inducing differentiation into regulator t cells and promoting proliferation of regulator t cells | |
CN104257657A (zh) | 用于治疗cmt和相关疾病的新治疗方法 | |
CN1188485A (zh) | 胰高血糖素样肽-2及其治疗应用 | |
CN1414971A (zh) | 用作免疫抑制剂的缩肽及其同类物 | |
CN104546912A (zh) | 用于治疗胰功能异常的方法 | |
CN108025035A (zh) | 用于治疗与etbr激活相关的癌症的组合物和方法 | |
CN110420315A (zh) | 枸杞糖肽在制备治疗三高药物中的应用 | |
CN106458869A (zh) | 具有免疫疾病治疗效果的新型化合物及其应用 | |
CN1498108A (zh) | 用于治疗炎性疾病的烟碱性受体激动剂 | |
Ceballos et al. | Chemoprophylactic activity of flubendazole in cystic echinococcosis | |
CN1643134A (zh) | 制备假胰岛的方法 | |
CN101039690A (zh) | 酶抑制剂及其应用 | |
CN1296051C (zh) | 糖酐酯的新用途 | |
CN1234417C (zh) | 用于自身免疫疾病免疫疗法的包含树突细胞的药物组合物及其应用 | |
CN1382043A (zh) | 用于防止和改善代谢性骨病的食品材料和包含这些材料的用于代谢性骨病的预防药/治疗药 | |
CN104548062B (zh) | 包含谷胱甘肽的药物组合物及其用途 | |
JP2009263344A (ja) | 脂肪細胞分化促進剤 | |
CN1791420A (zh) | T-细胞介导的疾病的治疗 | |
FR2669823A1 (fr) | Extrait de melange d'ecorce de philodendron et de graines de croton, procede pour sa preparation et drogue contenant celui-ci. | |
CN109563150A (zh) | 由血管高通透性介导的疾病的治疗 | |
CN1129453C (zh) | 用于下调免疫系统Th2活性的母牛分枝杆菌 | |
JP4285997B2 (ja) | 性的機能不全を予防および治療するための医薬の製造におけるn−アセチル−d−グルコサミンの使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1080508 Country of ref document: HK |
|
AD01 | Patent right deemed abandoned | ||
C20 | Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1080508 Country of ref document: HK |