ES2314694T3 - Factor 1 promotor de la insulina como elemento de referen-cia/marcador de la insuficiencia de celulas beta. - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro de cribado para un compuesto que impide y/o inhibe y/o retarda la insuficiencia de células beta, que comprende la etapa de detección del factor 1 (IPF-1) promotor de la insulina soluble, secretado por un anfitrión en presencia o ausencia de dicho compuesto, de forma que un compuesto que impide y/o inhibe y/o retrasa la insuficiencia de las células beta es un compuesto con el cual el nivel de IPF-1 de un anfitrión se ve alterado.
Description
Factor 1 promotor de la insulina como elemento
de referencia/marcador de la insuficiencia de células beta.
La diabetes tipo 2 es una enfermedad que tiene
cada día mayor importancia en el mundo entero y se puede describir
como una insuficiencia de células beta pancreáticas (insuficiencia
de células beta) para compensar la resistencia periférica a la
insulina con una secreción superior de insulina por parte de las
células beta. Esta insuficiencia se explica tanto por una pérdida
relativa de la masa de células beta así como por unos defectos
secretores que incluyen una secreción incrementada de la insulina
basal por parte de las células beta y una pérdida selectiva de
sensibilidad frente a la insulina principalmente en el músculo
esquelético pero también en otros órganos. Se cree que la pérdida
de la función de las células beta es provocada por una exposición
durante tiempo a elevados niveles de glucosa y lípidos (gluco- y
lipotoxicidad).
Actualmente no existe un tratamiento comprobado
clínicamente que haya podido prevenir o retardar la insuficiencia
de las células beta en unas condiciones de lipo/glucotoxicidad.
También sería útil identificar mejores grupos de referencia para el
tratamiento y marcadores para la detección de la insuficiencia o
función de las células beta, que sean más sensibles o más fiables
que los marcadores frecuentemente utilizados, como la insulina,
proinsulina o péptidos C.
Además sería una ventaja identificar los
marcadores que pueden ser detectados en plasma.
El objetivo de la presente invención consiste en
identificar y aportar un método nuevo para cribar o detectar
compuestos que impidan, atenúen o inhiban la insuficiencia de
células beta y un marcador para el diagnóstico de la insuficiencia
de células beta en una etapa prematura de la diabetes tipo II y todo
ello con mayor fiabilidad que la conocida actualmente.
Sorprendentemente, se descubrió que el uso de la
proteína IPF-1 puede solventar, al menos en parte,
los problemas conocidos de la tecnología actual.
El factor 1 promotor de la insulina
(IPF-1) es un factor de transcripción que contiene
un homeodominio, requerido críticamente para el desarrollo
embriónico del páncreas y para la regulación transcripcional de los
genes específicos del páncreas endocrino en adultos, como la
insulina. Las mutaciones que conducen a un defecto de la función
del IPF-1 se han relacionado con la diabetes tipo 2
(Macfarlane y cols., 1999, J.Clin.Invest.104,
R33-R39).
Sorprendentemente, se ha averiguado que los
grandes cambios en los niveles del IPF-1 secretado
se hallan en la insuficiencia de las células beta. La presente
invención aporta un método in vitro de cribado o detección
de un compuesto que impida y/o inhiba y/o retarde la insuficiencia
de las células beta, y de un marcador nuevo para el diagnóstico
prematuro de la insuficiencia de células beta en la diabetes.
En las configuraciones preferidas, el marcador
nuevo IPF-1 puede ser utilizado para el diagnóstico
así como para fines de cribado o detección.
En una configuración preferida, el método
diagnóstico conforme a la presente invención se utiliza para fines
de detección de pacientes, es decir, se utiliza para evaluar
individuos sin un diagnóstico previo de diabetes, midiendo el nivel
del IPF-1 en una muestra de fluido corporal y
correlacionando el nivel de IPF-1 con la presencia
o ausencia de la insuficiencia de células beta.
La presente invención aporta también un método
de cribado o detección de un compuesto que impida y/o inhiba y/o
retarde la insuficiencia de las células beta, y que comprenda la
etapa de detección de IPF-1 soluble secretado por
una célula anfitriona en presencia o ausencia de dicho compuesto,
donde un compuesto que impide y/o inhibe y/o retarda la
insuficiencia de las células beta es un compuesto con el cual se
modifica el nivel del IPF-1 secretado por una célula
anfitriona.
Una célula anfitriona puede ser una célula
modelo que represente las células beta en cultivo, o bien un animal
que se pueda usar como un modelo para la insuficiencia de células
beta.
La presente invención también informa sobre el
uso de un IPF-1 proteínico como marcador para el
cribado de un compuesto que impida y/o inhiba la insuficiencia de
células beta.
Los métodos de cribado de pacientes y de
diagnóstico conforme a la presente invención se basan en una muestra
del líquido corporal que procede de un individuo. A diferencia de
los métodos conocidos, el IPF-1 se mide de forma
específica a partir de esta muestra de fluido corporal utilizando un
aglutinante específico.
Un aglutinante específico es, por ejemplo, un
receptor del IPF-1 o de un anticuerpo para el
IPF-1. Como el experto apreciará, el término
específico se utiliza para indicar que otras biomoléculas presentes
en la muestra no se unen de forma significativa al aglutinante
específico del IPF-1. Se considera que un nivel
inferior al 5% de reactividad cruzada ya no es significativo.
Un aglutinante específico es preferiblemente un
anticuerpo reactivo con el IPF-1. El término
anticuerpo se refiere a un anticuerpo policlonal, un anticuerpo
monoclonal, fragmentos de dichos anticuerpos, así como a las
construcciones genéticas que comprende el dominio de unión de un
anticuerpo.
Los anticuerpos son generados por procedimientos
actuales como los descritos en Tijssen (Tijssen, P., Practice and
Theory of enzyme immunoassays 11 (1990) todo el libro, en particular
las páginas 43-78; Elsevier, Amsterdam). Para estos
ensayos se han utilizado anticuerpos policlonales procedentes de
conejos. Sin embargo, también se pueden usar anticuerpos
policlonales de diferentes especies, por ejemplo, de ratas o
cobayas, así como anticuerpos monoclonales. Puesto que los
anticuerpos monoclonales se pueden producir en cualquier cantidad
requerida con unas propiedades constantes, representan las
herramientas ideales en el desarrollo de un ensayo para la rutina
clínica.
Ahora que el IPF-1 se ha
identificado como un marcador que es útil en el diagnóstico de la
insuficiencia de células beta, el experto observará que existen
vías alternativas para alcanzar un resultado comparable a los
logros de la presente invención. Por ejemplo, se pueden utilizar
estrategias alternativas para generar anticuerpos. Dichas
estrategias comprenden entre otras cosas el uso de péptidos
sintéticos, lo que representa un epítopo del IPF-1
para la inmunización. Alternativamente, se puede usar la
inmunización del ADN también conocida como vacuna del ADN.
Para la medición, la muestra de fluido corporal
obtenida de un individuo se pone en contacto con el aglutinante
específico para el IPF-1 en unas condiciones
apropiadas para la formación de un complejo de agente
aglutinante-IPF-1. No es preciso
especificar dichas condiciones puesto que el experto prácticamente
sin esfuerzo alguno puede identificar fácilmente las condiciones
apropiadas de la incubación.
Como etapa final de acuerdo con los métodos
revelados en la presente invención se mide la cantidad de complejo
y se correlaciona con el diagnóstico de insuficiencia de células
beta o con el control respectivo tal como se ha descrito aquí
previamente. Tal como apreciará el experto existen numerosos métodos
para medir la cantidad de complejo de agente aglutinante específico
- IPF-1todos descritos con detalle en los libros de
texto relevantes (por ejemplo, Tijssen P., supra o Diamandis
y cols., eds(1996) Immnunoassay, Academia Press, Boston).
Preferiblemente, la IPF-1 se
detecta en un formato de ensayo tipo sándwich. En dicho ensayo se
utiliza un primer agente aglutinante específico para capturar la
IPF-1 por un lado y un segundo agente aglutinante
específico, que se marca para poder ser detectado directa o
indirectamente, por el otro lado.
Tal como se ha mencionado antes, se observa
sorprendentemente que se puede medir el IPF-1 de una
muestra de líquido corporal obtenida de una muestra individual. No
se precisa ninguna muestra de biopsia o de tejido para aplicar el
marcador IPF-1 en el diagnóstico de la insuficiencia
de células beta.
En una configuración preferida, el método
conforme a la presente invención se lleva a cabo con suero como
material de muestra líquido.
En otra configuración preferida, el método
conforme a la presente invención se lleva a cabo con plasma como
material de muestra líquido.
En otra configuración preferida, el método
conforme a la presente invención se lleva a cabo con sangre entera
como material de muestra líquido.
Mientras la aplicación de los métodos rutinarios
a las muestras tisulares condice a la identificación de muchos
marcadores posibles para el tejido seleccionado, los inventores de
la presente invención han sido capaces de detectar la
IPF-1 proteínica en una muestra de líquido corporal.
Incluso más sorprendentemente, han sido capaces de demostrar que la
presencia de IPF-1 en dicha muestra líquida obtenida
de un individuo se puede correlacionar con el diagnóstico de la
insuficiencia de células beta.
Preferiblemente en los procedimientos
establecidos se pueden utilizar los anticuerpos frente al
IPF-1, por ejemplo, para la insuficiencia de
células beta in situ, en biopsias o en método
inmunohistológicos.
El anticuerpo se utilizará preferiblemente en un
ensayo inmunológico cualitativo (IPF-1 presente o
ausente) o cuantitativo (se determina la cantidad de
IPF-1).
La medición del nivel de IPF-1
proteínico ha resultado ser muy favorable en el campo de la
insuficiencia de células beta y de diabetes. Por lo tanto, en otra
configuración preferida, la presente invención se relacionará con
el uso de la IPF-1 proteínica como molécula marcador
en el diagnóstico de insuficiencia de células beta de una muestra
de líquido corporal obtenida de un individuo.
El término molécula marcador se utiliza para
indicar que cambios en el nivel de IPF-1 del analito
marcan la presencia de la insuficiencia de células beta.
Se prefiere usar el marcador nuevo
IPF-1 en el diagnóstico prematuro de la diabetes
tipo II.
\newpage
Se prefiere usar preferiblemente el marcador
nuevo IPF-1 en el diagnóstico prematuro de la
intolerancia a la glucosa.
El uso del IPF-1 proteínico
propiamente representa un avance significativo en el ámbito
desafiante del diagnóstico de la insuficiencia de células beta. El
combinar las mediciones del IPF-1 con otros
marcadores conocidos para la diabetes como la insulina o con otros
marcadores de la insuficiencia de células beta por descubrir,
conduce a otros avances o mejoras. Por lo tanto en otra
configuración preferida la presente invención hará referencia al
uso del IPF-1 como de una molécula marcador para la
diabetes, preferiblemente para la insuficiencia de las células
beta, en combinación con otra molécula marcador de la diabetes,
preferiblemente para la insuficiencia de las células beta de una
muestra de líquido corporal obtenida de un individuo. Otros
marcadores especialmente preferidos con los que se combina la
medición de la insuficiencia de células beta son la insulina,
pre-insulina y/o los péptidos C.
Los reactivos diagnósticos para ensayos
específicos se suministran preferiblemente en estuches que
comprenden el agente aglutinante específico y los reactivos
auxiliares requeridos para realizar el ensayo.
Una forma de evaluar la utilidad clínica del
nuevo marcador IPF-1 consiste en medir sus niveles
en 10 pacientes diabéticos dependiendo de las inyecciones de
insulina exógena y comparando los niveles con los medidos en 10
pacientes con una función normal demostrada de las células beta.
Para el análisis estadístico, se realiza la evaluación estándar del
test t de Student con valores <0,05 que se consideran como
significativos.
La exactitud de un ensayo se puede describir por
sus características como receptor (ROC)(ver especialmente Xweig,
M.H., y
Campbell,G.,Clin.Chem.39(1993)561-577).
El gráfico ROC es un diagrama de todos los pares de
sensibilidad/especificidad resultantes de variar el umbral de
decisión en toda la gama de datos observados.
El rendimiento clínico de una prueba de
laboratorio depende de su exactitud diagnóstica o de la capacidad
de clasificar correctamente los individuos en subgrupos clínicamente
relevantes. La exactitud diagnóstica mide la capacidad de un ensayo
para distinguir correctamente dos situaciones diferentes de los
individuos investigados. Dichas situaciones son, por ejemplo, la
salud y la enfermedad.
En cada caso, el diagrama ROC refleja el
solapamiento entre las dos distribuciones mostrando la sensibilidad
frente a 1 - especificidad para el margen completo de decisiones. En
el eje y, la sensibilidad o bien la fracción verdadera positiva se
define como (número de resultados verdaderos positivos)/(número de
resultados verdaderos positivos + número de falsos negativos).Esto
también se conoce como positividad en presencia de una enfermedad o
de un estado. Se ha calculado únicamente del subgrupo afectado. En
el eje x, la fracción de falsos positivos o bien
1-especificidad se define como (número de resultados
falsos positivos)/(número de resultados verdaderos negativos +
número de falsos positivos). Esto es un índice de especificidad y se
calcula íntegramente a partir del subgrupo no afectado. Puesto que
las fracciones de verdaderos y falsos positivos se calculan
totalmente por separado, utilizando los resultados del ensayo de
dos subgrupos diferentes, el diagrama ROC es independiente de la
prevalencia de la enfermedad en la muestra. Cada punto del diagrama
ROC representa un par de sensibilidad/especificidad que corresponde
a un umbral de decisión específico. Un ensayo con discriminación
perfecta (sin solapamiento en las dos distribuciones de resultados)
tiene una línea ROC que pasa por la esquina izquierda superior,
donde la fracción de verdaderos positivos es de 1,0 o del 100%
(sensibilidad perfecta), y la fracción de falsos positivos es
0(especificidad perfecta). La línea teórica para un ensayo
sin discriminación (distribuciones idénticas de resultados de los
dos grupos) es una línea en diagonal de 45º desde la esquina
izquierda inferior hasta la esquina derecha superior. La mayoría de
líneas se encuentran entre estos dos extremos. (Si la línea ROC cae
totalmente por debajo de la diagonal de 45º, esto se soluciona
invirtiendo el criterio de "positividad" de "mayor a"
hasta "menor a" o viceversa). De forma cualitativa, cuanto más
próxima se encuentra la línea a la esquina izquierda inferior,
mayor es la exactitud global del ensayo.
Un objetivo conveniente para cuantificar la
exactitud diagnóstica de un ensayo de laboratorio consiste en
expresar su rendimiento mediante un número. La medida global más
frecuente es el área bajo la línea ROC. Por convención, este área
es siempre \geq0,5 (en caso de que no lo sea, se puede invertir la
regla de decisión que lo indica). Los valores oscilan entre 1,0
(separación perfecta de los valores de ensayo de los dos grupos) y
0,5 (ninguna diferencia aparente en cuanto a la distribución entre
los dos grupos de valores de ensayo). El área no depende solamente
de una parte especial de la línea como del punto más próximo a la
diagonal o de la sensibilidad para una especificidad del 90%, sino
que de toda la línea. Esta es una expresión descriptiva,
cuantitativa de lo próxima que se encuentra la línea ROC a la
perfecta (área=1,0).
Los siguientes ejemplos, referencias y listado
de secuencias serán una ayuda para comprender la presente invención,
cuyo verdadero objetivo se ha definido en las reivindicaciones. Se
entiende que se pueden efectuar modificaciones en los
procedimientos mencionados.
Para identificar las proteínas secretadas por
INS-1 (Safari M, Janjic D,Meda P, Li G, Halban PA,
Wollheim CB. Establishment of
2-mercaptoethanol-dependent
differentiated insulin-secreting cell lines,
Endocrinology, 1992 Jan;130(1):167-78) o
células de RINm5finsulinoma (Praz GA, Halban PA, Wohlheim CB,
Blondel B, Strauss AJ, Renold AE. Regulation of
immunoreactive-insulin release from a rat cell line
(RINm5F).Biochem J.1983 Feb 15;
210(2):345-52) hemos aplicado dos métodos:
(i) Fraccionamiento de las células por sedimentación diferencial en
compartimentos subcelulares con posterior identificación de las
proteínas en base a su impresión digital de la masa peptídica
usando espectrometría de masa MALDI-TOF y
(ii)enriquecimiento de las glucoproteínas por cromatografía
de la heparina seguida del método SDS-PAGE
monodimensional e identificación de las proteínas mediante análisis
de los péptidos trípticos resultantes del grupo de proteínas por
cromatografía líquida acoplado en tandem a la espectrometría de
masas, resultando una identificación basada en las marcas de la
secuencia proteínica. La combinación de estas dos estrategias de
purificación nos permitía incrementar la eficacia de la
identificación proteínica en los compartimentos celulares así como
en el medio de células de cultivo.
Hemos reproducido los rasgos de la insuficiencia
de células beta mediante la exposición crónica de células beta a
una combinación de glucosa/ácidos grasos (FAs), lo que sugiere que
la hiperlipidemia así como la hiperglucemia puede contribuir a una
descompensación de las células beta. Para estos experimentos se
utilizaban células INS-1E y RINm5f previamente
tratadas durante 24 horas con una combinación de glucosa 10 mM y
palmitato 0,5 mM.
Las muestras preparadas de cada línea celular se
sometían a 2-DE tal como se ha descrito (Peyrl A,
Krapfenbauer K, Slavc I, y cols. PROTEOMICS
3(9):1781-1800 SEP 2003; Fountoulakis M.,
Lancen H., Anal. Biochem. 250 (1997) 153-156). La
2-DE se realizaba básicamente tal como se ha
indicado (Lancen, H., Roedor, D., Juranville, J.-F., Fountoulakis,
M.Electrophoresis 1997, 18, 2085-2090). Las muestras
se desalaban usando tubos de filtración de membrana (Millipore,
Art.No.UFV4BGC25) y se aplicaban 2,0 mg en tiras de gradiente no
lineal inmovilizadas de pH 3-10 (Amersham, Pharmacia
Biotecnology, Upsala, Sweden) tanto en el extremo básico como el
ácido de las tiras. Las proteínas se enfocaban a 200 V después de
lo cual se aumentaba gradualmente el voltaje hasta 5000 V a 2 V/min.
El enfoque continuaba a 5000 V durante 24 h. La segunda separación
dimensional se realizaba en un gel de poliacrilamida al 12%
(Biosolve, Walkinswaard, Netherland). Los geles (180x200x1,5 mm)
eran recorridos a 50 mA/gel, en un sistema Ettan DALT
II(Amersham, Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Sweden)
acomodando doce geles. Tras la fijación proteínica durante 12 horas
en metanol al 50% que contiene ácidos fosfórico al 5%, los geles se
coloreaban con Coomassie blue coloidal (Novex, San Diego, CA)
durante 24 h. Las masas moleculares se determinaban por el recorrido
de los marcadores proteínicos estándar (Gibco, Basel, Suiza) que
abarcaba el margen de 10 a 200 kDa. Se usaban los valores Pl
suministrados por el proveedor de las tiras IPG (Amersham Pharmacia,
Uppsala, Suecia). Los geles se decoloraban con H_{2}O y se
escaneaban en un densitómetro AGFA DUOSCAN. Las imágenes
electrónicas de los geles se registraban usando Photoshop (Adobe) y
PowerPoint (Microsoft).
MALDI-MS: El análisis EM se
realizaba tal como se ha descrito (Lancen, H., Roedor, D.
Juranville, J.-F., Fountoulakis, M. Electrophoresis 1997, 18,
2085-2090) con mínimas modificaciones.
Resumiendo, se separaban las manchas, se
decoloraban con acetonitrilo (v/v) al 30% en bicarbonato de amonio
0,1 M y se secaban en un vaporizador Speed vac. Los trozos de gel
secados se volvían a inflar con 5 \mul de bicarbonato de amonio 5
mM, (pH 8,8), se añadían 50 ng de tripsina (Promega, Madison, WI,
USA), se centrifugaban durante 1 minuto y se dejaban a temperatura
ambiente durante unas 12 horas. Tras ello se añadían 5 \mul de
agua seguidos 10 minutos más tarde de 10 \mul de acetonitrilo al
75%, que contenían un 0,3% de ácido trifluoracético, se
centrifugaban durante 1 minuto y el contenido se agitaba durante 20
minutos. Para MALDI-MS 1,5 \mul del líquido
separado se mezclaban con 1 \mul de ácido
alfa-ciano cinámico en acetonitrilo al 50%, un 0,1%
de TFA en agua y se aplicaban a la referencia MALDI. Las muestras
se analizaban en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo
(Ultraflex, Bruker, Bremen, Alemania) equipado con un reflector y
extracción retardada. La Des-Arg-1
Bradiquinina (Sigma) y la ACTH (18-38)(Sigma) se
utilizaban como péptidos estándar. La calibración era interna para
las muestras. Las masas peptídicas se comparaban con las masas
peptídicas teóricas de todas las proteínas de todas las especies de
la base de datos Swiss-Prot.
Los datos de la espectrometría de masas se
filtran dos veces usando un filtro paramétrico contra el paso de
bajas frecuencias para determinar el valor de referencia del
instrumento. La desviación estándar media residual suavizada del
valor de referencia se utiliza como un valor aproximado del nivel de
ruido del instrumento en los datos. Tras la corrección del valor de
referencia y la reclasificación de los datos en las coordenadas
nivel-sobre ruido, el dato puntual con la mayor
desviación del valor de referencia se utiliza para sembrar un
procedimiento de ajuste de datos no lineales
(Lavenberg-Marquardt) para detectar los máximos o
picos de péptidos posibles. De forma específica, el procedimiento
de ajuste intenta crear la distribución de isótopos de péptidos
teórica promedio de mejor ajuste en función de los parámetros como
la altura del pico, la resolución y la masa monoisotópica. La
convergencia a un ajuste significativo viene determinada normalmente
por la localización de los valores sigma. Tras una convergencia
exitosa, se crea un valor aproximado de los errores de los
parámetros determinados empleando un procedimiento autoinducido que
utiliza dieciséis repeticiones con un intercambio aleatorio de 1/3
de los puntos de referencia. El ajuste resultante se sustrae de los
datos, el nivel de ruido cerca del ajuste se ajusta a la suma del
nivel de ruido extrapolado y a la desviación del ajuste del pico, y
el proceso es iterado para hallar el pico siguiente siempre que un
pico candidato se pueda hallar más de cinco veces sobre el nivel de
ruido. EL proceso se interrumpe cuando se han hallado más de 50
picos de datos. El cero y el primer orden del tiempo de vuelo a la
conversión de masa se corrigen usando la extrapolación lineal a
partir de los picos estándar internos detectados y de los intervalos
de confianza y se estiman los intervalos de confianza para los
valores de masa monoisotópica a partir de las exactitudes de masa de
los picos y de los estándares.
Se comparan directamente las listas de masas de
los picos para los espectros de masa con los extractos teóricos
para toda la secuencia proteica. Para cada extracto teórico, se
calcula el (1-\pi(1-N
P(pi))^{cMatches}, donde N es el número de péptidos en el
extracto teórico, P(pi) es el número de péptidos que
corresponde al intervalo de confianza para la masa monoisotópica
del pico dividido por el recuento de todos los péptidos en la base
de datos de la secuencia, y cMatches es el número de coincidencias
entre el extracto y el espectro de masas. Se puede observar que
este valor es proporcional a la probabilidad de obtener un valor de
coincidencia falso positivo entre el extracto y el espectro. Los
valores de probabilidad se filtran para una mayor significación de
los picos del espectro que producen las coincidencias. Después de
una primera vuelta de identificaciones, las desviaciones de las
identificaciones para los espectros de masa adquiridos en
condiciones idénticas se utilizarán para corregir los términos de
segundo y tercer orden del tiempo de vuelo frente a la conversión
de masa. Los valores resultantes tienen mayoritariamente unas
desviaciones absolutas inferiores a 10 ppm. Estos valores de masa
se utilizan luego para una vuelta final de coincidencias, donde se
aceptan todas las coincidencias que tienen un P_{mism} inferior a
0,01/N proteínas (nivel de significación del 1% con corrección de
Bonferoni).
En base a la observación de que la mayoría de
las proteínas con una función de señalización son glucosiladas, la
naturaleza de las columnas de Heparina Sepharose hace que sea
una herramienta muy versátil para la separación de muchas proteínas
glucosiladas como, por ejemplo, las proteínas con función de
señalización, los factores de crecimiento, las proteínas de
coagulación y los receptores esteroideos. El ligando en la columna
de Heparina Sepharose es un glucosaminglucano sulfatado
natural que se extrae del proteoglucano nativo de la mucosa
intestinal porcina. La heparina consiste en unidades alternantes de
ácido urónico y D-glucosamina, la mayoría de las
cuales son sustituidas por uno o dos grupos sulfato. La heparina
inmovilizada tiene dos formas importantes de interacción con las
proteínas. Puede funcionar como un ligando de afinidad; por ejemplo,
en su interacción con los factores de coagulación. La heparina
tiene también una función como de intercambiador catiónico de
elevada capacidad debido a sus grupos sulfato aniónicos. En nuestro
caso, la columna se manipulaba usando una jeringa.
Las condiciones de elución recomendadas para
ambos casos comprendían el aumento de la resistencia iónica usando
un gradiente de NaCl 2M en el cual el tampón ligante era el fosfato
de sodio 10 mM pH 7 y el tampón de elución era el fosfato de sodio
10 mM, NaCl 2M, pH 7.
25 ml del medio se centrifugaban a 10.000 g
durante 10 minutos a 4ºC para eliminar las células y otros
materiales insolubles. La solución de prueba se ajustaba a la
composición de la solución tampón de enlace. Esto se efectuaba
diluyendo la muestra añadiendo 25 ml de una solución tampón de
fosfato de sodio 20 mM (pH=7). La muestra se centrifugaba
inmediatamente antes de aplicarlo en la columna. El volumen de
descarga para la columna de heparina (HiTrap Heparin HP, 1 ml,
Cat.Nr. 17-0406-01, Amersham), era
de 5 ml para columna de 1 ml.
- 1.
- Una jeringa de 25 ml se llenaba de solución tampón de enlace. Además se retiraba el tapón y la columna se conectaba a la jeringa con el adaptador "gota a gota" para evitar la entrada de aire en la columna.
- 2.
- Se retiraba el extremo doblado para equilibrar la columna, se lavaba con 0 volúmenes de columna de solución tampón de unión.
- 3.
- Luego se prepara la muestra tal como se ha descrito y se aplicaba usando una jeringa ajustada al adaptador luer mediante bombeo en la columna
- 4.
- Luego la columna se lavaba con 5 volúmenes de solución tampón o hasta que el material no apareciera en el efluente.
- 5.
- Para eluir la muestra, la columna se lavaba con 5 volúmenes de columna de tampón de elución usando un gradiente
- 6.
- Finalmente, las fracciones purificadas se desalaban usando columnas de R2 POROS
Las fracciones de muestra eluidas de la columna
de heparina se desalaban usando cromatografía de fase invertida
(POROS R2, PerSeptive Biosystems), y se secaban usando un Speed Vac
(concentrador centrífugo). Tras el secado, las muestras se
disolvían en un tampón de muestra mencionado antes y el contenido en
proteína se determinaba mediante el procedimiento de Bradford
(BioRad protein assay, BioRad).
15 \mug de muestra se disolvían en 20 \mul
de solución tampón de muestra (Muestra, 2,5 \mul de tampón de
muestra NuPAGE LDS (4X), 1,0 \mul de agente reductor NuPAGE (10X)
y agua desionizada hasta 6,5 \mul, para un volumen total de 10
\mul) y antes de aplicarlo en el gel, se calentaba a 70ºC durante
10 minutos. La cámara superior para el tampón se llenaba de 200 ml
de tampón corriente 1X NuPAGE SDS (el tampón corriente MES SDS se
preparaba añadiendo 50 ml de tampón corriente 20X NuPAGE MES SDS a
950 ml de agua desionizada). Como un agente reductor, se añadían
200 \mul/200 ml de solución antioxidante a la cámara de tampón
superior. Finalmente, la cámara inferior de solución tampón se
llenaba con 600 ml de tampón corriente 1X Un PAGE SDS y la
electroforesis del gel se realizaba sobre un gradiente lineal BT del
10%, geles de poliacrilamida (NuPAGE, Invitrogen) a un voltaje
constante de 200V a temperatura ambiente durante 35 minutos.
Después de la fijación proteínica con un 50% de
metanol (v/v) que contiene un 5% de ácido fosfórico durante 12
horas, los geles se coloreaban con azul Coomassie coloidal (Novex,
San Diego, CA,USA) durante otras 24 horas. Los geles se decoloraban
con H_{2}O y se escaneaban en un escáner estándar. Las imágenes se
trataban usando el software Photoshop (Adobe) y el Power Point
(Microsoft). Las bandas proteicas se cuantificaban usando el
software Image Master 2D Elite (Amersham Pharmacia
Biotechnology).
LC-MS: Para la identificación de
las proteínas segregadas nuestros estudios de la proteinómica
también se llevaban a cabo usando un sistema LC/MS denominado
tecnología de identificación proteínica multidimensional (MudPIT)
que combina la cromatografía líquida multidimensional con la
espectrometría de masa junto con la ionización por electrospray
(ESI). Para separar las proteínas extraídas enriquecidas por las
columnas de heparina, nuestro método de cromatografía líquida
multidimensional consiste en una fuerte resina de intercambio
catiónico (SCX) y una resina de fase invertida en una columna
bifásica. Cada análisis MudPIT se realizaba por duplicado y la
separación era reproducible en un 0,05% entre dos análisis. Además,
se ha demostrado un margen dinámico de 10000 a 1 entre las
proteínas/péptidos más abundantes y menos abundantes en una mezcla
de péptidos compleja. Mejorando la preparación de la muestra junto
con las separaciones, el método mejoraba el análisis global de
proteomas al identificar las proteínas de una fracción enriquecida
con las proteínas segregadas. El sistema MudPIT incluía una
pre-columna de 4 cm x 50 - \mum d.i. x 5 \mum
C18 microSPE para la concentración de la muestra y una columna
capilar empaquetada de 85 cm x 15 - \mum d.i. x 3 \mum C18 para
una separación LC a nanoescala de fase invertida de cantidades de
muestra extremadamente pequeñas. La fase microSPE permitía que la
solución se cargara en la columna nanoLC a aproximadamente 8
\mul/min., lo que requería <2 min. para cargar una solución de
10 \mul con una pérdida de muestra <5% (debido a los
adaptadores de la jeringa y de la válvula). La separación se
realiza a una presión constante de 10.000 psi. La columna capilar
empaquetada de diámetro interior de 15 \mum y una longitud de
partícula de 3 \mum aporta una capacidad máxima de separación de
aproximadamente 10^{3}. La columna está conectada mediante una
tuerca de unión de acero inoxidable de volumen muerto cero a un
nanoESI emisor reemplazable fabricado a partir de una columna
capilar de sílice fundido de 10 \mum de d.i. x 150 \mum de
diámetro exterior con un orificio de aproximadamente 2 \mum de
diámetro interior para una ionización altamente eficaz del péptido
que se eluye. La fuente ESI se interconecta a un FTICR MS o bien a
un MS/MS iónico para la detección e identificación de
péptidos/proteínas. Un espectrómetro de masa FTICR se utilizaba
para la MS de una sola etapa en base a mediciones de masa de elevada
exactitud y al uso de la información (RRT) del tiempo de retención
relativo y un espectrómetro de masa captador de iones Finnigan (LCQ
XP, TermoQuestCorp., San Jose, CA) se utilizaba para el MS/MS.
El anticuerpo policlonal al marcador
IPF-1 de insuficiencia de células beta es generado
para el uso ulterior de los anticuerpos en la medición de suero y
plasma y de los niveles de sangre del IPF-1 mediante
ensayos de inmunodetección, por ejemplo, Western Blotting y
ELISA.
Para generar anticuerpos al
IPF-1 se realiza la expresión recombinante de la
proteína para obtener inmunógenos. La expresión se lleva a cabo
aplicando una combinación del sistema de expresión RTS 100 y de la
E. coli. En una primera etapa, se analiza la secuencia del
ADN y se obtienen las recomendaciones para las variantes
mutacionales silenciosas del ADNc de alto rendimiento y las
respectivas secuencias del cebador de la RCP utilizando el sistema
"ProteoExpert RTS E. coli HY". Este es un servicio
basado en una web comercial (www.proteoexpert.com).
Utilizando los pares de cebadores recomendados, se utiliza el
sistema "RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set,
His-tag" (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Germany, Cat.No. 3186237) para generar los templados de la RCP
lineal a partir del ADNc y para la transcripción in vitro y
la expresión de l código de la secuencia de nucleótidos para la
proteína IPF-1. Para la detección mediante el
sistema Western-blot y posterior purificación, la
proteína expresada contiene un His-tag. Se
identifica la variante que mejor se expresa. Todas las etapas desde
la RCP a la expresión y detección se llevan a cabo de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. El producto respectivo de la RCP
que contiene todas las regiones reguladoras necesarias T7 (promotor,
lugar del enlace ribosómico y terminador T7) está clonado al vector
pBAD TOPO® (Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Nr. cat. K 4300/01)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la expresión que
utiliza las secuencias reguladoras T7, la construcción se
transforma en E. coli BL 21(DE 3)(Studier, F.W., y
cols., Methods.
Enzymol.185(1990)60-89) y las
bacterias transformadas son cultivadas en un lote de 1 litro para la
expresión proteínica.
La purificación de la proteína de fusión
His-IPF-1 se realiza siguiendo los
procedimientos estándar en una columna de quelato de níquel.
Brevemente, 1 l de cultivo de bacteria que contiene el vector de
expresión para la proteína de fusión
His-IPF-1 se granula mediante
centrifugación. El granulado celular se vuelve a suspender en una
solución tampón de lisis que contiene fosfato, cloruro de guanidio
0,7M pH 8,0, imidazol y tioglicerol, y se somete a un proceso de
homogenización usando un Ultra-Turrax®. El material
insoluble se granula mediante centrifugación a elevada velocidad y
el sobrenadante se aplica a una columna cromatográfica de quelato de
níquel. La columna se lava con varios volúmenes de solución tampón
de lisis y seguidamente lavados con la solución tampón que contiene
fosfato, a pH 8,0 y urea. Finalmente, el antígeno enlazado es eluido
usando un tampón de fosfato que contiene SDS en condiciones
ácidas.
Ratones A/J de 12 semanas son inmunizados
inicialmente por vía intraperitoneal con 100 \mug de
IPF-1. Al cabo de 6 semanas se realizan otras dos
inmunizaciones intraperitoneales a intervalos mensuales. En este
proceso cada ratón recibe 100 \mug de IPF-1
adsorbidos en hidróxido de aluminio y 10^{9} gérmenes de
Bordetella pertussis. Posteriormente se llevan a cabo las dos
últimas inmunizaciones por vía intravenosa el tercer y segundo día
previo a la fusión utilizando 100 \mug de IPF-1 en
tampón de PBS para cada uno.
Las células del bazo de los ratones inmunizados
según a) se funden con células del mieloma conforme a Galfre, G., y
Milstein, C., Methods in Enzymology
73(1981)3-46. En este proceso,
aproximadamente 1*10^{8} células del bazo del ratón inmunizado se
mezclan con 2x10^{7} células de mieloma
(P3x63-Ag8-653, ATCC CRL 1580) y se
centrifugan (10 min a 300 g y 4ºC).Las células se lavan luego una
vez con el medio RPMI 1640 sin suero bovino fetal (FCS) y se
centrifugan de nuevo a 400 g en un tubo cónico de 50 ml. Se descarta
el sobrenadante, el sedimento celular se afloja suavemente con una
ligera sacudida, se añade 1 ml de PEG (peso molecular 4000, Merck,
Darmstadt) y se mezcla mediante pipeteo. Al cabo de 1 minuto en un
baño de agua a 37ºC, 5 ml de RPMI 1640 sin FCS se añadirán gota a
gota a temperatura ambiente en un periodo de 4-5
minutos. Posteriormente 5 ml de RPMI 1640 que contienen un 10% de
FCS se añaden gota a gota en aproximadamente 1 minuto, se mezcla
minuciosamente, y se llena con medio (RPMI 1640+10% FCS) hasta 50
ml y posteriormente se centrifuga durante 10 minutos a 400 g y a
4ºC. Las células sedimentadas son absorbidas en el medio RPMI 1640
que contiene un 10% de FCS y cultivadas en un medio de selección de
hipoxantina-azaserina (100 mmol/l de hipoxantina, 1
\mug/ml de azaserina en RPMI 1640+ 10% de FCS). La interleucina 6
se añadirá al medio a 100 U/ml como un factor de crecimiento.
Después de aproximadamente 10 días, se analiza el anticuerpo
específico en los cultivos primarios. Los cultivos primarios
positivos de IRPF-1 son clonados en unas placas de
cultivo celular de 96 pocillos por medio de un distribuidor de
células activado por fluorescencia. En este proceso de nuevo se
añade interleucina 6 al medio a 100 U/ml como aditivo de
crecimiento.
Las células del hibridoma obtenidas son
cultivadas en una densidad de 1x10^{5} células por ml en un medio
RPMI 1640 que contiene un 10% de FCS y son proliferadas durante 7
días en un fermentador (Thermodux Co., Wertheim/Main, Model
MCS-104XL, Pedido nr. 144-050). Se
obtienen concentraciones promedio de 100 \mug de anticuerpo
monoclonal por ml en el sobrenadante del cultivo. La purificación
de este anticuerpo del sobrenadante del cultivo se realiza
siguiendo métodos convencionales en la química de las proteínas (por
ejemplo, según Bruck, C., y cols., Methods in Enzymology 121 (1986)
(587-695).
Para la inmunización, se prepara una emulsión
nueva de la solución proteínica (100 \mug/ml de proteína
IPF-1) y el adyuvante completo de Freund en el
porcentaje 1:1. Cada conejo se inmuniza con 1 ml de la emulsión los
días 1, 7, 14 y 30, 60 y 90. La sangre se extrae y el suero
anti-IPF-1 resultante es utilizado
para otros experimentos tal como se ha descrito en los ejemplos 3 y
4.
Un volumen de suero de conejo se diluye con 4
volúmenes de tampón acetato (60 mM, pH 4,0). El pH se ajusta a 4,5
con Tris-base 2M. El ácido caprílico (25 \mul/ml
de muestra diluida) se añadirá gota a gota agitando vigorosamente.
Después de 30 minutos la muestra se centrifuga (13.000 x g, 30 min,
4ºC), se descartan los gránulos y se recoge el sobrenadante. El pH
del sobrenadante se ajusta a 7,5 añadiendo la
tris-base 2M y se filtra (0,2 \mum).
La inmunoglobulina en el sobrenadante se
precipita agitando vigorosamente mediante la adición gota a gota de
una solución de sulfato de amonio 4M a una concentración final de
2M. Las inmunoglobulinas precipitadas se recogen por centrifugación
(8000 x g, 15 min, 4ºC).
Se descarta el sobrenadante. Los gránulos se
disuelven en NaH_{2}PO_{4} 10 mM/NaOH, pH 7,5, NaCl 30 mM y se
dializan de forma exhaustiva. El dializado es centrifugado
(13.000xg, 15 min, 4ºC) y filtrado (0,2 \mum).
La IgG de conejo policlonal se lleva a 10 mg/ml
en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM. A la solución
de IgG se añaden 50 \mul de
Biotin-N-hidroxisuccinimida (3,6
mg/ml en DMSO) por ml. Después de 30 minutos a temperatura ambiente,
la muestra es cromatografiada en Superdez 200
(NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM). Se recogen las
fracciones que contienen IgG biotinilado. Los anticuerpos
monoclonales han sido biotinilados según el mismo
procedimiento.
La IgG policlonal de conejo se añade a 10 mg/ml
a NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM. A la solución
de IgG se añaden 50 \mul de ester de
digoxigenina-3-O-metilcarbonil-\varepsilon-aminocaproico
-N-hidroxisuccinimida (Roche Diagnostics, Mannheim,
Alemania, Nr. Cat. 1 333 054) (3,8 mg/ml en DMSO). Después de 30
minutos a temperatura ambiente, la muestra es cromatografiada en
Superdex® 200 (NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM).
Se recogen las fracciones que contienen IgG digoxigenilado. Los
anticuerpos monoclonales son etiquetados con digoxigenina según el
mismo procedimiento.
Las muestras de proteínas enriquecidas y
aisladas del medio por las columnas de heparina (mencionadas antes)
se disolvían en la solución tampón de la muestra formada por
Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,05% Tween
20, 1% de SDS, y se centrifugaban a 12.000 g durante 10 minutos a
4ºC. La concentración proteínica del sobrenadante se medía mediante
Bradford usando una curva estándar construida a partir de una gama
de estándares de albúmina de suero bovino conocida. Tras el
mezclado de muestras con el tampón de muestra
(Tris-HCl 60 mM, 2% SDS, 0,1% de azul de
bromofenol, 25% de glicerina, y 2-mercaptoetanol
14,4 mM, Ph 6,8) y la incubación a 70ºC durante 5 minutos, las
muestras se separaban por medio de geles ExcelGel SdS homogéneos del
12,5% (Amersham Bioscience) y se electrotransferían a las membranas
de nitrocelulosa. Después de la incubación en la solución de bloqueo
(Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,05% Tween
20 y 5% de leche seca no grasa), las membranas se incubaban con
anticuerpo de rata anti-anti conejo durante 2 horas
a temperatura ambiente, respectivamente. Tras lavar 3 veces durante
10 minutos con solución de lavado (0,3% Tween 20 en solución salina
tris-tamponada), las membranas se incubaban con una
IgG anti-conejo conjugada de peroxidasa de rábano
(H+L), una IgG_{1} anti-ratón y una IgG_{2a}
anti-ratón (Southern Biotechnology Associates, Inc.,
Birmingham, AL), respectivamente, durante 1 hora a temperatura
ambiente. Las membranas se lavaban 3 veces durante 10 minutos y los
complejos antígeno-anticuerpo se visualizaban
mediante un reactivo de quimioluminiscencia (Western
Lightning^{TM}, Perkin Elmer Life Sciences, Inc., Boston, MA)
sobre una película de rayos X según el protocolo del fabricante.
Para la detección del IPF-1 en
suero humano o plasma, se desarrolla un ELISA con la técnica
sándwich. Para la captura y detección del antígeno, las partes
alícuotas del anticuerpo policlonal
anti-IPF-1 (ver ejemplo 2) se
conjugan con biotina y digoxigenina, respectivamente.
Las placas de microvaloración de 96 pocillos
revestidas de estreptavidina se incuban con 100 \mul de anticuerpo
policlonal anti-IPF-1 biotinilado
durante 60 minutos a 10 \mug/ml en fosfato 10 mM, pH 7,4, 1% BSA y
0,1% Tween 20. Tras la incubación, las placas se lavan tres veces
con 0,9% de NaCl, 0,1% Tween 20. Los pocillos se incuban luego
durante 2 horas con una dilución en serie de la proteína
recombinante (ver ejemplo 2) como antígeno estándar o bien con
muestras de plasma diluido de los pacientes. Después de la unión del
IPF-1, las placas se lavan tres veces con un 0,9%
de NaCl, 0,1% Tween 20. Para la detección específica del
IPF-1enlazado, los pocillos se incuban con 100
\mul de anticuerpo policlonal
anti-IPF-1 digoxigenilado durante 60
minutos a 10 \mug/ml en fosfato 10 mM, pH 7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl
y 0,1% Tween 20. Posteriormente, las placas se lavan tres veces
para eliminar el anticuerpo no enlazado. En una etapa posterior, los
pocillos se incuban con conjugados de
anti-digoxigenina-POD 20 mU/ml
(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, nr. catálogo 1633716)
durante 60 minutos en fosfato 10 mM, pH 7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl y
0,1% Tween 20. Las placas se lavan seguidamente tres veces con el
mismo tampón. Para la detección de los complejos
antígeno-anticuerpo, los pocillos se incuban con 10
\mul de solución ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany,
nr. catálogo 11685767) y el OD se mide después de
30-60 minutos a 405 nm con un lector ELISA.
La utilidad clínica del marcador nuevo
IPF-1 se evalúa midiendo sus niveles en 10 pacientes
diabéticos según las inyecciones de insulina exógena y comparando
los niveles con los medidos en 10 pacientes con función normal
verificada de las células beta. El análisis estadístico se lleva a
cabo mediante la evaluación del test t de Student con valores
<0,05 tomados como significativos.
<100> F. Hoffmann- La Roche AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> IPF-1 como un
marcador/referencia para la insuficiencia de células beta
\vskip0.400000\baselineskip
<130> caso 22665
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Paciente versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 283
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor de insulina factor 1
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...283
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nr. Acceso P52945
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Un método in vitro de cribado para un
compuesto que impide y/o inhibe y/o retarda la insuficiencia de
células beta, que comprende la etapa de detección del factor 1
(IPF-1) promotor de la insulina soluble, secretado
por un anfitrión en presencia o ausencia de dicho compuesto, de
forma que un compuesto que impide y/o inhibe y/o retrasa la
insuficiencia de las células beta es un compuesto con el cual el
nivel de IPF-1 de un anfitrión se ve alterado.
2. Un método para el diagnóstico de la
insuficiencia de células beta que comprende las etapas de
- a)
- aporte de una muestra de líquido corporal obtenida de un individuo
- b)
- puesta en contacto de dicha muestra de líquido corporal con un agente aglutinante específico para el IPF-1 en unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho agente aglutinante y el IPF-1, y
- c)
- correlación de la cantidad de complejo formado en (b) con el diagnóstico de la insuficiencia de células beta.
3. Los métodos conforme a cualquiera de los
puntos de la reivindicación 2, que se caracterizan porque
dicha muestra es suero.
4. El método conforme a la reivindicación 2, que
se caracteriza porque dicha muestra es plasma.
5. El método conforme a la reivindicación 2, que
se caracteriza porque dicha muestra es sangre entera.
6. Uso de un IPF-1 proteínico
como una molécula marcador en el diagnóstico de la insuficiencia de
células beta y/o en el diagnóstico prematuro de la diabetes tipo II
de una muestra de líquido corporal obtenido de un individuo
7. El uso de la reivindicación 6, de forma que
el factor proteínico se utiliza en combinación con al menos otra
molécula marcador para la insuficiencia de células beta en el
diagnóstico de la insuficiencia de células beta de una muestra de
líquido corporal obtenida de un individuo
8. El uso conforme a la reivindicación 6, de
forma que el diagnóstico prematuro de la diabetes tipo II se realiza
con una muestra derivada de pacientes que sufren intolerancia a la
glucosa.
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