CN1642923A - 由1－苯磺酰－3－氨基酸侧链－4－(2－核酸碱基(乙酰基)－哌嗪－2－酮制备的肽核酸寡聚物 - Google Patents

由1－苯磺酰－3－氨基酸侧链－4－(2－核酸碱基(乙酰基)－哌嗪－2－酮制备的肽核酸寡聚物 Download PDF

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Abstract

本申请涉及用来制备PNA(肽核酸)寡聚物的通式(I)的单体，并提供了合成预定序列PNA寡聚物和随机序列PNA寡聚物的方法：其中，R1、R2、R3、R4、R5独立为H、卤素、C1－C4烷基、硝基、腈、C1－C4烷氧基、卤化的C1－C4烷基或卤化的C1－C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基；R6是H或天然或非天然α－氨基酸的被保护或未被保护的侧链；和B是天然或非天然的核酸碱基，其中，当所述核酸碱基具有环外氨基官能团时，所述官能团受保护基保护，所述保护基在酸性条件下不稳定但在弱碱性至中等碱性条件下稳定。

Description

由1-苯磺酰-3-氨基酸侧链-4-(2-核酸碱基(乙酰基)- 哌嗪-2-酮制备的肽核酸寡聚物
发明背景
1.发明背景：
本发明涉及适合制造PNA寡聚物的单体。本发明还涉及所述单体的前体和从该前体制造PNA单体的方法。此外，本发明涉及用PNA单体制造PNA寡聚物的方法。
2.技术背景和现状：
在最近20年中，通过修饰磷酸基、核糖环或核酸碱基来最优化寡核苷酸的性质的努力导致了许多新寡核苷酸衍生物的发现，这些衍生物可以反义和反义基因的形式用于DNA诊断和治疗的领域，以及用于对分子生物学和生物技术的基础研究(U.Englisch和D.H.Gauss，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1991，30，613-629；A.D.Mesmaeker等，Curr.Opinion Struct.Biol.1995，5，343-355；P.E.Nielsen，Curr.Opin.Biotech.，2001，12，16-20)。最显著的发现是由Nielsen，Egholm，Buchardt和Berg组成的丹麦小组报道的肽核酸(P.E.Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500)。PNA是DNA类似物，其中N-(2-氨基乙基)甘氨酸聚酰胺代替了磷酸-核糖环主链和亚甲基-羰基接头将天然和非天然核酸碱基连接到N-(2-氨基乙基)甘氨酸中间的胺上。尽管对天然的结构进行了基团的改变，但PNA仍能够遵守Watson-Crick碱基配对规则序列特异性地与DNA结合。PNA以高于其天然对应物的亲和力与互补的核酸结合。这一部分是由于主链上缺乏负电荷，从而减小了电荷-电荷之间的斥力，也由于有利的几何因素(S.K.Kim等，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，6477-6481；B.Hyrup等，J.Am.Chem.Soc.，1994，116，7964-7970；M.Egholm等，Nature，1993，365，566-568；K.L.Dueholm等，New J.Chem.，1997，21，19-31；P.Wittung等，J.Am.Chem.Soc.，1996，118，7049-7054；M.Leijon等，Biochemistry，1994，9820-9825)。还证实所得PNA/DNA双链体的热稳定性与杂交溶液的盐浓度无关(H.Orum等，BioTechniques，1995，19，472-480；S.Tomac等，J.Am.Chem.Soc.，1996，118，5544-5552)。而且，PNA可以平行或逆平行的方式结合，逆平行模式是优选的(E.Uhlman等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1996，35，2632-2635)。
PNA/DNA双链体的错配远比DNA/DNA双链体的错配不稳定。一个碱基的错配将导致PNA/DNA和DNA/DNA的Tm分别降低15℃和11℃。全嘧啶PNA寡聚物和有高嘧啶/嘌呤比例的PNA寡聚物可与互补DNA结合形成异常稳定的PNA2/DNA三螺旋(P.E.Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500；L.Betts等，Science，1995，270，1838-1841；H.Knudsen等，Nucleic Acids Res.，1996，24，494-500)。尽管PNA有酰胺键和核酸碱基，PNA对核酸酶和蛋白酶都显出很强的抗性。与DNA相比(DNA用强酸处理会脱嘌呤，用碱金属氢氧化物处理会水解)，PNA是完全酸稳定的且对弱碱足够稳定。
通常，PNA寡聚物是用已知的固相肽合成法合成的。一些研究小组独立开发了新的单体策略以优化PNA寡聚物的合成。PNA单体的制备可分为合成适当保护的N-氨基乙基甘氨酸和适当保护的核酸碱基乙酸衍生物，然后将这两者偶联。
据报道，PNA寡聚物合成的第一个合成策略是采用t-Boc/苄氧羰基保护基的Merrifield固相合成，其中，用t-Boc保护主链氨基，用苄氧羰基保护核酸碱基的环外氨基(P.E.Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500；M.Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，9677-9678；M.Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1895-1897；M.Egholm等，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1993，800-801；K.L.Dueholm等，J.Org.Chem.，1994，59，5767-5773；WO 92/20702)。用t-Boc/苄氧羰基保护的PNA单体现在可在商业上获得，但不便于使用，因为需要用TFA反复处理以将t-Boc去保护，同时需要用苛刻的HF或三氟甲烷磺酸处理以从树脂上切下并从核酸碱基的环外胺上除去苄氧羰基的保护。因此，这种方法不能用来合成许多类型的经过修饰的PNA寡聚物，如PNA-DNA嵌合体。此外，考虑到从操作人员的安全和对自动化设备和生产线的腐蚀作用，使用危险的酸如HF或三氟甲烷磺酸在商业上不可取。此外，t-Boc/苄氧羰基保护法是一种区分的策略，它定义为保护基系统，其中，保护基用相同种类的试剂或条件去除，但依赖于不同的相对反应速度以依次除去各个保护基。例如，在t-Boc/苄氧羰基保护法中，两种保护基都是酸不稳定的，但需要较强的酸以有效去除苄氧羰基。当使用酸完全去除更加酸不稳定的t-Boc基时，存在同时去除部分苄氧羰基的可能性。不幸的是，在合成寡聚物的每个合成循环中都必需从主链氨基上去除t-Boc基。因此，TFA足以将部分侧链苄氧羰基过早地去保护，这就可能造成寡聚物分支并降低所需产物的总产率。
在寻找用于PNA寡聚物合成的较温和的，与DNA寡聚物的合成不矛盾的去保护法的其它努力中，，一些研究小组开发出了用Mmt/酰基保护的PNA单体，其中，用Mmt保护主链氨基，用酰基保护核酸碱基的环外氨基，如对胞嘧啶或腺嘌呤用苯甲酰基、甲氧苯酰基和叔丁基苯甲酰基，对鸟嘌呤用异丁烯基、乙酰基(D.W.Will等，Tetrahedron，1995，51，12069-12082；P.J.Finn等，Nucleic Acid Research，1996，24，3357-3363；D.A.Stetsenko等，Tetrahedron Lett.1996，3571-3574；G.Breipohl等，Tetrahedron，1997，14671-14686)。
其它用Fmoc/二苯甲基氧羰基保护的PNA单体也可在商业上获得，其中，用Fmoc保护主链氨基，用二苯甲基氧羰基保护核碱基的环外氨基(J.M.Coull等，US6,133,444)。但Fmoc/二苯甲基氧羰基法也有一些缺点，如Fmoc去保护时发生的副反应和溶液中单体的不稳定性。最重要的副反应是在Fmoc去保护条件下，核酸碱基乙酰基从仲氨基官能团迁移到氨基乙基甘氨酸主链的游离N-末端氨基官能团(L.Christensen等，J.Pept.Sci.1995，1，175-183)。寡聚物合成每个循环中的N-乙酰基转移反应导致副产物的积累，这种副产物由于有类似的极性和同样的分子量而难以分离。而且，Fmoc保护基在痕量胺存在时非常不稳定。因此，选择PNA单体的溶剂必需小心。通常，推荐高质量的N-甲基吡咯烷酮是。这在合成PNA寡聚物时需要较高花费。
还报道了使用Fmoc/苄氧羰基(S.A.Thomson等，Tetrahedron，1995，6179-6194)和Fmoc/Mmt(G.Breipohl等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1996，6，665-670)保护单体用于PNA寡聚物的合成。然而，就单体溶解性和制备、苛刻的反应条件和单体合成和/或PNA寡聚物合成中发生的副反应而言，所有这些方法都有严重缺点。
在其它寻找新单体的努力中，ISIS和Biocept报道了环状单体。ISIS研究的第一种方法用吗啉酮(morpholinone)代替被保护的主链(美国专利No.5,539,083)，但该方法有严重的缺点，即偶联反应产生的羟基官能团需要在寡聚物合成的每个延伸步骤中转化为胺官能团。或者，用N-t-Boc-哌嗪酮(piperazinone)代替被保护的氨基乙基甘氨酸部分(WO 00/02899)。但该方法也有严重的缺点，即寡聚化过程中单体的反应性，以及在上述线性t-Boc法中出现的同样的问题。
尽管最近有发展，仍需要一种可提高产率、降低合成费用且适合自动合成和平行合成的新的单体。
发明概述
本发明提供了新的单体，这种单体在PNA寡聚物合成中具有提高的功效且简便。另一个目的是提供可方便地用于合成PNA寡聚物的自动合成仪等设备的PNA单体。
本发明的新单体是具有通式I的化合物：
其中，
R1、R2、R3、R4、R5分别可以是H，卤素，如F、Cl、Br或I，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，卤化的(如F和Cl)C1-C4烷基或卤化的(如F和Cl)C1-C4烷氧基，其中，
至少R1、R3和R5之一是硝基，
R6可以是H或天然或非天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链，和
B是天然或非天然的核酸碱基，其中，当所述核酸碱基具有环外氨基官能团时，所述官能团受保护基保护，所述保护基在酸性条件下不稳定但在弱碱性至中等碱性条件下稳定。
本发明还提供了从通式V的化合物制造通式I的化合物的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了通式V的化合物和从通式II的化合物制备通式化合物的方法。
Figure A0380649400112
其中，
R1、R2、R3、R4、R5分别可以是H，卤素，如F、Cl、Br或I，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，卤化的(如F和Cl)C1-C4烷基或卤化的(如F和Cl)C1-C4烷氧基，其中，
至少R1、R3和R5之一是硝基，
R6可以是H或天然或非天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链，
R7可以是H，(C1-C4)烷基或芳基，和
B是天然或非天然的核酸碱基，其中，当所述核酸碱基具有环外氨基官能团时，所述官能团受保护基保护，所述保护基在酸性条件下不稳定但在弱碱性至中等碱性条件下稳定。
本发明还提供了从通式IV的化合物制备式I的化合物的方法。
本发明还提供了通式IV的化合物及其游离酸形式，以及它们的制备方法：
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6如上定义，和
HY是有机或无机酸。
本发明还提供了从通式II的化合物制备通式IV的化合物的方法。
同时，本发明提供了式II的化合物和它们的制备方法：
Figure A0380649400122
其中，
R1、R2、R3、R4、R5，R6和R7如上定义。
本发明涉及式I的化合物，其残基如上定义。特别地，R6残基可以是H或天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链.在另一个实施方案中，B可以是胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)，腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)。更特别地，B的保护基可以是苄氧羰基或二苯甲基氧代羰基。在其它实施方案中，式I的单体化合物可具有以下构造：R1是硝基和R3是卤素，三氟甲基或甲基；R2、R4、R5是H。或者，R1是硝基，R3是Cl，R5是Cl或甲基，R2和R4是H。或者，R3是硝基和R1、R2、R4和R5是H。再或者，R3是硝基，R1是Cl，R2、R4和R5是H。
本发明还涉及制造式I的化合物的方法，包括在通常用于肽合成的偶联剂或混合酐存在下环化式VI的化合物(图6)。式VI的残基如上定义。
本发明还涉及制造式I的化合物的方法，包括在非亲核的有机碱和通常用于肽合成的偶联剂存在下使式IV的化合物与核酸碱基乙酸部分发生偶联反应。
本发明涉及式V的化合物，其残基如上定义。特别地，R6残基可以是H或天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链。在另一个实施方案中，B可以是胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)，腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)。更特别地，B的保护基可以是苄氧羰基或二苯甲基氧羰基.在其它实施方案中，所述式V的化合物可有以下构造：R1是硝基和R3是卤素，三氟甲基或甲基；R2、R4、R5是H。或者，R1是硝基，R3是Cl，R5是Cl或甲基，R2和R4是H。更特别地，R3是硝基和R1、R2、R4和R5是H。再则，R3是硝基，R1是Cl，R2、R4和R5是H。再则，R7可以是甲基，乙基或叔丁基。
在另一个实施方案中，本发明涉及制造式V的化合物的方法，包括在非亲核的有机碱和通常用于肽合成的偶联剂存在下使式II的化合物与核酸碱基乙酸部分发生偶联反应。
本发明涉及式II的化合物，其残基如上定义。特别地，R6残基可以是H或天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链。在其它实施方案中，所述式II的化合物可有以下构造：R1是硝基和R3是卤素，三氟甲基或甲基；R2、R4、R5是H。或者，R1是硝基，R3是Cl，R5是Cl或甲基，R2和R4是H。或者，R3是硝基和R1、R2、R4和R5是H。再则，R3是硝基，R1是Cl，R2、R4和R5是H。
本发明还涉及制造式II的化合物的方法，包括在非亲核的有机碱存在下使2-氨基乙基磺酰胺衍生物与卤代乙酸衍生物发生亲核取代反应。
本发明还涉及具有式IV的化合物及其游离酸形式。式IV的残基如上定义。但特别地，R6残基可以是H或天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链。在其它实施方案中，所述式IV的化合物可有以下构造：R1是硝基和R3是卤素，三氟甲基或甲基；R2、R4、R5是H。或者，R1是硝基，R3是Cl，R5是Cl或甲基，R2和R4是H。或者，R3是硝基和R1、R2、R4和R5是H。再则，R3是硝基，R1是Cl，R2、R4和R5是H。再则，HY可以是HCl或TFA。
本发明还涉及制造式IV的化合物的方法，包括在通常用于肽合成的偶联剂或混合酐存在下环化式III的化合物，然后在酸中将t-Boc去除。
本发明还涉及制造PNA寡聚物的方法，包括将式I的化合物连接在一起。
应当理解，上述“R”基团适用于所有式I-VI的化合物，包括特定实施方案中提到的R基团。还应理解，R基团适用于用本发明方法处理的化合物。
通过以下对本发明的描述、附图和权利要求和将更全面地理解本发明的这些目的和其它目的。
附图简述
通过下面的详细描述和附图将更全面地理解本发明，附图仅以例举方式给出，因此不是要限制本发明，其中：
图1显示了用于DNA识别的天然和非天然产生的核酸碱基的化学结构图。
图2显示了用于DNA识别的天然和非天然产生的核酸碱基的另一张化学结构图。
图3显示了合成被保护的主链的略图。
图4显示了另一种合成被保护的主链的略图。
图5显示了合成作为单体前体的被保护的哌嗪酮的略图。
图6显示了合成PNA单体的略图。
图7显示了另一种合成PNA单体的略图。
图8显示了合成PNA胸腺嘧啶单体的略图。
图9显示了另一种合成PNA胸腺嘧啶单体的略图。
图10显示了合成PNA胞嘧啶单体的略图。
图11显示了另一种合成PNA胞嘧啶单体的略图。
图12显示了合成PNA腺嘌呤单体的略图。
图13显示了另一种合成PNA腺嘌呤单体的略图。
图14显示了合成PNA或鸟嘌呤单体的略图。
图15显示了另一种合成PNA或鸟嘌呤单体的略图。
图16显示了从PNA单体合成PNA寡聚物的略图。
优选实施方案详述
在本发明中，通式I的化合物的硝基苯磺酰基发挥重要作用，它不仅作为主链胺的保护基，而且作为偶联反应的活化基团。具有上述特征的单体被用于通过手动或自动合成仪合成PNA寡聚物，以及通过组合化学制备PNA寡聚物文库。通式I的核酸碱基B自然连接在天然发现的位置上，即胸腺嘧啶或胞嘧啶的1位和腺嘌呤或鸟嘌呤的9位，以及非天然产生的核酸碱基(核酸碱基类似物)或核酸碱基连接部分。一些核碱基和说明性的合成核酸碱基显示在图1和图2中。
制备被保护的主链
制备通式I的新型单体的第一个步骤是合成式II的[2-(硝基苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物：
Figure A0380649400151
R1、R2、R3、R4、R5，R6和R7如上定义。
参考图3，N-[2-(硝基苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物的合成优选通过乙二胺用硝基苯磺酰氯的单保护反应，然后在非亲核的有机碱存在下使所得产物与卤代乙酸发生亲核取代反应。硝基苯磺酰氯是通过商业获得的或用已知方法制造的，如美国专利No.4,204,870中所述的方法。硝基苯磺酰氯是具有以下通式的化合物：
R1、R2、R3，R4和R5如上定义。
卤代乙酸酯是具有以下通式的化合物：
Figure A0380649400153
其中，
X是卤素基团，如Cl、Br和I，和
R7如上定义。
参考图3，单-磺酰化反应可将硝基苯磺酰氯缓慢加入在不存在有机碱的合适溶剂中的过量乙二胺溶液完成。上述反应的溶剂的例子有甲苯，苯，乙酸乙酯，四氢呋喃，二异丙醚，二乙醚，二氯甲烷，氯仿，四氯化碳和乙腈。优选的溶剂是二氯甲烷。反应完成后，反应混合物用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并过滤。所需产物通过在滤液中加入乙酸固化。亲核取代反应通过在合适溶剂中的单-磺酰化产物和非亲核的有机碱的混合物中加入卤代乙酸酯进行。上述反应的溶剂的例子有乙酸乙酯，四氢呋喃，二氯甲烷，氯仿，DMF和N-甲基吡咯烷酮。优选的溶剂是二氯甲烷。非亲核的有机碱的例子包括但不限于三乙胺、三丙胺、N，N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉和N-乙基吗啉。优选的非亲核的有机碱是三乙胺。
或者，优选的N-[2-(硝基苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物是使2-氨基甘氨酸衍生物的伯胺与硝基苯磺酰氯的选择性反应合成的(图4)，2-氨基甘氨酸衍生物是用已知方法制造的(例如，其中R1是H，见S.A.Thomson等，Tetrahedron，1995，6179-6194；其中R1是被保护或未被保护的天然或非天然α-氨基酸的侧链，见A.Puschl等，Tetrahedron Lett.，1998，39，4707-4710)。制备N-[2-(硝基苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物的偶联反应是在室温下在非亲核的有机碱存在下在N-(2-氨基乙基)-甘氨酸衍生物溶液中缓慢加入硝基苯磺酰氯进行的。上述反应的溶剂的例子有水，甲苯，苯，乙酸乙酯，四氢呋喃，二异丙醚，二乙醚，二氯甲烷，氯仿，四氯化碳和乙腈。优选的溶剂是二氯甲烷。非亲核的有机碱的例子包括但不限于三乙胺，三丙胺N，N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉和N-乙基吗啉。优选的非亲核的有机碱是三乙胺。通过薄层层析(TLC)监测反应完成后，反应混合物用水洗涤，干燥并减压蒸发以得到以得到所需产物。
制备1-(硝基苯磺酰基)-哌嗪-2-酮
用来合成通式I的单体的具有式IV的第一个前体合成子是从式II的N-[2-(硝基苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物，通过水解，保护仲胺，环化和去除仲胺的保护基制备的(图5)。
Figure A0380649400161
R1、R2、R3、R4、R5，R6和HY如上定义。
首先，通过添加过量的氢氧离子源将式II的N-[2-(硝基苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物转化成相应的酸。优选的R2是甲基或乙基。氢氧离子源的例子包括但不限于氢氧化锂，氢氧化钠和氢氧化钾。优选的氢氧离子源是氢氧化锂。然后无需后处理用二-叔丁基二碳酸酯处理反应混合物来保护仲胺以提供具有以下通式的化合物：
Figure A0380649400171
R1、R2、R3、R4、R5和R6如上定义。
水解反应优选通过在室温下在N-[2-(硝基苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物溶液中加入氢氧化锂(2当量)水溶液进行。通过TLC分析确定反应完成后，在反应混合物中加入氢氧化锂水溶液(再1当量)。将反应混合物搅拌足够长的时间。然后用乙酸乙酯提取除去过量的二-叔丁基二碳酸酯。然后酸化该水溶液，用二氯甲烷提取，干燥并减压蒸发以得到固体。上述反应的溶剂的例子是四氢呋喃水溶液，二噁烷水溶液和1，2-二甲氧基乙烷水溶液。优选的溶剂是四氢呋喃水溶液。
其次，使通式III的羧酸发生环化反应，然后将t-Boc去保护以得到通式IV的哌嗪酮衍生物。所述环化反应与羧酸的活化同时发生。羧酸的活化可通过肽合成的常规偶联剂在室温下完成。偶联剂的例子包括但不限于HATU(L.A.Carpino等，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，4397-4398)，HAPyU，TAPipU(A.Ehrlich等，TetrahedronLett.，1993，4781-4784)，HBTU(V.Dourtoglou等，Synthesis，1984，572-574)，TBTU，TPTU，TSTU，TNTU(R.Knorr等，Tetrahedron Lett.，1989，1927-1930)，TOTU，BOP(B.Castro等，Tetrahedron Lett.，1975，1219-1222)，PyBOP(J.Coste等，Tetrahedron Lett.，1990，205-208)，BroP(J.Coste等，Tetrahedron Lett.，1990，669-672)，PyBroP(J.Coste等，Tetrahedron Lett.，1991，1967-1970)，BOI(K.Akaji等，Tetrahedron Lett.，1992，3177-3180)，MSNT(B.Blankemeyer-Menge等，Tetrahedron Lett.，1990，1701-1704)，TDO(R.Kirstgen等，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1987，1870-1871)，DCC，EDC。羧酸溶剂可选自四氢呋喃，二氯甲烷，氯仿，DMF和N-甲基吡咯烷酮。优选的溶剂是DMF。
或者，羧酸的活化可通过用烷基氯甲酸酯或烷酰基氯化物和非亲核的有机碱形成混合酐完成。烷基卤代甲酸酯或烷酰基氯化物的例子包括但不限于氯甲酸甲酯，氯甲酸乙酯，氯甲酸丙酯，氯甲酸丁酯，氯甲酸异丁酯，新戊酰氯化物和金刚羧基氯化物。最优选的酰基氯是氯甲酸异丁酯。使用氯甲酸异丁酯的环化反应是通过在-20℃-0℃下，向在合适的无水溶剂中的通式III的羧酸和非亲核的有机碱的反应液缓慢加入氯甲酸异丁酯进行的。非亲核的有机碱的例子包括但不限于三乙胺，三丙胺、N，N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉和N-乙基吗啉。优选的非亲核的有机碱是N-甲基吗啉。合适的无水溶剂的例子包括但不限于乙腈，氯仿，二氯甲烷，1，2-二甲氧基乙烷，二乙醚，二异丙醚和四氢呋喃。优选的溶剂是二氯甲烷和四氢呋喃。最优选的反应温度是在-20℃完全加入氯甲酸异丁酯后使反应混合物缓慢升温至0℃的温度。
参考图5，在酸的存在下将t-Boc基团去保护。酸的例子包括但不限于HCl，HBr，HF，HI，硝酸，硫酸，甲烷磺酸，TFA和三氟甲烷磺酸。优选的酸是HCl。去保护反应的溶剂包括二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，乙酸乙酯，甲苯和苯。最优选的溶剂是二氯甲烷。
PNA单体的合成
根据本发明的方法，通式I的PNA单体可用至少两种方法合成。参考图6，第一种合成PNA单体的方法是在环化反应之前将被保护或未被保护的核酸碱基乙酸部分引入受保护的线性主链。或者，PNA单体可从受保护的线性主链的环化开始合成，然后偶联被保护或未被保护的核酸碱基乙酸部分以产生所需产物。
方法1
具有通式V的线性部分是通过用偶联剂乙酰化核酸碱基的乙酸部分从受保护的具有通式II的线性主链制备的。见图6。
参考图6，偶联反应是将偶联剂加入具有通式II的受保护的线性主链、核酸碱基乙酸部分和非亲核的有机碱在合适的无水溶剂中的混合物中进行的。偶联剂的例子包括但不限于HATU、HAPyU，TAPip，HBTU，TBTU，TPTU，TSTU，TNTU，TOTU，BOP，PyBOP，BroP，MSNT，TDO，DCC，EDC。优选的偶联剂是PyBOP。非亲核的有机碱的例子包括但不限于三乙胺，三丙胺，N，N-二异丙基乙胺，N-甲基吗啉和N-乙基吗啉。优选的非亲核的有机碱是二异丙基乙胺。合适的无水溶剂的例子包括但不限于氯仿，二氯甲烷，1，2-二甲氧基乙烷，四氢呋喃，DMF和N-甲基吡咯烷酮。优选的溶剂是DMF。
通过加入过量的氢氧离子源将具有通式V的化合物转化成相应的式VI的酸。优选的R2是甲基或乙基。氢氧离子源的例子包括但不限于氢氧化锂，氢氧化钠和氢氧化钾。优选的氢氧离子源是氢氧化锂。
Figure A0380649400181
R1、R2、R3、R4、R5，R6和B如上定义。
参考图6，在羧酸活化的同时使羧酸发生环化反应制得通式I的PNA单体。羧酸的活化可在室温下通过肽合成的常规偶联剂进行。偶联剂的例子包括但不限于HATU，HAPyU，TAPip，HBTU，TBTU，TPTU，TSTU，TNTU，TOTU，BOP，PyBOP，BroP，MSNT，TDO，DCC，EDC。优选的偶联剂是PyBOP.非亲核的有机碱的例子包括但不限于三乙胺，三丙胺，N，N-二异丙基乙胺，N-甲基吗啉和N-乙基吗啉。优选的非亲核的有机碱是N，N-二异丙基乙胺。羧酸溶剂可选自四氢呋喃，二氯甲烷，氯仿，DMF和N-甲基吡咯烷酮。优选的溶剂是DMF。
或者，羧酸的活化可通过用烷基氯甲酸酯或烷酰基氯化物和非亲核的有机碱形成混合酐完成。烷基卤代甲酸酯或烷酰基氯化物的例子包括但不限于氯甲酸甲酯，氯甲酸乙酯，氯甲酸丙酯，氯甲酸丁酯，氯甲酸异丁酯，新戊酰氯化物和金刚烷羧基氯化物。最优选的酰基氯是氯甲酸异丁酯。使用氯甲酸异丁酯的环化反应是通过在-20℃-0℃下，向在合适的无水溶剂中的通式III的羧酸和非亲核的有机碱反应液缓慢加入氯甲酸异丁酯进行的。非亲核的有机碱的例子包括但不限于三乙胺，三丙胺、N，N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉和N-乙基吗啉。优选的非亲核的有机碱是N-甲基吗啉。合适的无水溶剂的例子包括但不限于乙腈，氯仿，二氯甲烷，1，2-二甲氧基乙烷，二乙醚，二异丙醚和四氢呋喃。优选的溶剂是二氯甲烷和四氢呋喃。最优选的反应温度是在-20℃完全加入氯甲酸异丁酯后使反应混合物缓慢升温至0℃的温度。
方法2
另一种方法是，本发明的PNA单体可通过将被保护或未被保护的核酸碱基乙酸部分偶联到通式IV的环状前体来制备：
Figure A0380649400191
R1、R2、R3、R4、R5和R6如上定义。
参考图7，环状前体与被保护或未被保护的核酸碱基乙酸部分的偶联反应是在室温下用肽合成的常规偶联剂和非亲核的有机碱进行的。偶联剂的例子包括但不限于HATU，HAPyU，TAPip，HBTU，TBTU，TPTU，TSTU，TNTU，TOTU，BOP，PyBOP，BroP，MSNT，TDO，DCC，EDC。优选的偶联剂是PyBOP。非亲核的有机碱的例子包括但不限于三乙胺，三丙胺，N，N-二异丙基乙胺，N-甲基吗啉和N-乙基吗啉。优选的非亲核的有机碱是N，N-二异丙基乙胺.The溶剂可选自四氢呋喃，二氯甲烷，氯仿，DMF和N-甲基吡咯烷酮。优选的溶剂是DMF。
核酸碱基和保护基
本发明核酸碱基的例子包括但不限于腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，尿苷，2，6-二氨基嘌呤和天然或非天然产生的核酸碱基，如图1和图2所示。优选的核碱基是腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤和胸腺嘧啶。核酸碱基可以用保护基保护，用于合成PNA寡聚物酸。保护基可以是，但不限于，Boc，金刚烷氧基羰基(adamantyloxy羰基)，苄氧羰基(P.E.Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500；M.Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，9677-9679；M.Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1895-1897；M.Egholm等，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1993，800-801；K.L.Dueholm等，J.Org.Chem.，1994，59，5767-5773；WO 92/20702)，p-甲氧基苄氧羰基，二苯甲基氧羰基(美国专利No.6,133,444)，2-甲基硫代乙氧羰基(美国专利No.6,063,569)，Mmt(G.Breipohl等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1996，6，665-670)或酸不稳定保护基(T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Group in OrganicSynthesis，第三版，494-653页)。
T-单体的合成
T-单体是具有通式I-t的化合物：
R1、R2、R3、R4、R5和R6如上定义。
优选的单体是：
R1是硝基，R3可以是吸电子基团(electron withdrawing group)如F，Cl或三氟甲基。
R3是硝基，R1或R5可以是吸电子基团如F或Cl。
T-单体的前体，(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(如下所示)，是用已知方法制备的(K.L.Dueholm等，J.Org.Chem.，1994，59，5767-5773；WO 92/20702)。
参考图8，通式V-t的化合物是在偶联剂存在下使(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸与通式II的硝基苯磺酰基保护的主链酯发生偶联反应制得的，从而得到具有以下通式的化合物：
R1、R2、R3、R4、R5，R6和R7如上定义。
优选的R7是甲基或乙基。
通过加入过量的氢氧离子源将通式V-t的化合物转化成相应的酸以得到具有通式VI-t的化合物。
Figure A0380649400213
R1、R2、R3、R4、R5和R6如上定义。
参考图8，在羧酸活化的同时使羧酸发生环化反应制得通式I-t的PNA T-单体。羧酸的活化可通过肽合成的常规偶联剂或混合酐进行。反应条件和试剂与上述相同。
或者，参考图9，PNA T-单体可通过将(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸偶联到通式IV的哌嗪酮衍生物来制备。反应条件和试剂与上述相同。
合成C-单体
C-单体是通式I-c的化合物：
Figure A0380649400221
R8可以是苄基或二苯甲基。
R1、R2、R3、R4、R5和R6如上定义。
优选的单体是：
R1是硝基，R3可以是吸电子基团如F，Cl或三氟甲基。或
R3是硝基，R1或R5可以是吸电子基团如F或Cl。
PNA C-单体的前体，适当保护的(胞嘧啶-1-基)-乙酸(如下所示)，是用已知方法或其改进方法制造的，如美国专利No.6,133,444；美国专利No.6,063,569；Dueholm等，J.Org.Chem.，1994，59，5767-5773；WO 92/20702中所述的方法，在此将其全文并入以供参考。
Figure A0380649400222
R8可以是苄基或二苯甲基。
参考图10，PNAC-单体是在偶联剂存在下使适当保护的(胞嘧啶-1-基)-乙酸与通式II的硝基苯磺酰基保护的主链酯发生偶联反应制备的，从而得到具有以下通式的化合物：
Figure A0380649400231
R1、R2、R3、R4、R5，R6，R7和R8如上定义。
通过加入过量的氢氧离子源将通式V-c的化合物转化成相应的酸以得到具有通式VI-c的化合物。
Figure A0380649400232
R1、R2、R3、R4、R5，R6和R8如上定义。
参考图10，在羧酸活化的同时使羧酸发生环化反应制得通式I-c的PNA单体。羧酸的活化可通过肽合成的常规偶联剂或混合酐进行。反应条件和试剂与上述相同。
或者，参考图11，PNA C-单体可通过将(胞嘧啶-1-基)-乙酸偶联到通式IV的哌嗪酮衍生物来制备。反应条件和试剂与上述相同。
合成A-单体
A-单体是通式I-a的化合物：
Figure A0380649400241
R1、R2、R3、R4、R5，R6和R8如上定义。
优选的单体是：
R1是硝基，R3可以是吸电子基团如F，Cl或三氟甲基。或者，
R3是硝基，R1或R5可以是吸电子基团如F或Cl。
PNA A-单体的前体，适当保护的(腺嘌呤-9-基)-乙酸(如下所示)，是用已知方法或其改进方法制造的，如美国专利No.6,133,444；和S.A.Thomson等，Tetrahedron，1995，6179-6194中所述的方法，在此将其全文并入以供参考。。
Figure A0380649400242
R8选自苄基或二苯甲基。
参考图12，PNA C-单体是在偶联剂存在下使适当保护的(腺嘌呤-9-基)-乙酸与通式II的硝基苯磺酰基保护的主链酯发生偶联反应制备的，从而得到通式V-a的化合物：
R1、R2、R3、R4、R5，R6，R7和R8如上定义。
通过加入过量的氢氧离子源将通式V-a的化合物转化成相应的酸以得到具有通式VI-a的化合物：
Figure A0380649400252
R1、R2、R3、R4、R5，R6和R8如上定义
参考图12，在羧酸活化的同时使羧酸发生环化反应制得通式I-a的PNA单体。羧酸的活化可通过肽合成的常规偶联剂或混合酐进行。反应条件和试剂与上述相同。
或者，参考图13，PNA A-单体可通过将(腺嘌呤-9-基)-乙酸偶联到通式IV的哌嗪酮衍生物来制备。反应条件和试剂与上述相同。
合成G-单体
G-单体是通式I-g的化合物：
R1、R2、R3、R4、R5，R6和R8如上定义。
优选的单体是：
R1是硝基和R3可以是吸电子基团如F，Cl或三氟甲基。或者，
R3是硝基和R1或R5可以是吸电子基团如F或Cl。
PNA G-单体的前体，适当保护的(鸟嘌呤-9-基)-乙酸(如下所示)，是用已知方法或其改进方法制造的，如美国专利No.6,172,226中所示的方法。
R8可以是苄基或二苯甲基。
参考图14，
PNA G-单体是在偶联剂存在下使适当保护的(鸟嘌呤-9-基)-乙酸与通式II的硝基苯磺酰基保护的主链酯发生偶联反应制备的，从而得到通式V-g的化合物：
R1、R2、R3、R4、R5，R6，R7和R8如上定义
通过加入过量的氢氧离子源将通式V-g的化合物转化成相应的酸以得到具有通式VI-g的化合物：
Figure A0380649400271
R1、R2、R3、R4、R5，R6和R8如上定义
参考图14，在羧酸活化的同时使羧酸发生环化反应制得通式I-g的PNA单体。羧酸的活化可通过肽合成的常规偶联剂或混合酐进行。反应条件和试剂与上述相同。
或者，参考图15，PNA G-单体可通过将(鸟嘌呤-9-基)-乙酸偶联到通式IV的哌嗪酮衍生物来制备。反应条件和试剂与上述相同。
合成PNA寡聚物
化学文献中报道的各种组合合成法通常可用于用本发明的单体合成PNA寡聚物。这些方法包括但不限于固相合成法和溶液相合成法。用上述方法合成PNA单体后，通过固相合成法在合适的支承材料(例如但不限于聚苯乙烯，聚氧乙烯-修饰的聚苯乙烯，如，例如Tentagel，受控多孔玻璃(Controlled Pore Glass))上构建PNA寡聚物，支承材料上有锚定基，潜在含有可切割的胺官能团。在固相合成法中，本发明的第一个PNA单体通过偶联反应连接到固体支承物上。然后，下一个步骤是系统加工所需PNA寡聚物序列。这种加工包括反复去保护/偶联/帽化循环。在最后一个偶联单体上的主链保护基硝基苯磺酰基在有机碱存在下用合适的硫醇处理定量去除以释放末端游离胺。一旦完成PNA寡聚物合成，通过在室温下在含有甲酚作为阳离子清除剂的TFA中培育1-2小时将寡聚物从固体支承物上切下，并同时去除核酸碱基保护基。
以下是合成PNA寡聚物的常规循环：
1.从树脂上去除保护基以活化胺官能团。
2.在树脂上连接氨基酸、接头或具有末端保护的胺基的PNA单体。
3.洗涤。
4.在有机碱存在下用乙酸酐帽化。
5.洗涤。
6.切除磺酰胺中过度反应的乙酰基。
7.洗涤。
8.将磺酰基去保护。
9.洗涤。
10.加入单体。
11.返回步骤3并重复步骤4-11。
在寡聚物合成的单体偶联反应过程中，可用催化剂加速酰化反应，催化剂如乙酸汞、四甲基氟化铵，四乙基氟化铵，四丁基氟化铵，苄基三甲基氟化铵，氟化铯，三丁基膦，三苯基膦。优选的催化剂是四丁基氟化铵。反应速率还取决于溶剂和温度。溶剂的例子包括但不限于DMF，N-甲基吡咯烷酮，二甲氧基乙烷，二氯甲烷，1，2-二氯甲烷，DMSO，四氢呋喃，六甲基磷酰胺(phophoramide)，四亚甲基砜，异丙醇，乙醇和所选溶剂的混合物。优选的溶剂是DMF。N-末端氨基保护基用硫醇去除，其溶剂中含有有机碱。硫醇的例子包括但不限于C2-C20烷基硫醇，4-甲氧基甲苯硫醇，4-甲基苯硫醇，3，6-二噁-1，8-辛烷硫醇，4-氯甲苯硫醇，苄基硫醇，N-乙酰基半胱氨酸，N-(t-Boc)半胱氨酸甲酯，3-巯基丙酸甲酯，4-甲氧基苯硫醇。有机碱的例子包括但不限于三乙胺，N，N-二异丙基乙胺，哌啶，N-甲基吗啉和1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一烷-7-酮。优选的有机碱是N，N-二异丙基乙胺。
缩写表。
t-Boc   叔丁氧羰基
BOI     2-(苯并三唑-1-基)氧-1，3-二甲基-咪唑鎓六氟磷酸盐
BOP     苯并三唑基-1-氧-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐
BroP    溴代三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐
DMF     二甲基甲酰胺
Fmoc    9-芴基甲氧羰基
HAPyU   O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-二(四亚甲基)脲鎓六氟磷酸盐
HATU    O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HBTU    O-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
MSNT    2，4，6-均三甲苯磺酰-3-硝基-1，2，4-三唑(triazolide)
Mmt     4-甲氧基苯基二苯基甲基
PyBOP   苯并三唑基-1-氧-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
PyBroP  溴代三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
TAPipU  O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-二(五亚甲基)脲鎓四氟硼酸盐
TBTU  O-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
TDO   2，5-二苯基-2，3-二氢-3-氧代-4-羟基噻吩二氧化物
TFA   三氟乙酸
TNTU  O-[(5-降冰片烯-2，3-二羧酰亚胺基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(O-[(5-Norbonene-2，3-dicarboximido)-1，1，3，3-tetramethylruoniumtetrafluoroborate)
TOTU  O-[(氰基(乙氧羰基)亚甲基)氨基]-1，1，3.3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
TPTU  O-(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
TSTU  O-(N-琥珀酰亚胺基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
通过以下实施例更聚体描述了本发明，除非另有说明，这些实施例不是要限制本发明。
实施例
实施例1-N-(2-氨基乙基)-2-硝基-苯磺酰胺乙酸盐
将1.2-乙二胺(60.1g，1.00mol)溶于二氯甲烷(1L)。在3小时内逐滴加入溶于二氯甲烷(100mL)的2-硝基-苯磺酰氯(22.16g，0.100mol)溶液。在搅拌30分钟后，反应混合物用盐水洗涤(1L×4)。有机层用硫酸镁干燥并过滤。在滤液中加入乙酸(6.0g，0.1mol)以沉淀固体。将固体滤出，用二氯甲烷(200mL)洗涤并在真空下干燥以得到黄色固体状的标题化合物(23.1g，76％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.01-7.95(m，2H)，7.88-7.83(m，2H)，2.90(t，2H)，2.60(t，2H)，1.87(s，3H)。
实施例2-N-(2-氨基乙基)-4-氯-2-硝基-苯磺酰胺乙酸盐
标题化合物(22.5g，66％)是按照实施例1的方法由4-氯-2-硝基-苯磺酰氯(25.61g，0.1mol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.26(d，1H)，8.01-7.97(m，2H)，2.97(t，2H)，2.69(t，2H)，1.91(s，3H)。
实施例3-N-(2-氨基乙基)-4-氟-2-硝基-苯磺酰胺乙酸盐
标题化合物(21.7g，67％)是按照实施例1的方法由4-氟-2-硝基-苯磺酰氯(23.96g，0.10mol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.11-8.06(m，2H)，7.78(m，1H)，2.94(t，2H)，2.67(t，2H)，1.89(s，3H)。
实施例4-N-(2-氨基乙基)-2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰胺乙酸盐
标题化合物(23.62g，63％)是按照实施例1的方法由2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰氯(28.96g，0.10mol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.56(s，1H)，8.28(d，1H)，8.24(d，1H)，2.92(t，2H)，2.65(t，2H)，1.87(s，3H)。
实施例5-N-(2-氨基乙基)-4-硝基-苯磺酰胺乙酸盐
标题化合物(2.40g，78％)是按照实施例1的方法由4-硝基-苯磺酰氯(2.22g，10mmol)合成的。
实施例6-N-(2-氨基乙基)-2-氯-4-硝基-苯磺酰胺乙酸盐
标题化合物(2.38g，70％)是按照实施例1的方法由4-氯-2-硝基-苯磺酰氯(2.56g，0.1mol)合成的。
实施例7-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯
室温下，在溶于二氯甲烷(100mL)的N-(2-氨基乙基)-2-硝基-苯磺酰胺乙酸盐(15.15g，49.6mmol)和三乙胺(15.16g，0.15mol)溶液中边搅拌边加入溴乙酸乙酯(16.7g，0.100mol)。再搅拌1小时后，反应混合物用盐水洗涤(100mL)。有机层用硫酸镁干燥并过滤。滤液在真空下蒸发并在乙醚(100mL)中研磨残余物以得到白色固体状的标题化合物(8.1g，49％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.02-7.96(m，2H)，7.87-7.84(m，2H)，4.05(q，2H)，3.23(s，2H)，2.95(t，2H)，2.57(t，2H)1.16(t，3H)。
实施例8-N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯
标题化合物(8.3g，46％)是按照实施例7的方法由N-(2-氨基乙基)-4-氯-2-硝基-苯磺酰胺乙酸盐(16.79g，49.4mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.26(s，1H)，8.01(d，1H)，7.96(d，1H)，4.06(q，2H)，3.23(s，2H)，2.95(t，2H)，2.57(t，2H)，1.16(t，3H)。
实施例9-N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯
标题化合物(7.7g，42％)是按照实施例7的方法由N-(2-氨基乙基)-4-氟-2-硝基-苯磺酰胺，乙酸盐(16.79g，51.9mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.08(m，2H)，7.76(m，1H)，4.06(q，2H)，3.24(s，2H)，2.95(t，2H)，2.57(t，2H)，1.16(t，3H)。
实施例10-N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯
标题化合物(9.23g，46％)是按照实施例7的方法由N-(2-氨基乙基)-2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰胺乙酸盐(18.76g，50.3mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.55(s，1H)，8.27 d，1H)，8.22(d，1H)，4.05(q，2H)，3.22(s，2H)，2.99(t，2H)，2.57(t，2H)，1.16(t，3H)。
实施例11-N-[2-(4-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯
标题化合物(826mg，50％)是按照实施例7的方法由N-(2-氨基乙基)-4-硝基-苯磺酰胺乙酸盐(1.52g，5.2mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.41(d，2H)，8.04(d，2H)，4.05(q，2H)，3.23(s，2H)，2.86(t，2H)，2.54(t，2H)，1.16(t，3H)。
实施例12-N-[2-(2-氯-4-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯
标题化合物(885mg，48％)是按照实施例7的方法由N-(2-氨基乙基)-2-氯-4-硝基-苯磺酰胺乙酸盐(1.68g，5mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.43(d，1H)，8.32(dd，1H)，8.22(d，1H)，4.04(q，2H)，3.20(s，2H)，2.96(t，2H)，2.54(t，2H)，1.16(t，3H)。
实施例13-N-[2-(4-甲基-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯
室温下，在溶于二氯甲烷(50mL)的按照Will(D.W.Will等，Tetrahedron，1995，51，12069-12802)所述方法制备的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸乙酯·2HCl(1.10g，5.0mmol)的二氯甲烷溶液中缓慢加入三乙胺(2.02g，20mmol)。然后在室温下于5分钟内在反应混合物中加入溶于二氯甲烷(10mL)的4-甲基-2-硝基-苯磺酰氯。将所得反应混合物在室温下再搅拌2小时，并用水(30mL)洗涤。有机层用MgSO4干燥并过滤。滤液在真空下蒸发以得到固体状的所需产物(1.60g，92％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ7.87(d，1H)，7.81(s，1H)，7.66(d，1H)，4.06(q，2H)，3.24(s，2H)，2.91(t，2H)，2.57(t，2H)，2.44(s，3H)，1.17(t，3H)。
实施例14-N-[2-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯
标题化合物(1.72g，90％)是按照实施例13的方法，将N-(2-氨基乙基)-甘氨酸、乙酯2HCl(1.10g，5.0mmol)和4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺酰氯(1.36g，5.0mmol)反应合成的。
实施例15-N-[2-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯
标题化合物(1.83g，87％)是按照实施例13的方法，将N-(2-氨基乙基)-甘氨酸、乙酯2HCl(1.10g，5.0mmol)和4，6-二氯-2-硝基-苯磺酰氯(1.46g，5.0mmol)反应合成的。
实施例16-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-丙氨酸乙酯
按照实施例13的方法，将用Puschl(A.Puschl等，Tetrahedron，1998，39，4707-4710)所述方法制备的N-(2-氨基乙基)-丙氨酸乙酯2HCl(1.165g，5.0mmol)与2-硝基-苯磺酰氯(1.11g 5.0mmol)反应，以得到标题化合物(1.64g，95％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.02-7.96(m，2H)，7.86(m，2H)，4.05(q，2H)，3.16(q，1H)，2.94(t，2H)，2.58(m，1H)，2.43(m，1H)，1.17(t，3H)，1.09(d，3H)。
实施例17-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-苯基甘氨酸甲酯
标题化合物(716mg，91％)是按照实施例13的方法，将N-(2-氨基乙基)-苯基甘氨酸甲酯2HCl(416mg，2mmol)和2-硝基-苯磺酰氯(592mg，2.0mmol)反应合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.00-7.94(m，2H)，7.87-7.81(m，2H)，7.34-7.26(m，5H)，4.32(s，1H)，3.57(s，3H)，2.98(t，2H)，2.54-2.41(m，2H)。
实施例18-N-叔丁氧羰基-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸
在溶于四氢呋喃(50mL)的N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(6.66g，20.1mmol)溶液中加入溶于水(30mL)的LiOH(1.64g，40mmol)溶液。在室温下搅拌1小时后，将二-叔丁基二碳酸酯(6.55g，30mmol)加入反应混合物。所得反应混合物搅拌30分钟，然后加入溶于水(15mL)的LiOH(0.82g，0.02mol)溶液。用TLC监测反应完全后，过滤除去沉淀物并在真空下蒸发四氢呋喃。残余溶液用乙醚(100mL)洗涤。加入2N HCl将含水层酸化至pH＝3并用二氯甲烷(100mL)提取。有机层用硫酸镁干燥并过滤。在真空下浓缩滤液以得到所需产物(7.9g，98％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.00(m，2H)，7.86(m，2H)，3.80(s，1H)，3.76(s，1H)，3.24(m，2H)，3.05(m，2H)，1.35(s，4.5H)，1.31(s，4.5H)。
实施例19-N-叔丁氧羰基-N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸
标题化合物(8.1g，92％)是按照实施例18的方法由N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(7.35g，20mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.28(s，1H)，7.97(s，2H)，3.78(s，1H)，3.76(s，1H)，3.24(m，2H)，3.06(m，2H)，1.35(s，4.5H)1.31(s，4.5H)。
实施例20-N-叔丁氧羰基-N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸
标题化合物(7.9g，89％)是按照实施例18的方法由N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(7.35g，21mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.14-8.02(m，2H)，7.76(m，1H)，3.82(s，1H)，3.77(s，1H)，3.24(m，2H)，3.05(m，2H)，1.36(s，4.5H)，1.32(s，4.5H)。
实施例21-N-叔丁氧羰基-N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸
标题化合物(8.62g，91％)是按照实施例18的方法由N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(8.00g，20mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.57(d，1H)，8.41(t，0.5H)，8.35(t，0.5H)，8.19(dd，1H)，3.82(s，1H)，3.75(s，1H)，3.24(t，2H)，3.09(m，1H)，1.34(s，4.5H)，1.30(s，4.5H)。
实施例22-N-叔丁氧羰基-[2-(4-甲基-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸
标题化合物(7.80g，93％)是按照实施例18的方法由N-[2-(4-甲基-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(6.91g，0.02mol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ7.99-7.93(m，1H)，7.85(dd，1H)，7.82(s，1H)，7.67(d，1H)，3.81(s，1H)，3.76(s，1H)，3.23(m，2H)，3.05(m，2H)，2.44(s，3H)，1.36(s，4.5H)，1.31(s，4.5H)。
实施例23-N-叔丁氧羰基-N-[2-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸
标题化合物(413mg，91％)是按照实施例18的方法由N-[2-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(380mg，0.01mol)合成的。
实施例24-N-叔丁氧羰基-N-[2-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸
标题化合物(417mg，88％)是按照实施例18的方法由N-[2-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(400mg，1.0mmol)合成的。
实施例25-N-叔丁氧羰基-N-[2-(4-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸
标题化合物(362mg，90％)是按照实施例18的方法由N-[2-(4-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(331mg，1.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.42(dd，2H)，8.03(d，2H)，8.01(br，1H)，3.80(s，1H)，3.22(m，2H)，2.96(m，2H)，1.34(s，4.5H)，1.31(s，4.5H)。
实施例26-N-叔丁氧羰基-N-[2-(2-氯-4-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸
标题化合物(371mg，85％)是按照实施例18的方法由N-[2-(2-氯-4-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(366mg，20mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.44(q，1H)，8.35-8.27(m，2H)，8.20(d，1H)，3.81(s，1H)，3.73(s，1H)，3.22(t，2H)，3.06(m，2H)，1.35(s，4.5H)，1.30(s，4.5H)。
实施例27-N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-丙氨酸
在溶于四氢呋喃(10mL)的N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基-乙基)-丙氨酸乙酯(1.04g，3mmol)溶液中加入溶于水(10mL)的LiOH(252mg，6mmol)溶液。在室温下搅拌1小时后，将二-叔丁基二碳酸酯(983mg，4.5mmol)加入反应混合物。所得反应混合物搅拌5小时，然后加入溶于水(15mL)的LiOH(126mg，3mmol)溶液。用TLC监测反应完全后，过滤除去沉淀物并在真空下蒸发四氢呋喃。残余溶液用乙醚(20mL)洗涤。加入2N HCl将含水层酸化至pH＝3并用二氯甲烷(30mL)提取。有机层用硫酸镁干燥并过滤。在真空下浓缩滤液以得到所需产物(1.16g，93％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ7.99(m，2H)，7.87(m，2H)，4.31(q，0.4H)，4.03(q，0.6H)，3.37-3.19(m，2H)，3.10-2.95(m，2H)，1.35(s，4.5H)，1.33(s，4.5H)，1.30(d，1.5H)，1.29(d，1.5H)。
实施例28-N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-苯基甘氨酸
标题化合物(583mg，81％)是按照实施例27的方法由N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-苯基甘氨酸甲酯(590mg，1.5mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ7.97-7.82(m，4H)，7.35-7.30(m，3H)，7.23-7.21(m，2H)，5.58(s，0.6H)，5.40(s，0.4H)，3.20-2.85(m，4H)，1.46(s，4.5H)，1.37(s，4.5H)。
实施例29-1-(2-硝基苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐
在溶于二氯甲烷(100ml)的N-(叔-丁氧羰基)-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸(8.06g，20mmol)溶液中加入二环己基碳二亚胺(5.16g，25mmol)。在室温下搅拌2小时后，过滤除去沉淀物。将滤液浓缩，将残余物溶于乙酸乙酯(50mL)并冷却至0℃。除去沉淀的固体并在滤液中加入溶于乙酸乙酯(100mL)的2N-HCl。混合物在室温下再搅拌10小时。滤出沉淀产物，用乙酸乙酯(500mL)洗涤并在真空下干燥以得到5.39g白色固体状的标题化合物(79％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ9.95(br.s，2H)，8.38(d，1H)，8.04-7.95(m，2H)，4.09(dd，2H)，3.96(s，2H)，3.56(dd，2H)。
实施例30-1-(4-氯-2-硝基苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐
标题化合物(4.3g，67％)是按照实施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸(7.92g，18mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.01(br.s，2H)，8.42(d，1H)，8.35(dd，1H)，8.06(dd，1H)，4.07(t，2H)，3.95(s，2H)，3.55(t，2H)。
实施例31-1-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐
标题化合物(4.2g，69％)是按照实施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸(7.61g，18mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ9.91(br.s，2H)，8.43(m，1H)，8.27(m，1H)，7.87(m，1H)，4.06(dd，2H)，3.96(s，2H)，3.55(dd，2H)。
实施例32-1-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐
标题化合物(2.55g，65％)是按照实施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸(4.71g，10mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.16(br.s，2H)，8.71(s，1H)，8.60(d，1H)，8.35(d，1H)，4.13(dd，2H)，3.96(s，2H)，3.57(dd，2H)。
实施例33-1-(4-甲基-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐
标题化合物(2.40g，71％)是按照实施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(4-甲基-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸(4.19g，10mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ9.87(br.s，1H)，8.23(d，1H)，7.98(s，1H)，7.77(d，1H)，4.06(dd，2H)，3.95(s，2H)，3.55(dd，2H)，2.49(s，3H)。
实施例34-1-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐
标题化合物(2.53g，68％)是按照实施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸(4.54g，10mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.02(br.s，2H)，8.20(s，1H)，7.96(s，1H)，4.04(dd，2H)，3.96(s，2H)，3.53(dd，2H)，2.67(s，3H)。
实施例35-1-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐
标题化合物(2.51g，64％)是按照实施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸(4.74g，10mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.06(br.s，2H)，8.43(s，1H)，8.32(s，1H)，4.16(t，2H)，3.99(s，2H)，3.50(t，2H)。
实施例36-1-(4-硝基苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐
标题化合物(208mg，65％)是按照实施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(4-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸(403mg，1mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ9.92(br.s，2H)，8.43(d，2H)，8.29(d，2H)，4.17(dd，2H)，4.03(s，2H)，3.54(dd，2H)。
实施例37-1-(2-氯-4-硝基苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐
标题化合物(239mg，67％)是按照实施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(2-氯-4-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸(437mg，1mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.28(br.s，2H)，8.53(d，1H)，8.45(d，1H)，8.39(dd，1H)，4.25(dd，2H)，3.94(s，2H)，3.54(dd，2H)。
实施例38-1-(2-硝基-苯磺酰基)-3-甲基-哌嗪-2-酮盐酸盐
标题化合物(450mg，67％)是按照实施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-丙氨酸(835mg，2mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.38(d，1H)，8.14(d，1H)，8.03(dd，1H)，7.98(dd，1H)，4.30(m，1H)，4.13(m，2H)，3.70(m，1H)，3.51(m，1H)，1.39(d，3H)。
实施例39-1-(2-硝基-苯磺酰基)-3-苯基-哌嗪-2-酮盐酸盐
标题化合物(247mg，63％)是按照实施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-苯基甘氨酸(480mg，1mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.35(d，1H)，8.15(d，1H)，8.02(t，1H)，7.94(t，1H)，7.40(m，5H)，5.47(br s，1H)，4.24(m，2H)，3.69(m，1H)，3.60(m，1H)。
实施例40-(2-氨基-6-碘代嘌呤-9-基)-乙酸乙酯
在溶于DMF(1960mL)的2-氨基-6-碘代-嘌呤(78.3g，0.3mol)溶液中加入溴乙酸乙酯(55.1g，0.33mol)和碳酸钾(82.9g，0.6mol)。所得反应混合物在室温下搅拌12小时。反应混合物在真空下浓缩至较小体积(约150mL)并将残余物溶于水。将固体滤出，用水和乙醚洗涤并在真空下干燥以得到标题化合物(98.4g，95％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.06(s，1H)，6.90(br.s，2H)，4.94(s，2H)，4.17(q，2H)，1.22(t，3H)。
实施例41-[2-(二苯甲基氧羰基)-氨基-6-碘代嘌呤-9-基]-乙酸乙酯
0℃下，在溶于THF(280mL)的(2-氨基-6-碘代嘌呤-9-基)-乙酸乙酯(13.9g，40mmol)溶液中加入三光气(5.34g，18mmol)。再搅拌5分钟后，缓慢加入N，N-二异丙基乙胺(24.4mL)并将和反应混合物在0℃搅拌30分钟。然后加入二苯基甲醇，使所得反应混合物回复室温并再搅拌13小时。加入1N HCl溶液中和反应混合物，并用氯化钠和硫代硫酸钠饱和。分离有机层并用乙酸乙酯提取含水层(200mL×3)。合并的有机层用盐水洗涤(200mL×2)，用硫酸钠干燥并过滤。将滤液减压蒸发并通过柱层析纯化残余物以得到标题化合物(15.15g，68％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.88(bs，1H)，8.45(s，1H)，7.60-7.20(m，10H)，6.79(s，1H)，5.08(s，2H)，4.15(q，2H)，1.17(t，3H)。
实施例42-[2-N-(二苯甲基氧羰基)-鸟嘌呤-9-基]-乙酸
0℃下，在10分钟内在溶于THF(110mL)的60％NaH(5.04g，126mmol)溶液中加入3-羟基丙腈，并将混合物再搅拌12分钟。在冰浴中，在所得反应混合物中逐滴缓慢加入[2-(二苯甲基氧羰基)-氨基-6-碘代-嘌呤-9-基]-乙酸(11.12g，21mmol)。加入完全后，除去冰浴并继续搅拌3.5小时。然后加入20％的柠檬酸水溶液将反应混合物酸化并用氯化钠饱和。分离有机层并用THF(300mL×2)提取含水层。合并的有机层用硫酸钠干燥并过滤。在真空下除去溶剂，残余物在乙醇中重结晶。滤出固体，用冷的乙醇洗涤并在真空下干燥以得到所需产物(9.00g)。
实施例43-[2-(苄氧羰基)-氨基-6-碘代-嘌呤-9-基]-乙酸乙酯
标题化合物(12.42g，64.4％)是按照实施例41的方法，将(2-氨基-6-碘代嘌呤-9-基)-乙酸乙酯(13.9g，40mmol)和光气反应，然后用苄基醇处理制得的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.83(bs，1H)，8.48(s，1H)，7.50-7.30(m，5H)，5.18(s，2H)，5.11(s，2H)，4.19(q，2H)，1.21(t，3H)。
实施例44-[2-(苄氧羰基)-氨基-6-碘代嘌呤-9-基]-乙酸
10℃下，在存在于四氢呋喃(50mL)和水(50mL)中的[2-(苄氧羰基)-氨基-6-碘代-嘌呤-9-基]-乙酸乙酯(10.02g，20.8mmol)悬液中加入氢氧化锂水合物(2.83g，20.8mmol)。所得反应混合物搅拌30分钟。然后加入1N HCl将所述混合物酸化至pH＝3。滤出沉淀的固体，用水和乙醚洗涤并在真空下干燥以得到标题化合物(9.81g)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.75(s，1H)，8.44(s，1H)，7.50-7.30(m，5H)，5.17(s，2H)，4.97(s，2H)。
实施例45-[2-N-(苄氧羰基)-鸟嘌呤-9-基]-乙酸
标题化合物(5.44g，79.2％)是按照实施例42的方法由[2-(苄氧羰基)-氨基-6-碘代嘌呤-9-基]-乙酸(9.06g，20mmol)合成的。1H NMR(DMSO-d6)δ11.54(s，1H)，11.37(s，1H)，7.94(s，1H)，7.46-7.33(m，5H)，5.28(s，2H)，4.87(s，2H)。
实施例46-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸乙酯
室温下，在DMF(15mL)中N-[2-(2-硝基-磺酰氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(1.67g，5mmol)，(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(0.92g，5mmol)和PyBOP(3.12g，6mmol)的混合物中加入N，N-二异丙基乙胺(1.31mL，7.5mmol)。所得反应混合物在相同温度下搅拌7小时，并在真空下除去溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯(50mL)并用1N HCl水溶液、饱和的碳酸氢钠溶液和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥并过滤。将滤液浓缩并用乙醇研磨残余物。滤出所得固体并在真空下干燥以得到白色固体状的标题化合物(2.35g，93％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.29(s，0.6H)，11.26(s，0.4H)，8.25-7.87(m，5H)，7.30(s，0.6H)，7.23(s，0.4H)，4.64(s，1.2H)，4.46(s，0.8H)，4.29(s，0.8H)，4.16(q，0.8H)，4.07(q，1.2H)，4.00(s，1.2H)，3.49(t，1.2H)，3.21(q，1.2H)，3.12-3.01(m，1.6H)，1.75(s，3H)，1.22(t，1.2H)，1.17(t，1.8H)。
实施例47-N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸乙酯
标题化合物(2.46g，92％)是按照实施例46的方法将N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(1.84g，5mmol)与(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(0.92g，5mmol)反应合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.31(s，0.6H)，11.28(s，0.4H)，8.31-7.95(m，4H)，7.31(s，0.6H)，7.23(s，0.4H)，4.64(s，1.2H)，4.46(s，0.8H)，4.28(s，0.8H)，4.16(q.0.8H)，4.07(q.1.2H)，4.00(s，1.2H)，3.49(t，1.2H)，3.22(q，1.2H)，3.12-3.01(m，1.6H)，1.74(s，3H)，1.22(t，1.2H)，1.17(t，1.8H)。
实施例48-N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸乙酯
标题化合物(2.35g，91％)是按照实施例46的方法将N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(1.76g，5mmol)与(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(0.92g，5mmol)反应合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.30(s，0.6H)，11.27(s，0.4H)，8.28-8.05(m，2.8H)，7.78(m，1.2H)，7.31(s，0.6H)，7.23(s，0.4H)，4.65(s，1.2H)，4.47(s，0.8H)，4.30(s，0.8H)，4.16(q.0.8H)，4.07(q.1.2H)，4.00(s，1.2H)，3.49(t，1.2H)，3.22(q，1.2H)，3.12-3.01(m，1.6H)，1.75(s，3H)，1.23(t，1.2H)，1.18(t，1.8H)。
实施例49-N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸乙酯
标题化合物(2.69g，95％)是按照实施例46的方法将N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(2.00g，5mmol)与(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(0.92g，5mmol)反应合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.31(s，0.55H)，11.28(s，0.45H)，8.57(s，0.55H)，8.54(s，0.45H)，8.50(t，0.55H)，8.38(t，0.45H)，8.29-8.18(m，2H)，7.31(s，0.55H)，7.22(s，0.45H)，4.64(s，1.1H)，4.46(s，0.9H)，4.21(s，0.9H)，4.16(q.0.9H)，4.07(q.1.1H)，3.95(s，1.1H)，3.49(t，1.1H)，3.37(q，1.1H)，3.25(t，0.9H)，3.09(t，0.9H)，1.75(s，3H)，1.23(t，1.35H)，1.18(t，1.65H)。
实施例50-N-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酰基}-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯
标题化合物(2.45g，88％)是按照实施例46的方法将N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(1.33g，4mmol)与2-[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酸(1.51g，4mmol)反应合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.99(s，0.6H)，10.98(s，0.4H)，8.30-7.80(m，5H)，7.50-7.25(m，10H)，6.94(t，1H)，6.79(s，1H)，4.79(s，1.2H)，4.61(s，0.8H)，4.33(s，0.8H)，4.15(q，0.8H)，4.05(q，1.2H)，4.01(s，1.2H)，，3.52(t，1.2H)，3.36(t，0.8H)，3.24(q，1.2H)，3.02(q，0.8H)，1.23(t，1.2H)，1.15(t，1.8H)。
实施例51-N-{[4-(苄氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酰基}-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯
标题化合物(产率：78％)是按照实施例46的方法合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.15-8.06(m，1H)，7.84-7.57(m，5H)，7.38-7.32(m，6H)，7.14(t，0.7H)，6.44(t，0.3H)，5.20(s，2H)，4.93(s，1.4H)，4.55(s，0.6H)，4.36(s，0.6H)，4.26(q，0.6H)，4.17(q，1.4H)4.03(s，1.4H)，3.71(t，1.4H)，3.57(t，0.6H)，3.39(q，1.4H)，3.30(q，0.6H)，1.31(t，0.9H)，1.24(t，2.1H)。
实施例52-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸
10℃下，在溶于THF(10mL)的N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸乙酯(1.00g，2.0mmol)溶液中加入溶于水(10mL)的氢氧化锂(210mg，5mmol)。搅拌1.5小时后，加入1N HCl将反应混合物酸化至pH＝2-3。滤出沉淀的固体，用水洗涤并在真空下干燥以得到白色固体状的标题产物(896mg，95％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.30(s，0.6H)，11.27(s，0.4H)，8.22-7.85(m，5H)，7.31(d，0.6H)，7.23(d，0.4H)，4.63(s，1.2H)，4.45(s，0.8H)，4.19(s，0.8H)，4.16(q.0.8H)，3.93(s，1.2H)，3.47(t，1.2H)，3.34(t，0.8H)，3.20(q，1.2H)，3.04(q.0.8H)，1.75(s，3H)。
实施例53-N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸
标题化合物(1.40g，93％)是按照实施例52的方法由N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸乙酯(1.60g，3.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.31(s，0.55H)，11.28(s，0.45H)，8.33-7.95(m，4H)，7.31(s，0.55H)，7.23(s，0.45H)，4.63(s，1.1H)，4.44(s，0.9H)，4.20(s，0.9H)，4.00(s，1.1H)，3.47(t，1.1H)，3.34(t，0.9H)，3.19(q，1.1H)，3.04(q，0.9H)，1.75(s，3H)。
实施例54-N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸
标题化合物(0.92g，94％)是按照实施例52的方法由N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸乙酯(1.03g，2.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.30(s，0.6H)，11.28(s，0.4H)，8.29-8.05(m，2.8H)，7.78(m，1.2H)，7.31(s，0.6H)，7.23(s，0.4H)，4.63(s，1.2H)，4.44(s，0.8H)，4.20(s，0.8H)，3.94(s，1.2H)，3.46(t，1.2H)，3.34(t，0.8H)，3.20(q，1.2H)，3.04(q.0.8H)，1.75(s，3H)。
实施例55-N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸
标题化合物(1.02g，95％)是按照实施例52的方法由N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸乙酯(1.14g，2.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.31(s，0.55H)，11.28(s，0.45H)，8.58(s，0.55H)，8.54(s，0.45H)，8.51(t，0.55H)，8.38(t，0.45H)，8.29-8.18(m，2H)，7.31(s，0.55H)，7.22(s，0.45H)，4.63(s，1.1H)，4.45(s，0.9H)，4.20(s，0.9H)，3.94(s，1.1H)，3.48(t，1.1H)，3.37(t，0.9H)，3，24(q，1.1H)，3.09(q，0.9H)，1.75(s，3H)。
实施例56-N-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酰基}-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸
10℃下，在溶于THF(10mL)的N-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酰基}-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(1.91g，2.75mmol)溶液中加入溶于水(9mL)的氢氧化锂(290mg，6.9mmol)。搅拌1.5小时后，加入1N HCl溶液将反应混合物酸化至pH＝3-4。含水层用氯化钠饱和并分离有机层。含水层用THF(15mL×2)提取。合并的有机层用硫酸钠干燥并过滤。将滤液浓缩并用乙醇研磨以沉淀固体。将沉淀的固体滤出，用水洗涤并在真空下干燥以得到白色固体状的标题产物(1.42g，78％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.25-7.80(m，5H)，7.50-7.25(m，10H)，6.94(d，0.6H)，6.92(d，0.4H)，6，79(1H，s)，4.78(s，1.2H)，4.60(s，0.8H)，4.22(s，0.8H)，3.94(s，1.2H)，3.50(t，1.2H)，3.35(t，0.8H)，3.24(q，1.2H)，3.02(q，0.8H)。
实施例57-N-{[4-N-(苄氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酰基}-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸
标题化合物(产率：70％)是按照实施例56的方法由N-{[4-N-(苄氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酰基}-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.26-7.83(m，5H)，7.44-7.33(m，5H)，7.02(d，0.6H)，7.00(d，0.4H)，5.19(s，2H)4.80(s，1.2H)，4.61(s，0.8H)，4.23(s，0.8H)，3.94(s，1.2H)，3.50(t，1.2H)，3.35(t，0.8H)，3.24(q，1.2H)，3.02(q，0.8H)。
实施例58-1-(2-硝基-苯磺酰基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-哌嗪-2-酮
-20℃下，在溶于THF(10mL)的N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸(469mg，1.0mmol)和N-甲基吗啉(330μL，3mmol)溶液中加入氯甲酸异丁酯(isobutyl chloroformatre)(205mg，1.5mmol)。使反应混合物在1小时内回复0℃。然后在反应混合物中加入水(10mL)以沉淀固体。将固体滤出，用水洗涤，在真空下干燥以得到标题化合物(442mg，98％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.32(s，0.6H)，11.30(s，0.4H)，8.35(m，1H)，8.12(dd，1H)，8.04-7.96(m，2H)，7.35(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)， 4.67(s，1.2H)，4.59(s，0.8H)，4.41(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.04(m，1.2H)，3.95(m，1.2H)，3.90-3.85(m，1.6H)，1.75(s，3H)。
实施例59-1-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-哌嗪-2-酮)
标题化合物(933mg，96％)是按照实施例58的方法由N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸(1.01g，2.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.33(s，0.6H)，11.31(s，0.4H)，8.40(d，1H)，8.33(dd，1H)，8.08(dd，1H)，7.34(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)，4.66(s，1.2H)，4.59(s，0.8H)，4.41(s，0.8H)，4.26(s，1.2H)，4.02(m，1.2H)，3.94(m，1.2H)，3.89-3.82(m，1.6H)，1.74(s，3H)。
实施例60-1-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-哌嗪-2-酮
标题化合物(451mg，96％)是按照实施例58的方法由N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸(487mg，1.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.33(s，0.6H)，11.31(s，0.4H)，8.41(m，1H)，8.25(dd，1H)，7.88(m，1H)，7.34(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)，4.66(s，1.2H)，4.59(s，0.8H)，4.41(s，0.8H)，4.26(s，1.2H)，4.02(m，1.2H)，3.94(m，1.2H)，3.88-3.82(m，1.6H)，1.74(s，3H)。
实施例61-1-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-哌嗪-2-酮
标题化合物(493mg，95％)是按照实施例58的方法由N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-甘氨酸(537mg，1.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.33(s，0.6H)，11.31(s，0.4H)，8.69(s，1H)，8.56(dd，1H)，8.39(dd，1H)，7.34(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)，4.67(s，1.2H)，4.59(s，0.8H)，4.42(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.05(m，1.2H)，3.95(m，1.2H)，3.91-3.85(m，1.6H)，1.75(s，3H)。
实施例62-4-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酰基}-1-(2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮
在溶于THF(24mL)的N-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酰基}-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸(1.20g，1.8mmol)溶液中加入N-甲基吗啉(0.6mL，5.42mmol)，然后使混合物冷却至-20℃。在相同温度搅拌5分钟后，在反应混合物中加入氯甲酸异丁酯(0.30mL，2.31mmol)。使所得混合物在1小时内缓慢回复至0℃。然后在真空下蒸发反应混合物并将其溶于乙酸乙酯和乙腈的混合物。用饱和NaCl溶液洗涤该溶液，并用硫酸钠干燥并过滤。在真空下蒸发滤液并用甲醇研磨以沉淀固体。滤出固体，用甲醇洗涤并在真空下干燥以得到标题化合物0.9g(77％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.35(t，1H)，8.12-7.95(m，3H)，7.90(d，0.6H)，7.84(d，0.4H)，7.48-7.28(m，10H)，6.95(d，0.6H)，6.94(d，0.4H)，6.79(s，1H)，4.82(s，1.2H)，4.73(s，0.8H)，4.45(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.10-3.95(m，2.4H)，3.95-3.80(m，1.6H)。
实施例63-4-{[4-N-(苄氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酰基}-1-(2-硝基-苯磺酰基)哌嗪-2-酮
标题化合物(产率：90％)是按照实施例62的方法由N-{[4-N-(苄氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酰基}-N-[2-(2-硝基-苯磺酰基氨基)-乙基]-甘氨酸合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.76(s，1H)，8.36(t，1H)，8.12(dd，1H)，8.02-7.81(m，3H)，7.41-7.31(m，5H)，7.03(s，0.4H)，7.02(s，0.6H)，5.17(s，2H)，4.82(s，1.2H)，4.74(s，0.8H)，4.45(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.06(m，1.2H)，3.98(m，1.2H)，3.91(m，0.8H)，3.84(m，0.8H)。
实施例64-1-(2-硝基-苯磺酰基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-哌嗪-2-酮
室温下，在溶于DMF(11mL)的1-(2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(1.13g，3.5mmol)，(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(0.64g，3.5mmol)和PyBOP(2.00g，3.85mmol)的混合物中加入N，N-二异丙基乙胺(0.91mL)。再搅拌2小时后，将反应混合物缓慢加入乙醇水溶液以沉淀固体。滤出固体，用乙醇和乙醚洗涤并在真空下干燥以得到标题化合物(1.50g，95％)。
实施例65-1-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-哌嗪-2-酮
标题化合物(1.60g，94％)是按照权利要求64的方法将1-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(1.25g，3.5mmol)与(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(0.64g，3.5mmol)反应合成的。
实施例66-1-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-哌嗪-2酮
标题化合物(900mg，96％)是按照权利要求64的方法将1-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(680mg，2.0mmol)与(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(369mg，2.0mmol)反应合成的。
实施例67-1-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-哌嗪-2-酮
标题化合物(980mg，94％)是按照权利要求64的方法将1-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(780mg，2mmol)与(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(369mg，2mmol)反应合成的。
实施例68-1-(4-甲基-2-硝基-苯磺酰基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-哌嗪-2-酮
标题化合物(888mg，95％)是按照权利要求64的方法将1-(4-甲基-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(672mg，2.0mmol)与(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(369mg，2.0mmol)反应合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.33(s，0.6H)，11.32(s，0.4H)，8.22(m，1H)，7.96(s，1H)，7.78(m，1H)，7.35(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)，4.66(s，1.2H)，4.58(s，0.8H)，4.39(s，0.8H)，4.24(s，1.2H)，4.01(m，1.2H)，3.93(m，1.2H)，3.88-3.81(m，1.6H)，2.49(s，3H)，1.74(s，3H)。
实施例69-1-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺酰基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-哌嗪-2-酮
标题化合物(913mg，91％)是按照权利要求64的方法将1-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(740mg，2.0mmol)与(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(368mg，2.0mmol)反应合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.34(s，0.6H)，11.32(s，0.4H)，8.19(s，1H)，7.95(s，1H)，7.34(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)，4.67(s，1.2H)，4.59(s，0.8H)，4.40(s，0.8H)，4.26(s，1.2H)，3.99(m，1.2H)，3.92(m，1.2H)，3.82(s，1.6H)，2.64(s，3H)，1.74(s，3H)。
实施例70-1-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺酰基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)乙酰基]-哌嗪-2-酮
标题化合物(919mg，88％)是按照权利要求64的方法将1-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(781mg，2.0mmol)与(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(368mg，2.0mmol)反应合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.34(s，0.6H)，11.32(s，0.4H)，8.42(d，0.4H)，8.41(d，0.6H)，8.32(d，0.4H)，8.30(d，0.6H)，7.35(s，0.6H)，7.27(s，0.4H)，4.69(s，1.2H)，4.58(s，0.8H)，4.42(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.11(t，1.2H)，3.97(t，0.8H)，3.93(t，1.2H)，3.82(t，0.8H)，1.74(s，3H)。
实施例71-1-(4-硝基-苯磺酰基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-哌嗪-2-酮
标题化合物(151mg，95％)是按照权利要求64的方法将1-(4-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(113mg，0.35mmol)与(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(64mg，0.35mmol)反应合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.31(s，0.6H)，11.29(s，0.4H)，8.44(d，2H)，8.29(d，2H)，7.34(s，0.6H)，7.27(s，0.4H)，4.64(s，1.2H)，4.55(s，0.8H)，4.33(s，0.8H)，4.18(s，1.2H)，4.14(t，1.2H)，4.00(t，0.8H)，3.90(t，1.2H)，3.80(t，0.8H)，1.74(s，3H)。
实施例72-1-(2-氯-4-硝基-苯磺酰基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙酰基]-哌嗪-2-酮
标题化合物(159mg，94％)是按照权利要求64的方法将1-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(125mg，0.35mmol)与(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(64mg，0.35mmol)反应合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.32(s，0.6H)，11.30(s，0.4H)，8.53(d，1H)，8.47-8.40(m，2H)，7.35(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)，4.68(s，1.2H)，4.57(s，0.8H)，4.38(s，0.8H)，4.24(s，1.2H)，4.18(t，1.2H)，4.04(t，0.8H)，3.95(t，1.2H)，3.84(t，0.8H)，1.75(s，3H)。
实施例73-4-{[6-N-(二苯甲基氧羰基)-腺嘌呤-1-基]乙酰基}-1-(2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮
5℃下，在溶于DMF(20mL)的1-(2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(0.76g，2.36mmol)，[6-N-(二苯甲基氧羰基)-腺嘌呤-9-基]-乙酸(1.0g，2.47mmol)和PyBOP(1.35g)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.95mL)。再搅拌2小时后，反应混合物用乙酸乙酯(200mL)和水(150mL)稀释。分离有机层并用水、5％碳酸氢钠水溶液、10％柠檬酸水溶液和盐水洗涤。有机层用硫酸钠干燥并减压浓缩。残余物通过柱层析纯化以得到标题化合物(830mg，58％)。1H NMR(DMSO-d6)δ10.95(s，1H)，8.59(s，0.6H)，8.58(s，0.4H)，8.40-8.36(m，1H)，8.33(s，0.6H)，8.31(s，0.4H)，8.14(d，1H)，8.06-7.96(m，2H)，7.54-7.27(m，10H)，6.82(s，1H)，5.39(s，1.2H)，5.30(s，0.8H)，4.56(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.12-4.08(m，2.4H)，3.92-3.86(m，1.6H)。
实施例74-4-{[6-N-(二苯甲基氧羰基)-腺嘌呤-1-基]-乙酰基}-1-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮
标题化合物(810mg，56％)是按照实施例73的方法将1-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(712mg，2.0mmol)与[6-N-(二苯甲基氧羰基)-腺嘌呤-9-基]-乙酸(779mg，2.0mmol)反应合成的。1H NMR(DMSO-d6)δ11.05(s，1H)，8.60(s，0.6H)，8.59(s，0.4H)，8.43-8.41(m，1H)，8.37-8.32(m，2H)，8.08(m，1H)，7.53-7.27(m，10H)，6.82(s，1H)，5.39(s，1.2H)，5.31(s，0.8H)，4.56(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.12-4.08(br.m，2.4H)，3.90-3.85(m，1.6H)。
实施例75-4-{[6-N-(二苯甲基氧羰基)-腺嘌呤-9-基]-乙酰基}-1-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮
标题化合物(805mg，58％)是按照实施例73的方法将1-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(679mg，2.0mmol)与[6-N-(二苯甲基氧羰基)-腺嘌呤-9-基]-乙酸(807mg，2.0mmol)反应合成的。1H NMR(DMSO-d6)δ10.95(s，1H)，8.59(s，0.6H)，8.58(s，0.4H)，8.47-8.40(m，1H)，8.33(s，0.6H)，8.30(s，0.4H)，8.26(m，1H)，7.88(m，1H)，7.53-7.27(m，10H)，6.82(s，1H)，5.38(s，1.2H)，5.30(s，0.8H)，4.56(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.12-4.06(m，2.4H)，3.91-3.85(br.m，1.6H)。
实施例76-4-{[2-N-(二苯甲基氧羰基)-鸟嘌呤-9-基]-乙酰基}-1-(2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮
To a溶液of 4-[2-N-(二苯甲基氧羰基)-鸟嘌呤-9-基]-乙酸(1.89g，4.5mmol)，1-(2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(1.45g，4.5mmol)和PyBOP(2.81g，5.4mmol)在DMF(13mL)中加入N，N-二异丙基乙胺(1.96mL，13mmol)在室温下.再搅拌1小时后，反应混合物酸化至pH＝3-4 by adding 20％aqueous citric acid溶液.将沉淀的固体滤出，washed with brine和recrystallized from乙腈以得到标题化合物(1.15g，37％)。1H NMR(DMSO-d6)δ11.63(s，1H)，11.24(s，1H)，8.37(m，1H)，8.13(dd，1H)，8.06-7.97(m，2H)，7.82(s，0.6H)，7.78(s，0.4H)，7.46-7.28(m，10H)，6.86(s，1H)，5.15(s，1.2H)，5.07(s，0.8H)，4.52(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.12-4.02(m，2.4H)，3.94-3.83(m，1.6H)。
实施例77--{[2-N-(二苯甲基氧羰基)-鸟嘌呤-1-基]乙酰基}-1-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮
10℃下，在溶于DMF(10mL)的4-[2-N-(二苯甲基氧羰基)-鸟嘌呤-9-基]-乙酸(1.26g，3.0mmol)、1-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(1.07g，3.0mmol)和PyBOP(1.87g，3.6mmol)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(1.05ml，6.0mmol)。再搅拌1小时后，减压浓缩反应混合物并将残余物溶于乙酸乙酯。溶液用水、饱和碳酸氢钠溶液、20％柠檬酸水溶液和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥和减压蒸发。残余物通过柱层析纯化以得到标题化合物(1.25g，58％)。1H NMR(DMSO-d6)δ11.63(br.s，1H)，11.25(br.s，1H)，8.43-8.32(m，2H)，8.09(m，1H)，7.81(s，0.6H)，7.76(s，0.4H)，7.46-7.28(m，10H)，6.86(s，1H)，5.14(s，1.2H)，5.06(s，0.8H)，4.52(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.10-4.00(m，2.4H)，3.92-3.82(m，1.6H)
实施例78-4-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酰基}-1-(2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮
标题化合物(2.53g，78％)是按照实施例77的方法将1-(2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(679mg，2.0mmol)与[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酸(1.90g，5.0mmol)反应合成的。
实施例79-4-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]乙酰基}-1-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮
标题化合物(0.56g，27％)是按照实施例77的方法将1-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(1.07g，3.0mmol)与[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酸(1.14g，3.0mmol)反应合成的7.1H NMR(DMSO-d6)δ10.98(s，1H)，8.40(s，1H)，8.32(m，1H)，8.07(m，1H)，7.89(d，0.6H)，7.85(d，0.4H)，7.46-7.28(m，1H)，6.96(m，1H)，6.79(s，1H)，4.81(s，1.2H)，4.73(s，0.8H)，4.45(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.07-3.97(m，2.4H)，3.90-3.80(m，1.6H)。
实施例80-4-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]乙酰基}-1-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮
标题化合物(1.19g，60％)是按照实施例77的方法将1-(4-氟-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(1.02g，3.0mmol)与[4-N-(二苯甲基氧代羰基)-胞嘧啶-1-基]乙酸(1.14g，3.0mmol)反应合成的。1H NMR(DMSO-d6)δ10.98(s，1H)，8.41(m，1H)，8.24(dd，1H)，7.87(m，2H)，7.50-7.25(m，10H)，6.96(m，1H)，6.79(s，1H)，4.81(s，1.2H)，4.73(s，0.8H)，4.45(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.06-3.95(m，2.4H)，3.90-3.80(m，1.6H)。
实施例81-4-{[6-N-(苄氧羰基)-腺嘌呤-9-基]乙酰基}-1-(2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮
标题化合物(731mg，61％)是按照实施例77的方法将1-(2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(644mg，2.0mmol)与[6-N-(苄氧羰基)-腺嘌呤-9-基]-乙酸(655mg，2.0mmol)反应合成的。1H NMR(DMSO-d6)δ10.69(s，1H)，9.00(m，1H)，8.71(m，1H)，8.63-8.58(m，2H)，8.31(s，0.6H)，8.29(s，0.4H)，7.47-7.33(m，5H)，5.39(s，1.2H)，5.29(s，0.8H)，5.21(s，2H)，4.57(s，0.8H)，4.29(s，1.2H)，4.15-4.09(m，2.4H)，3.93-3.86(m，1.6H)。
实施例82-4-{[2-N-(苄氧羰基)-鸟嘌呤-9-基]乙酰基}-1-(2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮
室温下，在溶于DMF(13mL)的[2-N-(苄氧羰基)-鸟嘌呤-9-基]-乙酸(1.48g，4.5mmol)，1-(2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(1.45g，4.5mmol)和PyBOP(2.81g，5.4mmol)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(1.96mL，13mmol)。再搅拌40分钟后，反应混合物用水(80mL)稀释以沉淀固体。滤出固体，用乙醇洗涤并用乙腈和THF研磨以得到纯的产物(1.56g，58％)。1H NMR(DMSO-d6)δ11.47(s，1H)，11.38(s，1H)，8.40-7.96(m，4H)，7.82(s，0.6H)，7.78(s，0.4H)，7.45-7.35(m，5H)，5.25(s，2H)，5.13(s，1.2H)，5.04(s，0.8H)，4.51(s，0.8H)，4.26(s，1.2H)，4.10-4.02(m，2.4H)，3.93-3.83(m，1.6H)。
实施例83-4-{[2-N-(苄氧羰基)-鸟嘌呤-9-基]乙酰基}-1-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮
标题化合物(1.32g，60％)是按照权利要求82的方法将1-(4-氯-2-硝基-苯磺酰基)-哌嗪-2-酮盐酸盐(1.25g，3.5mmol)与[2-N-(苄氧羰基)-鸟嘌呤-9-基]-乙酸(1.15g，3.5mmol)反应合成的。1H NMR(DMSO-d6)：δ11.46(s，1H)，11.37(s，1H)，8.44-8.31(m，2H)，8.09(m，1H)，7.82(s，0.6H)，7.78(s，0.4H)，7.46-7.33(m，5H)，5.25(s，2H)，5.12(s，1.2H)，5.04(s，0.8H)，4.51(s，0.8H)，4.26(s，1.2H)，4.10-4.00(m，2.4H)，3.92-3.82(m，1.6H)。
实施例84-3-甲基-1-(2-硝基-苯磺酰)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)乙酰基]-哌嗪-2酮
室温下，在溶于DMF(1mL)的(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(55mg，0.30mmol)、1-(2-硝基-苯磺酰基)-3-甲基-哌嗪-2-酮盐酸盐(100mg，0.30mmol)和PyBOP(156mg，0.45mmol)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.08mL)。在40℃再搅拌2小时后，减压浓缩反应混合物。残余物溶于二氯甲烷并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥并过滤。将滤液减压浓缩并通过柱层析纯化残余物以得到标题化合物(100mg，72％)。1H NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.31(s，1H)，8.33(d，1H)，8.10(d，1H)，8.04-7.93(m，2H)，7.35(s，1H)，4.85-4.60(m，2.5H)，4.55-4.40(m，0.5H)，4.20-4.10(m，0.5H)，4.05-3.90(m，1.5H)，3.78-3.60(m，1H)，3.30(m，1H)，1.74(s，3H)，1.42(d，1H)，1.27(d，2H)。
实施例85-1-(2-硝基-苯磺酰)-3-苯基-4-[(胸腺嘧啶-1-基)乙酰基]-哌嗪-2-酮
室温下，在溶于DMF(0.3mL)的(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(13mg，0.071mmol)，1-(2-硝基-苯磺酰基)-3-苯基-哌嗪-2-酮盐酸盐(28mg，0.070mmol)和PyBOP(40mg，0.077mmol)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.018mL)。再搅拌27小时后，减压浓缩反应混合物。残余物通过柱层析纯化以得到标题化合物(16mg，43％)。1H NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.33(s，1H)，8.36(d，1H)，8.13(d，1H)，8.05-7.94(m，3H)，7.39-7.29(m，5H)，5.93(s，1H)，4.87(d，1H)，4.67(d，1H)，4.22-4.16(m，2H)，3.96(m，1H)，3.78(m，1H)，1.74(s，3H)。
文中提到的所有参考文献在此全文并入以供参考。
* * * * *
那些精通此领域的技术人员将得知，或仅用常规便能够确定，这里所述本发明特定实施方案的许多等价变化。这些变化包含在权利要求的范围之内。

Claims (20)

1.一种具有式I的化合物：
Figure A038064940002C1
其中，
R1、R2、R3、R4、R5独立为H，卤素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，卤化的C1-C4烷基或卤化的C1-C4烷氧基，其中，
至少R1、R3和R5之一是硝基；
R6是H或天然或非天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链；和
B是天然或非天然的核酸碱基，其中，当所述核酸碱基具有环外氨基官能团时，所述官能团受保护基保护，所述保护基在酸性条件下不稳定但在弱碱性至中等碱性条件下稳定。
2.如权利要求1所述的化合物，其中，R6是H或天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链。
3.如权利要求1所述的化合物，其中，B是胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)，腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)。
4.如权利要求1所述的化合物，其中，B的保护基是苄氧羰基或二苯甲基氧羰基。
5.如权利要求1所述的化合物，其中，R1是硝基，R3是卤素，三氟甲基或甲基；R2、R4、R5是H。
6.如权利要求1所述的化合物，其中，R1是硝基，R3是Cl，R5是Cl或甲基，R2和R4是H。
7.如权利要求1所述的化合物，其中，R3是硝基，R1、R2、R4和R5是H。
8.如权利要求1所述的化合物，其中，R3是硝基，R1是Cl，R2、R4和R5是H。
9.一种制备权利要求1的化合物的方法，所述方法包括在通常用于肽合成的偶联剂或混合酐存在下环化式VI的化合物，其中，式VI表示如下：
其中，
R1、R2、R3、R4、R5独立为H，卤素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，卤化的C1-C4烷基或卤化的C1-C4烷氧基，其中，
至少R1、R3和R5之一是硝基；
R6是H或天然或非天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链；和
B是天然或非天然的核酸碱基，其中，当所述核酸碱基具有环外氨基官能团时，所述官能团受保护基保护，所述保护基在酸性条件下不稳定但在弱碱性至中等碱性条件下稳定。
10.一种制备权利要求1所述化合物的方法，所述方法包括在非亲核的有机碱和通常用于肽合成的偶联剂存在下使式IV的化合物与核酸碱基乙酸部分发生偶联反应，其中，所述式IV表示如下：
其中，
R1、R2、R3、R4、R5独立为H，卤素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，卤化的C1-C4烷基或卤化的C1-C4烷氧基，其中，
至少R1、R3和R5之一是硝基；
R6是H或天然或非天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链，
其中，所述核酸碱基乙酸部分表示如下：
Figure A038064940003C3
其中，B是天然或非天然的核酸碱基，其中，当所述核酸碱基具有环外氨基官能团时，所述官能团受保护基保护，所述保护基在酸性条件下不稳定但在弱碱性至中等碱性条件下稳定。
11.一种具有式V的化合物
Figure A038064940004C1
其中，
R1、R2、R3、R4、R5独立为H，卤素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，卤化的C1-C4烷基或卤化的C1-C4烷氧基，其中，
至少R1、R3和R5之一是硝基；
R6是H或天然或非天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链；
R7是H，(C1-C4)烷基或芳基；和
B是天然或非天然的核酸碱基，其中，当所述核酸碱基具有环外氨基官能团时，所述官能团受保护基保护，所述保护基在酸性条件下不稳定但在弱碱性至中等碱性条件下稳定。
12.如权利要求11所述的化合物，其中，R7是甲基，乙基或叔丁基。
13.一种制备权利要求11所述化合物的方法，所述方法包括在非亲核的有机碱和通常用于肽合成的偶联剂存在下使式II的化合物与核酸碱基乙酸部分发生偶联反应，其中，式II表示如下：
Figure A038064940004C2
其中，
R1、R2、R3、R4、R5独立为H，卤素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，卤化的C1-C4烷基或卤化的C1-C4烷氧基，其中，
至少R1、R3和R5之一是硝基；
R6是H或天然或非天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链；
R7是H，(C1-C4)烷基或芳基，
其中，所述核酸碱基乙酸部分表示如下：
其中，B是天然或非天然的核酸碱基，其中，当所述核酸碱基具有环外氨基官能团时，所述官能团受保护基保护，所述保护基在酸性条件下不稳定但在弱碱性至中等碱性条件下稳定。
14.一种具有式II的化合物
其中，
R1、R2、R3、R4、R5独立为H，卤素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，卤化的C1-C4烷基或卤化的C1-C4烷氧基，其中，
至少R1、R3和R5之一是硝基；
R6是H或天然或非天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链；和
R7是H，(C1-C4)烷基或芳基。
15.一种制备权利要求14所述化合物的方法，所述方法包括在非亲核的有机碱存在下使N-(2-氨基乙基)-甘氨酸衍生物与磺酰氯衍生物发生偶联反应，其中，所述N-(2-氨基乙基)-甘氨酸衍生物表示如下：
Figure A038064940005C3
其中，
R6是H或天然或非天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链；和
R7是H，(C1-C4)烷基或芳基，
其中，所述磺酰氯衍生物表示如下：
Figure A038064940005C4
其中，
R1、R2、R3、R4、R5独立为H，卤素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，卤化的C1-C4烷基或卤化的C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基。
16.一种制备权利要求14所述化合物的方法，所述方法包括在非亲核的有机碱存在下使2-氨基乙基磺酰胺衍生物与卤代乙酸酯衍生物发生亲核取代反应，其中，2-氨基乙基磺酰胺衍生物表示如下：
其中，R1、R2、R3、R4、R5独立为H，卤素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，卤化的C1-C4烷基或卤化的C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基，和
其中，所述卤代乙酸酯衍生物表示如下：
Figure A038064940006C2
其中，
R7是H，(C1-C4)烷基或芳基；和
X是Cl、Br或I。
17.一种具有式IV的化合物及其游离酸形式
其中，
R1、R2、R3、R4、R5独立为H，卤素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，卤化的C1-C4烷基或卤化的C1-C4烷氧基，其中，
至少R1、R3和R5之一是硝基；
R6是H或天然或非天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链；和
HY是有机或无机酸。
18.如权利要求17所述的化合物，其中，HY是HCl或TFA。
19.一种制备权利要求17所述化合物的方法，所述方法包括在通常用于肽合成的偶联剂或混合酐存在下使式III的化合物环化，然后在酸中使t-Boc去保护，其中，所述式III表示如下：
其中，
R1、R2、R3、R4、R5独立为H，卤素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，卤化的C1-C4烷基或卤化的C1-C4烷氧基，其中，
至少R1、R3和R5之一是硝基；和
R6是H或天然或非天然α-氨基酸的被保护或未被保护的侧链。
20.一种制造PNA寡聚物的方法，所述方法包括将权利要求1所述的化合物连接在一起。
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