CN1631244B - 来源于黑曲霉的有机硒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的来源于黑曲霉的有机硒及其制备方法属于食品、保健品添加剂领域。本发明的有机硒以黑曲霉为载体，以黑曲霉细胞或水溶液或干粉形式存在。其制备方法是以硒化合物为原料，经过制备含硒培养基、接种培养黑曲霉、收集黑曲霉、洗涤除去胞外硒、灭菌或/和干燥的过程；通过干燥得黑曲霉细胞形式的有机硒、或菌体自溶得水溶液形式的有机硒、或将水溶液干燥制得干粉形式的有机硒。黑曲霉具有菌种生长快，富硒黑曲霉菌胞内有机硒含量高的特点。黑曲霉在发酵过程可以把无机硒转变为有机硒，容易为人体代谢和吸收。用含有机硒的黑曲霉代替普通黑曲霉作食品和保健品的添加剂，可以微量、持续补硒，有效的防治因缺硒引起的疾病。

Description

来源于黑曲霉的有机硒及其制备方法

技术领域

本发明属人类食品添加剂领域，涉及来源于黑曲霉的有机硒及其制备方法。

背景技术

硒存在于肌体的多种功能蛋白酶中。是谷胱甘肽过氧化物酶、磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶、5’-脱碘酶活性中心关键的组成元素，参与体内过氧化物及碘的代谢，硒具有清除自由基、预防癌症、抗衰养颜、保护肝脏、抵抗有害重金属、抗辐射，调节免疫功能等作用，硒对肝炎、心血管病、以及对肿瘤病人的放疗、化疗的辅助治疗均有明显促进恢复的作用。1973年，世界卫生组织(WHO)认为：硒是人类和动物生命中必需的微量元素，补硒可以有效预防多种疾病。中国营养学会的“每日膳食营养素供给量”已将硒列为15种每日膳食营养素之一。

研究表明：硒的生理需要量40ug/d，界限中毒量800ug/d，建议膳食补充量50ug/d～250ug/d，最高安全摄入量400ug/d，儿童为150ug/d。WHO等国际组织均采用了此数据。

现在预防和治疗由于缺硒引起的疾病主要方法是人工补硒。所用的硒主要有两种形式：无机硒和有机硒。而硒盐的毒理分析表明，无机硒毒性较强，一般仅用于医药品，不用于食品，其使用范围和计量都受到限制。通过生物将无机硒转化为有机硒，不但可以提高硒的生理活性与吸收率，而且可以降低其毒性，才具有普遍的食用和保健价值。

现在主要应用植物和微生物将无机硒转变为有机硒。转化方法主要为：(1)微生物合成转化法，如富硒酵母、富硒食用菌等；(2)植物天然合成转化法，如富硒茶叶、富硒苹果、富硒藻类等；(3)植物种子发芽转化法，如富硒麦芽、富硒豆芽等。现在应用的有机硒主要通过微生物合成转化法制备，应用的微生物有酵母和一些食用真菌如灵芝、香菇等。这些真菌还没有真正深入到人们的一日三餐中，不能达到补硒的目的。

与本发明最相近的现有技术是公开号为CN1252835A的发明专利，名称为“添加了来源于酵母的硒盐的食品以及来源于酵母的硒盐的制备方法”。其公开的用于生产硒富集酵母产物的方法，包括以下步骤：制备酵母生长营养物的混合物(含水培养基)；通过将硒化合物溶解在蒸馏水中然后将得到的硒溶液过滤制备在蒸馏水中的硒溶液；将该硒溶液加入酵母生长营养物中并混合形成一种硒生长混合物；将该硒生长混合物加入活的酵母培养物中，形成一种硒酵母生长溶液，并在振荡下温浴；从硒酵母生长溶液中回收并浓缩酵母细胞；将回收的酵母细胞洗涤，除去胞外硒；和将洗涤的酵母细胞干燥。

发明内容

本发明是提供一种来源于黑曲霉有机硒及其制备方法。来源于黑曲霉有机硒为人群提供一种较无机硒盐更容易吸收利用的有机硒盐，克服了直接补无机硒的缺点。在食品工业生产中，以含有机硒的黑曲霉代替普通的黑曲霉，使其生产的产品，如酱油、醋、黄酒等均含有有机硒，成一种补硒的保健食品。

黑曲霉是食品工业中常用的一种真菌，生产上用于酿造酱油、黄酒的糖化剂，还应用于发酵生产纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、曲酸等，有广泛的应用基础和应用价值。研究发现，黑曲霉与酵母、灵芝、香菇一样具有强的富硒能力。

本发明的来源于黑曲霉的有机硒，是以黑曲霉为载体，存在的形式为，干燥的黑曲霉细胞形式或水溶液形式或干粉形式的有机硒。

有机硒在黑曲霉水溶液中含量5ug/ml～200mg/ml。在黑曲霉干粉中含量10ug/mg～300ug/mg。

本发明的来源于黑曲霉的有机硒制备方法，以硒化合物为原料，硒化合物包括亚硒酸钠或/和硒酸钠，经过制备含硒培养基、接种培养、收集洗涤、细胞自溶、灭菌、制成成品的过程；其特征在于，

所说的制备含硒培养基，是将浓度为10mg/L～300g/L硒化合物的生理盐水溶液加入到黑曲霉发酵培养基中，形成硒化合物的含量在10mg/L～10g/L的含硒培养基；

所说的接种培养，是将黑曲霉孢子接种到含硒培养基中，在30～40℃温度范围，培养15～90小时；

所说的收集洗涤，是将含有机硒的黑曲霉细胞通过离心或过滤从含硒培养基中分离出来；用与黑曲霉细胞等渗的生理盐水溶液或葡萄糖水溶液或磷酸盐缓冲液将分离的黑曲霉细胞洗涤2～12次，除去胞外硒；

所说的细胞自溶，是应用高盐细胞自溶法，或者酸热细胞自溶法，裂解细胞，将细胞内有机硒、氨基酸、蛋白质、核糖等营养物质释放出来，制成水溶液形式的有机硒。高盐细胞自溶法是使自溶体系中的NaCl浓度达到1％～5％，温度在20℃～80℃之间，自溶5h～40h。酸热细胞自溶法是使自溶体系的pH值在2～7范围内，温度范围为20℃～70℃，自溶10min～30h，自溶完成后用NaOH调节自溶体系pH值到6.3～7.3。

所说的灭菌，是在90～135℃温度下灭菌15～30分钟；

所说的制成成品，是制成干燥的黑曲霉细胞形式的有机硒；使黑曲霉细胞自溶制成水溶液形式的有机硒；将水溶液干燥，制成干粉形式的有机硒产品。

更详细的来源于黑曲霉的有机硒制备方法，分为7个步骤：

(1)制备可以支持黑曲霉生长的培养基。

(2)制备硒化合物的母液；

(3)将硒化合物母液加入黑曲霉发酵培养基中，使之形成一种含硒的培养基；

(4)接种和培养黑曲霉，通过培养条件使黑曲霉发酵生长；

(5)从黑曲霉生长培养基中收集黑曲霉细胞；

(6)将回收的黑曲霉细胞洗涤，除去胞外硒；

(7)灭菌和/或干燥，制成干燥的黑曲霉细胞形式的有机硒；使菌体细胞自溶制成水溶液形式的有机硒；将水溶液干燥，制成干粉形式的有机硒产品。

本发明的制备步骤(1)黑曲霉生长培养基包括麸皮培养基、富含蛋白质的豆类，包括黄豆、黑豆、绿豆等，和富含淀粉的谷类，包括大麦、小麦、玉米等，及其副产品为主要原料做成的液体培养基，也包括可支持黑曲霉生长的培养基，也可以是以上两种或两种以上培养基的混合物组成。在培养基中加入可支持黑曲霉生长的维生素、生物素、生物小分子物质、有机和无机盐、矿物质、单质金属等，这些物质包括但不限于生物素，维生素B1，维生素B6，泛酸钙，肌醇，铜，硫酸铜，锌，硫酸锌，铁，和硫酸铁。培养基中还添加适量的抗生素防止染菌，抗生素包括四环素、链霉素等其他抗生素。培养基的pH控制在3～9之间，优选的范围控制在4～7之间。

本发明制备步骤(2)涉及硒化合物母液的制备，将硒化合物如硒酸钠、亚硒酸钠等硒盐溶解在生理盐水中，通过滤过得到硒母液。硒化合物包括硒酸钠、亚硒酸钠等硒盐或有机硒化合物形式。硒母液含有10mg/L～300g/L的硒化合物。

本发明制备步骤(3)涉及将硒化合物母液加入黑曲霉发酵培养基中，使之形成一种含硒的培养基。最终硒化合物的含量在10mg/L～10g/L。

本发明制备步骤(4)涉及黑曲霉的接种和培养。接种方式包括种子液接种，使用孢子直接接种，黑曲霉生产时做成的曲接种，但不限于以上几种接种方法。培养温度在30℃～40℃，优选在35℃～38℃。培养时间是15h～90h，优选范围是40h～70h。在生产过程中使用液体培养基时，要在振荡器或者摇床上培养，转速在50rpm～200rpm，优选范围在120rpm～170rpm。生产富硒黑曲霉中所选用的黑曲霉可以是从环境中筛选出来的，可以是直接从菌种收藏中心购买的，也可以是从工业生产中所用的曲或者发酵液中分离出来的。

本发明制备步骤(5)涉及从黑曲霉生长培养基中收集黑曲霉细胞。将含有机硒的黑曲霉细胞通过离心或者过滤从硒黑曲霉培养基中分离出来。离心的转速是1000rpm～10000rpm，优选方案在4000rpm～8000rpm。过滤可以选用滤纸、纱布、脱脂棉、过滤漏斗、抽滤等方法。

本发明制备步骤(6)涉及将回收的黑曲霉细胞洗涤，除去胞外硒。用与细胞等渗的水溶液将分离的黑曲霉细胞洗涤2～12次，优选为3～6次，洗涤溶液的核心问题是与黑曲霉细胞的渗透压保持一致，可以达到最佳的洗涤效果。水溶液的溶质可以选用NaCl、KCl、MgSO₄、KH₂PO₄、Na₂HPO₄等无机盐，也可以选用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等生物小分子溶液和选用聚乙二醇、聚乙烯醇、淀粉等生物大分子溶液，还可以使用两种或两种以上的溶质将水溶液的渗透压调节到与黑曲霉细胞渗透压一致。溶质的浓度范围在其与细胞等渗浓度的基础上下调90％到上调200％。以NaCl为例说明等渗水溶液的组成：等渗NaCl水溶液的浓度为0.9％，但NaCl的浓度范围可以是0.11％～2.7％，使用此范围内的水溶液均可达到较好的洗涤效果，有效的除去胞外硒。

本发明制备步骤(7)涉及将黑曲霉细胞灭菌和/或干燥，得到干燥的黑曲霉细胞形式的有机硒产品。灭菌步骤可在90℃～135℃进行，优选在115℃～125℃。干燥选用自然干燥、烘干、真空干燥、冻干等任何干燥形式，但不限于以上几种。所得到的干燥黑曲霉产品含有约10ug/mg～300ug/mg有机硒。

水溶液形式的有机硒：将洗去细胞外硒的黑曲霉细胞自溶，裂解细胞，将细胞内有机硒、氨基酸、蛋白质、核糖等营养物质释放出来，制成水溶液形式的有机硒。菌体细胞自溶采用高盐细胞自溶法，或者酸热细胞自溶法。菌体细胞自溶后滤过除去细胞壁等不溶物质，将得到的物质灭菌，灭菌温度在90℃～135℃之间，优选在115℃～125℃之间。灭菌时间在10min～2h，优选时间在20min～25min。最终水溶液有机硒产品中含有5ug/ml～200mg/ml的有机硒。高盐细胞自溶法中的盐选用NaCl，添加固体形式的NaCl，或者高浓度的NaCl水溶液，使自溶体系中的NaCl浓度达到1％～5％，优选的浓度为2.5％～3.5％。恒温自溶，自溶的温度可以在20℃～80℃之间，优选范围为50℃～60℃之间，自溶时间可以在5h～40h，优选时间为20h～30h。

酸热细胞自溶法是在洗去胞外硒的黑曲霉细胞中添加HCl，使自溶体系的pH值在2～7范围内，优选的PH值在3.5～4.5，温度范围为20℃～70℃，优选的温度为40℃～50℃，自溶时间为10min～30h，优选自溶时间为30min～2h。自溶完成后用NaOH调节自溶体系pH值到6.3～7.3。

干粉形式的有机硒：将细胞自溶后得到的水溶液通过自然干燥、烘干、真空干燥、冻干等手段制成干粉形式的有机硒，干粉灭菌后保存，灭菌温度可在90℃～135℃之间进行，优选在115℃～125℃，灭菌时间为10min～2h，优选时间为20min～25min。干粉中含10ug/mg～300ug/mg的有机硒。

本发明的有机硒是以黑曲霉为载体的，黑曲霉具有强的硒富集能力，并且具有菌种生长快，富硒黑曲霉菌胞内有机硒含量高的特点。本发明的方法中，黑曲霉在发酵过程可以把无机态的硒转变成为有机硒，这种有机硒存在于黑曲霉菌体细胞中，容易为人体所代谢和吸收，是供给人类使用的最优的硒营养源。用含有机硒的黑曲霉代替普通黑曲霉应用于食品工业生产中，可以为缺硒人群提供一种简便、持续的补充微量元素硒的方法；作为食品和保健品的添加剂，可以达到微量、持续补硒，有效的防治因缺硒引起的各种疾病。

具体实施方式

本发明具体实施步骤如下，但并不意味着对本发明范围的限制：

实施例1

首先配制液体麸皮汁培养基。再制备10g/L的亚硒酸钠母液，吸取一定量的母液加入到麸皮汁培养基中，使培养基中亚硒酸钠的最终浓度为150mg/L。挑取黑曲霉孢子直接接种到含有亚硒酸钠的麸皮汁培养基中，37℃、150rpm培养24h，作为一级种子液；将一级种子液按照10％的接种量接种到含有亚硒酸钠的麸皮汁培养基中，37℃、150rpm培养24h，作为二级种子液；将二级种子液按照10％的接种量接种到生长培养基中，生长培养基也是含有亚硒酸钠麸皮汁培养基，37℃、150rpm培养60h，8000rpm，离心30min收集黑曲霉细胞。用生理盐水洗涤3次，洗去胞外的硒化合物，121℃湿热灭菌20min。将灭完菌的黑曲霉细胞在60℃烘干，制成干燥的黑曲霉细胞形式的有机硒。

在实施例1中，一级种子液和二级种子液的培养温度可以在30～45℃、100～200rpm培养20～40h。在上述的温度、转速、时间范围内培养效果相同。

实施例2

首先配制液体麸皮汁培养基。再制备5g/L的亚硒酸钠母液，吸取一定量的母液加入到麸皮汁培养基中，使培养基中亚硒酸钠的最终浓度为100mg/L。挑取黑曲霉孢子直接接种到含有亚硒酸钠的麸皮汁培养基中，37℃、130rpm，培养20h，作为一级种子液；将一级种子液按照10％的接种量接种到生长培养基中，生长培养基也是含有亚硒酸钠麸皮汁培养基，30℃、130rpm，培养90h，8层纱布过滤收集黑曲霉细胞。用葡萄糖水溶液洗涤12次，洗去胞外的硒化合物，加固体NaCl直至浓度达到3％，55℃，自溶24h，滤纸过滤，除去细胞壁等不溶物，121℃湿热灭菌25min。制成水溶液形式的有机硒。

实施例3

首先配制液体麸皮汁培养基。再制备50mg/L的亚硒酸钠母液，吸取一定量的母液加入到麸皮汁培养基中，使培养基中亚硒酸钠的最终浓度为10mg/L。挑取黑曲霉孢子直接接种到含有亚硒酸钠的麸皮汁培养基中，37℃、100rpm，培养20h，作为一级种子液；将一级种子液按照10％的接种量接种到生长培养基中，生长培养基也是含有亚硒酸钠麸皮汁培养基，37℃、100rpm，培养48h，8层纱布过滤收集黑曲霉细胞。用葡萄糖水溶液洗涤2次，洗去胞外的硒化合物，加固体NaCl直至浓度达到2.5％，50℃，自溶30h，滤纸过滤，除去细胞壁等不溶物，121℃湿热灭菌25min。制成水溶液形式的有机硒。

实施例4

首先配制液体麸皮汁培养基。再制备100g/L的亚硒酸钠母液，吸取一定量的母液加入到麸皮汁培养基中，使培养基中亚硒酸钠的最终浓度为5g/L。挑取黑曲霉孢子直接接种到含有亚硒酸钠的麸皮汁培养基中，37℃、100rpm，培养20h，作为一级种子液；将一级种子液按照10％的接种量接种到生长培养基中，生长培养基也是含有亚硒酸钠麸皮汁培养基，40℃、300rpm，培养15h，8层纱布过滤收集黑曲霉细胞。用葡萄糖水溶液洗涤10次，洗去胞外的硒化合物，加固体NaCl直至浓度达到4％，60℃，自溶20h，滤纸过滤，除去细胞壁等不溶物，115℃湿热灭菌30min。制成水溶液形式的有机硒。

实施例5

首先配制液体麸皮汁培养基。再制备15g/L的亚硒酸钠母液，吸取一定量的母液加入到麸皮汁培养基中，使培养基中亚硒酸钠的最终浓度为100mg/L。在保存的黑曲霉菌种上挑取一些孢子接种到含有亚硒酸钠的麸皮汁培养基中，37℃、150rpm，培养70h，抽滤收集黑曲霉细胞。用磷酸盐缓冲液洗涤3次，洗去胞外的硒化合物，加HCl至pH值到4.5，50℃，自溶1.5h，4000rpm，除去不溶物，将上清用冻干法制成干粉，121℃，灭菌20min。得到干粉形式的有机硒。

实施例6

首先配制液体麸皮汁培养基。再制备100mg/L的亚硒酸钠母液，吸取一定量的母液加入到麸皮汁培养基中，使培养基中亚硒酸钠的最终浓度为20mg/L。在保存的黑曲霉菌种上挑取一些孢子接种到含有亚硒酸钠的麸皮汁培养基中，37℃、150rpm，培养24h，抽滤收集黑曲霉细胞。用磷酸盐缓冲液洗涤2次，洗去胞外的硒化合物，加HCl至pH值到3.5，40℃，自溶1h，4000rpm，除去不溶物，将上清用冻干法制成干粉，125℃，灭菌20min。得到干粉形式的有机硒。

Claims (5)

1.一种来源于黑曲霉的有机硒的制备方法，以硒化合物为原料，硒化合物选自亚硒酸钠或/和硒酸钠，经过制备含硒培养基、接种培养、收集洗涤、灭菌、制成成品的过程；其特征在于，

所说的制备含硒培养基，是将浓度为10mg/L～300g/L硒化合物的生理盐水溶液加入到黑曲霉发酵培养基中，形成硒化合物的含量在10mg/L～10g/L的含硒培养基；

所说的接种培养，是将黑曲霉孢子接种到含硒培养基中，在30～45℃温度范围，培养15～90小时；

所说的收集洗涤，是将含有机硒的黑曲霉细胞通过离心或过滤从含硒培养基中分离出来；用与黑曲霉细胞等渗的生理盐水溶液或葡萄糖水溶液或磷酸盐缓冲液将分离的黑曲霉细胞洗涤2～12次，除去胞外硒；

所说的灭菌，是在90～135℃温度下灭菌15～30分钟；

所说的制成成品，是制成干燥的黑曲霉细胞形式有机硒的产品。

2.一种权利要求1的方法制备的来源于黑曲霉的有机硒，其特征在于，是以黑曲霉为载体，存在形式为干燥的黑曲霉细胞形式的有机硒。

3.一种来源于黑曲霉的有机硒的制备方法，以硒化合物为原料，硒化合物选自亚硒酸钠或/和硒酸钠，经过制备含硒培养基、接种培养、收集洗涤、细胞自溶、灭菌、制成成品的过程；其特征在于，

所说的制备含硒培养基，是将浓度为10mg/L～300g/L硒化合物的生理盐水溶液加入到黑曲霉发酵培养基中，形成硒化合物的含量在10mg/L～10g/L的含硒培养基；

所说的接种培养，是将黑曲霉孢子接种到含硒培养基中，在30～45℃温度范围，培养15～90小时；

所说的收集洗涤，是将含有机硒的黑曲霉细胞通过离心或过滤从含硒培养基中分离出来；用与黑曲霉细胞等渗的生理盐水溶液或葡萄糖水溶液或磷酸盐缓冲液将分离的黑曲霉细胞洗涤2～12次，除去胞外硒；

所说的细胞自溶，是应用高盐细胞自溶法，或者酸热细胞自溶法，裂解细胞，将细胞内有机硒和营养物质释放出来，制成水溶液形式的有机硒；所述的高盐细胞自溶法是使自溶体系中的NaCl浓度达到1％～5％，在20℃～80℃自溶5h～40h；所述的酸热细胞自溶法是使自溶体系的pH值在2～7，20℃～70℃，自溶10min～30h；自溶完成后用NaOH调节自溶体系pH值6.3～7.3；

所说的灭菌，是在90～135℃温度下灭菌15～30分钟；

所说的制成成品，是制成水溶液形式的有机硒；或将水溶液干燥，制成干粉形式的有机硒。

4.一种权利要求3的方法制备的来源于黑曲霉的有机硒，其特征在于，是以黑曲霉为载体，存在形式为，水溶液形式的有机硒或干粉形式的有机硒。

5.按照权利要求4所述的来源于黑曲霉的有机硒，其特征在于，有机硒在黑曲霉水溶液中含量5ug/ml～200mg/ml；有机硒在黑曲霉干粉中含量10ug/mg～300ug/mg。