CN1609118A - 胞壁酰－丙氨酰－d－异谷氨酰胺衍生物、制法和其药物组合物与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了如通式(I)所示的化合物N^α－(1－α－苄基－N－乙酰基－胞壁酰－L－丙氨酰－D－异谷氨酰胺酰)－N^ε－(3－硝基－反式苯乙烯基羰基)－L－赖氨酰胺及其制备方法，它具有治疗肿瘤的作用，并能作为佐剂对晚期肿瘤、艾滋病、出血性休克、淋巴瘤、病毒性疾病、自身免疫病的有治疗或辅助治疗的用途。

Description

胞壁酰-丙氨酰-D-异谷氨酰胺衍生物、制法和其药物组合物与用途

技术领域

本发明涉及如通式(1)所示的化合物N^α-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰)-N^ε-(3-硝基-反式苯乙烯基羰基)-L-赖氨酰胺及其制备方法，它具有治疗肿瘤的作用，并能作为佐剂对晚期肿瘤、艾滋病、出血性休克、淋巴瘤、病毒性疾病、自身免疫病的有治疗或辅助治疗的用途。

背景技术

枝杆菌加热杀死后，悬浮在矿物油中制成的福氏完全佐剂(FCA)，能够有效地增加机体对抗原的体液免疫反应和细胞免疫反应。N-乙酰基胞壁酰二肽(MDP，N-Acetylmuramyl Dipeptide)是FCA的最小有效结构单位，具有广泛的生物活性，如非特异性抗感染(肺炎杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、白色念球菌等)、非特异性抗肿瘤(纤维肉瘤、肝细胞瘤等)、免疫调节、促眠等。但其毒性(免疫原性引起过敏反应、致热、致炎、疼痛)以及代谢迅速等限制其在临床上的应用。胞壁酰二肽化合物是通过非特异地激活或抑制人体免疫系统各细胞，如巨噬细胞、骨髓单核细胞、中性粒细胞、T和B淋巴细胞等生成生物活性。人们对其结构改造投入了极大热情，合成了数百个MDP衍生物，找到了一些活性较高，副作用较低的化合物，并对其构效关系进行了深入的探讨。在肽链碳端接入脂溶性基团的N-胞壁酰三肽-O-磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)，具有很强的抗肿瘤作用，已于1991年在美国完成二期临床研究，其主要副作用是发热及寒战。N^α-MDP-N^ε-十八烷酰赖氨酸[MDP-Lys(L18)]具有很强的抗感染、抗肿瘤作用，保留了MDP的免疫活性，而致热原性降低，已于1991年6月在日本获得认可，作为放、化疗后免疫增强剂上市。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种全新的化合物N^α-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-D-丙氨酰-L-异谷氨酰胺酰)-N^ε-(3-硝基-反式苯乙烯基羰基)-赖氨酰胺，代号为“MDP-C”。

本发明的另一目的在于提供多种制备N^α-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰)-N^ε-(3-硝基-反式苯乙烯基羰基)-L-赖氨酰胺的方法。

本发明又一目的在于提供一种药物组合物，其包括药物有效剂量的，作为活性成份的式(I)的化合物及其异构体及制药领域中常用的载体。

本发明的再一目的在于提供一种新的化合物及其组合物的在制备抗肿瘤，或作为佐剂对晚期肿瘤、艾滋病、出血性休克、淋巴瘤、病毒性疾病、自身免疫病的有治疗或辅助治疗的用途的药物中的应用。

为了完成本发明之目的，本发明采取如下技术方案：

具体讲，本发明一方面涉及如式(I)所示的化合物N^α-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰)-N^ε-(3-硝基-反式苯乙烯基羰基)-L-赖氨酰胺：

根据本发明还涉及制备本发明化合物N^α-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰)-N^ε-(3-硝基-反式苯乙烯基羰基)-L-赖氨酰胺的方法，具体地讲，包括如下步骤：

(A)Fmoc保护D-isoGln的合成，见路线1。

                      路线1

将D-谷氨酸的胺基端的羧酸的羟基转变为胺基，同时用Fmoc保护D-谷氨酸的中原先的胺基。

D-谷氨酸胺基端的羧基的羟基转变为胺基时，首先对D-谷氨酸的胺基进行保护，优选的保护基是苄氧羰基。

D-谷氨酸进行苄氧羰基保护时，优选是D-谷氨酸和苄氧羰酰氯反应。

D-谷氨酸和苄氧羰酰氯的反应，优选是在碱存在的条件下。优选的碱是NaOH。

反应优选是5～30分钟。

反应温度，优选是30～80℃，更优选是40-70℃，最优选是55-65℃。

再用盐酸酸化pH＝1～5。

苄氧羰基保护的Glu在DCC存在的条件下和通入氨气反应。

反应温度：冰盐浴冷却

反应的时间是：30分钟

在羧酸的羟基置换成胺基后，脱去第一步接上的保护基，脱去苄氧羰基优选使用氢化的方法；氢化的方法优选使用钯碳；

氢化反应的温度：0-40

氢化的压力：常压-3大气压

氢化的时间：1~3天。

氨基酸的胺基上Fmoc保护基；

反应温度：冰浴条件下冷却

反应时间：24小时

用酸酸化pH至2~4。

溶剂使用饱和100mL NaHCO₃和200mL丙酮。

(B)保护胞壁酸的合成，见路线2。文献：Liebigs Ann.Chem.1986，35-47

              线路2保护保护胞壁酸的合成

1-苄基-2-乙酰氨基-2-脱氧-4，6-O-苄叉-3-O-[(R，S)-(2’-甲氧羰基)乙基]-α-D-葡糖苷(4r，s)拆分：硅胶用量是1∶40-60；优选硅胶用量是1∶45-55。用极性由小到大的洗脱液依次洗脱，优选的洗脱液依次是乙酸乙酯/CH₂Cl₂＝0％，15％，20％，25％，40％，乙酸乙酯。用高效液相检测，分别合并含有4r，4s流份，浓缩分别得胞壁酸甲酯(4r)和异胞壁酸甲酯(4s)。

C)N^α-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-D-丙氨酰-L-异谷氨酰胺酰)-N^ε-(3-硝基-反式苯乙烯基羰基)-赖氨酰胺的固相合成，见路线3。

                路线3固相合成MDP-C的路线

树酯：优选Crown树酯，Rink Amide树酯，Rink MBHA Amide树脂，Wang树脂，以及其他裂解后产生羧基或酰胺基的树酯。

树脂脱除保护基。脱保护：优选使用20-50％哌啶/DMF的溶液，反应时间20分钟～3小时。

将Fmoc-Lys(Dde)-OH氨基酸接上树脂。缩合剂：优选HBTU，TBTU，HATU，BOP，PyBrBOP，DCC，DIC，以及其他多肽合成缩合剂。添加剂：优选HOBt，HOAt，HOSu，以及其他多肽合成用于形成活化酯的添加剂。连接氨基酸优选使用TBTU和HOBt。反应温度：10℃～80℃，优选是25℃。反应时间是3～30小时，优选是小时5-24小时。反应完后脱Fmoc保护基，优选用50％哌啶/DMF溶液脱保护。

使用同样的方法接上Fmoc-D-isoGln-OH、Fmoc-Ala-OH和保护胞壁酸。

再用30～60％无水肼/DMF溶液脱除Dde保护基后，与3-硝基肉桂酸活化酯在极性溶液(例如水)中反应。

最后用10ml 20％TFA-水溶液将合成的化合物从树脂上切落下来。

氮气吹干，再用10～30％的HCl脱除苄叉保护基得本发明的化合物。

为使反应稳定快速的进行，对反应物进行加热和搅拌等；为使反应的产物纯化采用重结晶和硅胶柱层析。

本发明还涉及一种含有药物有效剂量的如通式I所述的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

根据本发明，本发明化合物可以异构体的形式存在，而且通常所述的“本发明化合物”包括该化合物的异构体。

根据本发明的实施方案，所述的本发明化合物还包括其药效学上可接受的盐、盐的水合物、酯或前体药物。

本发明还涉及含有作为活性成份的本发明化合物和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-95重量％的本发明化合物。在单元剂型中本发明化合物一般含量为0.1-100mg，优选的单元剂型含有4-50mg。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天的合适剂量范围本发明的化合物的用量为0.001-100mg/Kg体重，优选为0.1-60mg/Kg体重，更优选为1-30mg/Kg体重，最优选为2-15mg/Kg体重。成人患者服用的本发明化合物每日为10-500mg，优选为20-100mg，可一次服用或分2-3次服用；儿童服用的剂量按照每kg体重5-30mg，优选为10-20mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这受限于给药医生的临床经验以及治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。

药理学研究表明，本发明化合物具有非特异免疫增强作用，有抗肿瘤转移作用，与抗肿瘤药合用有协同抗肿瘤作用，皮下注射对兔体温无影响，对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖有显著的促进作用，能显著促进DC诱导的细胞毒T细胞对P815细胞杀伤活性，能显著促进小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的分泌和DC细胞IL-2、IL-12和TNF-α的分泌。

因此本发明的化合物能用于肿瘤的免疫治疗，作为佐剂对晚期肿瘤、艾滋病、出血性休克、淋巴瘤、病毒性疾病、自身免疫病等有治疗或辅助治疗作用并且无致热原性。

英文缩略语表

BOP：苯并三氮唑-1-氧基-三(二甲胺基)膦六氟磷酸盐

Bz：苄基

DCC：二环己基碳二亚胺

DIC：二异丙基碳二亚胺

DCM：二氯甲烷

Dde：4，4-二甲基环己-2，6二酮-1-亚基-乙基

DEPT：无畸变极化转移增益

D-iso-Gln：D-构型异谷氨酰胺

DMAP：二甲氨基吡啶

DMF：二甲基甲酰胺

DMSO：二甲基亚砜

ESI：电喷雾电离

FAB：快原子轰击

FCA：福氏完全佐剂

Fmoc：9-芴甲氧羰基

Fmoc-OSu：氮羟基丁二酰亚胺-9-芴甲氧羰酸活化酯

HATU：2-(1H-9-氮杂苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐

HBTU：2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐

HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑

HOBt：1-羟基苯并三氮唑

HOSu：氮羟基丁二酰亚胺

L-Ala：L-构型丙氨酸

L-Lys：L-构型赖氨酸

MDP：N-乙酰基胞壁酰二肽

MDP-C：N^α-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-D-丙氨酰-L-异谷氨酰胺酰)-N^ε-(3-硝基苯乙烯基羰基)-赖氨酰胺

MDP-Lys(L18)：N^α-(N-乙酰基-胞壁酰-D-丙氨酰-L-异谷氨酰胺酰)-N^ε-十八烷酰赖氨酸

PyBOP：苯并三氮唑-1-氧基-三(1-吡咯烷基)膦六氟磷酸盐

TBTU：苯并三氮唑-1-氧基-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸盐

THF：四氢呋喃

TFA：三氟乙酸

TMS：四甲基硅烷

NMM：氮甲基吗啉

ConA：伴刀豆素蛋白A

LPS：磷酸脂多糖

MTT：噻唑兰

rmGM-CSF：重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

rmIL-4：重组小鼠白介素4

IL-2：白介素2

IL-12：白介素12

TNF-α：肿瘤坏死因子alpha。

具体实施方式

                         合成

以下实施例对本发明作进一步的说明。但本发明并不限于这些实施例。

实施例1：Fmoc保护D-isoGln的合成

取60g D-谷氨酸置于1000mL三口瓶中，加入200~300mL 1~4NNaOH溶液，电磁搅拌，同时滴加50~100mL苄氧羰酰氯和120mL1~4NNaOH溶液，约历时30分钟，加热至60℃，搅拌反应5~30分钟。再加入10~50mL 4N NaOH，继续搅拌反应1小时。加入乙醚(350mL×4)萃取有机质。水溶液用冰浴冷却，用盐酸酸化pH＝1~5。经乙酸乙酯提取(500mL×4)后，用无水硫酸镁干燥。蒸除溶剂，得白色固体110g。

取12.46g上面制得的Z-D-Glu溶于20~50mL无水THF中，搅拌下加入10.98g DCC，继续搅拌7小时，出现大量沉淀。过滤除去不溶物，用少量重蒸THF洗涤沉淀，并合并滤液。将滤液转移至一个250mL三口瓶中，冰盐浴冷却并且在机械搅拌下，通入氨气反应30分钟，固体用甲醇/乙醚重结晶，得无色产物。用乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸镁干燥。减压浓缩，重结晶，得无色固体6.2g，熔点174-176℃。

取14g Z-D-iso-Gln置于一500mL的三口瓶中，再加入1g 5％Pd/C、100~300mL水，电磁搅拌，室温下常压氢化1~2天。滤去Pd/C，并用少量水洗涤。

加入饱和100mLNaHCO₃和200mL丙酮。冰浴冷却下数次少量加入5~10倍摩尔过量的Fmoc-0Su，搅拌反应24小时后，用2~4N HCl酸化pH至2~4。旋转蒸除有机溶剂，将残液用乙酸乙酯提取(500mL×5)，有机相用无水硫酸镁干燥。蒸除溶剂后，残余物用甲醇重结晶，得产物15.35g。熔点204-205℃，产率41.8％。质谱(FAB+)：质核比(％)：369.1[M+H⁺](60％)，179.1[C₁₄H₁₁ ⁺](100％)。红外：735，756，1279，1319，1543，1635，1685，1741，3182，3313，3406。核磁氢谱(300MHz，[D₆]DMSO，25℃，TMS内标)：＝1.75-1.89(m，2H，CH₂)，2.24(t，J＝7.8Hz，2H；CH₂)，3.92(m，1H，CH)，4.19-4.27(m，3H，CHCH₂)，7.02(s，1H，CONH)，7.28-7.88(m，10H，8 ph-H+CONH₂)，12.07(s，1H，COOH)。

实施例2：保护胞壁酸的合成

(1)1-苄基-2-乙酰氨基-2-脱氧-α，β-D-葡萄糖苷制备：

取一适当的反应瓶，装入约200~500mL浓盐酸，从滴液漏斗中慢慢滴入浓硫酸，将产生的HCl气体通入冰浴下新蒸1500~3000mL的苄醇中，至苄醇中溶有40~80g HCl为止。取2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖72g~144g，置于适当的反应瓶中，再加入1500~3000mL含HCl苄醇。加热至85~120℃，搅拌反应1小时后，降低温度至40~70℃再反应5~10小时。搅拌下，加入含有200~400g K₂CO₃溶于300mL水的溶液，分出有机相，以无水Na₂SO₄干燥。过滤，于75-100℃用油泵减压蒸去苯甲醇，残余物中加入2000ml 1∶1的正己烷和乙醚混合物，-10℃析晶，过滤。将固体用乙醚洗涤，用乙醇重结晶，得产物76g，产率75％。

(2)1-苄基-2-乙酰氨基-4，6-O-苄叉-2-脱氧-α-D-葡糖苷(2a)制备

取1-苄基-2-乙酰氨基-2-脱氧-α，β-D-葡萄糖苷93g，置于1000mL的反应瓶中，加入150~300mL无水乙醇，再加入600mL甲苯，旋转蒸发除去溶剂。加入重蒸过的DMF 300~600mL，重蒸过的无水二氧六环300~600mL，原甲酸三乙酯150~300mL，苯甲醛120~240mL，对甲苯磺酸7.5~15g。室温下搅拌反应8~16小时后，加入750mL绝对无水乙醚，0℃搅拌1小时，抽滤，用乙醚洗涤固体，真空干燥，得2a产物91g，产率76.2％，薄层层析比移值Rf＝0.37(展开剂CHCl₃∶EtOH＝20∶1)。

(3)1-苄基-2-乙酰氨基-4，6-O-苄叉-2-脱氧-3-O-[(R，S)-(2’-甲氧羰基)乙基]-α-D-葡糖苷(4r，s)制备：

在5升三口瓶中，将80g干燥的2a溶于3000ml重蒸过的无水二氧六环中，搅拌，使溶解。分数次加入30~67.2g 50％NaH，50~80℃搅拌反应1~10小时。然后将温度降至40~65℃。取64g 2-氯丙酸，溶于约150~300ml重蒸过的无水二氧六环中，在40~65℃慢慢滴加至反应液中，升温至50~80℃，滴加640mL水，旋转蒸除溶剂至干。加入200~400mL乙醇，再蒸干。向固体加入800ml饱和NaCl水溶液，冰浴放置12小时。抽滤，滤饼用少量饱和NaCl溶液洗涤，再将滤饼溶于2400ml热水中，用乙醚(400ml×3)抽提杂质。将水溶液加热到80℃，用活性碳脱色，浓缩至约400ml，加入NaCl 140g，搅拌，使NaCl尽可能溶解。4℃放12小时，析出固体Na盐，过滤，干燥。

取上述固体溶于800ml无水DMF中，加入56g碘甲烷，室温搅拌三天，油泵减压蒸除DMF，用少量水洗涤，抽滤，干燥，得固体88g，产率90.5％。

(4)1-苄基-2-乙酰氨基-2-脱氧-4，6-O-苄叉-3-O-[(R，S)-(2’-甲氧羰基)乙基]-α-D-葡糖苷(4r，s)拆分：

取4r，s 8g用200ml二氯甲烷溶解，200-300目硅胶40g拌样。取柱高60cm，内径5.5cm的玻璃层析柱，将400g(200-300目)硅胶和500ml二氯甲烷拌匀，湿法装柱。装完后，静置过夜。以下列洗脱液依次洗脱：乙酸乙酯/CH₂Cl₂＝0％(300ml)，15％(21)，20％(21)，25％(11)，40％(500ml)，乙酸乙酯(11)。收集滴出液约100ml/瓶，用HPLC检测，分别合并含有4r，4s流份。浓缩得胞壁酸甲酯4.5g，收率56.3％，异胞壁酸甲酯2.3g，收率28.8％。

(5)1-苄基-2-乙酰氨基-2-脱氧-4，6-O-苄叉-3-O-[(R)-2’-羧基乙基]-α-D-葡糖苷(5r)制备：

将4r 13.5g在40℃溶于200ml二氧六环中，搅拌下慢慢滴加135ml 0.5~2N NaOH水溶液，TLC检测反应情况，反应12小时后，皂化彻底。旋转蒸发溶剂，将固体加至550ml水中，冰盐浴冷却，慢慢滴加约750~1500ml 1~2N HCl水溶液，至pH＝3.0~40时停止，此时反应液变成白色凝胶状固体。抽滤12小时，室温自然晾干，真空干燥，用400ml无水乙醇重结晶，得5r 12.7g，熔点231-233℃，产率：96.9％。

实施例3：固相合成化合物N^α-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰)-N^ε-(3-硝基-反式苯乙烯基羰基)-L-赖氨酰胺(X＝NH₂)

取5～8μmol的树脂Crown用50％哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护。然后将Fmoc-Lys(Dde)-OH氨基酸以TBTU和HOBt制成的活化酯，与Crown在25℃下反应24小时。然后再用50％哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护基，同样以活化酯法接上D-Fmoc-isoGln-OH、Fmoc-Ala-OH和保护胞壁酸。再用30～60％无水肼/DMF溶液脱除Dde保护基8小时后，与3-硝基肉桂酸活化酯在极性溶液(如水)中反应48小时。最后用10ml 20％TFA-水溶液将合成的化合物从树脂上切落下来。氮气吹干，再用10～30％的HCl脱除苄叉保护基，氮气吹干后，再以石油醚-乙醚-二氯甲烷-环己烷混合溶剂洗涤三次，冷冻干燥后得N^α-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰)-N^ε-(3-硝基-反式苯乙烯基羰基)-L-赖氨酰胺。经C18反相柱层析纯化得到化合物的高效液相色谱纯度为95％(甲醇∶水＝70∶30)。分子组成为：C₄₁H₅₆N₈O₁₄，ESI质谱：885.2[M+H]⁺。核磁氢谱(DMSO-d₆)：1.22(d，J＝8.0，3H)，1.23(d，J＝7.5，3H)，1.20--1.52(m，5H)，1.60--1.71(m，2H)，1.77(s，3H)，1.94(hex，J＝7.0，1H)，2.13(t，J＝7.0，2H)，3.15(d，J＝6.0，1H)，3.28(t，J＝9.0，1H)，3.47--3.51(m，3H)，3.63(d，J＝10.5，1H)，3.64(d，J＝10.5，1H)，3.81(m，1H)，4.12(m，2H)，4.25(m，2H)，4.43(d，J＝12.5，1H)，4.66(d，J＝12.5，1H)，4.72(d，J＝3.0，1H)，6.79(d，J＝16.0，1H)，6.94(br，s，1H，D₂O可交换)，7.03(br，s，1H，D₂O可交换)，7.27--7.37(m，5H)，7.31(br，s，1H，D₂O可交换)，7.52(d，J＝16.0，1H)，7.53(br，s，1H，D₂O可交换)，7.69(t，J＝7.8，1H)，7.86(d，1H，D₂O可交换)，8.00(d，J＝8.0，1H)，8.09(d，1H，D₂O可交换)，8.13(d，J＝8.0，1H)，8.17(d，3H，D₂O可交换)，8.37(br，s，1H)。核磁碳谱和DEPT谱(125M，DMSO-d₆)：18.39(CH₃)，19.00(CH₃)，22.63(CH₃)，23.02(CH₂)，27.85(CH₂)，28.82(CH₂)，31.61(CH₂)，31.73(CH₂)，38.72(CH₂)，48.20(CH)，52.14(CH)，52.40(CH)，52.98(CH)，60.53(CH)，67.92(CH₂)，69.52(CH)，73.20(CH)，76.50(CH)，79.16(CH)，95.98(CH)，121.54(CH)，123.68(CH)，125.25(CH)，127.54(CH)，127.63(2CH)，128.25(2CH)，130.52(CH)，133.86(CH)，136.18(CH)，136.88(C)，137.74(C)，148.33(C)，164.34(C＝O)，169.67(C＝O)，171.61(C＝O)，172.10(C＝O)，172.71(C＝O)，173.30(C＝O)，173.98(C＝O).

红外(KBr，cm^-1)：698，735，808，976，1045，1122，1230，1352，1454，1529，1658，2870，2933，3288

实施例4：固相合成化合物N^α-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰)N^ε-(3-硝基-反式苯乙烯基羰基)-L-赖氨酰胺(X＝NH₂)

Fmoc：9-芴甲氧羰基

Fmoc-OSu：氮羟基丁二酰亚胺-9-芴甲氧羰酸活化酯

称取200mg Fmoc保护的Rink Amide树脂(或者Rink MBHAAmide树脂)，负载量为0.58mmol/g，用5～10mL的20％哌啶/DMF脱Fmoc保护2～3小时，再用DMF洗涤10次后，加入20～50倍摩尔过量Fmoc-Lys(Dde)-Obt活化酯的DMF溶液，25℃～80℃下反应5～10小时。重复脱Fmoc保护基和Fmoc-D-isoGln-Obt的缩合过程，再重复脱Fmoc保护基和Fmoc-Ala-Obt的缩合过程，直至到重复脱Fmoc保护基和保护保护胞壁糖的缩合过程。最后用2％～20％的NH₂NH₂/DMF溶液处理2分钟～30分钟后，加入1～5倍摩尔过量的3-硝基肉桂酸活化酯的极性溶液(如水)反应48小时。化合物裂解与实施例3相同，液相-质谱联用系统给出的化合物ESI质谱：885.1[M+H]⁺。

实施例5：固相合成化合物N^α-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰)-N^ε-(3-硝基-反式苯乙烯基羰基)-L-赖氨酸(X＝OH)

称取200mg Wang树脂，负载量为0.60mmol/g，用Fmoc-Lys(Dde)-Obt活化酯在5倍摩尔过量的DMAP催化剂和100mL的DCM中反应3～5天，然后用5～10mL的20％哌啶/DMF处理2～3小时，再用DMF洗涤10次后，加入20～50倍摩尔过量Fmoc-D-isoGln-Obt活化酯的DMF溶液，25℃～80℃下反应5～10小时。重复脱Fmoc保护基和Fmoc-Ala-Obt的缩合过程。最后用2％～20％的NH₂NH₂/DMF溶液处理2分钟～30分钟后，加入1～5倍摩尔过量的3-硝基肉桂酸活化酯的极性溶液(如水)反应48小时。化合物裂解与实施例3相同。液相-质谱联用系统测得合成目的化合物的ESI质谱：886.3[M+H]⁺。

                     药理实验

实验例1：MDP-C免疫增强作用的体外生物筛选实验及其结果动物：雄性昆明种小鼠，由本院动物中心提供。

实验材料：MTT，购自sigma公司；P388为小鼠淋巴样细胞瘤，由上海细胞库提供。

实验方法：巨噬细胞-MTT法，作用时间：72小时，细胞种类：P388，样品浓度：10^-5M

取昆明种小鼠数只，每只腹腔注射1％淀粉液(生理盐水配)2mL，于第四天放血处死，消毒皮肤，打开腹腔，用无菌注射器向每只注入5mL左右冷的1640培养液，轻轻按揉后抽取腹腔水至无菌硅化试管中，以减少巨噬细胞的黏附。细胞用培养液洗涤2次后，计数调整浓度为4×10⁶/mL。取96孔培养板，每孔加巨噬细胞和肿瘤细胞个50μL，样品溶液10μL，每一浓度做3复孔。在5％CO₂，37℃的条件下培养72小时，然后加入20μL 5％MTT/孔，3～5小时后再加入50μL 10％SDS-5％异丁醇-0.02mol HCl三联液/孔，37℃再过夜，测O.D.570值，结果见表1。

            表1 MDP衍生物免疫活性筛选结果

样品      OD570X±SD      抑制率(％)     t检验

对照      0.41±0.02

MDP       0.25±0.03       56.2         P＜0.001

MDP-Lys   0.24±0.03       53.0         P＜0.001

(L18)

MDP-C     0.29±0.13       71.3         P＜0.001

小结：本实验检测化合物的非特异免疫增强作用，其结果表明化合物MDP-C可能在肿瘤的免疫治疗中起作用。

实验例2  MDP-C的动物体内抗肿瘤转移作用

动物：雄性C57BL/6，由本院动物中心提供。

实验材料：样品及其实验样品的制备：MDP-C，天然紫杉醇，均用吐温-80助溶，用生理盐水配制混悬液。

实验方法：取LLC瘤株，按1g瘤加2ml生理盐水磨成匀浆，于小鼠后腿肌肉内接种0.1ml瘤液。接种后24小时将小鼠按体重随机分组给药。实验共设4组：

1.对照组：给相同体积的溶剂

2.紫杉醇3.5mg/kg组；

3.MDP-C 1.25mg/kg组；

4.MDP-C 1.25mg/kg+紫杉醇3.5mg/kg组；

均为腹腔注射，给药体积为10mL/kg，每日一次，连续21天。接种后第9天，用戊巴比妥钠35mg/kg麻醉小鼠后，将荷瘤腿截肢，手术后肌注青霉素10万单位/kg。于接种后第22天处死小鼠，取肺，称重，固定，计数肺癌转移灶。(固定液的配制：冰乙酸：2mL，苦味酸15mL，福尔马林1mL)，结果见表2。

表2 MDP-C的动物体内抗Lewis肺癌转移作用及其与紫杉醇的协同作用

                   转移灶(个)     SD(标准差)     抑制率(％)

空白对照               12.0          3.9

MDP-C                  5.2           6.5           56.6％

紫杉醇                 3.8           3.1           67.3％

紫杉醇+MDP-C           3.2           3.4           73.3％

小结：结果表明MDP-C具有抗肿瘤转移作用，与紫杉醇合用有协同抗肿瘤作用。

实施例3：MDP-C对兔体温的影响(结果见表3)

动物：家兔20只，由本院动物中心提供。

实验方法：随机分为两组：

(1).MDP-C 0.1mg/kg组；

(2).MDP-C 0.2mg/kg组；

1.按体重给药(见下表)

2.然后皮下注射脱脂奶粉乳液(脱脂奶粉/水为1/7，w/v)2mL/kg。

3.致热后用体温计测量肛温，每小时1次，连续4次。

4.次日测量致热后24小时肛温，以给药前的肛温为基础体温，以不同时间点测肛温，结果见表3。

              表3 化合物MDP-C对兔体温的影响

化合物     基础               兔致热后不同时间(小时)体温(℃)

MDP-C      体温         1         2         3         4        24

0.1         39.93     40.20     39.88     39.92     39.88     39.62

(mg/kg)    ±0.24    ±0.97    ±0.41    ±0.52    ±0.34    ±0.31

0.2       39.80     39.65     39.62     39.92     39.93     39.57

(mg/kg)  ±0.23    ±0.36    ±0.26    ±0.28    ±0.26    ±0.33

小结：结果提示MDP-C在0.1、0.2mg/kg剂量下皮下注射对兔体温无影响，表明其无致热原性。

实施例4：MDP-C对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

动物：雄性BALB/c小鼠，由本院动物中心提供。

实验材料：MTT，ConA和LPS均购自sigma公司。

实验方法：

1.无菌取小鼠脾淋巴细胞，用完全RPM1-1640培养基调细胞浓度为5×10⁶cells/mL。

2.分别添加ConA(2μg/mL)和不同化合物，在5％CO₂、完全湿度培养箱中培养72小时。

3.MTT法测脾淋巴细胞增殖反应，结果见表4。

     表4 化合物MDP-C对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

MDP-C浓度           OD₅₇₀        增长率(％)

(mol/L)

1×10^-5         1.150±0.036      158.9^***

1×10^-6         1.292±0.032      191.1^***

1×10^-7         0.778±0.007      75.28^***

空白对照组       0.444±0.003

ConA(2μg/mL)    1.214±0.010

^***，表示P＜0.001

小结：结果提示化合物MDP-C对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖有显著的促进作用。

实施例5：MDP-C对DC诱导的细胞毒T细胞对P815细胞杀伤

                 活性的影响

动物：雄性BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠，由本院动物中心提供。

实验材料：rmGM-CSF，rmlL-4和丝裂酶素C均购自sigma公司。Non-radioactive Cytotoxicity 96CTL试剂盒购于Promega公司。P815细胞为小鼠肥大瘤细胞，中国药品生物制品检定所惠赠。

实验方法：

1.无菌取小鼠骨髓细胞，用完全RPM1-1640培养基调细胞浓度为5×10⁶cells/mL。

2.培养基补加rmGM-CSF(5ng/mL)和rmlL-4(5ng/mL)。隔天半量换液。

3.在培养第五天加入P815细胞冻融抗原和MDP-C，并培养18小时。

4.用25μg/mL丝裂酶素C处理DC细胞30分钟，按10³细胞/孔接于24孔板(Costr)。

5.无菌取小鼠T淋巴细胞，用完全RPM1-1640培养基调细胞浓度为1×10⁷cells/mL，按1mL/well接种于上述孔板，5％CO₂、完全湿度培养箱中培养5天。

6.取上清，用Non-radioactive Cytotoxicity 96CTL试剂盒测定CTL活性，结果见表5。

   表5MDP-C对DC诱导的细胞毒T细胞对P815细胞杀伤活性的影响

MDP-C          特异性释放率       增加率

浓度(mol/L)       (％)             (％)

1×10^-5          37.7             243.2

1×10^-6          45.2             311.1

1×10^-7          29.4             167.8

空白对照组        11.0±0.027

LPS(1.0μg/mL)    24.6±0.055

小结：结果提示MDP-C能显著促进DC诱导的细胞毒T细胞对P815细胞杀伤活性。实例4和5均是检测能否治疗免疫缺陷疾病的重要依据，其结果表明MDP-C可能作为佐剂对晚期肿瘤和艾滋病等有治疗或辅助治疗作用。

实施例6：MDP-C对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α分泌的影响

动物：雄性C57BL/6小鼠，由本院动物中心提供。

实验材料：小鼠TNF-α ELISA试剂盒购于Diaclone公司。

实验方法：

1.无菌取小鼠腹腔巨噬细胞，用完全RPM1-1640培养基调细胞浓度为5×10⁶cells/mL。

2.分别添加LPS(1.0μg/mL)和不同化合物，在5％CO₂、完全湿度培养箱中培养24小时，取上清。

3.用TNF-α E LlSA法检测上清中TNF-α的含量，结果见表6。

       表6MDP-C对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α分泌的影响

   MDP-C            平均值±SD

浓度(mol/L)      (pg/mL)of TNF-α         增长率(％)

2.5×10^-6       26.341±0.003         482.4^***

1×10^-6         14.295±0.001         216.1^***

1×10^-7         11.114±0.001         145.7^**

空白对照组       4.523±0.001

LPS(1.0μg/mL)   31.568±0.003

小结：结果提示MDP-C显著促进小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的分泌，可能对艾滋病、出血性休克和淋巴瘤等疾病有治疗或辅助治疗作用。

实施例7：MDP-C对小鼠树突状细胞(DC)细胞因子分泌的影响

动物：雄性C57BL/6小鼠，由本院动物中心提供。

实验材料：小鼠TNF-αELlSA试剂盒购于Diaclone公司。IL-2和IL-12 ELISA试剂盒均购于深圳晶美生物工程有限公司。

实验方法：

1.无菌取小鼠骨髓细胞，用完全RPMI-1640培养基调细胞浓度为5×10⁶cells/mL。

2.培养基补加rmGM-CSF(5ng/mL)和rmIL4(5ng/mL)。隔天半量换液。

3.第五天添加LPS(1μg/mL)和不同浓度的不同化合物。

4.第七天收集培养上清。

5.分别用IL-2、IL-1 2和TNF-αELISA法检测其分泌水平，结果见表7。

                 表7化合物MDP-C对小鼠树突状细胞(DC)细胞因子分泌的影响

MDP-C                IL-2                         IL-12                     TNF-α

浓度(mol/L)

             平均值±SD      增长率       平均值±SD    增长率      平均值±SD      增长率

               (pg/mL)        (％)          (pg/mL)       (％)        (pg/mL)        (％)

1×10^-5     102.5±0.036    142.2^***   918.2±0.001    65.1^***   14.636±0.001   163.9^**

1×10^-6     115.5±0.026    172.8^***   1103.5±0.127   98.4^***   16.341±0.006   194.7^**

1×10^-7     75.3±0.032     77.8^**     757.9±0.059    36.3^***   12.023±0.007   116.8^*

空白对照组   42.3±0.025                 556.3±0.002               5.545±0.002

LPS          95.9±0.055                 1126.6±0.201              42.705±0.003

(1.0μg/mL)

注：^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001，与空白对照组比

小结：结果提示MDP-C显著促进小鼠DC细胞IL-2、IL-12和TNF-α的分泌。可能在某些病毒性疾病、自身免疫病和晚期肿瘤的治疗中有一定的作用。

Claims (15)

1、式(I)所示的化合物，及其药效学上可接受的盐、盐的水合物、酯或前体药物。

           X＝NH₂，或者OH

                        (I)。

2、制备权利要求1所述化合物的方法，包括如下步骤：

(A)Fmoc保护D-isoGln的合成，

(B)保护胞壁酸的合成和拆分，

(C)N^α-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-D-丙氨酰-L-异谷氨酰胺酰)-N^ε-(3-硝基-反式苯乙烯基羰基)-赖氨酰胺的固相合成；

其特征在于：

Fmoc保护D-异谷氨酸的合成是将D-谷氨酸的胺基端的羧酸的羟基转变为胺基，同时用Fmoc保护D-谷氨酸的中原先的胺基，并且，羟基转变为胺基前对D-谷氨酸的胺基进行保护，羟基转变为胺基后脱除保护基。

3、根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述的D-谷氨酸的胺基端的羧酸的羟基转变为胺基前对D-谷氨酸的胺基保护，所用的保护基是苄氧羰基。

4、根据权利要求3的制备方法，其特征在于，所述脱除保护基使用的是氢化的方法。

5、根据权利要求4的制备方法，其特征在于，所述的氢化的方法是钯碳催化氢化。

6、根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述的D-谷氨酸的胺基端的羧酸的羟基转变为胺基是通过用苄氧羰基保护的D-谷氨酸在DCC存在的条件下和氨气反应。

7、根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述的保护胞壁酸的拆分是采用柱层析的方法获得胞壁酸甲酯。

8、根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述的N^α-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-D-丙氨酰-L-异谷氨酰胺酰)-N^ε-(3-硝基-反式苯乙烯基羰基)-赖氨酰胺的固相合成是依次连接树酯、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-D-isoGln-OH、Fmoc-Ala-OH和保护胞壁酸，再和3-硝基肉桂酸活化酯反应，再把合成的化合物从树脂上切落下来最后脱除苄叉保护基。

9、根据权利要求8的制备方法，其特征在于，所述的树脂选自Crown树酯，Rink Amide树酯，Rink MBHA Amide树脂，Wang树脂，以及其他裂解后产生羧基或酰胺基的树酯。

10、根据权利要求8的制备方法，其特征在于，所述的连接树酯、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-D-isoGln-OH、Fmoc-Ala-OH和保护胞壁酸时采用的缩合剂选自HBTU，TBTU，HATU，BOP，PyBrBOP，DCC，DIC，以及其他多肽合成缩合剂。

11、根据权利要求3的制备方法，其特征在于，所述的连接树酯、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-D-isoGln-OH、Fmoc-Ala-OH和保护胞壁酸时采用的添加剂选自HOBt，HOAt，HOSu，以及其他多肽合成用于形成活化酯的添加剂。

12、一种药物组合物，其特征在于，含有有效剂量的如权利要求1的化合物，以及药效学上可接受的载体。

13、根据权利要求12的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物可以是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。

14、权利要求1化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

15、权利要求1化合物制备治疗或辅助治疗艾滋病、出血性休克、淋巴瘤、病毒性疾病、自身免疫病的佐剂药物中的应用。