CN1590394A - 新型三糖和五糖寡糖抗原,它们的合成方法以及在制备抑制排斥反应的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通式I、II和III的三糖和五糖寡糖抗原。本发明还涉及利用“一釜合成法”合成通式I、II和III的三糖和五糖寡糖抗原的方法,以及它们在制备抑制异种器官移植的排斥反应的药物中的用途。
Description
发明领域
本发明涉及新型三糖和五糖寡糖抗原,它们的“一釜合成法”合成方法,以及它们在制备抑制异种器官移植的排斥反应的药物中的用途。
背景技术
异种器官移植被认为是解决器官移植中供体器官短缺的方法之一。超级免疫排斥反应被视为异种器官移植中最具挑战性的障碍。它由人体循环系统内一种名为anti-αGal的天然抗体特异性识别非灵长目动物器官细胞上表达的含Galα1→3Gal-R寡糖片断的抗原所引起。用合成的寡糖抗原来中和anti-αGal抗体是抑制超级免疫排斥反应的可能的途径之一。我们用“一釜合成”的方法成功地构建了与异种器官移植相关的寡糖抗原系列。
有关研究表明,三糖Galα1-3Galβ1-4Glcβ-R(1),Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ-R(2)和五糖Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ-R(3)是αGal抗原表位的主要组分(参阅(a)Cooper,D.K.C.;Koren,E.;Oriol,R.Immunol.Rev.1994,141,31.(b)Galili,U.Immunol.Today 1993,14,480.(c)Sandrin,M.S.;Vaughan,H.A.;McKenzie,I.F.C.Transplant.Rev.1994,8,134.(d)Samuelsson,B.E.;Rydberg,L.;Breimer,M.E.;Backer,A.;Gustavsson,M.;Holgersson,J.;Karlsson,E.;Uyterwaal,A.-C.;Cairns,T.;Wel sh,K.Immunol.Rev.1994,141,151)。虽然有文献报道用化学以及酶的方法对其合成进行了研究(参阅Zhu,T.;Boons,G.-J.J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1 1998,857;Gege,C.;Kinzy,W.;Schmidt,R.R.Carbohydr.Res.2000,328,459;和Fang,J.;Li,J.;Chen,X.;Zhang,Y.;Wang,J.;Guo,Z.;Zhang,W.;Yu,L.;Brew,K.;Wang,P.G.J.Am.Chem.Soc.1998,120,6635.),但合成的步骤较多,总收率低,不能满足需要较大量寡糖样品的要求。我们在这里选择常用的保护基对糖结构模块进行合适的保护,然后将这些结构模块用“一釜合成法”进行装配,高效率地得到了所需的三个新型寡糖抗原系列。
发明内容
因此,本发明的目的是提供式I和II的三糖化合物,式III的五糖化合物,或它们的药用盐或溶剂化合物:
其中R1-R2和R5-R6是氢或保护基(如Bn,或R1和R2,或R5和R6一起是苄叉基);R3-R4和R8-R11是氢或保护基(如Bn);R7是H或保护基(如酰基,例如苯甲酰基,乙酰基,氯乙酰基,丙酰基,新戊酰基);R12是H或保护基(如Cbz)。
其中R13-R14和R17-R18是氢或保护基(如Bn,或R13和R14,或R17和R18一起是苄叉基);R15-R16和R20-R21是氢或保护基(如Bn);R19是H或保护基(如酰基,例如苯甲酰基,乙酰基,氯乙酰基,丙酰基,新戊酰基);R23是氢或保护基(如Cbz);R22是氢或保护基(例如-NR22是-NH2,-N3,邻苯二甲酰亚胺基,-NHC(O)O-CH2CCl3,-NHAc等)。
其中R24-R25,R28-R29和R34-R35是氢或保护基(如Bn,或R24和R25,或R28和R29,或R34和R35一起是苄叉基);R26-R27和R31-R32,R36-R40是氢或保护基(如Bn);R30是氢或保护基(如酰基,例如苯甲酰基,乙酰基,氯乙酰基,丙酰基,新戊酰基);R33是氢或保护基(-NR33例如是-NH2,-N3,邻苯二甲酰亚胺基,-NHC(O)O-CH2CCl3,-NHAc等);R41是氢或保护基(例如Cbz)。
本发明的式I的化合物的制备方法包括:
(A)让1,2,3,4,6-五乙酰基葡萄糖:
在三氟化硼合乙醚和惰性溶剂(如非质子溶剂)的存在下与HO(CH2)3MHCbz反应,以引入侧链,获得化合物5:
(B)然后脱乙酰基接着苄叉基保护,获得化合物6:
(C)然后苄基化,获得化合物7:
(D)然后选择性开环,获得化合物8:
(E)然后化合物8与以下化合物9和10偶联,
获得式1化合物,任选脱保护:
式II的化合物的制备方法包括以下步骤:
(A)将化合物11
与HO(CH2)3NHCbz反应,以引入侧链,获得化合物12:
(B)然后选择性开环,获得化合物13:
(C)然后化合物13与以上化合物9和10偶联,获得化合物2,任选脱保护:
式3的化合物的制备方法包括:
(A)将以上化合物9和10偶联,获得化合物14:
(B)将乳糖15:
乙酰化,获得化合物16:
然后与HO(CH2)3NHCbz反应,以引入侧链,获得化合物17:
然后脱乙酰化,引入烯丙基,苄基化,获得化合物18:
然后脱烯丙基,获得化合物19:
(C)化合物14,化合物19与以下化合物20偶联,
获得化合物3,再任选脱保护:
化合物1、2和3的合成路线分别如下所示。
三糖1的合成路线:
三糖2的合成路线:
五糖3的合成路线:
形成寡糖的偶联反应的条件包括:活化剂,选自:NIS/TfOH,DMTST,BSP/Tf2O,PhSCl/AgOTf等;温度:-78℃至室温;反应溶剂,选自:甲苯,二氯甲烷,氯仿,乙腈,DMF,THF,DME等。
化合物1可以先后用1)NaOMe/MeOH和2)H2/Pd-C/H2O/THF/CH3COOH处理来脱保护,获得下式的化合物1a:
化合物2可以先后用甲胺的醇溶液(室温到60℃),2)Ac2O/Pyr,3)NaOMe/MeOH,和4)H2/Pd-C/THF/H2O/CH3COOH处理来脱保护,获得下式化合物2a:
化合物3可以先后用1)甲胺的醇溶液(室温到60℃),2)Ac2O/Pyr,3)NaOMe/MeOH,和4)H2/Pd-C处理来脱保护,获得下式化合物3a:
本发明的另一个目的是提供上述化合物或药用盐或溶剂化物用于制备抗异种器官移植排斥的免疫抑制药物的用途。
本发明的又一个目的是提供含有有效量的上述化合物或药用盐或溶剂化物的药物组合物。本发明的化合物还可以含有药学可接受的载体(如注射或输液用生理盐水)。
本发明的化合物可以单独使用,也可以组合物的形式使用。本发明的化合物优选以注射剂或输液制剂的形式使用。通常,本发明化合物的给药量将在0.1mg/kg/d至10mg/kg/d体重的范围内。
实施例
以下通过实施例来进一步阐述本发明,应该理解的是,这些实施例仅用于例证的目的,不构成对本发明范围的限制。
实施例1、三糖1的合成步骤:
(1)化合物5的合成
1,2,3,4,6-五乙酰基葡萄糖(7g,0.018mol)和化合物HO(CH2)3NHCbz(Zhu,T.;Boons,G.-J.Angew.Chem.Int.Ed.1999,38,3495.)(4.49g,0.0216mol)于250ml茄形瓶中,加入100ml干燥CH2Cl2溶解,注入BF3.OEt2(15.3ml,15.32g,0.108mol),室温下搅拌8h,停止反应,加入100ml CH2Cl2稀释,依次用饱和NaHCO3和NaCl洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,得黄色油状物,残余物用柱层析分离[洗脱剂石油醚∶乙酸乙酯(V/V)=1∶1]得黄色糖浆3.94g,收率:40%。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:7.20-7.29(m,5H),5.15-5.20(m,1H),5.10(t,J=9.6Hz,1H),4.91-5.02(m,3H),4.87(dd,J=8.1,9.3Hz,1H),4.40(d,J=7.8Hz,1H),4.14(dd,J=4.5,12.3Hz,1H),4.03(dd,J=2.4,12.0Hz,1H),3.80(dt,J=9.9,5.4Hz,1H),3.56-3.60(m,1H),3.48(dt,J=9.3,4.4Hz,1H),3.0.-3.24(m,2H),1.97(s,3H),1.94(s,3H),1.92(s,3H),1.89(s,3H),1.67-1.70(m,2H);13CNMR(75MHz,CDCl3)δ:170.46,170.00,169.20,156.26,136.45,128.25,127.85,127.82,100.36,72.49,71.54,70.96,68.10,67.27,66.25,61.60,37.86,29.23,20.45,20.37,20.35;FAB-MS(M+H+)540.元素分析(%):C25H33O12N计算值:C:55.65,H:6.16,N:2.60.实测值:C:55.80,H:6.19,N:2.30。
(2)化合物6的合成
化合物5(2.97g,5.51mmol)于150ml反应瓶中,加入50ml无水甲醇溶解,注入NaOMe(0.2ml,30%的甲醇溶液,0.55mmol),室温搅拌5h,停止反应,加入强酸型阳离子交换树脂中和至中性,滤去树脂后,浓缩抽干得黄色油状物。再在反应瓶中加入无水乙腈(60ml),加入苯甲醛二甲缩醛(1.0ml,1.00g,6.61mmol)及樟脑磺酸(0.11g,0.44mmol),室温搅拌5min后,有白色固体析出,再搅拌5h,溶液变成澄清,TLC检测反应完,加入三乙胺中和,浓缩蒸干溶剂,残余物用柱层析分离[洗脱剂石油醚∶乙酸乙酯(V/V)=1∶1]得白色晶体1.67g,收率:66.0%。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:7.24-7.45(m,10H),5.57(s,1H),5.29(dd,J=5.0,13.5Hz,1H),5.01(m,2H),4.32(d,J=8.0Hz,1H),4.17(dd,J=3.5,10.0Hz,1H),3.73(dt,J=10.0,5.0Hz,1H),3.66-3.70(m,1H),3.49(dt,J=9.0,4.5Hz,1H),3.16-3.20(m,6H),3.09-3.06(m,2H),1.70-1.65(m,2H);13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ:156.13,137.78,137.25,128.83,128.37,128.03,127.78,126.33,103.44,100.63,80.60,74.31,72.85,67.95,66.83,65.77,65.15,37.48,29.65;FAB-MS(M+H+)460.元素分析(%):C24H29O8N计算值:C:62.73,H:6.36,N:3.05.实测值:C:62.55,H:6.38,N:2.83。
(3)化合物7的合成
化合物6(1.62g,3.53mmol)加入到150ml茄形瓶中,注入DMF(30ml)溶解,冷却至0℃,加入NaH(0.36g,14.12mmol),注入BnBr(1.71ml,2.41g,14.12mmol),室温搅拌反应过夜,停止反应,将化合物倒入冰水中,然后用乙酸乙酯(3×30ml)萃取,乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残余物用柱层析分离[洗脱剂石油醚∶乙酸乙酯(V/V)=4∶1]得黄色糖浆2.5g,收率:97%。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:7.21-7.43(m,25H),5.66(s,1H),5.10(br.s,2H),4.45-4.78(m,7H),4.20(m,1H),4.10(q,J=5.0Hz,1H),3.68-3.76(m,4H),3.38-3.54(m,2H),3.28(m,2H),1.76(m,2H);13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ:155.79,138.67,138.42,138.12,137.60,136.93,128.74,128.46,128.35,128.05,127.77,127.53,127.45,127.39,127.34,127.11,126.95,125.93,102.88,100.05,81.65,80.52,80.13,74.05,73.67,67.82,67.00,66.86,66.35,65.18,49.99,28.35.FAB-MS(M+H+)730.元素分析(%):C45H47O8N计算值:C:74.05,H:6.49,N:1.92.实测值:C:73.91,H:6.49,N:1.76。
(4)化合物8的合成
在反应瓶中加入化合物7(2.4g,3.29mmol),3MS(2.5g),注入干燥THF(50ml)N2保护,室温搅拌0.5h,加入NaCNBH3(2.7g,0.041mol),注入HCl-Et2O(66ml,1M的乙醚溶液,65.8mmol),有气泡放出,10min后反应完,加入60ml二氯甲烷停止反应,硅藻土过滤除3MS,滤液依次用饱和NaHCO3和NaCl洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,得黄色油状物,柱层析分离[洗脱剂石油醚∶乙酸乙酯(V/V)=3∶1]得黄色糖浆2.11g,收率:88%。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:7.23-7.32(m,25H),5.40(d,J=6.0Hz,1H),5.09(br.s,2H),4.36-4.82(m,10H),4.07-4.12(m,2H),3.71-3.75(m,2H),3.29-3.55(m,4H),1.78(m,2H);13CNMR(75MHz,CDCl3)δ:156.59,138.50,138.26,137.79,137.74,136.64,129.65,128.89,128.45,128.42,128.37,128.31,128.25,127.91,127.85,127.76,127.71,127.62,127.57,127.22,103.45,83.90,81.58,76.21,75.16,74.59,73.98,73.53,71.36,70.07,67.13,58.20,50.63,28.56;FAB-MS(M+H+)732.元素分析(%):C45H49O8N计算值:C:73.85,H:6.75,N:1.91.实测值:C:74.12,H:6.87,N:1.72。
(5)三糖1的合成
在50ml反应瓶中加入4MS(500mg),化合物9(参阅,Zhang,Z.;Ollmann,I.R.;Ye,X.-S.;Wischnat,R.;Baasov,T.;Wong,C.-H.J.Am.Chem.Soc.1999,121,734.)(163mg,0.25mmol),化合物10(参阅,Zhang,Z.;Ollmann,I.R.;Ye,X.-S.;Wischnat,R.;Baasov,T.;Wong,C.-H.J.Am.Chem.Soc.1999,121,734.)(100mg,0.209mmol),氮气保护,注入干燥CH2Cl2(10ml)搅拌0.5h,冰水条件下加入NIS(132.3mg,0.25mmol),TfOH(42μl,0.5M的乙醚溶液,0.021mmol),反应0.5h后TLC[石油醚∶丙酮(v/v)=3∶2]显示原料10基本反应完且生成一个新点,再加入化合物8(229mg,0.313mmol),NIS(132.3mg,0.25mmol),TfOH(42μ1,0.5M的乙醚溶液,0.02lmmol),反应3h后TLC[石油醚∶丙酮(v/v)=3∶2]检测显示上一步生成的新点基本消失,加入三乙胺(2ml)和CH2Cl2(15ml)稀释,硅藻土过滤除4MS,滤液依次用饱和NaHCO3和NaCl洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残余物用柱层析分离[洗脱剂石油醚∶丙酮(v/v)=4∶1]得黄色油状物175mg,收率55%。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:7.94(d,J=7.5Hz,2H),7.61(t,J=7.5Hz,1H),7.10-7.41(m,52H),5.54(s,1H),5.34(dd,J=8.5,10.0Hz,1H),5.29(d,J=3.0Hz,1H),5.06(br.s,3H),4.82(d,J=7.5Hz,1H),4.18-4.72(m,17H),3.93-4.03(m,3H),3.72-3.79(m,4H),3.40-3.50(m,6H),3.16-3.28(m,7H),1.66-1.82(m,2H);13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ:164.49,139.13,138.56,138.49,138.25,138.11,136.89,133.56,129.35,128.97,128.69,128.41,128.27,128.23,128.17,128.06,128.00,127.84,127.72,127.54,127.46,127.36,127.29,127.12,126.96,126.17,102.01,100.33,99.85,93.10,82.13,81.15,77.69,77.21,75.06,74.38,74.17,73.99,73.56,73.43,73.33,72.41,72.09,71.87,71.13,70.74,68.92,68.21,68.10,66.27,66.23,49.92,43.63,38.99,29.00;MALDI-TOF-MS(M+Na+)1630,(M+K+)1646.元素分析(%):C99H101O19N计算值:C:73.91,H:6.33,N:0.88.
实测值:C:73.66,H:6.53,N:0.56。
(6)三糖1的脱保护
在50ml反应瓶中加入三糖1(50mg),甲醇(15ml),甲醇钠(0.1ml,30%的甲醇溶液),室温搅拌6h,加入强酸型阳离子交换树脂中和至中性,滤去树脂后,滤液浓缩蒸干。将残留物溶于4mlHOAc∶H2O∶THF=4∶2∶1的溶剂中,加入10%Pd/C(10mg),于高纯氢发生器内进行氢化反应,反应完后,过滤出Pd/C,用甲醇充分洗。用C-18反相硅胶柱纯化,得化合物1a纯品,产率92%。
实施例2、三糖2的合成步骤:
(1)化合物12的合成
在50ml反应瓶中加入4MS(400mg),化合物11(参阅Koeller,K.M.;Wong,C.-H.Chem.Rev.2000,100,4465.)(100mg,0.18mmol),化合物HO(CH2)3NHCbz(48.6mg,0.22mmol),氮气保护,注入干燥CH2Cl2(10ml)搅拌0.5h,冰水条件下加入NIS(39.5mg,0.18mmol),TfOH(69μl,0.5M的乙醚溶液,0.034mmol),2h后反应完,加入三乙胺(1ml)中和,加入CH2Cl2(15ml)稀释,硅藻土过滤除4MS,滤液依次用饱和NaHCO3和NaCl洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残余物用柱层析分离[洗脱剂石油醚∶乙酸乙酯(V/V)=1∶1]得淡黄色固体56mg,收率49%。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:7.71-7.92(m,4H),7.49(d,J=6.5Hz,2H),7.26-7.49(m,7H),7.07(t,J=5.0Hz,1H),6.97(t,J=7.0Hz,1H),6.87-6.92(m,4H),5.77(s,1H),5.14(d,J=8.5Hz,1H),4.85(br.s,2H),4.70(d,J=12.0Hz,1H),4.40(d,J=12.5Hz,1H),4.28-4.32(m,2H),3.99(dd,J=8.5,10.5Hz,1H),3.98(t,J=9.5Hz,1H),3.85(t,J=10.0Hz,1H),3.67(t,J=10.0Hz,1H),3.58(dt,J=4.5,9.0Hz,1H),3.34-3.42(m,2H),3.16(m,1H),2.76-2.80(m,2H),1.40-1.49(m,2H);13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ:167.42,155.87,137.77,137.55,137.18,134.72,130.74,128.88,128.32,128.21,127.91,127.74,127.53,127.37,126.03,123.38,100.24,98.30,81.87,74.57,73.14,67.75,66.70,65.71,65.04,55.38,36.84,29.41;FAB-MS(M+H+)679.元素分析(%):C39H38O9N2计算值:C:69.01,H:5.64,N:4.13.实测值:C:68.95,H:5.64,N:3.92。
(2)化合物13的合成
在反应瓶中加入化合物12(440mg,0.66mmol),3MS(2.5g),注入干燥THF(50ml),N2保护,室温搅拌0.5h,加入NaCNBH3(546mg,8.25mmol),注入HCl-Et2O(13.2ml,1M的乙醚溶液,13.2mmol),有气泡放出,30min后反应完,加入50ml二氯甲烷稀释反应液,硅藻土过滤除3MS,滤液依次用饱和NaHCO3和NaCl洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,得黄色油状物,柱层析分离[洗脱剂石油醚∶乙酸乙酯(V/V)=1∶1]得黄色糖浆400mg,收率:91%。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:7.73-7.85(m,4H),7.28-7.37(m,9H),7.07(t,J=5.7Hz,1H),6.86-6.94(m,5H),5.65(d,J=6.6Hz,1H),5.03(d,J=11.4Hz,1H),4.89(br.s,2H),4.76(d,J=12.0Hz,1H),4.57(br.s,2H),4.41(d,J=12.3Hz,1H),4.02-4.14(m,2H),3.35-3.86(m,7H),2.81(q,J=6.3Hz,2H),1.41-1.53(m,2H);13CNMR(75MHz,DMSO-d6)δ:167.64,167.43,155.87,138.59,138.30,137.17,134.59,130.79,128.29,128.22,127.77,127.71,127.38,127.35,127.10,123.24,97.64,78.64,75.68,73.48,72.27,71.58,69.13,66.40,65.04,55.24,36.98,29.42;FAB-MS(M+H+)681.元素分析(%):C39H40O9N2计算值:C:68.81,H:5.92,N:4.12.实测值:C:68.80,H:6.11,N:3.76。
(3)三糖2的合成
在50ml反应瓶中加入4MS(1g),化合物9(815mg,1.254mmol),化合物10(500mg,1.045mmol),氮气保护,注入干燥CH2Cl2(30ml)搅拌0.5h,冰水条件下加入NIS(660mg,1.254mmol),TfOH(0.21ml,0.5M的乙醚溶液,0.105mmol),反应0.5h后TLC显示化合物10基本反应完且生成一个新点,再加入化合物13(1.2g,1.567mmol),NIS(660mg,1.254mmol),TfOH(0.21ml,0.5M的乙醚溶液,0.105mmol),反应3h后TLC检测显示上一步生成的新点基本消失,加入三乙胺(5ml)和CH2Cl2(30ml)稀释,硅藻土过滤除4MS,滤液依次用饱和NaHCO3和NaCl洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残余物用柱层析分离[洗脱剂石油醚∶丙酮(v/v)=4∶1]得黄色油状物814mg,收率55%。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ:8.00(d,J=7.5Hz,2H),7.62(m,2H),7.51(t,J=7.5Hz,1H),7.10-7.38(m,39H),6.97(dd,J=2.0,7.5Hz,2H),6.77(m,3H),5.64(dd,J=8.5,10.0Hz,1H),5.31(s,1H),4.96-5.06(m,6H),4.79(d,J=11.5Hz,1H),4.72(d,J=8.5Hz,1H),4.50-4.63(m,5H),4.44(d,J=12.0Hz,1H),4.21-4.38(m,7H),4.04-4.12(m,4H),3.97(dd,J=3.5,10Hz,1H),3.85(m,2H),3.81(dd,J=3.5,10.0Hz,1H),3.67-3.72(m,3H),3.51-3.55(m,2H),3.38-3.41(m,2H),3.27(dd,J=7.0,9.0Hz,1H),3.15-3.18(m,1H),2.98-3.02(m,1H),1.65-1.74(m,2H);TOF-MS(M+NH4 +)1574.元素分析(%)C93H02O20N2计算值:C:71.71,H:5.95,N:1.80.实测值:C:71.49,H:5.89,N:1.55。
(4)三糖2的脱保护
在50ml反应瓶中,加入三糖2(50mg),甲胺的醇溶液(10ml),于60℃加热回流10h,停止反应,反应液浓缩蒸干。残留物与5ml吡啶和5ml醋酸酐混合搅拌8h,再浓缩蒸干。所得残留物溶于甲醇(15ml)中,加入甲醇钠(0.1ml,30%的甲醇溶液),室温搅拌8h,加入强酸型阳离子交换树脂中和至中性,滤去树脂后,滤液浓缩蒸干。再将残留液溶于5ml HOAc∶H2O∶THF=4∶2∶1的溶剂中,加入10%Pd/C(12mg),于高纯氢发生器内进行氢化反应,反应完后,过滤出Pd/C,用甲醇充分洗。最后用C-18反相硅胶柱纯化,得化合物2a纯品,产率72%。
实施例3、五糖3的合成步骤:
(1)化合物14的合成
在25ml茄形瓶中加入4MS(200mg),化合物9(44.6mg,0.069mmol),BSP(12mg,0.063mmol),注入干燥二氯甲烷(2ml),N2保护,搅拌0.5h,冷却至零下70℃,注入Tf2O(11.9μl,19.46mg,0.069mmol),反应10min后,用干燥二氯甲烷2ml溶解化合物10(30mg,0.063mmol)并加入反应瓶中,然后慢慢升至室温,2h后TLC检测显示原料反应完,加入三乙胺2ml和CH2Cl2(10ml)稀释,硅藻土过滤除4MS,滤液依次用饱和NaHCO3和NaCl洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残余物用柱层析分离[洗脱剂石油醚∶乙酸乙酯(V/V)=3∶1]得淡黄色油状物56mg,收率90%。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ:7.96(d,J=8.0Hz,2H),7.41-7.45(m,3H),7.34(d,J=7.5Hz,2H),7.02-7.27(m,23H),6.89((d,J=8.0Hz,2H),6.97(d,J=8.0Hz,2H),5.49(t,J=9.5Hz,1H),5.32(s,1H),4.98(d,J=3.0Hz,1H),4.70(d,J=11.8Hz,1H),4.65(d,J=9.5Hz,1H),4.55(d,J=12.0Hz,1H),4.49(d,J=11.5Hz,1H),4.39(d,J=11.5Hz,1H),4.35(d,J=12.0Hz,1H),4.24-4.31(m,4H),4.18(d,J=12.0Hz,1H),3.84-3.94(m,3H),3.74(t,J=6.0Hz,1H),3.55(d,J=10.0Hz,1H),3.34(d,J=13.0Hz,2H),3.16(m,2H),2.26(s,3H).13CNMR(125MHz,CDCl3)δ:164.65,138.51,134.20,132.96,129.83,129.47,128.93,128.32,128.22,128.18,128.11,128.03,127.82,127.62,127.48,127.42,127.34,127.25,126.57,101.06,94.60,85.41,78.58,75.77,75.45,74.91,74.58,74.25,73.12,72.20,71.76,69.90,69.82,69.35,68.97,68.63,21.26.TOF-MS(M+NH4 +)1018。
(2)化合物16的合成
在500 ml圆底烧瓶中加入乳糖(32.4g,0.1mol),无水乙酸酐(180ml,163.2g,1.6mol),醋酸钠(16.6g,0.2mol),加热到120℃回流搅拌3h,减压蒸除乙酸酐得深黄色糖浆,加入200ml CH2Cl2溶解,用150ml左右的饱和NaHCO3溶液洗涤2-3次至中性,再用饱和NaCl溶液(100ml)洗涤,无水硫酸钠干燥后,过滤干燥剂,浓缩,所得固体用石油醚-乙酸乙酯(V石油醚∶V乙酸乙酯=3∶2)重结晶,得白色固体57.95g,产率:85.5%。参考文献【82】的方法。
(3)化合物17的合成
化合物16(200mg,0.3mmol)和化合物HO(CH2)3NHCbz(63mg,0.35mmol)于50ml茄形瓶中,加入15ml干燥CH2Cl2溶解,注入BF3·OEt2(1.01ml,127.7mg,0.90mmol),室温下搅拌8h,停止反应,加入50ml CH2Cl2稀释,依次用饱和NaHCO3和NaCl洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,得黄色油状物,主层析分离[洗脱剂石油醚∶乙酸乙酯(V/V)=1∶1]得黄色糖浆98.4mg,收率:43%。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:7.24-7.32(m,5H),5.31(d,J=2.7Hz,1H),5.16(t,J=9.6Hz,1H),5.05-5.11(m,3H),4.93(dd,J=3.6,10.5Hz,1H),4.85(dd,J=7.8,9.6Hz,1H),4.42-4.51(m,3H),3.97-4.13(m,4H),3.79-3.86(m,2H),3.75(t,J=9.6Hz,1H),3.52-3.59(m,2H),3.14-3.27(m,2H),2.11(s,3H),2.05(s,3H),2.02(s,3H),2.01(s,3H),1.98(s,3H),1.93(s,3H),1.89(s,3H),1.75(m,2H);13CNMR(75MHz,CDCl3)δ:170.78,170.70,170.50,170.41,170.09,169.43,156.80,137.05,128.86,128.46,128.42,101.45,100.78,76.60,73.11,73.08,71.96,71.33,71.06,69.49,67.88,66.97,62.22,61.16,60.75,38.58,29.85,21.15,20.99,20.86;FAB-MS(M+H+)828。
(4)化合物18的合成
化合物17(107.5mg,0.13mmol)于50ml反应瓶中,加入20ml无水甲醇溶解,注入NaOMe(10μl,30%的甲醇溶液,0.0026mmol),室温搅拌5h,停止反应,加入强酸型阳离子交换树脂中和至中性,滤去树脂后,浓缩蒸干得黄色油状物。再在反应瓶中加入Bu2SnO(58mg,0.023mmol),注入无水甲醇20ml,N2保护,加热回流搅拌16h,冷却至室温,减压蒸干溶剂,向残余物中加入4MS,四丁基碘化胺(2.2mg,0.006mmol),注入20ml干燥苯,烯丙基溴(18μl,25.16mg,0.208mmol),N2保护,加热回流搅拌5h,冷却至室温,硅藻土过滤除4MS,浓缩滤液得黄色油状物。重复地在反应瓶中加入Bu2SnO(58mg,0.023mmol),注入无水甲醇20ml,N2保护,加热回流搅拌16h,冷却至室温,减压抽干溶剂,向残余物中加入4MS,四丁基碘化胺(2.2mg,0.006mmol),注入20ml干燥苯,烯丙基溴(18μl,25.16mg,0.208mmol),N2保护,加热回流搅拌5h,冷却至室温,硅藻土过滤除4MS,浓缩滤液得黄色油状物,经初步柱层析分离[洗脱剂甲醇∶乙酸乙酯(V/V)=1∶15]后投入下步反应。
将上面所得化合物加入50ml茄形瓶中,注入DMF(4ml)溶解,冷却至0℃,加入NaH(39mg,1.56mmol),注入BnBr(0.14ml,200.1mg,1.17mmol),搅拌5h,停止反应,将化合物倒入冰水中,然后用乙酸乙酯(3×10ml)萃取,乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残余物经柱层析分离[洗脱剂石油醚∶乙酸乙酯(V/V)=3∶1]得黄色糖浆0.111g,收率:70%。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ:7.12-7.34(m,40H),5.92(m,1H),5.32(dd,J=1.5,17.0Hz,1H),5.15-5.18(m,3H),4.99(d,J=11.0Hz,1H),4.95(d,J=11.5Hz,1H),4.66-4.81(m,5H),4.14-4.55(m,11H),3.91(t,J=10.0Hz,2H),3.86(d,J=2.5Hz,1H),3.76(m,1H),3.68(dd,J=7.5,8.6Hz,2H),3.53(t,J=10Hz 2H),3.29-3.35(m,8H),1.85(m,2H);13CNMR(75MHz,CDCl3)δ:162.64,139.10,139.09,138.86,138.62,138.31,138.07,137.88,134.97,128.49,128.43,128.34,128.23,128.19,128.12,128.01,127.93,127.87,127.82,127.71,127.65,127.50,127.46,127.41,127.39,127.29,127.03,116.38,103.46,102.72,82.91,82.34,81.71,79.86,77.20,76.58,75.32,75.21,75.08,74.91,74.59,73.48,73.38,73.01,72.92,71.46,68.28,68.08,67.15,50.77,36.59,31.55;MALDI-TOF-MS(M+Na++H+)1227,(M+K++H+)1243。
(5)化合物19的合成
取化合物18(21mg,0.017mmol)于25ml茄形瓶中,N2保护,注入1.5ml无水甲醇,加入PdCl2(1.1mg,0.0068mmol),室温搅拌4h,反应完毕,加甲醇5ml稀释,硅藻土过滤除PdCl2,浓缩滤液,残余物经柱层析分离[洗脱剂(v/v)石油醚∶乙酸乙酯=1∶2]得浅黄色糖浆19.8mg,产率:97.5%。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ:7.14-7.34(m,40H),5.15(br.s,2H),5.00(d,J=10.5Hz,1H),4.25-4.81(m,16H),3.95(t,J=9.5Hz,1H),3.86-3.92(m,1H),3.83(br.s,1H),3.66-3.79(m,2H),3.26-3.56(m,10H),2.18(d,J=3.5Hz,1H),1.85(m,2H).13CNMR(75MHz,CDCl3)δ:157.87,138.97,138.64,138.52,138.35,138.07,137.93,137.79,136.65,128.91,128.45,128.37,128.29,128.20,128.04,127.92,127.81,127.77,127.67,127.62,127.53,127.48,127.10,103.43,102.56,82.72,81.62,80.52,75.83,75.28,74.98,74.87,74.02,73.27,73.11,73.04,68.14,67.86,67.11,50.68,44.67,43.65,28.59;MALDI-TOF-MS(M+Na++H+)1187,(M+K++H+)1203。
(6)化合物20的合成
在反应瓶中加入化合物11(74mg,0.18mmol),3MS(2.5g),注入干燥THF(10ml),N2保护,室温搅拌0.5h,加入NaCNBH3(0.11g,1.625mmol),注入HCl-Et2O(2.6ml,1M的乙醚溶液,2.5mmol),有气泡放出,10min后反应完,加入10ml二氯甲烷稀释反应液,硅藻土过滤除3MS,滤液依次用饱和NaHCO3和NaCl洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,得黄色油状物,柱层析分离[洗脱剂石油醚:乙酸乙酯(V/V)=3∶1]得黄色糖浆43mg,收率:58%。1HNMR(300MHz,CD3COCD3-d6)δ:7.69-7.84(m,4H),7.27-7.40(m,7H),6.88-7.01(m,7H),5.56(d,J=10.2Hz,1H),4.83(d,J=12.0Hz,1H),4.51-4.64(m,3H),4.28(dd,J=7.8,10.2Hz,1H),4.16(t,J=10.2Hz,1H),3.95(d,J=9.3Hz,1H),3.74-3.82(m,2H),3.32(br.s,2H),2.22(s,3H)。
(7)五糖3的合成
在25ml茄形瓶中加入4MS(200mg),化合物14(30mg,0.03mmol),BSP(2.9mg,0.015mmol),注入干燥二氯甲烷(2ml),N2保护,搅拌0.5h,冷却至零下70℃,注入Tf2O(3.1μl,5.6mg,0.018mmol),反应10min后,加入化合物20(21.5mg,0.036mmol),然后慢慢升至室温反应3h,TLC检测化合物14基本消失。再冷却至-70℃,加入BSP(2.9mg,0.015mmol),Tf2O(3.1μl,5.6mg,0.018mmol),反应10min后,用干燥二氯甲烷2ml溶解化合物19(45mg,0.039mmol)并加入反应瓶中,然后慢慢升至室温,3h后TLC检测显示上一步生成的新点基本消失,加入三乙胺2ml和CH2Cl2(10ml)稀释,硅藻土过滤除4MS,滤液依次用饱和NaHCO3和NaCl洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残余物经柱层析分离[洗脱剂石油醚∶乙酸乙酯(V/V)=2∶1]得淡黄色油状物31.4mg,收率42%。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:7.97(d,J=7.5Hz,2H),7.63-7.73(m,6H),7.44(t,J=7.5Hz,2H),7.37-7.02(m,67H),6.86(d,J=7.5Hz,3H),6.74(t,J=7.5Hz,4H),5.55(s,1H),5.40(dd,J=8.0,10.0Hz,1H),5.32(d,J=3.0Hz,1H),5.28(d,J=8.0Hz,1H),5.05(s,2H),4.90(d,J=11.5Hz,1H),4.87(d,J=8.0Hz,1H),4.75(d,J=11.0Hz,1H),3.92-4.65(m,36H),33.76-3.80(m,3H),3.18-3.76(m,16H),2.95-3.14(m,2H),1.66-1.75(m,2H);13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ:167.44,164.52,155.80,139.14,138.86,138.58,138.34,138.27,138.03,137.98,137.87,136.89,134.37,133.64,131.53,130.50,129.38,128.93,128.76,128.65,128.39,128.30,128.17,128.10,127.99,127.88,127.82,127.72,127.61,127.54,127.40,127.35,127.21,127.16,127.02,126.91,126.70,126.29,126.17,123.06,102.25,101.23,100.04,99.99,99.01,93.34,81.84,80.97,78.06,77.66,77.41,76.85,76.41,75.14,74.44,74.19,74.13,74.05,73.66,73.56,73.40,73.31,72.53,72.47,72.34,71.88,71.22,70.81,68.94,68.38,68.15,68.04,67.90,67.40,66.28,66.10,65.03,55.80,49.95,48.60,44.48,43.61,30.00;MALDI-TOF-MS(M+Na++H+)2534,(M+K++H+)2550。
(8)五糖3的脱保护
五糖3的脱保护与三糖2的脱保护操作步骤相同,得化合物3a,脱保护总收率71%。
实施例4组合物的制备
将本发明的通式I、II或III的化合物20mg和2ml注射用生理盐水按常规注射制剂方法制备成注射剂。
生物活性测试结果
用纯化的人抗α-Gal抗体(男性,AB血型)作为抗体,用小鼠层黏连蛋白作为天然来源的α-Gal抗原,用ELISA方法测定合成抗原对天然抗原与抗体间结合的抑制作用,初步结果表明它们对抗原与抗体间的结合具有较强的抑制作用。测定数据如下:
合成的寡糖对人抗α-Gal抗体与小鼠层黏连蛋白结合的抑制作用的初步实验结果
化合物 IC50(μM)
IgG IgA IgM
1a 15 11 50
2a 35 27 135
3a 2.5 1.3 8.2
Claims (6)
1、式I和II的三糖化合物,式III的五糖化合物,或它们的药用盐或溶剂化物:
其中R1-R2和R5-R6是氢或保护基;R3-R4,R8-R11是氢或保护基;R7是H或保护基;R12是H或保护基;
其中R13-R14和R17-R18是氢或保护基;R15-R16和R20-R21是氢或保护基;R19是H或保护基;R23是氢或保护基;R22是氢或保护基;
其中R24-R25,R28-R29和R34-R35是氢或保护基;R26-R27,R31-R32和R36-R40是氢或保护基;R30是氢或保护基;R33是氢或保护基;R41是氢或保护基。
5、权利要求1的式I、II、III的化合物或药用盐或溶剂化物用于制备抗异种器官移植排斥的免疫抑制药物的用途。
6、含有有效量的式I、II、III的化合物或药用盐或溶剂化物的药物组合物。
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