CN1586548A - 一种银杏叶提取物及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种银杏叶提取物及其提取方法，属于中药制备技术领域。该银杏叶提取物中总黄酮和总萜内酯的总含量达到80％以上，其中总黄酮达70％以上，黄酮醇甙达40％以上，总萜内酯的含量达到10％以上。本提取方法包括提取、纯化分离、浓缩干燥等步骤。本发明与现有技术相比，具有工艺路线更合理；提取、除杂、纯化、萃取、柱分离与精制等过程符合大生产要求；絮凝剂壳聚糖、聚酰胺柱、AB－8大孔树脂等的使用科学可行；生产成本低；有效成分提取率高；具备工业化条件等优点。本发明同时还公开了由上述银杏叶提取物制备的大输液、粉针剂及其制备方法。银杏叶提取物大输液、粉针剂在心血管疾病领域具有广阔的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种银杏叶提取物及其提取方法，特别是涉及一种治疗心脑血管、周边血管等血液循环障碍性疾病的原料药，属于中药制备技术领域。
背景技术
心脑血管、周边血管等血液循环障碍性疾病是临床最常见的疾病之一，是影响人民健康和长寿的一类主要疾病。银杏叶提取物及其制剂在心脑血管、周边血管疾病方面的作用越来越受到世界各国的重视。银杏(Ginkgo biloba L.)为古代遗孑植物，又名白果树。银杏是我国的稀有树种，也是世界上珍贵的药用植物资源。尤其在最近四十年来，国内外相继对银杏化学成分、药理作用进行了深入研究，大量的药学、药理、药效、临床研究表明：银杏叶提取物的主要活性成份是银杏总黄酮醇苷类、萜内酯类化合物，这两类成分也是评判银杏叶提取物质量的重要指标。临床及药理研究发现银杏叶提取物具有增强心功能、改善微循环、降低血液粘稠性、拮抗血小板活化因子(PAF)，清除体内自由基及明显的纤维蛋白原溶解，抑制血流再灌注后的损伤，增强心脏细胞对缺血的耐受能力等。60--70年代，在国外尤其是德国、法国已有一定量银杏叶提取物应用于临床并证明了其效果，目前已发展到欧、亚、美等几十个国家。目前国内外利用银杏叶提取物开发出了许多能有效治疗与预防心脑血管、周边血管、神经系统、泌尿系统疾病的药物与保健食品，银杏叶提取物及其制剂已在临床与人们的生活中有了一定的应用，但应用程度不高，银杏制剂主要作为辅助药物用于临床，主要原因是银杏叶提取物质量标准中有效成分量偏低，影响了疗效。如国际上通用的EGB761银杏叶提取物质量标准中以银杏黄酮苷24％、萜内酯6％为质量指标，用银杏黄酮苷24％、萜内酯6％作为银杏叶提取物的有效成分限度是偏低的，不能满足临床的疗效要求。造成银杏叶提取物有效成分含量偏低的原因同银杏叶提取物的生产工艺有很大关系。
已报道的银杏叶提取物现有工艺技术有：树脂吸附纯化法、热浸法、微波提取法、CO2超临界提取法等。现有技术存在的主要问题：提取的有效成分总量不高、工艺路线不够合理或工业化条件不具备等。
发明内容
本发明的目的是提出一种银杏叶提取物及其提取方法，提高提取物中活性物质银杏总黄酮、黄酮醇苷、萜内酯的含量，以满足药物的临床需要。
本发明提出的银杏叶提取物，其中，总黄酮和总萜内酯的总含量为80％以上，
其中总黄酮为70％以上，总黄酮醇甙为40％以上，总萜内酯为10％以上。
本发明提出的银杏叶提取物的提取方法，包括以下步骤：
(1)将干燥银杏叶粉碎至10-20目，用浓度为70-85％乙醇回流提取多次，将提取液合并，过滤，回收乙醇，对过滤液减压浓缩至稠膏；
(2)在上述稠膏中加入浓度为15-25％乙醇，加入量为2-3ml/g稠膏，搅匀后回流提取，过滤，沉淀，同法再处理一次，合并滤液，搅拌，在滤液中加入浓度为0.5-1.5％壳聚糖溶液作为絮凝剂，加入量为0.1-0.4ml/g稠膏，絮凝，静置，离心分离；
(3)将第(2)步离心分离得到的上清液，减压回收乙醇至无醇味，以相当于每克干叶加入0.5-1.5ml水的比例，将水加入回收乙醇后的上清液中，制得供试液A；
(4)以每克树脂加入1.5-2.5ml供试液的比例，将上述供试液A进样至聚酰胺树脂，用浓度为5-15％乙醇洗脱，得洗脱物I，减压回收乙醇，浓缩，再用水饱和乙酸乙酯萃取，回收有机层中的溶剂后得浓缩液I，水层备用；
(5)用浓度为70-80％乙醇洗脱聚酰胺柱，回收乙醇，得洗脱物II，将洗脱物II与第(4)步所得水层合并，减压浓缩至近干，以相当于每克干叶加入0.8-1.2ml浓度为80-90％乙醇的比例，用乙醇使其溶解，用NaOH溶液调PH值至9.5～10，搅拌后静置，离心分离后取上清液；
(6)将第(5)步得到的上清液用NaOH溶液调PH值至5～6，减压回收乙醇至无醇味，以相当于每克干叶加入0.4-0.6ml水的比例，将水加入回收乙醇后的上清液中，用HCL溶液调PH值至3～4.5，制得供试液B，以每克树脂加入1ml供试液B的比例，将上述供试液进样至AB-8大孔树脂，以相当于每克干叶加入2-3ml浓度为8-13％乙醇的比例，用乙醇洗脱，洗脱液弃去，再以相当于每克干叶加入2.5-3.5ml浓度为55-65％乙醇的比例，用乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得浓缩液II；
(7)将浓缩液I、浓缩液II合并，减压浓缩，真空干燥，得银杏叶提取物。(10.5-14.5mg/g干叶)。
本发明提出的银杏叶提取物的提取方法，具有下述优点：工艺路线更合理；提取、除杂、纯化、萃取、柱分离与精制等过程符合大生产要求；絮凝剂壳聚糖、聚酰胺柱、AB-8大孔树脂等的使用科学可行；生产成本低；有效成分提取率高；具备工业化生产的条件。本发明的银杏叶提取物可以制备成大输液及粉针剂，银杏叶提取物大输液、粉针剂在心血管疾病领域具有广阔的应用。
具体实施方式
本发明银杏叶提取物的制备
以银杏叶为原料。秋季银杏叶尚绿时采摘，除去杂质，晒干。选用的银杏叶中含总黄酮醇苷达0.85％以上，总萜内酯达0.25％以上。
制备方法如下：
1.提取：将干燥银杏叶粉碎至10-20目，用浓度为65-85％乙醇提取若干次，将提取液合并，滤过，回收乙醇，浓缩至稠膏。
银杏叶细度对提取效果的影响是，粉碎过细不仅杂质增加，还影响总黄酮醇苷和总萜内酯的提出，采用10～20目的碎叶提取比较适合，本发明确定的银杏叶粒度范围是10～20目。
不同乙醇浓度对提取效果的影响是乙醇浓度的提高有助于总黄酮醇苷和总萜内酯的浸出，用75％的乙醇提取即可得到较好的提取效果，而90％乙醇在生产成本方面考虑没有必要，且其提出物中叶绿素等脂溶性杂质太多，给后来的分离精制造成困难。本发明明确乙醇浓度范围是70-85％。
提取时间和次数对提取效果的影响是，提取时间超过1小时，总黄酮醇甙和总萜内酯的浸出已经接近完全，第二、三次提取超过0.5小时，总黄酮醇甙和总萜内酯的浸出就已经接近完全；提取次数超过3次时，总黄酮醇甙和总萜内酯的浸出也已经接近完全。在此基础上再增加时间或次数则没有必要。本发明明确提取时间及次数是：提取三次，时间分别为1-2小时、0.5-1小时、0.5-1小时。
乙醇用量对提取效果的影响是，三次加醇量为12、8、6倍的提取效果与14、10、8倍量接近，采用12、8、6倍量75％乙醇为提取溶媒用量比较适合。因此本发明提出三次乙醇用量范围是：乙醇用量(重量)分别为银杏叶干重的10-14倍(第1次)、7-9倍(第2次)、5-6倍(第3次)。
2.分离与纯化
(1)转溶与除杂：加入10-30％乙醇搅匀后回流提取，滤过、沉淀，同法再处理一次，合并滤液，搅拌，加入0.5-1.5％壳聚糖溶液絮凝，静置，离心。
得到的稠膏含有较多的脂溶性物质，尤其是叶绿素，可能会永久性的吸附在树脂柱上。本发明采用低浓度的乙醇处理，增加有效成分的溶出。对试验数据进行方差分析，结果表明：乙醇浓度、用量对有效成分的溶出有显著性影响，沉淀次数则无显著性影响。通过对比试验确定乙醇浓度10-30％，用量(重量)为银杏叶干重的0.25-1.2倍，沉淀2次即可，回流时间在0.5小时以内。
水沉之后，总黄酮、黄酮醇甙和总萜内酯的总含量较低，仍然有较多的杂质，本发明采用加入絮凝剂的方法去除一部分杂质。称取壳聚糖，用1％的醋酸溶解，配成规定0.5-1.5％壳聚糖溶液。对比试验表明：随着壳聚糖用量的增加，提取物得率和有效成分含量也随之减少，但壳聚糖用量超过0.6g/L后不再降低，此时总黄酮醇甙和总萜内酯的含量分别达到17％和4％，说明在水沉后药液中加入0.6g/L壳聚糖能较好的除去杂质。
(2)低浓度乙醇洗脱：上清液回收乙醇至无醇味，上样至已处理好的聚酰胺树脂，5-15％乙醇洗脱，得洗脱物I，减压回收溶剂，浓缩，用水饱和乙酸乙酯萃取，有机层回收溶剂后得浓缩液I，水层备用。
对比试验表明：采用5-15％乙醇洗脱聚酰胺树脂，可以基本上将萜内酯化合物洗脱下来。浓度更高时，洗脱的萜内酯化合物相对含量减少，而绝对量增加不大。
对比试验表明：用乙酸乙酯萃取2次即可将萜内酯基本分离出来。
(3)高浓度乙醇洗脱：用70-85％乙醇洗脱聚酰胺柱，回收乙醇，得洗脱物II，将洗脱物II与第(2)步所述水层合并，减压浓缩至近干，用80-90％乙醇溶解，调PH值9.5～10，搅拌后静置，离心。
对比试验表明：采用70-85％乙醇洗脱聚酰胺树脂，可以完全将黄酮醇甙类洗脱下来，而且可以使部分杂质滞留在聚酰胺树脂上。通过盐酸镁粉反应检测收集的洗脱液中黄酮醇甙类含量，至无显色反应时即可停止洗脱。
对比试验表明：80-90％乙醇比较适宜；乙醇用量则相反，用量越少沉淀越多，但是用量过少对总黄酮醇甙类损失较大；PH值为9.5～10时降低总固体量的幅度明显较高。
(4)AB-8大孔树脂分离纯化：将第(3)步得到的上清液调节PH值5～6，回收乙醇至无醇味，调PH值至3～4.5，上样至已处理好的大孔树脂，5-15％乙醇洗脱，洗脱液弃去，再用50-70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得浓缩液II。
PH沉淀除杂以后，黄酮醇甙类含量提高到30％以上，仍然需要进一步纯化处理。本发明采用AB-8型大孔树脂进行药液的进一步分离纯化，总黄酮醇苷动态吸附量可达11.4mg/g树脂，解吸率95.0％，。
AB-8大孔树脂吸附以后，需要选择适当的乙醇浓度区间来洗脱，尽量得到较高浓度的黄酮醇甙。本发明采用50-70％的乙醇洗脱时，可以基本上将黄酮醇甙类洗脱下来，洗脱液经盐酸-镁粉反应无显色反应时即可停止洗脱。
3.浓缩干燥：将浓缩液I、浓缩液II合并，减压浓缩.真空干燥，得银杏叶提取物。
通过对制得的银杏叶提取物进行分析，结果表明：总黄酮和总萜内酯的总含量达到80％以上，其中总黄酮达70％以上，黄酮醇甙达40％以上，总萜内酯达10％以上，符合中药注射剂型对单味药有效部位的含量要求。
本发明制得的银杏叶提取物的药理、药效学试验结果如下：
(1)毒理学试验，结果表明正常使用时试验动物没有毒性反应。具体试验数据如下：
A、急性毒性试验 小鼠静脉注射及腹腔注射试验表明：小鼠静脉注射LD50为685.5mg/Kg，95％d可信限为574.9-817.4mg/Kg；小鼠腹腔注射LD50为1683.2mg/Kg，95％d可信限为1398.9-2025.3mg/Kg。
B、长期毒性试验 结果表明：大鼠长期腹腔注射给药，安全剂量为42mg/Kg；家犬静脉注射，连续6周的安全剂量为21mg/Kg。
C.通过银杏叶提取物对心血管系统和呼吸系统的影响试验结果表明：对麻醉犬血压、呼吸频率、呼吸深度以及心电图都没有明显影响。对小鼠的神经系统的影响结果表明：小鼠静脉注射银杏叶提取物，剂量为10、20、40mg/Kg，对以上指标均无明显影响。
(2)药效学试验表明本发明银杏叶提取物在心血管疾病领域具有广阔的应用。
具体试验如下：
A.对犬冠状动脉结扎所致急性心肌梗塞的试验表明：具有明显的抗心肌缺血作用，能显著减轻结扎犬左冠状动脉前降支所致急性心肌缺血损伤。
B.对大鼠垂体后叶素所致急性心肌缺血的影响试验表明：具有明显抗大鼠垂体后叶素所致急性心肌缺血的作用，能显著减轻垂体后叶素所致急性心肌缺血损伤。
C.对麻醉犬血流动力学影响的试验表明：具有增加麻醉犬心输出量、冠脉流量的作用；并具有提高心脏指数和减少血管总外周阻力之趋势。
D.对麻醉犬心肌耗氧量影响的试验表明：具有减少心肌耗氧量的作用。
E.活血化瘀作用的实验研究结果提示：家兔静脉注射银杏叶提取物(2，4，8mg/Kg)能抑制ADP诱导的家兔血小板聚集及血栓形成，能改善全血粘度及血浆粘度。小鼠静脉注射银杏叶提取物(8.2，16.4，32.8mg/Kg)明显延长凝血时间。
下面是本发明的一个实施例：
将干燥银杏叶1000g，粉碎至10目-20目以下，用75％乙醇提取三次，第一次加醇12倍，浸泡1.0小时，回流提取1.0小时，第二、三次分别加8、6倍量，均回流提取0.5小时，提取液合并，滤过，减压回收乙醇，浓缩至稠膏，加入500ml20％乙醇，搅匀后回流提取0.5小时，滤过，沉淀同法再处理一次，合并滤液，搅拌加入1％壳聚糖溶液60ml絮凝，静置，离心，上清液回收乙醇至无醇味，加水至适量，进样(2ml/g)至已处理好的聚酰胺柱，10％乙醇洗脱，收集洗脱至设定量，再用75％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液至设定量，减压回收乙醇；10％乙醇洗脱液减压浓缩至一定量，用水饱和乙酸乙酯萃取2次，每次适量，有机层回收溶剂，备用，水层与75％乙醇洗脱浓缩液合并，减压浓缩至近干，用适量的85％乙醇溶解，调节PH值9.5～10，搅拌后静置，离心，调节PH值5～6，回收乙醇至无醇味，加水至适量，调PH值至3～4.5，进样(1ml/g树脂)至已处理好的AB-8大孔树脂，10％乙醇洗脱，洗脱液弃去，再用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，与聚酰胺柱10％洗脱液的萃取后有机相浓缩液合并，减压浓缩，真空干燥，得约11g银杏叶提取物。
Claims (2)
1、一种银杏叶提取物，其特征在于该提取物中，总黄酮和总萜内酯的总含量为80％以上，其中总黄酮为70％以上，总黄酮醇甙为40％以上，总萜内酯为10％以上。
2、一种银杏叶提取物的提取方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)将干燥银杏叶粉碎至10-20目，用浓度为70-85％乙醇回流提取多次，将提取液合并，过滤，回收乙醇，对过滤液减压浓缩至稠膏；
(2)在上述稠膏中加入浓度为15-25％乙醇，加入量为2-3ml/g稠膏，搅匀后回流提取，过滤，沉淀，同法再处理一次，合并滤液，搅拌，在滤液中加入浓度为0.5-1.5％壳聚糖溶液作为絮凝剂，加入量为0.1-0.4ml/g稠膏，絮凝，静置，离心分离；
(3)将第(2)步离心分离得到的上清液，减压回收乙醇至无醇味，以相当于每克干叶加入0.5-1.5ml水的比例，将水加入回收乙醇后的上清液中，制得供试液A；
(4)以每克树脂加入1.5-2.5ml供试液的比例，将上述供试液A进样至聚酰胺树脂，用浓度为5-15％乙醇洗脱，得洗脱物I，减压回收乙醇，浓缩，再用水饱和乙酸乙酯萃取，回收有机层中的溶剂后得浓缩液I，水层备用；
(5)用浓度为70-80％乙醇洗脱聚酰胺柱，回收乙醇，得洗脱物II，将洗脱物II与第(4)步所得水层合并，减压浓缩至近干，以相当于每克干叶加入0.8-1.2ml浓度为80-90％乙醇的比例，用乙醇使其溶解，用NaOH溶液调PH值至9.5～10，搅拌后静置，离心分离后取上清液；
(6)将第(5)步得到的上清液用NaOH溶液调PH值至5～6，减压回收乙醇至无醇味，以相当于每克干叶加入0.4-0.6ml水的比例，将水加入回收乙醇后的上清液中，用HCL溶液调PH值至3～4.5，制得供试液B，以每克树脂加入1ml供试液B的比例，将上述供试液进样至AB-8大孔树脂，以相当于每克干叶加入2-3ml浓度为8-13％乙醇的比例，用乙醇洗脱，洗脱液弃去，再以相当于每克干叶加入2.5-3.5ml浓度为55-65％乙醇的比例，用乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得浓缩液II；
(7)将浓缩液I、浓缩液II合并，减压浓缩，真空干燥，得银杏叶提取物。
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