CN1569220A - 基因重组抗真菌肽在治疗病原真菌感染上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用酵母菌工业化生产提取纯化的基因重组抗真菌肽，作为制备治疗深部和浅部真菌在皮肤粘膜表面感染引起上呼吸道、阴道、皮肤和口腔炎症药物的应用；并用具有杀真菌作用的基因重组抗真菌肽作为治疗各种临床炎症体内的药物针剂、片剂、喷雾剂和体外药物滴剂、膏剂等的配制和用药方法。

Description

基因重组抗真菌肽在治疗病原真菌感染上的应用

技术领域

本发明涉及生物医学中利用基因重组抗真菌肽作为制备治疗病原真菌引起各种感染的药物应用。

背景技术

抗生素的大量使用、免疫抑制剂的应用、手术、放射性治疗等等造成菌群失调，使得许多原来不致病的和正常情况下治病性很弱的病原菌引起疾病，而且发病率逐年增加，尤以医院内交叉感染最为明显。目前引起临床感染较常见的病原菌主要是革兰阴性细菌中的大肠杆菌、绿脓杆菌和克雷伯菌等，革兰阳性细菌中的葡萄球菌等和真菌如念珠菌等。对细菌引起的感染可采用抗生素进行治疗，虽然耐药菌的增多给治疗造成困难，但尚可采用药物敏感试验筛选敏感药物和联合用药予以治疗。而真菌引起的感染近年逐渐增多，在临床致病菌捡出率各地区有所区别，一般在10％左右，而在医院内感染中高达20％以上。由于真菌细胞与人体细胞都属于真核细胞，对真菌有效的抗生素对人体细胞也有毒性作用，所以治疗时的副作用较大，造成治疗困难。

既然真菌细胞与人体细胞都属于真核细胞，对真菌有效的抗生素对人体细胞也有毒性作用，所以治疗时的副作用较大。能否开发出仅针对真菌有作用，而对人体细胞无副作用的抗生素？人体在生物进化过程中，人体演化出多种天然抗菌物质，这些抗菌物质对多种病原菌均有杀灭作用，而对自身无任何副作用，是我们寻找低毒高效抗真菌药物的理想源泉。溶菌酶是由Fleming在1922年发现的。它是一种有效的抗菌剂，全称为：1，4-β-N-溶菌酶或者称：粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能切断细菌细胞壁的肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键的联结，破坏肽聚糖支架，细菌在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。近年来研究，溶菌酶可能作为一种很古老的防御机制，还活跃于细胞质和细胞外防御病毒和真菌的侵袭。

目前，溶菌酶主要从鸡蛋清来制取。然而，鸡溶菌酶作为异种蛋白可引起变态反应而无法用于人类，天然人溶菌酶的价格过于昂贵也无法用于临床。我公司利用酵母系统表达人溶菌酶，成本低，生产量大，可实现工业化生产。同时建立的新提取纯化的方法，产物纯度高达99.8％以上，同时具有天然人溶菌酶的杀菌活性。该方法已申请专利(专利申请号：00110463.2)。在此基础上我公司牵头承担并完成了国家十五重大医药课题“一类新生物制药人溶菌酶抗耐药菌研究”。在研究人溶菌酶功能的同时，我们发现人溶菌酶的一些功能区的抗菌作用较完整的人溶菌酶更强，具有更好的开发前景。

近年来，研究发现溶菌酶除杀菌作用外，还发现有抗真菌、抗病毒、消炎等作用(申请号：200410021100.9)，针对这些新发现的作用，研究发现了溶菌酶的水解粘肽N-乙酰基胞壁酰β-1，4-糖苷键酶切作用以外的其它生物学活性。

对溶菌酶非酶活性功能的研究发现，加热灭活溶菌酶的酶活性后，或溶菌酶的部分片段同样具有杀菌作用，有些杀灭活性甚至超过完整溶菌酶的杀菌活性。如Ibrahim，HR研究表明溶菌酶C端的螺旋-环状-螺旋结构(HLH)具有非酶活性的杀菌作用。它可嵌入到细菌、真菌等的外膜和胞膜中，造成穿孔，由于细菌、真菌等的内部渗透压作用而裂解死亡。

发明内容

本公司研发中心在鉴定基因工程表达的人溶菌酶生物学活性时发现，基因工程表达的人溶菌酶在体外同样具有明显地杀灭真菌的活性，破坏真菌细胞壁。同时，进一步研究还发现，基于人溶菌酶C端的螺旋-环状-螺旋结构(HLH)之间序列的不同多肽和一些改构体均有良好的杀灭真菌的活性，特别是人溶菌酶C端的螺旋-环状-螺旋结构(HLH)中的部分氨基酸序列与人体内其他抗菌多肽构成的HLH复合体，抗菌效果明显提高，特别是在抗真菌方面，个别序列多肽的杀灭真菌的活性比人溶菌酶高100-1000倍以上，具有良好的开发前景。

本发明首先根据人溶菌酶C端的螺旋-环状-螺旋HLH结构，设计测定了不同氨基酸序列，然后，通过多肽合成仪合成了11个抗真菌肽氨基酸序列，它们是：

1)DNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNR

2)IKISGKWKAQKRFLKGIRAWVAWRNR

3)IKISGKWKAQKRFLKDPQGIRAWVAWRNR

4)RAWVAWRNRDPQGIRAWVAWRNR

5)RAWVAWRNRGIRAWVAWRNR

6)RAWVAWRNR

7)AWVAWRNR

8)WVAWRNR

9)VAWRNR

10)RAWVAWRN

11)IKISGKWKAQKRFLK

用微孔板法(见实施例1)，鉴定11个氨基酸序列的多肽对病原真菌的杀菌活性，不同的基因重组抗真菌肽杀菌活性结果如下：

         基因重组抗真菌肽         杀真菌的最低剂量

1)DNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNR       6.25mg/L

2)IKISGKWKAQKRFLKGIRAWVAWRNR          6.25mg/L

3)IKISGKWKAQKRFLKDPQGIRAWVAWRNR       3.125mg/L

4)RAWVAWRNRDPQGIRAWVAWRNR             3.125mg/L

5)RAWVAWRNRGIRAWVAWRNR                6.25mg/L

6)RAWVAWRNR                           50mg/L

7)AWVAWRNR                            50mg/L

8)WVAWRNR                             200mg/L

9)VAWRNR                              无作用

10)RAWVAWRN                           无作用

11)IKISGKWKAQKRFLK                    200mg/L

结果证明了基因重组抗真菌肽(1)-(5)具有良好的抗真菌活性和制药前景。

最后，确定了基因重组抗真菌肽的氨基酸序列(1)-(5)可以作为制备治疗病原真菌感染引起炎症的抗真菌药物是：

1)DNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNR；

2)IKISGKWKAQKRFLKGIRAWVAWRNR；

3)IKISGKWKAQKRFLKDPQGIRAWVAWRNR；

4)RAWVAWRNRDPQGIRAWVAWRNR；

或5)RAWVAWRNRGIRAWVAWRNR

用基因重组抗真菌肽通过微孔板法作为制备治疗病原真菌感染的药物进行杀真菌鉴定。然后，用基因重组抗真菌肽作为制备治疗真菌感染在皮肤黏膜表面感染引起上呼吸道感染、阴道感染、皮肤感染和口腔感染药物的应用；将具有杀真菌作用的基因重组抗真菌肽制成体内用注射针剂、口服片剂、雾化吸入喷雾剂和体外用药滴剂、膏剂或栓剂。

本发明病原真菌涉及的是指念珠菌、曲霉菌、隐球菌和皮肤癣菌，基因重组抗真菌肽对真菌敏感的有效抑菌浓度在0.1μg-100μg/ml之间。上呼吸道感染是由念珠菌感染引起的气管炎、支气管炎、肺炎、咽炎；皮肤感染是由念珠菌、曲霉菌和皮肤癣菌感染引起的湿疹、过敏性皮炎、牛皮癣或皮癣；口腔或阴道感染是由念珠菌感染引起的牙龈炎、鹅口疮、口腔溃疡或阴道炎；全身深部真菌感染是由念珠菌、曲霉菌、隐珠菌引起的。

本发明还涉及用基因重组抗真菌肽作为制备治疗上呼吸道感染、阴道感染和皮肤感染的药物是由1％基因重组抗真菌肽冻干粉和生理盐水配制成的注射针剂，静脉注射用药量为30,000u/ml/20g鼠，每日三次；作为制备治疗口腔炎症的药物是由0.1％基因重组抗真菌肽冻干粉、20mM磷酸盐PH7缓冲液80％、25％丙三醇和5/万吐温80配制成的喷雾剂，用药量为1500μl/20g鼠，每日六次；作为制备治疗体内真菌感染用药的口服片剂是由10％基因重组抗真菌肽冻干粉、50％药用淀粉、25％药用糊精、10mM磷酸盐PH7缓冲液和5％蔗糖配制而成；体内雾化吸入基因重组抗真菌肽的浓度为0.025～0.4mg/ml，吸入用药2～5天；作为制备治疗体外用药的滴剂是由0.5％基因重组抗真菌肽冻干粉、10mM磷酸盐PH7缓冲液80％、20％丙三醇、6％2-吡咯烷酮-5羧酸钠、0.9％水溶性氮酮和3/万吐温80配制而成：体外用药膏剂是由0.1％基因重组抗真菌肽冻干粉、20mM磷酸盐PH7缓冲液85％、20％丙三醇、1％卡波树脂和0.3％香精配制而成。

为了更好的理解本发明的实质，首先，我们通过微孔板法用基因重组抗真菌肽作为活性组分对病原真菌进行杀菌活性鉴定，其方法是：

用10mM PH7.2 PB缓冲液将不同真菌分别配成10³-10⁴CFU/ml浓度的菌液，100μl定量加到96孔培养板中，同时分别加入100μl的200μg～0.1μg不同剂量的基因重组抗真菌肽，37℃作用30分钟，补加200μl沙保弱培养基，37℃培养过夜，观察结果。计算可杀死病原真菌的最低有效浓度。

一、基因重组抗真菌肽作为制备治疗上呼吸道感染、阴道感染、口腔感染和皮肤感染药物的应用。

下面将分述由白色念球菌感染引起的上呼吸道感染、阴道感染、口腔感染；由皮肤癣菌感染引起的温疹、过敏性皮炎、皮癣药物的配制、用药及治疗效果：

(一)药物配制

A、将培养基高压灭菌后，接种基因重组抗真菌肽菌株、摇床转数为每分钟250转，培养温度为30℃，在恒温床上培养36小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。并将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩进行冻干，测得蛋白活性后保存。取基囚重组抗真菌肽冻干粉1％，用生理盐水制成注射针剂，主要用于对念珠菌引起的病症。

B、将培养液进行纯化制成含基因重组抗真菌肽冻干粉0.1％、磷酸盐缓冲液20mM(PH＝7.0)80％、25％丙三醇、5/万吐温80的喷雾剂。

C、将培养液进行纯化制成含基因重组抗真菌肽冻干粉0.5％、磷酸盐缓冲液10mM(PH＝7.0)80％、20％丙三醇、6％2-比咯烷酮-5-羧酸钠、0.9％水溶性氮酮、3/万吐温80的滴剂。

D、将培养液进行纯化制成含基因重组抗真菌肽冻干粉0.1％、磷酸盐缓冲液20mM(PH＝7.0)85％、20％丙三醇、卡波树脂1％、香精0.3％的膏剂。

E、将培养液进行纯化制成胶囊剂、片剂、其含基因重组抗真菌肽冻干粉10％、药用淀粉50％、药用糊精25％、磷酸盐缓冲液10mM(PH＝7.0)、蔗糖5％。

(二)对小鼠的模型试验

A、白色念珠菌呼吸道感染所致小鼠口腔炎、气管炎、肺炎模型的制备：

选用健康昆明种小鼠20只，雌雄各半，体重为18-22克，分两组，每组10只，选取一定量的白色念珠菌用喷雾方式感染小鼠上呼吸道致小鼠气管炎10只、肺炎10只，感染后即刻静脉注射受试药30000u/ml/20g鼠重，观察一周，每日三次给药，记录小鼠有效率。实验结果表明基因重组抗真菌肽对白色念珠菌呼吸道感染所致小鼠气管炎、肺炎有明显疗效。结果如下表：

病种	受试动物(只)	痊愈	显效	无效	有效率％
						气管炎	10	7	3	0	100
肺炎	10	7	3	0	100
						口腔炎	10	8	2	0	100

B、白色念珠菌所致小鼠阴道炎模型的制备：

选用健康昆明种小鼠10只，雌雄各半，体重为18-22克，挑取一定量的白色念珠菌用涂抹方式感染小鼠阴道致小鼠阴道炎10只，感染后即静脉注射受试药30000u/ml/20g鼠重，观察一周，每日三次给药，记录小鼠有效率。实验结果表明基因重组抗真菌肽对白色念珠菌感染所致小鼠阴道炎有明显疗效。结果如下表：

病种	受试动物(只)	痊愈	显效	无效	有效率％
						阴道炎	10	7	3	0	100

C、对由皮肤癣菌引起的湿疹、过敏性皮炎、皮癣等皮肤性感染疗效如下表

病种	受试动物(只)	痊愈	显效	无效	有效率％
						湿疹	10	6	3	1	90
过敏性皮炎	10	4	4	2	80
						牛皮癣	10	4	4	2	80

皮癣

10

6

2

2

80

二、基因重组抗真菌肽作为制备治疗体内真菌感染引起深部真菌感染药物的应用。

采用小鼠腹腔感染败血症观察基因重组抗真菌肽对小鼠体内感染的治疗作用。

试验菌株：白色念球菌、曲霉菌用于小鼠败血症感染试验。方法是挑取一定量的菌苔接种于2ml沙保弱液体培养基中，在35℃培养18小时候后，取出用灭菌生理盐水进行适当稀释(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4)，每组5只鼠，分别腹腔感染不同菌量的受试菌液，测定引起小鼠100％死亡的最小菌量(MLD)，用该菌量作为体内感染菌量。

基因重组抗真菌肽药剂静脉注射对真菌感染小鼠败血症的治疗试验，把受试小鼠按体重性别均匀分组，每组10只鼠，然后取出经35℃培养18小时的上述6种菌种的菌液，用无菌生理盐水稀释至1MLD，分别注入小鼠腹腔体内，每鼠0.5ml，制备小鼠败血症模型，再将各受试药物以1∶0.5剂间距设5-6个剂量组，分别于感染后即刻静脉注射不同浓度的受试药液，0.5ml/20g鼠重，同时设感染对照组(不给药)，观察并记录小鼠死亡数，连续观察7-14天，按Bliss法计算半数有效剂量ED₅₀及可信限。

杀菌试验结果表明：静脉注射给药对细菌感染具有一定的体内疗效，其半数有效剂量ED₅₀分别是：白色念球菌4.1mg/kg，曲霉菌为15mg/kg。(附表1-2)

三、基因重组抗真菌肽对真菌132株体外抗菌活性。

本试验中采用的临床分离菌种有念珠菌属84株、隐球菌属7株、毛霉菌属21株、曲霉菌属9株、申克孢子丝菌属4株、皮炎芽生菌2株、毛发癣菌属5株，总共132株菌。

试验方法：将受试药物用灭菌蒸馏水溶解，适当稀释。分别取1ml药液加9ml融化的琼脂糖固体培养基混匀，倍比稀释，制备系列含药平皿。每皿所含药物终浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03-0.001mg/ml；用多点接种仪将稀释至10⁴CFU/ml的试验菌液接种于各含药平皿表面，置35℃培养8-10小时，取出，再分别吸取6ml融化的M-H培养基(50℃)覆盖上述系列平皿表面，再置于35℃培养10小时取出，观察结果，以无细菌生长平皿内所含最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度(MIC)。分别以累积抑制50％、90％所试菌株的MIC值计为MIC₅₀、MIC₉₀。所试菌株的MIC值最小值至其最大值计为MIC_Range(范围)。

试验结果表明：基因重组抗真菌肽对所试真菌均具有抗菌作用。本发明对上述132株菌的试验结果数据见附表4。

以上所有应用结果表明：利用本公司生物基因工程技术开发出的基因重组抗真菌肽，具有杀真菌作用，可以作为制备治疗真菌在体内深部和浅部感染的药物。这就为生物工程制约提供了新的研制方向，也为临床治愈真菌感染提供新的制剂和福音。

具体实施方式

                              实施例1

本实施例为用基因重组抗真菌肽微孔板法对真菌进行杀菌活性鉴定方法。

用10mM PH7.2 PB缓冲液将不同真菌分别配成10³-10⁴CFU/ml浓度的菌液，100μl定量加到96孔培养板中，同时分别加入100μl的200μg-0.1μg不同剂量的基因重组抗真菌肽，37℃作用30分钟，补加200μl沙保弱培养基，37℃培养过夜，观察结果。计算可杀死病原真菌的最低有效浓度。

                              实施例2

本实施例是用基因重组抗真菌肽经雾化吸入对小鼠真菌性呼吸道感染治疗作用。

模型制备：

试验前将小鼠放入密封玻璃缸内，玻璃缸连接至超声雾化器(型号：402，上海合力医疗器械厂生产)，内装30ml试验菌液，菌液浓度为10⁷CFU/ml，开动超声雾化器，给小鼠雾化吸入20分钟，间隔10分钟，再雾化需吸入20分钟，连续雾吸入3次。末次雾化吸入后6小时，分别用无菌棉签挑取咽部黏膜涂于无药粘脂平皿表板，35℃培养24小时，观察有无真菌生长，进计活菌计数。真菌培养阳性，且活菌数≥10³CFU/ml，表明感染模型成功。提示该感染模型可用于治疗试验。

基因重组抗真菌肽雾化吸入对小鼠真菌性呼吸道治疗试验。

取呼吸道感染真菌成功的小鼠，随机分组，每组10只鼠，装入盛有适当浓度的受试药液(连接了超声雾化器)的玻璃缸内进行雾化吸入治疗，每次吻合吸入20分钟，间隔10分钟，共雾化吸入3次，于雾化吸入药液后第一天、第二天、第三天、第四天、第五天分别用灭菌棉签桃取咽喉部黏膜涂于无药琼脂平皿表板。35℃培养24小时，进行活菌计数。实验设真菌性呼吸道感染对照组(不给药)。将给药组小鼠咽部活菌数与感染对照组小鼠咽部活菌数进计Student t检验，以评价受试药物经雾化吸入对小鼠真菌性呼吸道感染的治疗作用。(附表3)

                              实施例3

本实施例是基因重组抗真菌肽冻干粉的制备方法。

将培养基高压灭菌后，接种基因重组抗真菌肽菌株，摇床转数为每分钟250转，培养温度为30℃，在恒温摇床上培养36-40小时，进行种子罐培养，最后进行生产罐培养，并将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行冻干，测得蛋白活性后保存。

                              实施例4

用基因重组抗真菌肽作为制备治疗上呼吸道、阴道和皮肤感染炎症的药物针剂是用1％基因重组抗真菌肽的氨基酸序列(1)的冻干粉与生理盐水配制成的注射剂。静脉注射时用药量为30000μ/ml/20g鼠，每日三次。该注射剂也可以选用1％基因重组抗真菌肽的氨基酸序列(2)、(3)、(4)或(5)来配制。

                              实施例5

用基因重组抗真菌肽作为制备治疗口腔炎症的药物喷雾剂是用0.1％基因重组抗真菌肽的氨基酸序列(2)的冻干粉、20mM磷酸盐PH7缓冲液80％、25％丙三醇和5/万吐温80配制成的喷雾剂。用药量为1500μl/20g鼠，每日六次。

该喷雾剂也可以选用(1)、(3)、(4)或(5)氨基酸序列的基因重组抗真菌肽来配制。

                              实施例6

用基因重组抗真菌肽作为制备治疗体内真菌感染的药物口服片剂是用10％基因重组抗真菌肽的氨基酸序列(3)的冻干粉、50％药用淀粉、25％药用糊精、10mM磷酸盐PH7缓冲液和5％蔗糖配制而成。

该喷雾剂也可以选用(1)、(2)、(4)或(5)氨基酸序列的基因重组抗真菌肽来配制。

                              实施例7

用基因重组抗真菌肽作为制备治疗体外真菌感染的药物滴剂是用0.5％基因重组抗真菌肽的氨基酸序列(4)的冻干粉、10mM磷酸盐PH7缓冲液80％、25％丙三醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、0.9％水溶性氮酮和3/万吐温80配制而成。

该滴剂也可以选用(1)、(2)、(3)或(5)氨基酸序列的基因重组抗真菌肽来配制。

                              实施例8

用基因重组抗真菌肽作为制备治疗体外真菌感染的药物膏剂是用0.1％基因重组抗真菌肽的氨基酸序列(5)的冻干粉、20mM磷酸盐PH7缓冲液85％、20％丙三醇、1％卡波树脂和0.3香精配制而成。

该膏剂也可以选用(1)、(2)、(3)或(4)氨基酸序列的基因重组抗真菌肽来配制。

                              实施例9

本实施例是用基因重组抗真菌肽对细菌感染体内注射药剂的治疗试验。

把受试小鼠按体重、性别均匀分组每组10只鼠，然后取出经35℃培养24小时的个同真菌的菌液，用无菌生理盐水稀释至1MLD，分别注入小鼠腹腔体内，每鼠0.5ml，制备小鼠败血症模型，再将各受试药物以1∶0.5剂间距设5-6个剂量组，分别于感染后即刻静脉注射不同浓度的受试药液，0.5ml/20g鼠重，同时设感染对照组(不给药)，观察并记录小鼠死亡数，连续观察7-14天，按Bliss法计算半数有效剂量ED₅₀及95％可信限。(见表1、2)

         表1基因重组抗真菌肽对白色念珠菌感染所致小鼠败血症的体内疗效试验结果

感染真菌菌量                           剂量    浓度    动物数    死亡数    死亡率

                 受试药物  给药途径

  (CFU/ML)                           (mg/kg)  (mg/ml)   (只)      (只)      (％)

 白色念珠菌                  i.v        40      1.6      10        1         10

                 抗真菌肽

 1.9×10⁵                              20      0.8      10        1         10

                                        10      0.4      10        3         30

                                        5       0.2      10        6         60

感染对照组(1MLD)             ip^*       —             —            10        10        100

感染对照组(1/10MLD)          ip         —              —            10        8         80

^*ip：腹腔感染真菌。

         表2抗真菌肽对黄曲霉菌感染所致小鼠败血症的体内疗效试验结果

感染真菌菌量                            剂量    浓度    动物数    死亡数    死亡率

                 受试药物  给药途径

  (CFU/ML)                            (mg/kg)  (mg/ml)   (只)      (只)      (％)

                                         25      1.00     10         4        40

                                         12.5    0.50     10         6        60

  黄曲霉菌       抗真菌肽    i.v         6.25    0.25     10         5        50

  2×10⁵                                3.12    0.13     10         8        80

                                         1.56    0.06     10         7        70

                 感染对照组              —                              10         10       100

         表3基因重组抗真菌肽雾化吸入对小鼠呼吸道感染白色念珠菌的疗效试验结果

                                给药量                             给药后菌落计数(CFU)

 真菌感染

                    给药浓度    (ul)×给

   菌量     药物

                    (mg/ml)     药次数        第1天         第2天             第3天            第4天         第5天

 (cfu/ml)

                                (次/日)

白色念珠菌            0.2       100×4    242.80±22.88  222.10±18.46    150.80±16.08    100.20±13.97  70.70±11.60

2×10⁴               0.1       100×4    243.20±25.42  221.30±18.12    157.70±17.62    100.70±15.59  72.30±17.86

          抗真菌肽    0.05      100×4    242.90±15.91  228.80±18.70    159.50±26.28    103.80±17.64  74.80±14.28

                      0.025     100×4    245.40±14.31  217.20±17.02    161.90±11.14    105.50±12.41  78.20±20.90

                      0.0125    100×4    246.50±46.60  220.50±12.99    167.80±20.67    105.90±14.69  80.50±15.71

          菌对照      —                 —               246.60±21.60  240.302±9.12    179.30±17.63    115.10±19.34  86.70±12.88

                表4基因重组抗真菌肽对132株病原真菌体外作用比较

                                             MIC(μg/ml)

   真菌名称

                    50-100    25-50    12.5-50    6.25-12.5    3.125-6.25    ＜3.125

白色念珠菌37株                                        5            15           17

热带念珠菌26株                                        1            6            19

克柔氏念珠菌11株                                                   5            6

光滑念珠菌10株                                        1            4            5

隐珠菌7株                                  1          3            2            1

毛霉菌21株                      1                     2            8            10

曲霉菌9株                                             2            5            2

申克孢子丝菌4株       1                               1            2

皮炎牙生菌2株                   1                     1

毛发癣菌属5株         1                    2          2

Claims (9)

1、一种抗真菌药物作为制备治疗病原真菌感染引起炎症的应用，其特征在于本抗真菌药物是具有下列不同氨基酸序列的基因重组抗真菌肽：

1)DNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNR；

2)IKISGKWKAQKRFLKGIRAWVAWRNR；

3)IKISGKWKAQKRFLKDPQGIRAWVAWRNR；

4)RAWVAWRNRDPQGIRAWVAWRNR；

或5)RAWVAWRNRGIRAWVAWRNR

作为制备治疗真菌在皮肤粘膜表面感染引起上呼吸道、阴道、皮肤和口腔炎症药物的应用；用具有杀真菌的基因重组抗真菌肽制备治疗真菌感染引起体内炎症药物注射针剂、口服片剂或雾化吸入喷雾剂和体外炎症药物滴剂、膏剂或栓剂的应用。

2、按照权利要求1所述基因重组抗真菌肽作为制备治疗病原真菌感染药物的应用，其特征在于病原真菌中所指的真菌是念珠菌、曲霉菌、隐球菌和皮肤癣菌，基因重组抗真菌肽对真菌敏感的有效抑菌浓度在0.1μg-100μg/ml之间。

3、按照权利要求1所述基因重组抗真菌肽作为制备治疗病原真菌感染药物的应用，其特征在于上呼吸道、口腔和阴道粘膜表面感染的炎症是指由念珠菌感染引起的气管炎、支气管炎、肺炎、咽炎、牙龈炎、鹅口疮或口腔溃疡和阴道炎。

4、按照权利要求1所述基因重组抗真菌肽作为制备治疗病原真菌感染药物的应用，其特征在于皮肤感染是指由念珠菌、曲霉菌和皮肤癣菌的感染引起的湿疹、过敏性皮炎、牛皮癣或皮癣。

5、按照权利要求1所述基因重组抗真菌肽作为制备治疗病原真菌感染药物的应用，其特征在于治疗上呼吸道炎症、阴道炎症和皮肤炎症的药物是由1％基因重组抗真菌肽冻干粉和生理盐水配制成的注射针剂，静脉注射用药量30,000u/ml/20g鼠重，每日三次，上呼吸道和阴道炎症的有效治愈率100％，皮肤炎症的有效治愈率80-100％。

6、按照权利要求1所述基因重组抗真菌肽作为制备治疗病原真菌感染药物的应用，其特征在于治疗口腔炎症的药物是由0.1％基因重组抗真菌肽冻干粉、20mM磷酸盐PH7缓冲液80％、25％丙三醇和5/万吐温80配制成的喷雾剂，用药量1500μL/20g鼠重，每日六次，有效治愈率100％。

7、按照权利要求1所述基因重组抗真菌肽作为制备治疗病原真菌感染药物的应用，其特征在于体内用药口服片剂是由10％基因重组抗真菌肽冻干粉、50％药用淀粉、25％药用糊精、10mM磷酸盐PH7缓冲液和5％蔗糖配制成的片剂；体内雾化吸入喷雾剂的基因重组抗真菌肽的浓度为0.025-0.4mg/ml，吸入用药2-5天。

8、按照权利要求1所述基因重组抗真菌肽作为制备治疗病原真菌感染药物的应用，其特征在于体外用药滴剂是由0.5％基因重组抗真菌肽冻干粉、10mM磷酸盐PH7缓冲液、20％丙三醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、0.9％水溶性氮酮和3/万吐温80配制而成；膏剂是由0.1％基因重组抗真菌肽冻干粉、20mM磷酸盐PH7缓冲液85％、20％丙三醇、1％卡波树脂和0.3％香精配制而成。

9、按照权要求1所述基因重组抗真菌肽作为制备治疗病原真菌感染药物的应用，其特征在于体外用药的滴剂是由0.5％基因重组抗真菌肽冻干粉、10mM磷酸盐PH7缓冲液80％、20％丙三醇、6％ 2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、0.9％水溶性氮酮、3/万吐温80配制而成。