CN1546170A - 重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂对抗耐药菌在制药中的新用途 - Google Patents

重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂对抗耐药菌在制药中的新用途 Download PDF

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华 张
张华�
安米
安献禄
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Abstract

本发明涉及制药领域中重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂在对病毒、细菌、耐药菌的新用途。可作为制备治疗由病毒、细菌、耐药菌引起的上呼吸道如肺炎、气管炎等疾病的药中的应用。做成雾化溶液和吸入剂用超声波或雾化机以雾化的形式直接吸入肺部给药。具有安全无毒副作用，制备工艺简单，使用方便，有很好的药用前景。

Description

重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂对抗耐药菌 在制药中的新用途
技术领域：
本发明涉及一种重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂的新用途，特别是涉及制药领域中重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂在对病毒、细菌、耐药菌在制药中的新用途。
背景技术：
抗生素创造了许多医学奇迹，使许多疾病消失无踪，如肺炎、脑膜炎、产褥热、败血症、结核等。21世纪的今天，耐药菌的发展令人触目惊心。如耐青霉素的肺炎链球菌，过去对青霉素、红霉素、磺胺等药品都很敏感，现在几乎“刀枪不入”。肺炎克雷伯氏菌对西力欣、复达欣等16种高档抗生素的耐药性高达51.85％-100％。而耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)除万古霉素外已经无药可治。从细菌的耐药发展史可以看出，在某种新的抗生素出现以后，就有一批耐药菌株出现。开发一种新的抗生素一般需要10年左右的时间，而一代耐药菌的产生只要2年的时间，抗生素的研制速度远远赶不上耐药菌的发展速度。目前急需开发一种针对不同耐药菌株均有效的“超级抗生素”用于临床治疗。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂对抗耐药菌在制药中的新用途。
实际上，本发明涉及重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂作为制备治疗由病毒、细菌、耐药菌引起的肺炎或预防肺炎的药中的应用。
涉及发明涉及重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂作为制备治疗由病毒、细菌、耐药菌引起的或预防气管炎的药中的应用。
涉及发明涉及重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂作为制备治疗由病毒、细菌、耐药菌引起的或预防咽喉炎疾病的药中的应用。
涉及重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂作为制备治疗由病毒、细菌、耐药菌引起的或预防鼻窦炎的药中的应用
涉及重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂作为制备治疗由RNA、DNA病毒或非典型肺炎SAES、细菌、耐药菌引起的气管炎、肺炎及肺脓肿在药中的应用。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行冻干，测蛋白测活性保存。将合格的基因重组人溶菌酶冻干粉溶于水中制得雾化溶液、吸入剂1500U～30000U/ml备用。
一对小鼠的模型试验：
A、耐药肺炎球菌上呼吸道感染所致小鼠肺炎模型的制备：
选用健康昆明种小鼠10只，雌雄各半，体重为18-22克，挑取一定量的耐药肺炎球菌用喷雾方式感染小鼠上呼吸道，致小鼠肺炎10只，感染后即雾化溶液及吸入剂对受试药30000U/ml/20g鼠重，观察一周，每日三次给药，记录小鼠有效率。实验结果表明重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂对耐药肺炎球菌上呼吸道感染所致小鼠肺炎有明显疗效。结果如下表：
  病种 受试动物(只)   痊愈   显效   无效   有效率％
  肺炎     10     6     4     0     100
B、耐药金葡球菌上呼吸道感染所致小鼠气管炎、支气管炎模型的制备：
选用健康昆明种小鼠20只，雌雄各半，体重为18-22克，分两组，每组10只，选取一定量的耐药金葡球菌用喷雾方式感染小鼠上呼吸道致小鼠气管炎10只、支气管炎10只，感染后即雾化溶液及吸入剂对受试药30000U/ml/20g鼠重，观察一周，每日三次给药，记录小鼠有效率。实验结果表明重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂对耐药金葡球菌上呼吸道感染所致小鼠气管炎、支气管炎有明显疗效。结果如下表：
   病种  受试动物(只) 痊愈  显效 无效  有效率％
  气管炎     10   7    3   0     100
 支气管炎     10   7    3   0     100
C、耐药化脓性链球菌上呼吸道感染所致小鼠急慢性化脓性咽喉炎模型的制备：
选用健康昆明种小鼠10只，雌雄各半，体重为18-22克，挑取一定量的耐药化脓性链球菌用喷雾方式感染小鼠上呼吸道感染所致小鼠急慢性咽喉炎10只，感染后即雾化溶液及吸入剂对受试药30000U/ml/20g鼠重，观察一周，每日三次给药，记录小鼠有效率。实验结果表明重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂对耐药化脓性链球菌上呼吸道感染所致小鼠急慢性化脓性咽喉炎有明显疗效。结果如下表：
  病种  受试动物(只)   痊愈   显效   无效   有效率％
急慢性化脓性咽喉炎 10     8     2     0     100
D、耐药化脓性链球菌上呼吸道感染所致小鼠扁条体炎模型的制备：
选用健康昆明种小鼠10只，雌雄各半，体重为18-22克，挑取一定量的化脓性链球菌用喷雾方式感染小鼠上呼吸道致扁条体炎小鼠10只，感染后即雾化溶液及吸入剂对受试药30000u/ml/20g鼠重，观察一周，每日三次给药，记录小鼠有效率。实验结果表明重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂对化脓性链球菌感染所致扁条体炎有明显疗效。结果如下表：
   病种 受试动物(只)   痊愈   显效   无效   有效率％
 扁桃体炎     10     8     2     0     100
E、厌氧性球菌上呼吸道感染所致小鼠口腔炎模型的制备：
选用健康昆明种小鼠10只，雌雄各半，体重为18-22克，挑取一定量的厌氧性球菌用喷雾方式感染小鼠上呼吸道致小鼠口腔炎10只，感染后即口腔雾化溶液及吸入剂对受试药1500 1/20g鼠重，观察一周，每日六次给药，记录小鼠有效率。实验结果表明重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂对厌氧性球菌上呼吸道感染所致小鼠口腔炎有明显疗效。结果如下表：
   病种  受试动物(只)   痊愈   显效   无效   有效率％
  口腔炎       10    8     2     0     100
F重组人溶菌酶药物体外预防、抑制冠状病毒的试验：
(一)、试验目的
检测重组人溶菌酶药物体外预防、抑制冠状病毒的效果，为加快药物的筛选进度，提供试验依据。
(二)、试验材料
1.验证药物：重组人溶菌酶  蛋白含量：4.3845mg  由长春奇龙
  生物技术研究所提供
2.阳性对照药物：注射用更昔洛韦批号：020802  由湖北科
  益药业股份有限公司提供。
3.细胞：人宫颈癌传代细胞(HELA)由本室提供。
4.病毒：冠状病毒04号分离株(SARS病人血清04号标本)由
  佑安医院提供。
5.CO2培养箱NUAIR US AUTO FLOW提供
6.(XSZ-D2)由重庆光学仪器厂生产
7.其它试剂、器材等均由本室提供。
(三)、试验方法
预备试验：
1.重组人溶菌酶对HELA细胞的毒性测定
HELA细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO2培养2小时，加入验证药物，重组人溶菌酶倍比稀释为6000ug/ml～11.7ug/ml，阳性对照药物更昔洛韦稀释为6000ug/ml～11.7ug/ml，每浓度接种3孔，每孔100μl，同时设正常细胞对照，37℃ 5％CO2孵箱培养6天，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化(CPE)，以25％以下形态变化为“+”，26％～50％形态变化为“++”，51％75％形态变化为“+++”，76％～100％形态变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算药物半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)。
2.在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的毒力的测定冠状病毒04号的分离(SARS病人血清分离)：
HELA细胞以每毫升40万浓度接种试管，37℃ 5％CO2培养24小时，弃掉培养液，每管加入SARS病人血清0.2ml，33℃转鼓培养5小时后，加入维持液1ml，同时设正常细胞对照，33℃转鼓培养5～7天。细胞出现CPE变化后，采用PCR的方法检测冠状病毒，04号标本PCR阳性，确定为冠状病毒分离株。用终末稀释法纯化病毒2次，PCR检测冠状病毒仍为阳性，经免疫荧光测定双份SARS病人血清，IgM阳性，IgG4倍升高，确定为冠状病毒。采用病毒CPE法测定其效价。
病毒CPE法：
HELA细胞以每毫升40万浓度接种96孔培养板，37℃ 5％CO2培养24小时，加入病毒液，病毒稀释10-1～10-5，5个浓度，每浓度3孔，每孔100μl，设正常细胞对照，37℃ 5％CO2培养5～7天，每24小时在倒置显微镜下观察记录细胞形态变化(CPE)：以25％以下变化为“+”，26％～50％变化为“++”，51％～75％为“+++”，76％～100％变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算病毒半数感染浓度TCID50。
正式试验
重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用
试验目的：
观察不同浓度的重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用，试验采用病毒细胞(CPE)法，计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数TI，判断药效。
HELA细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃5％CO2孵箱培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，加入100 TCID50的冠状病毒液，置37℃5％CO2吸附2小时后，弃掉病毒液，加入不同浓度的重组人溶菌酶药液，药物选用对细胞的最大无毒浓度(TD0)2倍稀释10个浓度即750μg/ml～1.46μg/ml，阳性对照药物更昔洛韦为2倍稀释10个浓度即6000μg/ml～1.46μg/ml，将稀释的药物分别加入细胞孔内，每浓度3孔，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO2培养箱培养5～7天，逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE，以病毒对照出现+++-++++时结束试验，用Reed-Muench法，计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)判断药效，试验重复三次。
重组人溶菌酶对冠状病毒04号的预防作用
试验目的：
观察不同浓度的重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的预防作用，试验采用病毒细胞(CPE)法，计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数TI，判断药效。
HELA细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃5％CO2孵箱培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，加入不同浓度的重组人溶菌酶药液，药物选用对细胞的最大无毒浓度(TD0)2倍稀释10个浓度即750μg/ml～1.46μg/ml，阳性对照药物更昔洛韦为2倍稀释13个浓度即6000μg/ml～1.46μg/ml，将稀释的药物分别加入细胞孔内，每浓度3孔，置37℃5％CO2吸附2.5小时后，加入100 TCID50的冠状病毒液，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO2培养箱培养5～7天，逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE，以病毒对照出现+++-++++时结束试验，用Reed-Muench法计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)判断药效，试验重复三次。
四、试验结果
预备试验结果：
重组人溶菌酶对HELA细胞的毒性作用：
由长春奇龙生物技术研究所提供的重组人溶菌酶和阳性对照药物注射用更昔洛韦在HELA细胞培养内，采用细胞形态变化(CPE)法。计算药物最大无毒浓度(TD0)和半数中毒浓度(TD50)，以下试验结果为三次试验结果的均值。
1.重组人溶菌酶对HELA细胞的毒性试验结果
验证药物：
重组人溶菌酶：最大无毒浓度(TD0)为750±0μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为1500±0μg/ml
阳性对照药物：
注射用更昔洛韦：最大无毒浓度(TD0)为＞6000±0μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为＞6000±0μg/ml。
2.在HELA细胞培养内对冠状病毒04号毒力测定结果(TCID50)冠状病毒04号：半数感染量(TCID50)为10-3(如图)
正式试验结果(如图)
重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用(以下试验数据为三次试验结果的均值)
验证药物：
重组人溶菌酶：CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为23.4±0μg/ml，最小有效浓度(MIC)为46.8±0μg/ml，治疗指数(TI)为16。
阳性对照药物：
注射用更昔洛韦：CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为11.7μg/ml±0，最小有效浓度(MIC)为23.44μg/ml±0，治疗指数(TI)为256。
重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的预防作用(以下试验数据为三次试验结果的均值)
验证药物：
重组人溶菌酶：CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为5.9±0μg/ml，最小有效浓度(MIC)为11.7±0μg/ml，治疗指数(TI)为64。
阳性对照药物：
注射用更昔洛韦：CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为11.7μg/ml±0，最小有效浓度(MIC)为23.44μg/ml±0，治疗指数(TI)为256。
结论：
以上试验由长春奇龙生物技术研究所提供的重组人溶菌酶药物在HELA细胞培养内，采用病毒CPE法，结果表明重组人溶菌酶药物有预防和抑制冠状病毒的作用，预防冠状病毒的效果优于抑制试验
结果。
以上结果，可以得出本发明的优点在于：
本发明对重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，其安全无毒副作用，有很好的药用前景；制备工艺简单，使用更方便。
二用法与用量：
雾化溶液和吸入剂用超声波或雾化机雾化直接吸入肺部给药作用于病灶部位给药，每日1～6次，每次1500u～30000u，成人与小儿相同。
附图说明：
图1为人宫颈癌传代细胞(显微放大10×，光学放大3.5×)；
图2为冠状病毒04号(显微放大10×，光学放大3.5×)；
图3为重组人溶菌酶对冠状病毒最小有效浓度(显微放大10×，光学放大3.5×)；
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步的描述：
实施例1：
将培养基高压灭菌后，接种人溶菌酶菌株、摇床转数为每分钟250转，培养温度为20℃，在恒温床上培养36小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。并将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行冻干，测得蛋白活性后保存。取重组人溶菌酶冻干粉1％，制成1500u～30000/ml雾化溶液用超声波或雾化机以雾化的形式直接吸入肺部给药，主要用于对病毒、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的抗耐药性的上、下呼吸道病症。如咽炎、气管炎、肺炎等疾病。
实施例2：
将培养基高压灭菌后，接种人溶菌酶菌株、在恒温床上培养40小时后，再将培养液进行纯化制成含人溶菌酶冻干粉配制成15000U/ml、磷酸盐缓冲液20mM(pH7.0)80％、10％丙三醇、0.01％吐温80的吸入剂用超声波或雾化机雾化直接吸入肺部给药治疗作用于病灶部位给药。

Claims (6)

1、重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂作为制备治疗由病毒、细菌及耐药菌引起的肺炎或预防肺炎及肺脓肿在药中的应用。
2、重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂作为制备治疗由病毒、细菌及耐药菌引起的或预防气管炎在药中的应用。
3、重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂作为制备治疗由病毒、细菌及耐药菌引起的或预防咽喉炎疾病在药中的应用。
4、重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂作为制备治疗由病毒、细菌及耐药菌引起的或预防鼻窦炎在药中的应用
5、重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂作为制备治疗由病毒(RNA、DNA病毒)或非典型肺炎(SAES)引起的气管炎、肺炎及肺脓肿在药中的应用。
6、重组人溶菌酶雾化溶液和吸入剂用超声波或雾化机雾化直接吸入肺部给药治疗作用于病灶部位给药，每日1～6次，每次1500u～30000u，成人与小儿相同。
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