CN1593653A - 人溶菌酶膜剂、制法及其应用 - Google Patents

人溶菌酶膜剂、制法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN1593653A
CN1593653A CN 200410020817 CN200410020817A CN1593653A CN 1593653 A CN1593653 A CN 1593653A CN 200410020817 CN200410020817 CN 200410020817 CN 200410020817 A CN200410020817 A CN 200410020817A CN 1593653 A CN1593653 A CN 1593653A
Authority
CN
China
Prior art keywords
human lysozyme
membrane
lysozyme
medicine
portugal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 200410020817
Other languages
English (en)
Inventor
安米
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN 200410020817 priority Critical patent/CN1593653A/zh
Publication of CN1593653A publication Critical patent/CN1593653A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及生物制药，特别是人溶菌酶针对细菌、霉菌、病毒的药物、制法及其应用。人溶菌酶膜剂，含有活性300U～300万U/ml人溶菌酶基因重组人溶菌酶来源丰富，制备工艺简单，安全无毒副作用，有很好的药用前景，人溶菌酶膜剂适合口腔溃疡直接贴膜给药，药物含量准确，稳定性好，重量轻，体积小，应用方便，可以适合多种给药途径应用。

Description

人溶菌酶膜剂、制法及其应用
技术领域：
本发明本发明涉及生物制药，特别是人溶菌酶针对细菌、霉菌、病毒的药物、制法及其应用。
背景技术：
口腔溃疡是由细菌、霉菌或免疫缺陷引起的，由于口腔环境的原因，口腔溃疡疾病很难治愈。重组人溶菌酶它是一种有效的抗菌剂，全称为：1，4-β-N-溶菌酶或者称：粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能切断细菌细胞壁的肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键的联结，破坏肽聚糖支架，细菌在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。重组人溶菌酶除可以直接裂解细菌外，还有抗病毒、抗肿瘤、抗炎和免疫调节作用。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种人溶菌酶膜剂，有效针对细菌、霉菌、病毒，使用直接方便，效果好。另外还提供其制法和应用。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：人溶菌酶膜剂，含有活性300U～300万U/ml人溶菌酶。
由纯度95％的基因重组人溶菌酶制得300U～300万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、万分之五吐温80，维生素B215g，羧甲基纤维素(CMC)3g，PVC(17～88)15g制成膜剂。
所述人溶菌酶包括基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶、基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
所述人溶菌酶膜剂的制备工艺流程为：成膜材料浆液配制→加入配方药物→着色剂等→脱泡→涂膜→干燥→脱膜→含量测定→成品包装。具体制法如下：
第一步、基因重组人溶菌酶的制法：基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行冻干，测蛋白测活性保存。
第二步、膜剂的制法：将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得300U～300万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、万分之五吐温80，维生素B2 15g，羧甲基纤维素(CMC)3g，PVC(17～88)15g，将精制的PVC、CMC溶解于水中浸润，膨胀，并于水浴上加热至80℃，待全溶后，加入处方中各药，温度降至50℃按批量加入基因重组人溶菌酶，搅拌均匀，用100目尼龙筛过滤，消除气泡，降至室温。将配制好的含药液的成膜材料溶液加在涂膜机料斗中，通过可以调节流量的流液嘴，将药液以一定的宽度和厚度恒定的流量涂于不锈钢循环带上，经热风干燥，迅速成膜。根据规格经含量测定合格后，包装成品(此膜剂型要在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)。
本发明人溶菌酶膜剂在制备治疗由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、霉菌或免疫缺陷引起口腔溃疡的药物中的应用。
涉及人溶菌酶膜剂在制备治疗由链球菌引起的口腔溃疡疾病的药物中的应用。
涉及人溶菌酶膜剂在制备治疗由病原性念珠菌引起的口腔溃疡疾病的药物中的应用。
涉及人溶菌酶膜剂在制备治疗由免疫缺陷引起的口腔溃疡疾病的药物中的应用。
基因重组人溶菌酶来源丰富，制备工艺简单，安全无毒副作用，有很好的药用前景，人溶菌酶膜剂适合口腔溃疡直接贴膜给药，药物含量准确，稳定性好，重量轻，体积小，应用方便，可以适合多种给药途径应用。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用基因重组人溶菌酶的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高玉灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行冻干，测蛋白测活性保存。在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得300U～300万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、万分之五吐温80，维生素B2 15g，羧甲基纤维素(CMC)3g，PVC(17～88)15g制成膜剂。
一、动物模型试验：
A、人溶菌酶对大鼠的镇痛作用(大鼠甩尾法)
120-150克的SD健康大鼠，雌雄各半，动物自由饮水，试验室温度控制在22-28℃左右，动物喂饲大鼠标准饲料。选用在TF-光热测痛仪(光源为12V，50W)热照射下10秒钟内反应的大鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。设空白对照组、人溶菌酶三个剂量组(120、60、30IU/只)、鸡溶菌酶(阳性对照)30IU/，均尾部涂药。涂药前和涂药后0.5-4小时测每只大鼠的疼痛反应(甩尾)时间，若痛阈升高到照射30秒钟不甩尾时即中断照射，以免损伤皮肤与起泡，并以30秒计算。试验重复一次。
实验结果见表17-21，结果表明，涂抹人溶菌酶30、60、120IU/只三小时内，其痛阈明显升高，具有镇痛作用。
表17-21(A)人溶菌酶外涂对大鼠的镇痛作用(甩尾法)
                    (第一次试验结果)
                                    疼痛反应时间(秒，X±SD)
组别    剂量      动物数
        (I/只)    (只)      0         0.5       1         2         3         4(h)
空白    -         10        5.2       5.7       6.4       6.4       6.8       10.3
对照                        ±1.69    ±2.16    ±2.46    ±3.34    ±3.91    ±5.33
鸡溶    30        10        5.5       11.4**   14.0**   14.7**   15.2**   12.7**
菌酶                        ±1.72    ±4.5     ±6.93    ±7.67    ±7.45    ±6.99
人溶    120       10        5.3       13.6**   15.2**   13.4**   15.4**   14.9
菌酶                        ±1.77    ±6.98    ±7.42    ±6.38±      6.62      ±6.54
人溶    60        10        5.3       9.8*     12.9**   12.7*    13.5*   12.4
菌酶                        ±1.89    ±4.05    ±6.69    ±6.9     ±6.72    ±6.65
人溶    30        10        5.2       8.6*     12.4*    10.9      11.7      10.1
菌酶                        ±1.93    ±2.67    ±7.49    ±7.09    ±6.89    ±7.5
注：经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表17-21(B)人溶菌酶外涂对大鼠的镇痛作用(甩尾法)
        (第二次试验结果)
                                  疼痛反应时间(秒，X±SD)
组别    剂量       动物数
        (IU/只)    (只)      0        0.5       1       2         3         4(h)
空白    -          10        5.5      5.9       6.5     6.6       6.9       9.8
对照                         ±1.58   ±1.66   ±1.78   ±4.95    ±6.35    ±6.73
鸡溶    30         10        5.7      12.3**   15.0**   13.8*1    3.6*      11.7
菌酶                         ±1.64   ±4.6    ±7.99   ±7.99    ±7.6     ±6.9
人溶    120        10        5.8      14.2**   157**    14.5**    14.3*     13.5
菌酶                         ±1.23   ±6.54   ±6.78   ±7.11    ±7.44    ±7.69
人溶    60         10        5.6      12.6**   14.3**   14.0*     13.8*     12.5
菌酶                         ±1.89   ±4.05   ±6.69   ±6.9     ±6.72    ±6.65
人溶    30         10        5.7      10.0*    12.0*    10.7      10.1      11.2
菌酶                         ±1.34   ±4.47   ±7.85   ±4.27    ±3.84    ±4.5
注：经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
B、人溶菌酶对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀的影响
选用体重27-30克的健康雄性昆明小鼠50只，动物自由饮水，试验室温度控制在22-28℃左右，动物喂饲大鼠标准饲料。随机分成5组，每组10只。第一组为空白对照组；第二、三、四组为人溶菌酶，剂量分别为120、60、30IU/只；第五组为鸡溶菌酶(阳性对照)，30IU/只。首先，各组小鼠全部右耳内侧涂1％巴豆油(巴豆油，浅棕色油状液体，药用级，批号000309，由江西吉水县华宝天然药用厂生产。临用前用乙醇∶水∶乙醚25∶5∶70混合溶媒配制成1％浓度备用。)30μL致炎，半小时后分别用双蒸水20μl、人溶菌酶(6000IU/ML)20μl、人溶菌酶(3000IU/ML)20μl、人溶菌酶(1500IU/ML)20μl、鸡溶菌酶(1500IU/ML)20μl涂抹各组小鼠右耳内侧。致炎后4小时将小鼠脱颈椎致死，沿耳廓基线剪下左右两耳片，用8mm打孔器冲下两耳片，精确称重，左右耳片重量之差为肿胀度。经T检验，比较药物组与空白对照组的差异，并求出抑制率。试验重复一次。
试验结果见表17-22。小鼠经外涂人溶菌酶120、60、30IU/只，使小鼠由巴豆油诱发耳廓肿胀度明显减轻，经T检验，药物组与空白对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)，说明人溶菌酶具有抗炎作用。
表17-22  人溶菌酶对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀的影响
                    第1次试验                     第2次试验
组别        剂量
            (IU/只)      肿胀度           抑制率         肿胀度          抑制率
                         (mg，X±SD)      (％)           (mg，X±SD)     (％)
空白对照    -            20.3±3.40                      20.1±4.01
人溶菌酶    120          12.5±5.56**    38.42           13.6±3.78**    32.34
人溶菌酶    60           13.5±4.67**    33.50           15.1±2.42**    24.88
人溶菌酶    30           14.2±3.77**    30.05           15.4±4.22*     23.38
鸡溶菌酶    30           14.6±2.12**    28.08           15.1±2.51**    24.88
注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
C、人溶菌酶对厌氧性球菌上呼吸道感染所致小鼠口腔炎的影响：
选用健康昆明种小鼠10只，雌雄各半，体重为18-22克，挑取一定量的厌氧性球菌用滴鼻方式感染小鼠上呼吸道致小鼠口腔炎10只，感染后即用重组人溶菌酶气雾吸入剂3000U/ml/20g鼠给药，观察一周，每日六次给药，记录小鼠有效率。实验结果表明重组人溶菌酶气雾吸入剂对厌氧性球菌上呼吸道感染所致小鼠口腔炎有明显疗效。结果如下表：
  病种 受试动物(只)   痊愈   显效   无效   有效率％
  口腔炎     10     8     2     0     100
二、基因重组人溶菌酶(HLZ)体内外抗菌作用评价
(1)体外抗菌作用：
受试药品及试剂：
1、人溶菌酶(Human Lysozyme HLZ)：活性单位：30000单位/mL，由大连奇龙生物技术研究所提供。
2、对照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)：白色粉未，活性单位：50000单位/mg，美国SIGMA公司产品，批号：L6876。
3、克拉霉素：效价948μ/mg，中国药品生物制品检定所标准品，批号：
4、罗红霉素：效价878μ/mg，中国药品生物制品检定所标准品，批号：
5、注射用阿莫西林：哈尔滨制药厂产品，批号：010504。
6、琼脂糖(B10WEST AGAROSE)：
7、三羟甲基氨基甲烷(Tris)：成都化学试验厂，批号010211
试验菌株：
所用菌株均为2001.4~2002.4月于四川、北京地区收集的临床分离致病菌。经本室用API方法重新鉴定后用于试验。
质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923
          大肠埃希菌ATCC25922
          铜绿假单孢菌ATCC27853
培养基：
4、Tris-HCl缓冲液：0.1M Tris 100ml，0.1M HCl 70ml，High Water 800ml，测PH值，用HCl溶液调至PH7.2，加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl琼脂培养基：在Tris-Cl缓冲液中加入琼脂糖116℃无菌后使用。
3、M-H培养基：中国药品生物制品检定所产品，M-H肉汤培养基：称取25g加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌，116℃20分钟。M-H固体培养基：称取36g，加1000ml蒸馏水，高压灭菌，116℃20分钟，用于革兰阳性、阴性需氧菌的药敏试验。
4、血培养基，即在M-H培养基中加5-10％脱纤维兔血配制而成，用于肠球菌、链球菌的药敏试验。
试验方法：
体外抗菌活性(MIC)测定：采用琼脂二倍稀释法测定受试药物对试验菌株的最低抑菌浓度(MIC)。将受试药物用灭菌蒸馏水溶解，适当稀释。分别取1ml药液加9ml融化的Tris-HCl琼脂糖固体培养基混匀，以二倍稀释，制备系列含药平皿。每皿所含药物终浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；用多点接种仪(Denley A400，England)将稀释至105CFU/ml的试验菌液接种子各含药平皿表面，置于37℃培养8-10小时，取出分别吸取6ml融化的M-H培养基(50℃)覆盖上述系列平皿表面，再置于37℃培养10小时取出，观察结果，以无细菌生长平皿内所含最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度(MIC)。
(2)体内抗菌作用评价：
药品：人溶菌酶来源同前。
      克拉霉素来源同前。
      罗红霉素来源同前。
      阿莫西林来源同前。
细菌：金黄色葡球菌01193，金黄色葡球菌MRSA021923均为临床分离致病菌。
动物：昆明种小鼠，体重18-22克，由本所动物室提供。
试验方法：
体内保护试验：挑取一定量的菌苔接种于2ml M-H液体培养基中，37℃培养6小时后，取出用灭菌干酵母液进行适当稀释(10-1，10-2，10-3，10-4)，再取昆明种小鼠，随机分组，每组5只鼠，分别腹腔感染不同菌量的受试菌液，测定引起小鼠100％死亡的最小致死菌量(MLD)。再按1∶0.5剂间距设置5个剂量组，每组10只鼠，每只小鼠腹腔感染1MLD菌量的菌液0.5ml，感染后即刻静脉注射受试药0.5ml，设感染对照组(不给药)，观察1周，记录小鼠死亡数。按Bliss法计算半数有效剂量ED50及95％可信限。
小鼠皮肤烧伤感染模型的疗效评价：昆明种小鼠26-30g，随机分组，每组5只鼠，分别皮肤烧伤感染模型喷涂金黄色葡萄球菌菌液100ml，菌量为108CFU/ml，连续喷5次(间隔10分钟喷一次)，末次喷菌后6小时，分别用无菌棉签挑取皮肤烧伤感染模型涂于无药琼脂平板表面，37℃培养18小时，皮肤烧伤感染模型感染细菌数在＞103CFU/ml，且经革兰氏染色、光镜检测为金黄色葡萄球菌的小鼠为感染模型成功。
选取皮肤烧伤感染模型感染成功小鼠随机分组，每组10只鼠，分别用喷雾器喷涂受试药物100μl/次，4次/日，连续5日，每日采用咽试子涂片法，于琼脂平板表面进行活菌计数，作统计学处理，与感染对照组和克拉霉素组、罗红霉素给药组作比较。
试验结果：
(1)人溶菌酶对临床分离菌株的体外抗菌活性见表1。
(2)克拉霉素、罗红霉素、阿莫西林与人溶菌酶以1∶1联合用药的体外抗菌作用结果见表2。
(3)人溶菌酶对379株临床分离致病菌的MIC50、MIC90见表3。
根据以上试验结果表明：人溶菌酶体外具有一定抗菌作用，体内对伤口感染溃烂的疗效较确切。对多数菌株的抗菌活性比不上克拉霉素、罗红霉素和阿莫西林。人溶菌酶与克拉霉素、罗红霉素联用(1∶1)，可使克拉霉素、罗红霉素对其耐药菌株的抗菌活性增效2-16倍以上，个别菌株增效倍数在1000倍。溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪液、唾液、白细胞和血清中，对多种革兰氏阳性菌和少数革兰氏阴性菌有杀菌作用，由大连奇龙生物技术研究所研制的基因重组人溶菌酶(Human Lysozyme)也具有溶菌酶相同作用机制，主要切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1、4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，引起细菌裂解。
    表1  人溶菌酶、鸡溶菌酶、克拉霉素和罗红霉素体内外抗菌活性
                                                  MIC
细菌                   HLZ                   CLZ                CLA        ROX
                       mg/ml(万μ/ml)        mg/ml(万μ/ml)     mg/ml      mg/ml
金葡MRSA02-22         0.25(0.8)              0.008(0.04)        ＞1        ＞1
金葡MRSA02-23         0.25(0.8)              0.008(0.04)        ＞1        ＞1
金葡MRSA02-26         0.25(0.8)              0.004(0.02)        ＞1        ＞1
金葡MRSA02-28         0.5(1.5)               0.016(0.08)        ＞1        ＞1
金葡02-19-5           0.03(0.1)              ＜0.002(0.001)     ＞1        ＞1
表葡MssE25            0.016(0.05)            0.004(0.02)        ＜0.001    ＜0.001
表葡MRSE 02-29        0.063(0.2)             0.5(2.5)           0.03       0.5
表葡MRSE 02-5         ＜0.001(0.003)         ＜0.001(0.003)     ＜0.001    ＜0.001
表葡MRSE 02-6         ＜0.001(0.005)         ＜0.001(0.005)     ＜0.001    ＜0.001
表葡MRSE 02-20-2      ＜0.001(0.003)         ＜0.001(0.005)     ＞1        1
表葡MRSE 02-20-3      ＜0.001(0.003)         0.004(0.02)        ＞1        1
表葡MRSE 02-20-4      ＜0.001(0.003)         ＜0.001(0.005)     ＞1        ＞1
表葡MRSE 02-20-5      0.004(0.012)           ＜0.001(0.005)     ＞1        ＞1
表葡MRSE 02-20-6      0.004(0.012)           ＜0.001(0.005)     ＞1        ＞1
表葡MRSE 02-20-7      ＜0.001(0.003)         ＜0.001(0.005)     1          1
表葡MRSE 02-20-8      ＜0.001(0.003)         ＜0.001(0.005)     ＜0.001    ＜0.001
表葡MRSE 02-20-9      ＜0.001(0.003)         ＜0.001(0.005)     ＜0.001    ＜0.001
表葡MRSE 02-20-1      ＜0.001(0.003)         ＜0.001(0.005)     ＜0.001    ＜0.001
表葡MRSE 02-3         1(3)                   0.015(0.08)        ＞1        ＞1
表葡MRSE 02-4         0.004(0.012)           0.008(0.04)        0.5        ＞1
续表2
                                               MIC
细菌              HLZ                   CLZ                  CLA          ROX
                  mg/ml(万μ/ml)        mg/ml(万μ/ml)       mg/ml        mg/ml
表葡MRSE 02-10    0.004(0.012)          0.25(1.25)           1            1
表葡MRSE 02-12    ＜0.001(0.003)        ＜0.001(0.005)       0.008        0.125
表葡MRSE 02-11    ＜0.001(0.003)        ＜0.001(0.005)       ＜0.001      ＜0.001
表葡MRSE 02-15    0.008(0.024)          0.002(0.01)          1            ＞1
表葡MRSE 02-17    0.004(0.012)          ＜0.001(0.005)       0.25         ＞1
表葡MRSE 02-18    ＜0.001(0.003)        ＜0.001(0.005)       ＜0.001      ＜0.001
表葡MRSE 02-20    0.008(0.024)          ＜0.001(0.005)       ＞1          ＞1
表葡MRSE 02-21    0.016(0.05)           0.25(1.25)           ＜0.001      ＜0.001
表葡MRSE 02-22    0.004(0.012)          ＜0.001(0.005)       ＜0.001      ＜0.001
表葡菌02-7-4      0.008(0.02)           4(20)                0.002        0.002
表葡菌02-7-5      0.008(0.02)           0.25(0.63)           ＜0.001      ＜0.001
金葡菌02-7-6      0.008(0.02)           0.063(0.31)          0.008        0.25
金葡菌02-7-9      0.063(0.2)            0.125(0.63)          0.008        0.016
金葡菌02-7-7      0.125(0.4)            0.016(0.08)          0.032        0.25
金葡菌01-2-22     0.032(0.1)            0.5(2.5)             1            1
金葡菌01-2-30     0.063(0.2)            4(10)                ＞1          ＞1
金葡菌01-2-32     0.016(0.05)           0.25(1.25)           0.008        0.5
金葡菌01-2-33     0.032(0.1)            2(10)                ＞1          ＞1
金葡菌01-2-36     0.063(0 2)            4(20)                0.25         0.5
金葡菌01-2-37     0.032(0.1)            ＞4(20)              ＞1          1
金葡菌01-2-39     0.032(0.1)            0.5(2.5)             0.5          1
续表3
                                               MIC
细菌
                           HLZ                CLZ             CLA        ROX
                           mg/ml(万μ/ml)     mg/ml(万μ/ml)  mg/ml      mg/ml
铜绿假单孢菌01-2-41        0.032(0.1)         0.5(2.5)        ＞1        ＞1
铜绿假单孢菌01-2-42        0.016(0.05)        0.5(2.5)        0.063      ＞1
铜绿假单孢菌01-2-43        ＜0.001(0.003)     ＞4(20)         0.016      0.25
铜绿假单孢菌01-2-45        0.032(0.1)         2(10)           0.25       0.5
铜绿假单孢菌01-2-51        0.032(0.1)         ＞4(20)         ＞1        ＞1
铜绿假单孢菌01-2-52        0.032(0.1)         ＞4(20)         ＞1        0.25
铜绿假单孢菌01-2-53        0.008(0.024)       4(20)           0.03       0.25
铜绿假单孢菌01-2-54        0.032(0.1)         1(5)            ＞1        1
金葡菌01-2-56              0.032(0.1)         ＞4(20)         0.016      0.25
金葡菌01-2-57              ＜0.001(0.003)     2(10)           0.032      0.25
大肠埃希菌01-2-58          ＜0.001(0.003)     4(20)           ＞1        0.5
大肠埃希菌01-2-59          0.032(0.1)         4(20)           0.125      0.25
沙雷氏菌2-31-8             0.008(0.02)        0.5(0.25)       0.008      0.016
沙雷氏菌2-31-8             0.008(0.02)        1(5)            0.008      0.016
金葡菌2-31-8               0.008(0.02)        0.125(0.63)     0.016      0.016
金葡菌02-6-14              0.25(0.8)          1(5)            0.063      ＞1
金葡菌02-6-18              0.5(1.5)           ＞4(20)         0.5        1
注：HLZ指人溶菌酶，CLZ指对照溶菌酶(鸡溶菌酶)，CLA指克拉霉素，ROX指罗红素
三、用法及用量：
根据口腔溃疡面积，每天贴膜2～3次。
具体实施方式：
实施例1
第一步、基因重组人溶菌酶的制法：基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行冻干，测蛋白测活性保存。
第二步、膜剂的制法：在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制备膜剂。将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得100万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、万分之五吐温80，维生素B2 15g，羧甲基纤维素(CMC)3g，PVC(17～88)15g，将精制的PVC、CMC溶解于水中浸润，膨胀，并于水浴上加热至80℃，待全溶后，加入处方中各药，温度降至50℃按批量加入基因重组人溶菌酶，搅拌均匀，用100目尼龙筛过滤，消除气泡，降至室温。将配制好的含药液的成膜材料溶液加在涂膜机料斗中，通过可以调节流量的流液嘴，将药液以一定的宽度和厚度恒定的流量涂于不锈钢循环带上，经热风干燥，迅速成膜。根据规格经含量测定合格后，包装成品。
实施例2
在符合GMP要求的制药工厂，将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得200万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、万分之五吐温80，维生素B2 15g，羧甲基纤维素(CMC)3g，PVC(17～88)15g，按实施例1所述方法制备膜剂。
实施例3
在符合GMP要求的制药上厂，将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得5000U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、万分之五吐温80，维生素B2 15g，羧甲基纤维素(CMC)3g，PVC(17～88)15g，按实施例1所述方法制备膜剂。

Claims (8)

1、人溶菌酶膜剂，含有活性300U～300万U/ml人溶菌酶。
2、根据权利要求1所述的人溶菌酶膜剂，其特征是：由纯度95％的基因重组人溶菌酶制得300U～300万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、万分之五吐温80，维生素B215g，羧甲基纤维素(CMC)3g，PVC(17～88)15g制成膜剂。
3、根据权利要求1所述的人溶菌酶膜剂，其特征是：人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶、基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
4、根据权利要求1、2或3所述的人溶菌酶膜剂的制法：其特征是：将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得300U～300万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、万分之五吐温80，维生素B215g，羧甲基纤维素(CMC)3g，PVC(17～88)15g，将精制的PVC、CMC溶解于水中浸润，膨胀，并于水浴上加热至80℃，待全溶后，加入处方中各药，温度降至50℃按批量加入基因重组人溶菌酶，搅拌均匀，用100目尼龙筛过滤，消除气泡，降至室温。将配制好的含药液的成膜材料溶液加在涂膜机料斗中，通过可以调节流量的流液嘴，将药液以一定的宽度和厚度恒定的流量涂于不銹钢循环带上，经热风干燥，迅速成膜。根据规格经含量测定合格后，包装成品。
5、根据权利要求1、2或3所述的人溶菌酶膜剂在制备治疗由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、霉菌或免疫缺陷引起口腔溃疡的药物中的应用。
6、根据权利要求1、2或3所述的人溶菌酶膜剂在制备治疗由链球菌引起的口腔溃疡疾病的药物中的应用。
7、根据权利要求1、2或3所述的人溶菌酶膜剂在制备治疗由病原性念珠菌引起的口腔溃疡疾病的药物中的应用。
8、根据权利要求1、2或3所述的人溶菌酶膜剂在制备治疗由免疫缺陷引起的口腔溃疡疾病的药物中的应用。
CN 200410020817 2004-06-21 2004-06-21 人溶菌酶膜剂、制法及其应用 Pending CN1593653A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200410020817 CN1593653A (zh) 2004-06-21 2004-06-21 人溶菌酶膜剂、制法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200410020817 CN1593653A (zh) 2004-06-21 2004-06-21 人溶菌酶膜剂、制法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1593653A true CN1593653A (zh) 2005-03-16

Family

ID=34663243

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200410020817 Pending CN1593653A (zh) 2004-06-21 2004-06-21 人溶菌酶膜剂、制法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1593653A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104257636A (zh) * 2014-09-26 2015-01-07 天津市聚星康华医药科技有限公司 一种溶菌酶口腔贴膜及其制备方法
CN105475359A (zh) * 2015-11-24 2016-04-13 陕西师范大学 溶菌酶二维纳米薄膜作为抗菌材料的应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104257636A (zh) * 2014-09-26 2015-01-07 天津市聚星康华医药科技有限公司 一种溶菌酶口腔贴膜及其制备方法
CN105475359A (zh) * 2015-11-24 2016-04-13 陕西师范大学 溶菌酶二维纳米薄膜作为抗菌材料的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1578670A (zh) 乳清脱辅基蛋白在预防或治疗微生物或病毒感染中的用途
CN1810259A (zh) 防治龋病的五倍子药物及其提取方法
CN1909914A (zh) 由酿酒酶母is2分离的水溶性葡聚糖低聚物用于预防和治疗禽流感的新应用
CN1679504A (zh) 人溶菌酶在制备治疗痤疮的化妆品中的应用
CN1943675A (zh) 清热化痰、止咳平喘的藏药药物组合物及其制备方法
CN1308033C (zh) 减弱阴道酸度及治疗阴道炎的药物及其用途
CN1899600A (zh) 抗菌肽喷雾成膜剂及其制备方法
CN1557485A (zh) 基因重组人溶菌酶在消除病原微生物感染炎症上的应用
CN1593653A (zh) 人溶菌酶膜剂、制法及其应用
CN1391905A (zh) 一种治疗肠道疾病的微生物制剂
CN1593652A (zh) 人溶菌酶在制备治疗皮肤病的药物中的新用途
CN1686165A (zh) 药用纳米碳管组合物、制备方法及其应用
CN1167567A (zh) 杀菌、抗菌和抑菌组合物
CN1593651A (zh) 人溶菌酶在制备治疗眼病的药物中的新用途
CN1583168A (zh) 人溶菌酶在制备治疗伤口感染不愈溃烂的药物中的新用途
CN1583169A (zh) 人溶菌酶在制备治疗痤疮的药物中的新用途
CN1583170A (zh) 用于抗病毒抗耐药菌的人溶菌酶药物及其制法
CN1809366A (zh) 抑制猪流感(siv)和可传播的肠胃炎冠状病毒(tgev)的含有来自酿酒酵母is2的可溶性葡聚糖低聚物的组合物
CN1323681C (zh) 一种治疗上呼吸道感染的复方制剂及其在制药中的应用
CN1593453A (zh) 一种杀菌、抑菌药物组合物及其制剂和制备工艺
CN1634573A (zh) 人溶菌酶在制备治疗痱子的药物中的新用途
CN1634574A (zh) 人溶菌酶在制备治疗间擦疹的药物中的新用途
CN1691959A (zh) 白介素－6产生抑制剂
CN1593654A (zh) 人溶菌酶栓剂、制法及其应用
CN1232259C (zh) 一种口腔局部给药的具有双向免疫调节功能的药物组合物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication