CN1568298A - 发光性化合物及使用它们的标识试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一般式(I)表示的化合物：R－Y－(－X－Phe－COCH2COCnF2n+1) m (I)(式中R是H、烷基、苯基或能够结合蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱的基团，Y是CH2、碳化或杂环，X是O、S、NH、CH2、OCH2、CONH或NHCO，Phe是亚苯基，n是1～5的整数，m是1、2或3)；含有上述化合物和稀土离子的发光络合物；含有上述的化合物或发光络合物的标识试剂；及使用上述标识试剂的蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱的标识方法。

Description

发光性化合物及使用它们的标识试剂
技术领域
本发明涉及适于核酸检测法、免疫测定法和化学发光分析法中使用的时间分解荧光测定法、延迟磷光测定法或能量转移荧光检测法的标识试剂的化合物，特别是涉及在配位金属离子形成络合物时，能够产生荧光、延迟荧光或磷光的化合物。
背景技术
免疫测定法或核酸检测法根据包括可见的及放射活性测量的许多方法进行其测定，荧光体或荧光色素标识物的荧光强度测定因为其简单被广泛采用。该方法的实用性在于处于和激发光波长不同的波长区域的荧光或发光产生时，能够准确地将其检测出来，但是由于荧光或发光会在短时间内消失，因此存在的问题是：存在激发光的发生和荧光或发光的测定几乎被同时进行，由激发光产生的噪声被测定，背景高。
荧光或发光波长的峰和激发光波长峰比较在长波长区域的多，使用波长选择滤波器从激发光中分离出荧光或发光对其进行测定。激发光波长和发光或荧光波长的波长差一般称为斯托克斯频移，如果荧光测定中斯托克斯频移小，通过波长差准确地分离激发光和荧光或发光是困难的。
对于若丹明或荧光素等的荧光色素，其荧光的波长分布区域广，得到宽的荧光波形。在假设使用几个荧光体或荧光色素同时测定几个物质的场合，由于荧光波长区域叠加难以对各物质进行测定，为了得到各物质的量，必须适用换算式进行算法解析。
作为激发光不对发光产生干涉的方法，有时使用包括电化学发光法，化学发光法的化学发光法。其中，由于激发光没有照射到标识体或标识色素，因而可以仅测定发光。标识异鲁米诺或丙烯酸(ジウムウムエステル)测定对象物质的方法可以构筑高灵敏度测量体系，该高灵敏度测量体系是利用标识物质是酶并采用在基质中发生发光反应的过氧化物酶和鲁米诺的反应，或者利用金刚烷基1，2-二氧六环芳基磷酸酯(AMPPD)和碱性磷酸酯酶的反应。
近年来，利用铕或钐等的稀土元素和它们的配位体、络合物的荧光或磷光消光时间长，开发了优越的时间分解荧光或磷光测定法。由于荧光或磷光的消光时间长、斯托克斯频移大以及荧光或磷光峰波形窄，因此不含有激发光产生的噪声，可以检测荧光或磷光的信号，提供高灵敏度的分析方法。通过氙闪光灯或激光等用脉冲照射激发光，激发光的装置或其它物质的荧光经过消失的时间以后，是所需的荧光或磷光的测定方法。由于配位体改良的进展，报道了化合物4，7-二(氯磺酰基苯基)-1，10-菲咯啉-2，9-二羧酸(BCPDA)或4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己烷二酮-6-基)氯磺酰基-邻-三联苯(BHHCT)。BHHCT例如公开于特开平9-241233公报。虽然这些是优良的螯合物，但是仍然不能在免疫测定或核酸检测法中给出足够的最小检测灵敏度。
发明内容
本发明的目的是围绕在核酸检测法、免疫测定法和化学发光分析法中使用的时间分解荧光测定法、延迟磷光测定法或能量转移荧光检测法的标识试剂，提供可以高灵敏度地测定样品中的目标物质的有用的标识试剂，以及用于该标识试剂的化合物。
本发明包括以下的发明：
(1)一般式(I)表示的化合物：
R-Y-(-X-Phe-COCH2COCnF2n+1)m  (I)
(式中R是氢、烷基、苯基或能够结合蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱的基团；Y是CH2、碳环或杂环；X是O、S、NH、CH2、OCH2、CONH或NHCO；Phe是亚苯基；n是1～5的整数；m是1，2或3)
(2)一般式(1)表示的上述(1)中记载的化合物：
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(3)一般式(2)表示的上述(1)中记载的化合物：
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(4)一般式(3)表示的上述(1)中记载的化合物：
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(5)一般式(4)表示的上述(1)中记载的化合物：
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(6)一般式(5)表示的上述(1)中记载的化合物：
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(7)一般式(6)表示的上述(1)中记载的化合物：
Figure A0281996400123
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(8)一般式(7)表示的上述(1)中记载的化合物：
Figure A0281996400131
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(9)一般式(8)表示的上述(1)中记载的化合物：
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(10)一般式(9)表示的上述(1)中记载的化合物：
Figure A0281996400133
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(11)一般式(10)表示的上述(1)中记载的化合物：
Figure A0281996400134
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(12)一般式(11)表示的上述(1)中记载的化合物：
Figure A0281996400141
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(13)一般式(12)表示的上述(1)中记载的化合物：
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(14)一般式(13)表示的上述(1)中记载的化合物：
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(15)一般式(14)表示的上述(1)中记载的化合物：
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和上述(1)的定义相同)
(16)上述(1)～(15)任何一项记载的化合物，其中，R是能够结合蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱的官能团结合到可以在链原子中含有选自氧、氮和硫中的至少一个杂原子的碳链构成的间隔基团末端形成的基团。
(17)上述(1)～(16)任何一项记载的化合物，其中，R具有下式表示的至少一个官能团：
-N＝C＝S、-N＝C＝O、
Figure A0281996400152
-N2X、-N3、 -SO3CF3、-NH2、-SO2X、-SO3H、-SH、-X、-CX3、
Figure A0281996400155
Figure A0281996400156
(但是，X选自卤化物原子、-OSO3CH3、-OSO2F、-OSO2CF3、-SO2C4F9、
Figure A0281996400161
RA选自烷基、链烯基、芳基、芳烷基；RB选自亚烷基、亚芳基、亚芳烷基；p是0～5；q是2～10；n是1～20)
(18)含有上述(1)～(17)中任何一项记载的化合物和稀土离子的荧光性络合物。
(19)含有上述(1)～(17)中任何一项记载的化合物或上述(18)中记载的荧光性络合物的标识试剂。
(20)用于免疫测定或核酸检测的上述(19)中记载的标识试剂。
(21)使用上述(19)或(20)中记载的标识试剂的蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱的标识方法。
在上述式(I)中R是氢、烷基、苯基或能够结合蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱的基团。这里对于“可以结合蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱的基团”，只要是可以结合蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱中存在的氨基、羧基、巯基、羟基中的任何一个的基团，没有特别的限制，例如可以列举出具有用下式表示的至少一个官能团的基团：
-N＝C＝S、-N＝C＝O、
Figure A0281996400171
-N2X、-N3、
Figure A0281996400172
-SO3CF3、-NH2、
Figure A0281996400173
-SO2X、-SO3H、-SH、-X、-CX3、
Figure A0281996400174
(但是，X选自卤化物原子、-OSO3CH3、-OSO2F、-OSO2CF3、-SO2C4F9、 RA选自烷基、链烯基、芳基、芳烷基；RB选自亚烷基、亚芳基、亚芳烷基；p是0～5；q是2～10；n是1～20)
上述式中，作为用X表示的卤化物原子(卤原子)，可以举出氟、氯、溴或碘；作为用RA表示的烷基，例如可以举出碳原子数1～6的烷基(例如甲基、乙基)；作为链烯基，例如可以举出碳原子数2～6的链烯基(例如乙烯基、丙烯基)；作为芳基，例如可以举出苯基、萘基；作为芳烷基，例如可以举出苄基、苯乙基和萘甲基。作为用RB表示的亚烷基，例如可以举出碳原子数1～6的亚烷基(例如-(CH2)n-，n是1～6的整数)；作为亚芳基，例如可以举出亚苯基、亚萘基；作为亚芳烷基，例如可以举出-Ar-(CH2)n-(这里Ar是亚苯基、亚萘基；n是1～6的整数)。
在R是可以结合蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱的基团的情况，作为R结合对象的蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱，没有特别的限制，例如可以举出抗体类、标识抗体类、抗原类、生物素、卵白素、链抗生物素蛋白、牛血清白蛋白、半抗原、激素、多肽、多核苷酸。
作为用Y表示的碳环，例如可以举出可以被取代的芳香族单环烃环(例如苯环)，由可以被取代饱和单环烃组成的3～8元环(例如环己烷环)，由可以被取代不饱和单环烃组成的4～8元环(例如环己烯环、1，3-环戊二烯环)，可以被取代的缩合多环烃环(例如萘环、菲环、芴环)，烃环集合(联苯、三联苯、菲环、芴环)。
作为用Y表示的杂环，例如可以举出可以被取代的芳香族杂单环(例如噻吩)，可以被取代的3～8元饱和杂单环(例如四氢呋喃)，可以被取代的不饱和杂单环(例如吡咯)，可以被取代的缩合杂环(例如苯并噻吩、二苯并噻吩、苯并呋喃、二苯并呋喃)。
作为用Phe表示的亚苯基优选1，4-亚苯基。
作为本发明使用的稀土离子，优选镧系元素离子，例如可以举出铕(Eu)、钐(Sm)、铽(Tb)、镝(Dy)等的离子。
含金属元素的螯合物的分子大小是较小的，但在肽、氨基酸、特别是蛋白质或碱链的标识中，通过以碳为主的链(间隔基团)有时有利于标识。蛋白质或碱链多数有复杂的3次结构，对标识体具有的官能团的结合位置有时在结构的内部。在对它们标识时，使用间隔基团是有效的。
作为上述间隔基，例如可以使用在链原子中可以含有选自氧、氮及硫中的至少一个杂原子的碳链构成的间隔基团。
作为具有上述间隔基团的R的具体例可以举出：
-(CH2)a-FG或-[(CH2)b-A]c-CH2)d-FG
(式中a是1～40的整数，b是1～20的整数，c是1～10的整数，d是0～20的整数，A是氧(O)、氮(N)或硫(S)，FG是官能团)
荧光是从第一激发态向基态迁移时产生的发光，通过自旋多重度不同的状态间的迁移产生磷光。以往，和重金属离子配位的络合物试剂有具有β-二酮结构的标识试剂和具有芳香族基团的标识试剂。对于酚酞不能观测到荧光和磷光，可是具有-O-(氧)桥的荧光素显示有强的荧光和磷光。另外，虽然吡啶也不能观测到荧光和磷光，但是具有一个苯环的喹啉可以观测到荧光和磷光。
在想加强荧光或磷光强度的情况，同时具有芳香族基团和-O-(氧)、并且稳定、合成收率还高的物质是有效的。
在免疫测定或核酸检测法中，将固相作为其反应平台，在固相上形成抗原抗体反应物、DNA或RNA杂交反应产物，对其进行测定。标识体或标识色素预先结合抗原、抗体、DNA或RNA构成反应生成物，或者利用卵白素和生物素的反应，在最后结合反应物，开始测定。
本发明的化合物及标识试剂具有β-二酮结构和芳香基，而且在用Phe表示的亚苯基和用Y表示的CH2、碳环和杂环之间存在用X表示O、S、NH、CH2、OCH2、CONH或NHCO，这样在桥接以铕为例的稀土元素的β-二酮部位，其可移动区域变大，从而可以更有效地保持稀土类离子。这样，稀土类离子会更准确地配位到β-二酮部位，其结果是，当被合适的激发光照射时，能够准确产生荧光或磷光。
本发明的化合物及标识试剂，如上述，由于在用Phe表示的亚苯基和用Y表示的碳环或杂环之间放置有用X表示的O、S、NH、CH2、OCH2、CONH或NHCO，所以芳香族基团(亚苯基)和碳环或杂环没有连接，亲水性没有受到很大阻害，能够生成有效的螯合物。
另外，本发明的化合物及标识试剂通过在用Phe表示的亚苯基和用Y表示的碳环或杂环之间放置有用X表示的O、S、NH、CH2、OCH2、CONH或NHCO，在CnF2n+1(在这里，n是1～5的整数)和β-二酮部位相对的位置很难被它们的电子吸引作用所影响，容易导入活性基团。其结果是，能够更有效地得到与氨基酸、肽、蛋白质、核酸的结合体。
同样，本发明的化合物及标识试剂通过在用Phe表示的亚苯基和用Y表示的碳环或杂环之间放置有X表示的O、S、NH、CH2、OCH2、CONH或NHCO，在和以活性基团为媒介的氨基酸、肽、蛋白质、核酸或塑料粒子等的固相载体进行结合时，在β-二酮部位难以受到它们的影响，能够有效地保持稀土类离子。这样，稀土类离子能够准确地配位到β-二酮部位上，其结果是，当被合适的激发光照射时，能够准确产生荧光或磷光。
而且，对于本发明的标识试剂及化合物，要是在R中使用间隔基团，R的基团更容易结合到蛋白质或碱链上，其结果是，能够增加每1分子被标识体的标识体标记数。
本发明的化合物例如可以按照以下方法制造。
制造方法1
第1步骤
(式中X是卤原子，例如氯原子，R、Y、X及Phe和上述式(I)定义相同)
该反应是所谓的付瑞德-克莱福特反应，可以按照常规方法进行。作为溶剂，可以使用二氯甲烷、氯仿等，在氯化铝等的路易士酸存在下进行反应。
第2步骤
R-Y-(-X-Phe-COCH3)m+CnF2n+1COOR1
R-Y-(-X-Phe-COCH2COCnF2n+1)m
(式中R1是低级烷基，例如甲基、乙基，R、Y、X、Phe、n和m与上述式(I)定义相同)
该反应是酮化合物和酯化合物的缩合反应，可以按照常规方法进行。作为溶剂，可以使用环己烷、正己烷、二乙醚等，在氢化钠、金属醇化物等存在下进行反应。
制造方法2
这种制造方法是X为CH2时的制造方法。
第1步骤
(式中R、Y、Phe和m与上述式(I)定义相同)
该反应在四氢呋喃-水的混合溶剂等溶剂中进行，在PdCl2(dppf)·CH2Cl2(dppf＝1，1’-二(二苯基膦)二茂铁)的存在下进行反应。
第2步骤
(式中R1是低级烷基，例如甲基、乙基，R、Y、Phe、n和m与上述式(I)定义相同)
该反应可以和制造方法1的第2步骤同样地进行。
制造方法3
该制造方法是X为O时的制造方法。
第1步骤
(式中R、Y、Phe和m与上述式(I)定义相同)
该反应是在溶剂中加入K2CO3、NaOH或NaH等下进行。
第2步骤
(式中R1是低级烷基，例如甲基、乙基，R、Y、Phe、n和m与上述式(I)定义相同)
该反应可以和制造方法1的第2步骤同样地进行。
通过上述得到的化合物作为标识试剂，可以用于蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱的标识，或者在塑料粒子等的载体表面固化使用，而且还可以内封于具有微脂粒等的中空的封闭体中使用。
使用本发明化合物的标识反应，可以根据该化合物中的官能团和蛋白质、核酸中的官能团的关系选择适当的反应进行。例如，可以通过本发明化合物中的氯磺酰基、羧基和蛋白质中的氨基形成酰胺的反应来进行标识反应。在室温下这种形成酰胺的反应在碳酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液(pH＝9.0～9.5)中容易进行反应。
作为使用本发明标识试剂的免疫测定法，例如可以举出利用时间分解荧光免疫测定法、抗原抗体反应的特别结合试验。这里，时间分解荧光免疫测定法是指在使用长寿命的荧光标识体(E-螯合物)，短寿命的背景荧光消失以后，仅对标识体的荧光信号进行时间分解荧光测定的高灵敏度的荧光免疫测定法。特别结合试验是指利用抗原抗体反应的免疫测定，利用受体·接受体的结合反应的试验，利用核酸的杂交的试验等。
附图说明
图1表示实施例1的化合物(b)的凝胶色谱分析数据；
图2表示实施例2的化合物(b)的HPLC分析数据；
图3表示实施例2的化合物(b)的NMR光谱分析数据；
图4表示实施例2的化合物(b)的TOF/MS光谱分析数据；
图5表示实施例5～7中使用的本发明的化合物和其它的β-二酮(1，3-二酮)化合物；
图6是表示使用时间分解测定装置中的本发明化合物的荧光信号、荧光分光计激发光谱的最大激发波长以及分光光度计吸收光谱的最大吸收波长的一览表和图；
图7表示本发明的化合物的荧光衰减曲线；
图8表示使用本发明的化合物作为标识体的α-检甲胎蛋白试剂(AFP)的标准曲线；
图9是使用本发明化合物的1例，显示本发明的特征；
图10表示本发明的铕标识的牛血清白蛋白(BSA)的标准曲线；
图11表示本发明的热C反应性蛋白(CRP)的测定结果。
具体实施方式
下面用实施例说明本发明，但是这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
以下是用一般式(6)表示的化合物的合成方法的1例。
第1步骤
以下是第1步骤：
Figure A0281996400231
材料
(1)无水氯化铝：    2.18g
(2)无水二氯甲烷：  35mL
(3)乙酰氯：        1.29g
(4)二苯基甲烷：    2.5g
合成方法
在烧瓶中加入(1)和(2)，冷却到0℃。再加入材料(3)，在冷却条件下慢慢滴加材料(4)的二氯甲烷溶液15mL，室温下搅拌2小时。往混合物中加入15g左右的冰，再加入1当量浓度盐酸溶液20mL，溶解析出的氧化铝，分离有机层。水层用20mL二氯甲烷萃取3次。混合有机层，水洗，加入无水硫酸镁，在减压条件下馏去溶剂，残留物用硅胶色谱法精制(溶剂：正己烷∶乙酸乙酯＝3∶2)，得到化合物(a)。(收率96％)
第2步骤
以下是第2步骤：
Figure A0281996400241
材料
(1)氢化钠(60％油分散)：  60mg
(2)无水环己烷：          5mL
(3)C3F7COOC2H5：   460mg
(4)化合物(a)：           200mg
合成方法
在烧瓶中加入材料(1)和(2)，一边加热搅拌一边加入材料(3)和材料(4)的环己烷溶液3mL，再在室温下搅拌30分钟。往混合物中加入15％的乙酸水溶液，加入到冰水10mL中。通过分液漏斗分离有机层，水层用20mL乙醚萃取3次。混合有机层，再水洗，加入无水硫酸镁干燥，在减压条件下馏去溶剂，残留物用硅胶色谱法精制(溶剂  正己烷∶乙酸乙酯＝3∶2)，得到淡黄色化合物(b)。(收率99％)
化合物(b)的凝胶色谱分析数据表示在图1中。另外，用TOF/MS光谱分析确认m/z 406。
实施例2
以下是用一般式(2)表示的化合物的合成方法的1例。
第1步骤
以下是第1步骤：
Figure A0281996400251
材料
(1)1，2-二(溴甲基)苯：         5.0g
(2)4-乙酰基苯基硼酸：          13.6g
(3)四氢呋喃(THF)：             50mL和5mL蒸馏水的混合液
(4)碳酸铯：                    18.5g
(5)PdCl2(dpPf)·CH2Cl2：  1.5g(dppf＝1，1’-二(二苯基膦)二茂铁)
反应温度：70℃
反应时间：1天
合成方法
在反应容器中混合材料(1)、(2)、(3)和(4)，在70℃加热搅拌。30分钟后，加入材料(5)。24小时后，停止加热，将反应溶液加入到60mL蒸馏水中，用80mL氯仿萃取。依次用5％盐酸水溶液40mL和蒸馏水40mL洗涤有机层，用硫酸镁干燥。减压馏去溶剂得到6g粗产物。用硅胶色谱法分离精制后，用凝胶色谱分离精制，得到1.0g化合物(a)。(HPLC纯度99％，收率15％)
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ2.56(6H，s)，3.96(4H，s)，7.10-7.15(6H，m)，7.3-7.27(2H，m)，7.81-7.84(4H，m)
MS(MALDI TOF) m/z 344(M+H+)
第2步骤
以下是第2步骤：
材料
(1)化合物(a)：          300mg
(2)C3F7COOC2H5：  440mg
(3)脱水乙醚：           12mL
(4)甲醇钠：             99mg
反应温度：室温
反应时间：1天
合成方法
在反应容器中混合材料(1)、(2)、(3)和(4)。24小时以后，加入10％硫酸水溶液12mL。搅拌15分钟后，减压馏去有机层，过滤析出的结晶。充分水洗后，将结晶投入到10mL乙醇中，加热搅拌。减压馏去乙醇至5mL左右，加入石油醚20mL，加热搅拌。过滤不溶物，馏去溶剂得到300mg化合物(b)。用凝胶色谱法精制，得到化合物(b)100mg。MS(MALDI TOF)m/z 735(M+H+)
化合物(b)的HPLC分析数据表示在图2中，化合物(b)的NMR分析数据表示在图3中，化合物(b)的TOF/MS光谱分析数据表示在图4中。
实施例3
以下是用一般式(1)表示的化合物的合成方法的1例。
第1步骤
以下是第1步骤：
材料
(1)1，2-二羟基苯
(2)4’-氟苯乙酮
合成方法
使材料(1)和(2)在溶解于溶剂N，N-二甲基乙酰胺中的碳酸钾存在下反应，得到化合物(a)
第2步骤
以下是第2步骤：
材料
(1)化合物(a)：         1.75g
(2)无水乙醚：          40mL
(3)甲醇钠：            1.36g
(4)C3F7COOC2H5： 3.67g
合成方法
将材料(1)和(2)混合冷却，加入材料(3)。再滴加材料(4)的乙醚溶液10mL。冷却1小时搅拌后，加入乙醚用稀盐酸调节到pH4，用水、饱和食盐水依次洗涤。用无水硫酸钠干燥，在减压条件下除去溶剂，得到红褐色的膏状物3.87g。用湿柱精制(溶剂  己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)，得到红褐色的膏状物2.69g。
实施例4
准备含有本发明化合物的发光性化合物。另外TTA(4，4，4-三氟-1-(2-噻吩基)-1，3-丁烷二酮)和BFA(4，4，4-三氟-1-苯基-1，3-丁烷二酮)由(株)同人化学研究所购入，BHHT(4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3’-七氟-4”，6”-己烷二酮-6”-基)-O-三联苯)的合成参考特开平9-241233及Yuan &Matsumoto(Analytical Chemistry，1998，70，596-601)。
它们的化学结构式表示在图5中。
实施例5
将含有本发明化合物的图5中的化合物溶解于乙腈(和光纯药制造)中，达到10-4mol/mL或10-5mol/mL，再以10倍等级稀释至10-10mol/mL。使用其10-7mol/mL的溶液，用分光光度计(日立ハイテクノロジ-ズ制造)进行吸收光谱分析。进而，将化合物的10-10mol/mL溶液和含0.2mM的氯化铕6水合物(EuCl3·6H2O，和光纯药制造)、0.2mM TOPO(三正辛基膦氧化物，同仁化学研究所)、1％三硝基甲苯X-100(シゲマ制造)的水溶液以1∶9混合，在42℃培养2小时。将其0.1mL分别注于96槽平底微培养皿(Nunc制造)的槽中，用时间分解测定装置(日立ハイテクノロジ-ズ制造)照射340nm附近的激发光，测定通过激发光照射从0.2微秒后到0.8微秒具有615nm附近波长的荧光。进而，使用同样的溶液，用荧光分光计F-4010(日立ハイテクノロジ-ズ制造)进行激发光谱分析。
其结果表示在图6。对于化合物4，在时间分解测定装置中显示最高的信号强度，在荧光光谱分析和吸收光谱分析中峰强度也最大，从而确认其是作为荧光体的有用的化合物。对于化合物6，通过在亚苯基和用Y表示的碳环之间放置有用X表示的CH2，难以形成跨过3个碳环的共轭体系，结果是，被认为可以观察到同化合物1的结构的个数对应的信号。
实施例6
将实施例5的10-11mol/mL化合物溶液0.1mL分别注于微培养皿的槽中，用时间分解测定装置照射340nm附近的激发光，通过激发光照射在0.1、0.2、0.3…0.8、0.9及1.0微秒后开始测定，然后将在0.1微秒间观察的发光信号各自在图上记下点，用线连接。
结果表示在图7中。本发明的化合物具有足够长的荧光持续得到确认。特别是化合物4，显示出最长的半衰期时间。
实施例7
α检甲胎蛋白试剂(AFP)的测定
参考Yuan & Matsumoto(Analytical Chemistry，1998，70，596-601)。
(1)AFP抗体的生物素标识(按照Pierce社，磺化-NHS-LC-生物素操作说明书)
抗热AFP抗体(DACO Immunoglobulins制造)1mg用1mL磷酸缓冲食盐水中(PBS，pH7.4)溶解。混合磺化-NHS-LC-生物素0.062mg，在冰浴中静置2小时。然后，使用PD-10柱(フアルマシア制造)，通过PBS洗提出抗体部分，除去未结合的磺化-NHS-LC-生物素。生物素标识抗体液中加入的叠氮化钠至0.1％，在4℃保存。
(2)实施例4的化合物的氯磺酰基的导入
每0.1mmol图5的化合物加0.2mL氯代硫酸(和光纯药制造)，在室温搅拌7小时以后，将反应溶液滴加到搅拌下的纯水(冰浴)4mL中。离心分离生成的沉淀，用纯水洗涤3次。然后真空干燥沉淀45小时。
(3)化合物的链霉卵白素标识
将10-5mmol链霉卵白素(SA，Chemicon International制造)溶解在0.1M的碳酸缓冲液(pH9.1)4mL中。将10-3mmol上述(2)的化合物溶解在40μL乙醇中，滴加到SA液中。混合液在室温搅拌1小时后，用0.05％的叠氮化钠加0.1M碳酸氢钠水溶液充分透析。透析后，用1M HCl调整pH为6.8且总量为6mL，加BSA至0.1％。再将其用含有10-7MEuCl3·6H2O、1％BSA、0.1％叠氮化钠的0.05M tris-HCl缓冲液(pH7.8)稀释300倍，在56℃加热2小时后，用于反应。
(4)抗AFP抗体的微培养皿涂层
将用0.1M碳酸缓冲液(pH9.6)稀释至5μg/mL的抗热AFP抗体(日本バイオテスト研究所制造)100μL分别注于微培养皿中，在4℃静置一夜进行涂布。然后，用0.05％吐温20加生理食盐水洗涤，再加入1％BSA、2％蔗糖加碳酸缓冲液(pH9.1)100μL，在37℃静置。1小时后，用0.05％吐温20(シゲマ制造)加生理食盐水洗涤，在-20℃保存。
(5)免疫测定的实施
用1％BSA加PBS以10倍等级稀释热AFP标准品(DACOImmunoglobulins制造)，将其50μL加入到微培养皿各槽中。在37℃振荡1小时后，用0.05％吐温20加生理食盐水洗涤。然后，用1％BSA加生理食盐水将上述(1)得到的生物素标识抗AFP抗体稀释到1μg/mL，将其50μL分别注于各槽中。在37℃振荡1小时，用0.05％吐温20加生理食盐水洗涤。然后，将上述(3)的链霉卵白素标识化合物50μL分别注于各槽中。
在室温静置30分钟后，用0.05％吐温20加生理食盐水洗涤。使用时间分解测定装置对微培养皿测定发光量。
结果表示在图8中。由此可知，本发明化合物可以性能良好地用于免疫测定。特别是化合物4描出了良好的标准曲线，其最小检测灵敏度和同时检测的其它化合物比较是最好的。对于化合物6也得到比较好的标准曲线和最小检测灵敏度。虽然在实施例6中没有显示大的信号，但是氯磺酰基活性基团的结合良好，并且加上β-二酮部位的铕粒子的捕捉，其稳定性高，可以认为在抗原抗体反应中得到相对良好的结果。
在具有一个碳环或杂环的化合物1、TTA、BFA的情况，氯磺酰基活性基团没有结合，处于β-二酮部位的铕粒子不能够保持稳定，结果是得不到抗原抗体反应的信号。
实施例8
用作为本发明化合物的1例的图5的化合物4进行研究。
通过在亚苯基和用Y表示的碳环之间放置有用X表示的O，C3F7及β-二酮部位和R的部位之间的距离大，由于难以被C3F7和β-二酮部位的电子吸引效果影响，活性基团的导入容易。结果是，能够更有效地得到与氨基酸、肽、蛋白质或核酸的结合体。
同样，通过放置有用X表示的O，在与以活性基团为媒介的氨基酸、肽、蛋白质、核酸或塑料粒子等的固相载体进行结合的情况，在β-二酮部位难以受到它们影响，能够有效并且稳定地保持稀土类离子。这样，稀土类离子更准确地配位到β-二酮部位，结果是当被照射合适的激发光时，能够准确地发出荧光或磷光。
另外，通过放置有用X表示的O，可以认为形成了C3H7、β-二酮部位及同其连接的碳环更柔韧地配置配位基、同时稀土离子更稳定的络合物。
实施例9
进行图5的化合物4的BSA标识。按照实施例7(2)导入氯磺酰基。另外，对于标识，参考Yuan & Matsumoto(Analytical Chemistry，1998，70，596-601)。
含有1.5mg导入氯磺酰基的化合物4的0.8mL DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶液，搅拌同时加入到含有2mg BSA的0.4mL 0.1M碳酸缓冲液(pH9.3)中。在室温搅拌后，使用PD-10柱，得到由化合物标识的BSA部分。这时，将0.05M碳酸氢铵水溶液(pH8.0)作为洗提液。
用含有10-7M EuCl3·6H2O、1％BSA及0.1％叠氮化钠的0.05Mtris-HCl缓冲液(pH7.8)将其稀释，在56℃加热2小时。
用含有0.05％吐温20和0.05％的叠氮化钠的0.1M tris-HCl缓冲液(pH9.1)将铕标识的BSA以10倍等级稀释，用时间分解测定装置测定发光量。结果如图10所示，表明本发明化合物能够作为性能良好的标识体使用。
实施例10
下面以实例说明使用本发明化合物(图5的化合物4)的免疫测定。
(1)抗热CRP(C反应性蛋白)抗体的生物素标识
按照实施例7(1)，对抗热CRP抗体进行生物素标识。
(2)SA标识体的制作
按照实施例7(3)，制作图5的化合物4的SA标识体，并且混合铕。
(3)抗热CRP抗体的微培养皿涂层
按照实施例7(4)，准备抗热CRP抗体固化的微培养皿。
(4)免疫测定的实施
用1％BSA加生理食盐水以10倍等级稀释热CRP标准品，将其50μL加入到微培养皿各槽中。在37℃振荡1小时后，用0.05％吐温20加生理食盐水洗涤。然后，用1％BSA加生理食盐水稀释上述(1)的生物素标识抗热CRP抗体至1μg/L，将其50μL分别注于各槽中。在37℃振荡1小时后，用0.05％吐温20加生理食盐水洗涤。然后，用1％BSA加生理食盐水稀释(2)的铕标识SA，将其50μL分别注于各槽中。
在室温静置30分钟后，用0.05％吐温20加生理食盐水洗涤。使用时间分解测定装置对微培养皿测定发光量。
结果如图11所示。表明图5的化合物4作为标识体能够以性能良好地用于免疫测定。
通过本发明，能够得到(1)容易形成络合物的新的化合物以及(2)和蛋白质等容易反应的新的化合物。而且，在免疫测定法或核酸检测法等中可以作为有用的标识体使用。

Claims (21)

1.一种一般式(I)表示的化合物：
R-Y-(-X-Phe-COCH2COCnF2n+1)m    (I)
(式中R是氢、烷基、苯基或能够结合蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱的基团；Y是CH2、碳环或杂环；X是O、S、NH、CH2、OCH2、CONH或NHCO；Phe是亚苯基；n是1～5的整数；m是1，2或3)
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(1)表示：
Figure A028199640002C1
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(2)表示：
Figure A028199640002C2
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(3)表示：
Figure A028199640003C1
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(4)表示：
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
6.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(5)表示：
Figure A028199640003C3
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
7.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(6)表示：
Figure A028199640004C1
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
8.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(7)表示：
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
9.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(8)表示：
Figure A028199640004C3
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
10.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(9)表示：
Figure A028199640005C1
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
11.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(10)表示：
Figure A028199640005C2
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
12.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(11)表示：
Figure A028199640005C3
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
13.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(12)表示：
Figure A028199640006C1
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
14.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(13)表示：
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
15.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，用下述一般式(14)表示：
(式中*是CnF2n+1(这里，n是1～5的整数)；R和权利要求1的定义相同)
16.权利要求1～15中任何一项记载的化合物，其特征在于，R是能够结合蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱的官能团结合到可以在链原子中含有选自氧、氮和硫中的至少一个杂原子的碳链构成的间隔基团末端形成的基团。
17.权利要求1～16中任何一项记载的化合物，其特征在于，R具有下式表示的至少一个官能团：
-N＝C＝S、-N＝C＝O、
Figure A028199640007C1
-N2X、-N3、
Figure A028199640007C2
-SO3CF3、-NH2、
Figure A028199640007C3
-SO2X、-SO3H、-SH、-X、-CX3、
Figure A028199640007C4
(但是，X选自卤化物原子、-OSO3CH3、-OSO2F、-OSO2CF3、-SO2C4F9、-OSO2-C6H4-CH3；RA选自烷基、链烯基、芳基、芳烷基；RB选自亚烷基、亚芳基、亚芳烷基；p是0～5；q是2～10；n是1～20)
18.含有权利要求1～17中任何一项记载的化合物和稀土离子的荧光性络合物。
19.含有权利要求1～17中任何一项记载的化合物或权利要求18中记载的荧光性络合物的标识试剂。
20.用于免疫测定或核酸检测的权利要求19中记载的标识试剂。
21.使用权利要求19或20中记载的标识试剂的蛋白质、肽、氨基酸、核酸或碱的标识方法。
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