JP2010501481A - 発光性ランタノイド標識試薬及びその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、発光性ランタノイドキレートに保持された生体特異的結合反応性物質を含む検出可能な分子であって、該発光性ランタノイドキレートが、ランタノイドイオンと、下記式（Ｉ）で表されるキレートリガンドからなる、ことを特徴とする検出可能な分子に関する。
但し、Ｒ1AとＲ1Bは各々、独立的に、水素原子、メチル、エチル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、ヒドロキシル及び−ＯＲ2からなる群より選ばれ；Ｒ2は、−ＣＨ3、−Ｃ（ＣＨ3）3 及び−Ｃ（ＣＲ4）3からなる群より選ばれ、但しＲ4は炭素数１〜６のアルキル、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、又は適当なヘキソース残基から選ばれ；Ｒ3は生体特異的結合反応性物質に連結するためのリンカーであり、チオウレア（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−）、アミノアセトアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−と−ＣＯ−ＮＨ−）、脂肪族チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）及び６−置換−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミンからなる群より選ばれ；そして、ランタノイドイオンは、ユーロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロジウム（ＩＩＩ）及びサマリウム（ＩＩＩ）からなる群より選ばれる。本発明はまた、上記のランタノイドキレートに関する。本発明はさらに、検出可能な上記の分子の用途にも関する。
但し、Ｒ1AとＲ1Bは各々、独立的に、水素原子、メチル、エチル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、ヒドロキシル及び−ＯＲ2からなる群より選ばれ；Ｒ2は、−ＣＨ3、−Ｃ（ＣＨ3）3 及び−Ｃ（ＣＲ4）3からなる群より選ばれ、但しＲ4は炭素数１〜６のアルキル、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、又は適当なヘキソース残基から選ばれ；Ｒ3は生体特異的結合反応性物質に連結するためのリンカーであり、チオウレア（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−）、アミノアセトアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−と−ＣＯ−ＮＨ−）、脂肪族チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）及び６−置換−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミンからなる群より選ばれ；そして、ランタノイドイオンは、ユーロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロジウム（ＩＩＩ）及びサマリウム（ＩＩＩ）からなる群より選ばれる。本発明はまた、上記のランタノイドキレートに関する。本発明はさらに、検出可能な上記の分子の用途にも関する。
Description
本発明は、生体特異的結合反応性物質を保持して検出可能な分子を形成するための発光性ランタノイドキレート、及び該検出可能な分子の、生体親和性に基づく結合アッセイにおける使用に関する。
本発明の背景技術を明らかにするために本願明細書で言及する刊行物などの資料や、特に、発明の実施に関連する詳細を説明するための実例は、本願明細書で言及されることによりここに組み込まれるものである。
生体特異的結合アッセイ（例えば、イムノアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、細胞結合アッセイ）においては、測定すべき検体は、一般に、非常に低濃度である。標識用反応性物質の高感度の検出と定量を可能にする様々な標識化合物が開発されてきた。近年、ランタノイドキレートを用いる時間分解発光分光分析法がイムノアッセイと核酸ハイブリダイゼーションアッセイに応用されている[例えば下記を参照。I. Hemmila, T. Stalberg, and P. Mottram (eds.), “Bioanalytical Applications of Labelling Technologies”, Wallac, Turku, 1994 and D. Wild (eds.), “The Immunoassay Handbook”, Nature Publishing Group, 2001]。安定な光励起発光性（photoluminescent）ランタノイドキレートは、他の用途、例えば、蛍光顕微鏡法や血球計算法にも用いられている（本願明細書の文脈においては、「光励起発光性」を単に「発光性（luminescent）」と称する）。したがって、これらの時間分解蛍光分析法の用途に適した、新たな高度発光性キレートの開発のための多くの試みがなされてきた。これらの従来技術の例としては、ピリジン誘導体からなる安定なキレート（米国特許第4,920,195号; 米国特許第4,801,77号; 米国特許第4,761,481号; Bush. C.E. et al., 1992, Anal. Biochem., 202,146; WO 92/14841; Hemmila, et al.,1993, J. Biochem. Biophys. Methods, 26, 283; 米国特許第5,571,897号; 米国特許第5,859,215号; Latva, M. et al., 1997, J. Luminescence, 75, 149; Takalo, H. et al., 1996, Helv. Chim. Acta, 79, 789; von Lode, P. et al., 2003, Anal.Chem.75, 3193; 米国特許第7,018,851号; WO 2005/021538; 米国特許出願公開第2005/0181393号)、ビピリジン（米国特許第5,216,134号）、テルピリジン（米国特許第4,859,777号; 米国特許第5,202,423号; 米国特許第5,324,825号)、エネルギー仲介基としての種々のフェノール性化合物（米国特許第4,670,572号; 米国特許第4,794,191号; イタリア国特許第1235668号）や、キレート部としてのポリカルボン酸が挙げられる。加えて、種々のジカルボン酸誘導体（米国特許第5,032,677号; 米国特許第5,055,578号; 米国特許第4,772,563号）、大環状クリプタート（米国特許第4,927,923号; WO 93/5049; EP 0 493 745）、カリックスアレーン（Sato, N. et al., 1993, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 621; Steemers, F.J. et al., 1995, J. Am. Chem. Soc., 117, 9408）、ＤＴＰＡカルボスチリル１２４複合体（Selvin, P.R., et al., 1994, J. Am. Chem. Soc., 116, 6029)、及び大環状シッフ塩基（EP 0 369 000）が特許出願明細書及び／又は特許公報に開示されている。
２つ又は３つの別の４−（フェニルエチニル）ピリジン部分を有するキレート（Takalo, H. et al., Helv. Chim. Acta, 79, 789）が発表されて以来、特許出願や刊行物において、上記キレート構造体のフェニルエチニルを２−フリルやトリアルコキシフェニルで置換した構造体が応用されてきた（WO 2005/021538; 米国特許出願公開第2005/0181393号, Jaakkola, L. et al., 2005, Bioconjugate Chem., 16, 700）。更に、２つの反応性官能基を組み合わせることにより標識を生体特異的結合反応性物質に連結して、高度発光性キレートが得られている（米国特許第7,018,851号）。２,４,６−トリメトキシピリジン発色団を有するキレートが高度発光性を示し、特に、Ｔｂ（ＩＩＩ）イオンやＤｙ（ＩＩＩ）イオンを用いた場合により優れた発光性を示すことが知られている（米国特許第4,761,481号; Hemmila, et al., 1993, J. Biochem. Biophys. Methods, 26, 283; Latva, M. et al., 1997, J. Luminescence, 75, 149; 米国特許出願公開第2005/0181393号; Jaakkola, L. et al., 2005, Bioconjugate Chem., 16, 700）。リガンドの三重項状態のエネルギーレベル、発色団の性質及び生体分子結合基が、Ｔｂ（ＩＩＩ）標識の発光特性に有意な影響をもつ(例えば、Sabbatini, N. et al., 1991, J. Luminescence 48 & 49: 463; Hemmila, et al., 1997, J. of Alloys and Compounds 249, 158 を参照)。このように、キレート構造をわずかに変化させただけで、Ｔｂ（ＩＩＩ）標識の発光が有意に低下する場合がある。
発色団の添加によりリガンドとキレートの水への溶解度が減少し、標識過程で生体特異的結合反応性物質の凝集体形成が進み、標識された生体分子の生体非特異的結合特性が高まることが知られている。凝集体は、精製工程に問題を生じ、標識された物質の収率が低下する。また、標識された生体分子の非特異的結合が増加することにより、生体特異的アッセイのバックグラウンド発光が増加し、アッセイの感度が減少する。
発明の概要
本発明の１つの目的は、発光性ランタノイドキレートに保持された生体特異的結合反応性物質を含む検出可能な分子を提供することにある。
本発明の１つの目的は、発光性ランタノイドキレートに保持された生体特異的結合反応性物質を含む検出可能な分子を提供することにある。
本発明の他の１つの目的は、発光性ランタノイドキレートを提供することにある。
本発明の更なる目的は、生体特異的結合アッセイにおける、検出可能な本発明の分子の使用を提供することにある。
したがって、本発明においては、発光性ランタノイドキレートに保持された生体特異的結合反応性物質を含む検出可能な分子であって、該発光性ランタノイドキレートが、ランタノイドイオンと、下記式（Ｉ）で表されるキレートリガンドからなる、ことを特徴とする検出可能な分子が提供される。
但し、
ａ） Ｒ1AとＲ1Bは各々、独立的に、水素原子、メチル、エチル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、ヒドロキシル及び−ＯＲ2からなる群より選ばれ；
ａ） Ｒ1AとＲ1Bは各々、独立的に、水素原子、メチル、エチル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、ヒドロキシル及び−ＯＲ2からなる群より選ばれ；
ｂ） Ｒ2は、−ＣＨ3、−Ｃ（ＣＨ3）3 及び−Ｃ（ＣＲ4）3からなる群より選ばれ、但しＲ4は炭素数１〜６のアルキル、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、
ｃ） Ｒ3は生体特異的結合反応性物質に連結するためのリンカーであり、チオウレア（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−）、アミノアセトアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−と−ＣＯ−ＮＨ−）、脂肪族チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）及び６−置換−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミンからなる群より選ばれ；そして
ｄ） ランタノイドイオンは、ユーロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロジウム（ＩＩＩ）及びサマリウム（ＩＩＩ）からなる群より選ばれる。
また、本発明においては、ランタノイドイオンと、下記式（Ｉ）で表されるキレートリガンドからなる、ことを特徴とする発光性ランタノイドキレートが提供される。
但し、
ａ） Ｒ1AとＲ1Bは各々、独立的に、水素原子、メチル、エチル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、ヒドロキシル及び−ＯＲ2からなる群より選ばれ；
ａ） Ｒ1AとＲ1Bは各々、独立的に、水素原子、メチル、エチル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、ヒドロキシル及び−ＯＲ2からなる群より選ばれ；
ｂ） Ｒ2は、−ＣＨ3、−Ｃ（ＣＨ3）3 及び−Ｃ（ＣＲ4）3からなる群より選ばれ、但しＲ4は炭素数１〜６のアルキル、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、
ｃ） Ｒ3は生体特異的結合反応性物質に連結するためのリンカーであり、アミノ、アミノオキシ、カルボキシ、アルデヒド、メルカプト及びそれらの活性誘導体からなる群より選ばれ；そして
ｄ） ランタノイドイオンは、ユーロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロジウム（ＩＩＩ）及びサマリウム（ＩＩＩ）からなる群より選ばれる。
更に、本発明においては、生体特異的結合アッセイにおける、検出可能な本発明の分子の使用が提供される。
発明の詳細な説明
本発明の目的は、特異的生体親和性に基づく結合アッセイ（例えば、イムノアッセイ（不均質アッセイと均質アッセイの両方）、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、免疫細胞化学アッセイ、又は蛍光分析又は時間分解蛍光分析による特異的発光の決定を利用する免疫組織化学アッセイ）において使用するための改良されたランタノイドキレート標識を得るための手段を提供することにある。
本発明の目的は、特異的生体親和性に基づく結合アッセイ（例えば、イムノアッセイ（不均質アッセイと均質アッセイの両方）、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、免疫細胞化学アッセイ、又は蛍光分析又は時間分解蛍光分析による特異的発光の決定を利用する免疫組織化学アッセイ）において使用するための改良されたランタノイドキレート標識を得るための手段を提供することにある。
本発明のキレートは、下記に列挙するようないくつもの重要な特徴を１つの標識にまとめるものである。
１．好適な波長、好ましくは３００ｎｍ以上、での高い光吸収。
２．１つのリガンド構造体に存在する複数の異なるＵＶ吸収部分（発色団）、好ましくは２つの発色団。
３．ＵＶ吸収部分（三重項増感剤）からランタノイドイオンへの効果的なエネルギー転移。
４．強力なキレート部分により、ａ）標識された反応性物質を長時間にわたり貯蔵するのに必要な熱力学的安定性が得られ、また、ｂ）競合する金属イオンやキレート剤が存在する条件下での反応性物質の使用を可能にする高い速度論的安定性が得られる。
５．キレートされたイオンをできる限り完全に保護できるキレート部分、好ましくは９座のリガンド。
６．結合反応性物質（例えば抗体）の結合特性を損なわず、また、標識の発光特性を低下させずに、キレートを結合反応性物質に効果的に連結できる官能基。
７．高い水溶性を与え、生体分子の標識の際の凝集体形成を防止でき、標識された生体分子の非特異的結合を防止できる官能基。
７．高い水溶性を与え、生体分子の標識の際の凝集体形成を防止でき、標識された生体分子の非特異的結合を防止できる官能基。
本発明は、上記のような発光性ランタノイドキレートに保持された生体特異的結合反応性物質を含む検出可能な分子に関する。
生体特異的結合反応性物質を発光性ランタノイドキレートに保持するための方法は、先行技術文献、例えば、Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press (1996)に記載されている。
好ましくは、Ｒ1AとＲ1Bは同一である。
本発明における「生体特異的結合反応性物質」という用語は、他の分子を結合可能なあらゆる物質や分子を含む用語である。生体特異的結合反応性物質は、典型的には、抗体、抗原、受容体リガンド、特異的結合性タンパク質又はペプチド、核酸分子、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブ、リボ核酸（ＲＮＡ）プローブ、核酸誘導体（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ））、及び、核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）と核酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むキメラ分子、からなる群より選ばれ、また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及び／又はＬＮＡを含むキメラプローブ分子を含むが、これらに限定されない。
本発明における「生体特異的結合アッセイ」という用語は、試料中の検体分子の存在又は存在と量を決定するために用いられる方法や技術を意味する用語である。生体特異的結合アッセイの例としては、イムノアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、核酸増幅アッセイ（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応法、ＮＡＳＢＡ法（nucleic acid sequence based amplification）、ＲＣＡ法（rolling circle amplification reaction）などに基づく）、受容体結合アッセイ、及び細胞結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。生体特異的結合アッセイは、均質アッセイでもよいし、不均質アッセイでもよい。均質アッセイでは、全てのアッセイ成分が溶液相中に存在し、生体特異的結合事象を検出するために、結合標識分子を未結合標識分子から物理的に分離する必要はない。一方、不均質アッセイでは、結合標識分子を未結合標識分子から分離した後でのみ、生体特異的結合事象を検出することができる。
本発明はまた、生体特異的結合アッセイにおける、検出可能な本発明の分子の使用に関する。これらのアッセイにおいて、検出可能な従来技術の分子の代わりに検出可能な本発明の分子を用いることにより、アッセイを改善することができる。
本発明は更に、上記の発光性ランタノイドキレートに関する。
本発明におけるリンカー基であるＲ3がアミノ、アミノオキシ、カルボニル、アルデヒド又はメルカプトの活性誘導体である場合は、Ｒ3は、イソシアナト、イソチオシアナト、ジアゾニウム、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、反応性エステル類、ピリジル−２−ジチオ及び６−置換−４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノからなる群より選ぶことができる。
６−置換−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミンと６−置換−４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノにおける６位の置換基は、水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ、アリーロキシ、アミノ、炭素数１〜６のアルキル、置換アミノ及び置換チオエーテルからなる群より選ぶことができ、好ましくは、塩素原子、フッ素原子、エトキシ、２−メトキシエトキシ、２−シアノエトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、チオフェノキシ及びエトキシカルボニルチオメトキシからなる群より選ぶことができる。置換アミノ及び置換チオエーテルは１置換又は２置換であることが好ましく、置換基は、各々、独立的に、炭素数１〜６のアルキル又はアルコキシ、フェニル、カルボニル及びカルボキシルからなる群より選ばれることが好ましい。
Ｒ3基を固体支持体に保持する場合は、Ｒ3基が、重合性基である反応性基を有することが好ましい。
キレートリガンドを、ペプチド又はオリゴヌクレオチド合成において標識ペプチド又は標識オリゴヌクレオチドを調製する手段として用いる（例えば、米国特許出願公開第2005/0181393号に記載されるように）場合は、２つの発色団の間の架橋（即ち、Ｒ3−Ｐｈ−ＣＨ2−ＣＨ2−）は、例えば米国特許出願公開第2005/0181393号に記載されるような官能基であることが好ましい。
本発明の好ましい態様においては、ランタノイドイオンは、テルビウム（ＩＩＩ）又はジスプロジウム（ＩＩＩ）である。
以下の実施例では、標識試薬のバイオアッセイへの適合性が示される。実施例８は、消光反応に基づく均質ハイブリダイゼーションアッセイを開示し、実施例９は、ＰＣＲ産物の均質検出を開示している。
実施例のキレート７（化合物７）が２，４，６−トリメトキシフェニルピリジン部分を２つ有する場合に相当する化合物、即ち、{２，２’，２’’，２’’’−｛［２−（４−イソチオシアナトフェニル)−エチルイミノ］ビス（メチレン）ビス［４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ピリジン−６，２−ジイル）］ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタト）｝テルビウム（ＩＩＩ）は、水溶性が非常に低いので、標識試薬としては不適切であることは注目に値する。
実施例で用いられる構造体と合成経路を反応スキーム１に示す。反応スキーム１は、実施例１〜７で例示される化合物７の合成を示すものである。
４−ヨード−３−メトキシフェノール（化合物１）の合成
３−メトキシフェノール（２．０ｍｌ、１８．２ｍｍｏｌ）を乾燥したＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解した。得られた混合物にヨウ化ナトリウム（３．３ｇ、２１．９ｍｍｏｌ）とクロラミンＴ（５．０ｇ、２１．９ｍｍｏｌ）とを添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた。得られた反応混合物を水（１５０ｍｌ）で希釈し、５％の塩酸で酸性化し、酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。有機層を５％のチオ硫酸ナトリウム溶液（２００ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。得られた生成物を、シリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィーを２回行うことによって精製した（溶離液として、１回目はジクロロメタンを用い、２回目は酢酸エチルの２０％石油エーテル溶液を用いる）。収量は、０．８２ｇ（１８％）であった。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）： δ ７．５２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、６．６３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．０Ｈｚ）、６．３７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、３．０Ｈｚ）、５．２７（１Ｈ、ｓ）、３．８１（３Ｈ、ｓ）。
３−メトキシフェノール（２．０ｍｌ、１８．２ｍｍｏｌ）を乾燥したＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解した。得られた混合物にヨウ化ナトリウム（３．３ｇ、２１．９ｍｍｏｌ）とクロラミンＴ（５．０ｇ、２１．９ｍｍｏｌ）とを添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた。得られた反応混合物を水（１５０ｍｌ）で希釈し、５％の塩酸で酸性化し、酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。有機層を５％のチオ硫酸ナトリウム溶液（２００ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。得られた生成物を、シリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィーを２回行うことによって精製した（溶離液として、１回目はジクロロメタンを用い、２回目は酢酸エチルの２０％石油エーテル溶液を用いる）。収量は、０．８２ｇ（１８％）であった。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）： δ ７．５２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、６．６３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．０Ｈｚ）、６．３７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、３．０Ｈｚ）、５．２７（１Ｈ、ｓ）、３．８１（３Ｈ、ｓ）。
ｔｅｒｔ−ブチル（４−ヨード−３−メトキシフェノキシ）アセテート（化合物２）の合成
化合物１（０．８ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）を乾燥したＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶解した。乾燥させた炭酸カリウム（１．３２ｇ、９．５７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物をアルゴンで脱気した。得られた混合物にｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート（０．７１ｍｌ、４．７８ｍｍｏｌ）を添加し、攪拌しながら７０℃で一晩反応させた。得られた反応混合物を室温にまで冷却し、水（２０ｍｌ）で希釈した。得られた生成物をジエチルエーテル（３×５０ｍｌ）で抽出し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。得られた生成物を、シリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィー（溶離液としてジクロロメタンを用いる）を行うことによって精製した。収量は、１．１ｇ（９６％）であった。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）： δ ７．６６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、６．３９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２．５Ｈｚ）、６．３４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．５）、４．５７（２Ｈ、ｓ）、３．７９（３Ｈ、ｓ）、１．５１（９Ｈ、ｓ）。
化合物１（０．８ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）を乾燥したＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶解した。乾燥させた炭酸カリウム（１．３２ｇ、９．５７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物をアルゴンで脱気した。得られた混合物にｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート（０．７１ｍｌ、４．７８ｍｍｏｌ）を添加し、攪拌しながら７０℃で一晩反応させた。得られた反応混合物を室温にまで冷却し、水（２０ｍｌ）で希釈した。得られた生成物をジエチルエーテル（３×５０ｍｌ）で抽出し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。得られた生成物を、シリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィー（溶離液としてジクロロメタンを用いる）を行うことによって精製した。収量は、１．１ｇ（９６％）であった。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）： δ ７．６６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、６．３９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２．５Ｈｚ）、６．３４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．５）、４．５７（２Ｈ、ｓ）、３．７９（３Ｈ、ｓ）、１．５１（９Ｈ、ｓ）。
ｔｅｒｔ−ブチル［３−メトキシ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ］アセテート（化合物３）の合成
化合物２（１．０５ｇ、２．８８ｍｍｏｌ）を乾燥したＤＭＦ（２０ｍｌ）に溶解した。ビス（ピナコラート）ジボロン（０．８８ｇ、３．４６ｍｍｏｌ）と酢酸カリウム（０．８５ｇ、８．６４ｍｍｏｌ）とを添加した。得られた反応混合物をアルゴンで脱気した。酢酸パラジウム（１９．３ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を添加し、攪拌しながら８５℃で３時間反応させた。得られた反応混合物を室温にまで冷却し、水（４０ｍｌ）と酢酸エチル（４０ｍｌ）とで希釈した。セライト（Celite）のパッドを用いた濾過によって黒色の粒子を除去した。有機層を分離し、水（３０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。得られた生成物を、シリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィー（溶離剤としてメタノールの３％ジクロロメタン溶液を用いる）を行うことによって精製した。収量は、０．２６ｇ（２５％）であった。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）： δ ７．７９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、６．５９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２．５Ｈｚ）、６．３１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ）、４．５４（２Ｈ、ｓ）、３．８３（３Ｈ、ｓ）、１．５５（９Ｈ、ｓ）、１．２８（１２Ｈ、ｓ）。
化合物２（１．０５ｇ、２．８８ｍｍｏｌ）を乾燥したＤＭＦ（２０ｍｌ）に溶解した。ビス（ピナコラート）ジボロン（０．８８ｇ、３．４６ｍｍｏｌ）と酢酸カリウム（０．８５ｇ、８．６４ｍｍｏｌ）とを添加した。得られた反応混合物をアルゴンで脱気した。酢酸パラジウム（１９．３ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を添加し、攪拌しながら８５℃で３時間反応させた。得られた反応混合物を室温にまで冷却し、水（４０ｍｌ）と酢酸エチル（４０ｍｌ）とで希釈した。セライト（Celite）のパッドを用いた濾過によって黒色の粒子を除去した。有機層を分離し、水（３０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。得られた生成物を、シリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィー（溶離剤としてメタノールの３％ジクロロメタン溶液を用いる）を行うことによって精製した。収量は、０．２６ｇ（２５％）であった。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）： δ ７．７９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、６．５９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２．５Ｈｚ）、６．３１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ）、４．５４（２Ｈ、ｓ）、３．８３（３Ｈ、ｓ）、１．５５（９Ｈ、ｓ）、１．２８（１２Ｈ、ｓ）。
テトラ（ｔｅｒｔ−ブチル）−２，２’，２’’，２’’’−｛［２−（４−アミノフェニル）エチルイミノ］ビス（メチレン）ビス｛４−｛２−メトキシ−４−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−メトキシ］フェニル｝ピリジン−６，２−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセテート）（化合物４）の合成
化合物３（０．１１ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）とテトラ（ｔｅｒｔ−ブチル）−２，２’，２’’，２’’’−｛［２−（４−アミノフェニル）エチルイミノ］ビス（メチレン）ビス（４−ブロモピリジン−６，２−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセテート）（０．１０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）とを乾燥したＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解した。得られた混合物をアルゴンで脱気した。得られた混合物に、炭酸セシウム（０．１１ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（４．６ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）とを添加し、攪拌しながら８０℃で一晩反応させた。得られた反応混合物を室温にまで冷却し、水（１０ｍｌ）と酢酸エチル（１０ｍｌ）とで希釈した。セライトのパッドを用いた濾過によって黒色の粒子を除去した。有機層を分離し、塩水（brine）（２０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。得られた生成物を、シリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィーを２回行うことによって精製した（溶離剤として、１回目はメタノールの５％ジクロロメタン溶液を用い、２回目はメタノールの１０％ジクロロメタン溶液を用いる）。収量は、９０．０ｍｇ（６９％）であった。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）： δ ７．６３−７．７２（４Ｈ、ｍ）、７．２４（２Ｈ、ｓ）、６．９０（２Ｈ、ｄ）、６．５５（２Ｈ、ｄ）、６．５０（２Ｈ、ｄ）、６．４１（２Ｈ、ｓ）、４．４２（４Ｈ、ｓ）、４．０８（４Ｈ、ｓ）、３．９６（４Ｈ、ｓ）、３．８３（６Ｈ、ｓ）、３．５３（８Ｈ、ｓ）、２．６８−２．９７（４Ｈ、ｍ）、１．４５（５４Ｈ、ｍ）。
化合物３（０．１１ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）とテトラ（ｔｅｒｔ−ブチル）−２，２’，２’’，２’’’−｛［２−（４−アミノフェニル）エチルイミノ］ビス（メチレン）ビス（４−ブロモピリジン−６，２−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセテート）（０．１０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）とを乾燥したＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解した。得られた混合物をアルゴンで脱気した。得られた混合物に、炭酸セシウム（０．１１ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（４．６ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）とを添加し、攪拌しながら８０℃で一晩反応させた。得られた反応混合物を室温にまで冷却し、水（１０ｍｌ）と酢酸エチル（１０ｍｌ）とで希釈した。セライトのパッドを用いた濾過によって黒色の粒子を除去した。有機層を分離し、塩水（brine）（２０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。得られた生成物を、シリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィーを２回行うことによって精製した（溶離剤として、１回目はメタノールの５％ジクロロメタン溶液を用い、２回目はメタノールの１０％ジクロロメタン溶液を用いる）。収量は、９０．０ｍｇ（６９％）であった。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）： δ ７．６３−７．７２（４Ｈ、ｍ）、７．２４（２Ｈ、ｓ）、６．９０（２Ｈ、ｄ）、６．５５（２Ｈ、ｄ）、６．５０（２Ｈ、ｄ）、６．４１（２Ｈ、ｓ）、４．４２（４Ｈ、ｓ）、４．０８（４Ｈ、ｓ）、３．９６（４Ｈ、ｓ）、３．８３（６Ｈ、ｓ）、３．５３（８Ｈ、ｓ）、２．６８−２．９７（４Ｈ、ｍ）、１．４５（５４Ｈ、ｍ）。
２，２’，２’’，２’’’−｛［２−（４−アミノフェニル）エチルイミノ］ビス（メチレン）ビス｛４−｛２−メトキシ−４−（カルボキシメトキシ）フェニル］ピリジン−６，２−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（酢酸）（化合物５）の合成
化合物４（４０．０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（０．４０ｍｌ）に溶解することによって得られる溶液を、室温で２時間攪拌した。加熱せずに蒸発を行った後、混合物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）でトリチュレート（triturate）して濾過した。濾過によって純粋な生成物が得られた。収量は、５３ｍｇであった。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6−ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）： δ ７．８７（２Ｈ、ｍ）、７．７５（２Ｈ、ｓ）、７．３８（２Ｈ、ｍ）、７．１７（２Ｈ、ｍ）、６．９９（２Ｈ、ｍ）、６．６８（２Ｈ、ｄ）、６．６１（２Ｈ、ｍ）、４．７４（４Ｈ、ｓ）、４．５４（４Ｈ、ｓ）、４．０９（４Ｈ、ｍ）、３．８０（６Ｈ、ｓ）、３．５６（８Ｈ、ｓ）、３．０９（４Ｈ、ｍ）。
化合物４（４０．０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（０．４０ｍｌ）に溶解することによって得られる溶液を、室温で２時間攪拌した。加熱せずに蒸発を行った後、混合物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）でトリチュレート（triturate）して濾過した。濾過によって純粋な生成物が得られた。収量は、５３ｍｇであった。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6−ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）： δ ７．８７（２Ｈ、ｍ）、７．７５（２Ｈ、ｓ）、７．３８（２Ｈ、ｍ）、７．１７（２Ｈ、ｍ）、６．９９（２Ｈ、ｍ）、６．６８（２Ｈ、ｄ）、６．６１（２Ｈ、ｍ）、４．７４（４Ｈ、ｓ）、４．５４（４Ｈ、ｓ）、４．０９（４Ｈ、ｍ）、３．８０（６Ｈ、ｓ）、３．５６（８Ｈ、ｓ）、３．０９（４Ｈ、ｍ）。
２，２’，２’’，２’’’−｛［２−（４−アミノフェニル）エチルイミノ］ビス（メチレン）ビス｛４−｛２−メトキシ−４−（カルボキシメトキシ）フェニル］ピリジン−６，２−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタート）｝テルビウム（ＩＩＩ）（化合物６）の合成
化合物５（４９．２ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）を水（１ｍｌ）に溶解し、固体の炭酸水素ナトリウムを用いてｐＨを６．５に調整した。テルビウム（ＩＩＩ）クロライドヘキサハイドレート（１５．４ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）を水（０．２ｍｌ）に溶解することによって得られる溶液を１０分以内で添加し、固体の炭酸水素ナトリウムを用いてｐＨを６．５に維持した。攪拌しながら室温で２時間反応させた後、１Ｍの水酸化ナトリウムを用いてｐＨを８．５に上げ、得られる沈殿物を遠心分離によって除去した。濾液をアセトンで処理し、生成物を遠心分離によって集め、アセトンで洗浄した。生成物は精製せずに次の工程で用いた。収量は、１９．６ｍｇ（４７％）であった。ＵＶ（５０ｍＭのカーボネートバッファー、ｐＨは９．８）： ３０８、２８１。Ｃ48Ｈ48Ｎ6Ｏ16Ｔｂのためのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）： 計算値は１１２３．８５、測定値は１１２２．８５（Ｍ−１）-。
化合物５（４９．２ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）を水（１ｍｌ）に溶解し、固体の炭酸水素ナトリウムを用いてｐＨを６．５に調整した。テルビウム（ＩＩＩ）クロライドヘキサハイドレート（１５．４ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）を水（０．２ｍｌ）に溶解することによって得られる溶液を１０分以内で添加し、固体の炭酸水素ナトリウムを用いてｐＨを６．５に維持した。攪拌しながら室温で２時間反応させた後、１Ｍの水酸化ナトリウムを用いてｐＨを８．５に上げ、得られる沈殿物を遠心分離によって除去した。濾液をアセトンで処理し、生成物を遠心分離によって集め、アセトンで洗浄した。生成物は精製せずに次の工程で用いた。収量は、１９．６ｍｇ（４７％）であった。ＵＶ（５０ｍＭのカーボネートバッファー、ｐＨは９．８）： ３０８、２８１。Ｃ48Ｈ48Ｎ6Ｏ16Ｔｂのためのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）： 計算値は１１２３．８５、測定値は１１２２．８５（Ｍ−１）-。
２，２’，２’’，２’’’−｛［２−（４−イソチオシアナトフェニル）エチルイミノ］ビス（メチレン）ビス｛４−｛２−メトキシ−４−（カルボキシメトキシ）フェニル］ピリジン−６，２−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタート）｝テルビウム（ＩＩＩ）（化合物７）の合成
化合物６（１８．４ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）を水（０．５ｍｌ）に添加して得られる混合物をチオホスゲン（５．０μｌ、０．０６６ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（６．９ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）及びクロロホルム（０．５ｍｌ）の混合物に徐々に添加した。室温で１時間攪拌した後、水相をクロロホルム（３×１ｍｌ）で洗浄した。水溶液のｐＨを１Ｍの酢酸で７．０に調整し、アセトンを添加した。得られた生成物を遠心分離によって集め、アセトンで洗浄した。収量は、１６．１ｍｇ（８４％）であった。ＵＶ（５０ｍＭのカーボネートバッファー、ｐＨは９．８）： ３１０、２７８。Ｃ49Ｈ46Ｎ6Ｏ16ＳＴｂのためのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ： 計算値は１１６５．９１、測定値は１１６４．８４（Ｍ−１）-。
化合物６（１８．４ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）を水（０．５ｍｌ）に添加して得られる混合物をチオホスゲン（５．０μｌ、０．０６６ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（６．９ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）及びクロロホルム（０．５ｍｌ）の混合物に徐々に添加した。室温で１時間攪拌した後、水相をクロロホルム（３×１ｍｌ）で洗浄した。水溶液のｐＨを１Ｍの酢酸で７．０に調整し、アセトンを添加した。得られた生成物を遠心分離によって集め、アセトンで洗浄した。収量は、１６．１ｍｇ（８４％）であった。ＵＶ（５０ｍＭのカーボネートバッファー、ｐＨは９．８）： ３１０、２７８。Ｃ49Ｈ46Ｎ6Ｏ16ＳＴｂのためのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ： 計算値は１１６５．９１、測定値は１１６４．８４（Ｍ−１）-。
消光反応の効率
開発したテルビウムキレートの、消光反応に基づく均質ハイブリダイゼーションアッセイにおける適合性を特徴付けるために、以下の配列：5'-AAT TTA GAA GTC ATT AGC GAG CAG GCT ACC G-3'（配列番号１）を有する５’アミノ修飾オリゴヌクレオチドプローブを、２種の異なるランタノイドキレートをそれぞれ用いた２種の個別の標識−精製反応によって標識し、精製した。使用したランタノイドキレートは、本発明のキレート（化合物７）、及び２，２’，２’’，２’’’−｛｛６，６’−｛４’’−［２−（４−イソチオシアナトフェニル）エチル］−１Ｈ−ピラゾール−１’’，３’’−ジイル｝ビス（ピリジン）−２，２’−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタト）テルビウム（ＩＩＩ）（米国特許第5,859,215号）である。本願明細書で使用する「消光反応に基づく均質ハイブリダイゼーションアッセイ」という用語は、例えば、Kiviniemi et al.（Clin Biochem. 2003 Nov; 36(8):633-40. A homogeneous high-throughput genotyping method based on competitive hybridization. Kiviniemi M, Nurmi J, Turpeinen H, Lovgren T, Ilonen J.）に記載されている核酸検出方法を意味する。Nurmi et al.（Anal Chem. 2002 Jul 15; 74(14):3525-32. High-performance real-time quantitative RT-PCR using lanthanoid probes and a dual-temperature hybridization assay. Nurmi J, Wikman T, Karp M, Lovgren T.）に記載された方法に従って各キレートでプローブを標識し、精製した。以下の実験では、同じ塩基配列を有するが、標識として異なるテルビウムキレートを保有する２種のプローブ、即ち、本発明のキレート（化合物７）で標識したプローブ及び従来技術のキレートで標識したプローブをそれぞれプローブ１及びプローブ２と称する。
開発したテルビウムキレートの、消光反応に基づく均質ハイブリダイゼーションアッセイにおける適合性を特徴付けるために、以下の配列：5'-AAT TTA GAA GTC ATT AGC GAG CAG GCT ACC G-3'（配列番号１）を有する５’アミノ修飾オリゴヌクレオチドプローブを、２種の異なるランタノイドキレートをそれぞれ用いた２種の個別の標識−精製反応によって標識し、精製した。使用したランタノイドキレートは、本発明のキレート（化合物７）、及び２，２’，２’’，２’’’−｛｛６，６’−｛４’’−［２−（４−イソチオシアナトフェニル）エチル］−１Ｈ−ピラゾール−１’’，３’’−ジイル｝ビス（ピリジン）−２，２’−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタト）テルビウム（ＩＩＩ）（米国特許第5,859,215号）である。本願明細書で使用する「消光反応に基づく均質ハイブリダイゼーションアッセイ」という用語は、例えば、Kiviniemi et al.（Clin Biochem. 2003 Nov; 36(8):633-40. A homogeneous high-throughput genotyping method based on competitive hybridization. Kiviniemi M, Nurmi J, Turpeinen H, Lovgren T, Ilonen J.）に記載されている核酸検出方法を意味する。Nurmi et al.（Anal Chem. 2002 Jul 15; 74(14):3525-32. High-performance real-time quantitative RT-PCR using lanthanoid probes and a dual-temperature hybridization assay. Nurmi J, Wikman T, Karp M, Lovgren T.）に記載された方法に従って各キレートでプローブを標識し、精製した。以下の実験では、同じ塩基配列を有するが、標識として異なるテルビウムキレートを保有する２種のプローブ、即ち、本発明のキレート（化合物７）で標識したプローブ及び従来技術のキレートで標識したプローブをそれぞれプローブ１及びプローブ２と称する。
プローブ１及びプローブ２の産生するシグナルが相補的な消光プローブによっていかに効率よく消光されるのかを決定するために、以下の４種の反応系を調製した。
１． １×ＰＣＲバッファーＩＩと２．５ｍＭのＭｇＣｌ2（米国、フォスターシティー、Applied Biosystems社）で調製した１７ｎＭのプローブ１を含む５０μｌの反応系。
２． １×ＰＣＲバッファーＩＩと２．５ｍＭのＭｇＣｌ2（米国、フォスターシティー、Applied Biosystems社）で調製した１７ｎＭのプローブ１と１７０ｎＭの消光プローブを含む５０μｌの反応系。プローブ１とプローブ２に相補的な消光プローブの配列は5'-TCG CTA ATG ACT TCT AAA TT-3'（配列番号２）であり、３’末端に消光ラベルＱＳＹ７を保有している。
３． １×ＰＣＲバッファーＩＩと２．５ｍＭのＭｇＣｌ2（米国、フォスターシティー、Applied Biosystems社）で調製した１７ｎＭのプローブ２を含む５０μｌの反応系。
４． １×ＰＣＲバッファーＩＩと２．５ｍＭのＭｇＣｌ2（米国、フォスターシティー、Applied Biosystems社）で調製した１７ｎＭのプローブ２と１７０ｎＭの消光プローブを含む５０μｌの反応系。
１． １×ＰＣＲバッファーＩＩと２．５ｍＭのＭｇＣｌ2（米国、フォスターシティー、Applied Biosystems社）で調製した１７ｎＭのプローブ１を含む５０μｌの反応系。
２． １×ＰＣＲバッファーＩＩと２．５ｍＭのＭｇＣｌ2（米国、フォスターシティー、Applied Biosystems社）で調製した１７ｎＭのプローブ１と１７０ｎＭの消光プローブを含む５０μｌの反応系。プローブ１とプローブ２に相補的な消光プローブの配列は5'-TCG CTA ATG ACT TCT AAA TT-3'（配列番号２）であり、３’末端に消光ラベルＱＳＹ７を保有している。
３． １×ＰＣＲバッファーＩＩと２．５ｍＭのＭｇＣｌ2（米国、フォスターシティー、Applied Biosystems社）で調製した１７ｎＭのプローブ２を含む５０μｌの反応系。
４． １×ＰＣＲバッファーＩＩと２．５ｍＭのＭｇＣｌ2（米国、フォスターシティー、Applied Biosystems社）で調製した１７ｎＭのプローブ２と１７０ｎＭの消光プローブを含む５０μｌの反応系。
反応系を調製した後に、テルビウム測定用デフォルトパラメーターを用いたVictor 2マルチラベルカウンター（フィンランド国、PerkinElmer Life and Analytical Sciences Wallac社）でそれぞれのテルビウムシグナルを計測した。消光反応に基づく均質ハイブリダイゼーションアッセイにおいてプローブ１及びプローブ２を用いて達成しうる最大シグナル−ノイズ比については、反応系１から得たシグナル値を反応系２のシグナル値で除してプローブ１の値を決定し、反応系３から得たシグナル値を反応系４のシグナル値で除してプローブ２の値を決定した。
結果を表１に示した。表１から明らかなように、プローブ１単独が放出するシグナルの強度［５９７，２４１カウント／秒（ｃｐｓ）］は、プローブ２単独が放出するシグナル（１３４，７１６ｃｐｓ）よりも高かった。この結果は、長寿命の蛍光をより高い強度で提供する本発明のキレート（化合物７）が従来技術のキレートと比べて優れていることを示している。更に、プローブ１の放出するシグナルは、プローブ２の放出するシグナルよりも効率よく相補的な消光プローブによって消光された。具体的には、消光反応に基づくアッセイでプローブ１を用いて得られうる最大シグナル−ノイズ比は約６５であるが、プローブ２が理論的に提供しうるシグナル−ノイズ比はわずか１４程度である。したがって、本発明のキレートは、消光反応に基づくハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いる標識として適していると結論づけることができる。
表１． プローブ１とプローブ２によって得られうる消光反応の効率。本発明のキレート（化合物７）で標識したプローブ１単独（反応系１）は、先行技術に開示されているキレートで標識したプローブ２単独（反応系３）よりも高いシグナルを示した。遊離標識プローブ１（反応系１）と消光しているプローブ１（反応系２）のシグナル比は、遊離標識プローブ２（反応系３）と消光しているプローブ２（反応系４）のシグナル比よりも高く、これは本発明のキレートが、先行技術に開示されているキレートよりも、均質な消光反応に基づくハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いる標識として適していることを意味する。
ＰＣＲ産物の均質検出における本発明のキレートの適合性
ＰＣＲ産物の均質検出における本発明のテルビウムキレート（化合物７）の適合性を特徴付けるために、細菌であるListeria monocytogenesに特異的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを用いてプローブ１（上記実施例８に記載）とプローブ２（上記実施例８に記載）を比較した。ＰＣＲアッセイにおけるシグナル発生の原理はNurmi et al.（Anal Chem. 2002 Jul 15;74(14):3525-32. High-performance real-time quantitative RT-PCR using lanthanide probes and a dual-temperature hybridization assay. Nurmi J, Wikman T, Karp M, Lovgren T.）に記載されている。
ＰＣＲ産物の均質検出における本発明のテルビウムキレート（化合物７）の適合性を特徴付けるために、細菌であるListeria monocytogenesに特異的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを用いてプローブ１（上記実施例８に記載）とプローブ２（上記実施例８に記載）を比較した。ＰＣＲアッセイにおけるシグナル発生の原理はNurmi et al.（Anal Chem. 2002 Jul 15;74(14):3525-32. High-performance real-time quantitative RT-PCR using lanthanide probes and a dual-temperature hybridization assay. Nurmi J, Wikman T, Karp M, Lovgren T.）に記載されている。
２種の異なるキレートを比較するために、以下の４種の反応系を調製した。
１． Listeria monocytogenesのＤＮＡを含まない、プローブ１の負の対照反応系。
２． 反応によって増幅するためのListeria monocytogenesのＤＮＡを１，０００コピー含む、プローブ１の正の対照反応系。
３． Listeria monocytogenesのＤＮＡを含まない、プローブ２の負の対照反応系。
４． 反応によって増幅するためのListeria monocytogenesのＤＮＡを１，０００コピー含む、プローブ２の正の対照反応系。
１． Listeria monocytogenesのＤＮＡを含まない、プローブ１の負の対照反応系。
２． 反応によって増幅するためのListeria monocytogenesのＤＮＡを１，０００コピー含む、プローブ１の正の対照反応系。
３． Listeria monocytogenesのＤＮＡを含まない、プローブ２の負の対照反応系。
４． 反応によって増幅するためのListeria monocytogenesのＤＮＡを１，０００コピー含む、プローブ２の正の対照反応系。
３０μｌのＰＣＲ反応系は、次の成分からなるものである。１×HotMaster Taq バッファー（ドイツ国、Eppendorf社）、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．３μＭのフォワードプライマー（5'-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC-3'、配列番号３）、０．３μＭのリバースプライマー（5'-GTG TAA TCT TGA TGC CAT CAG G-3'、配列番号４）、２８ｎＭのプローブ１またはプローブ２、２８０ｎＭの消光プローブ（上記実施例１に記載）及び１単位のHotMaster Taq ＤＮＡポリメラーゼ（Eppendorf社）。熱サイクル反応を９６穴のプレートを用いてPTC 200 DNA Engine（米国、MJ Research社）で実施した。熱サイクル反応のプロトコルは、初期の９４℃で２分の変性工程及びそれに続く４０サイクルの９４℃で３０秒と６５℃で１分の反応からなり、その後、反応系を４℃に冷却した。熱サイクル反応後には、テルビウム測定用デフォルト設定値を用いたVictor 2マルチラベルカウンターでテルビウムシグナルを計測した。正の対照反応（反応２と反応４）のシグナル−ノイズ比（Ｓ／Ｎ）は、反応２の平均テルビウムシグナル値を反応１の平均テルビウムシグナル値で除し、反応４の平均テルビウムシグナル値を反応３の平均テルビウムシグナル値で除すことで決定した。
実験の結果を表２に示した。表２から明らかなように、プローブ１を含む負の対照反応の平均シグナル値は８０，８６４ｃｐｓであったが、プローブ１を含む正の対照反応のシグナル値は１，３４２，５６６ｃｐｓであり、シグナル−ノイズ比は１６．６であった。正の対照反応の示す高いシグナル値は標的ＤＮＡ配列の増幅を意味し、本発明のキレートが均質ＰＣＲアッセイにおける標識として非常に適していることを示している。プローブ２をプローブ１の代わりに使用した場合には、シグナル強度とシグナル−ノイズ比が共にプローブ１の場合よりも低かった。具体的には、負の対照反応で得られた平均シグナル値が３２，９７６ｃｐｓ、正の対照反応で得られた平均シグナル値が２４８，３９３ｃｐｓであり、その結果、シグナル−ノイズ比は７．５であった。プローブ１（Ｓ／Ｎ １６．６）とプローブ２（Ｓ／Ｎ ７．５）の間に見られるシグナル−ノイズ比の明確な違いは、本発明のキレートがプローブ２に用いたキレートよりも優れており、均質ＰＣＲアッセイに用いる標識としてより適切であることを示している。即ち、本発明のキレートは、より高いシグナル強度とより高いシグナル−ノイズ比を提供することが可能であり、標的核酸のより感度の高い検出及び正の反応と負の反応のより容易な識別を可能にする。
本発明の方法は多様な態様を含むものであって、そのうちのほんのわずかの態様を本願明細書に記載した。この分野の専門家にとって、他の態様が存在し且つ本発明の精神を逸脱しないものであることは明らかである。したがって、本願明細書に記載した態様は、単に例示に過ぎないのであって、本発明を限定するものではない。
配列番号１： 公知でない
配列番号２： 公知でない
配列番号３： 公知でない
配列番号４： 公知でない
配列番号２： 公知でない
配列番号３： 公知でない
配列番号４： 公知でない
Claims (8)
- 発光性ランタノイドキレートに保持された生体特異的結合反応性物質を含む検出可能な分子であって、該発光性ランタノイドキレートが、ランタノイドイオンと、下記式（Ｉ）で表されるキレートリガンドからなる、ことを特徴とする検出可能な分子。
ａ） Ｒ1AとＲ1Bは各々、独立的に、水素原子、メチル、エチル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、ヒドロキシル及び−ＯＲ2からなる群より選ばれ；
ｂ） Ｒ2は、−ＣＨ3、−Ｃ（ＣＨ3）3 及び−Ｃ（ＣＲ4）3からなる群より選ばれ、但しＲ4は炭素数１〜６のアルキル、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、
ｃ） Ｒ3は生体特異的結合反応性物質に連結するためのリンカーであり、チオウレア（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−）、アミノアセトアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−と−ＣＯ−ＮＨ−）、脂肪族チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）及び６−置換−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミンからなる群より選ばれ；そして
ｄ） ランタノイドイオンは、ユーロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロジウム（ＩＩＩ）及びサマリウム（ＩＩＩ）からなる群より選ばれる。 - 生体特異的結合反応性物質が、抗体、抗原、受容体リガンド、特異的結合性タンパク質又はペプチド、核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ、核酸誘導体、及び、核酸と核酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むキメラ分子、からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１に記載の検出可能な分子。
- 生体特異的結合反応性物質に保持された発光性ランタノイドキレートが｛２，２’，２’’，２’’’−｛［２−（４−イソチオシアナトフェニル）エチルイミノ］ビス（メチレン）ビス｛４−［２−メトキシ−４−（カルボキシメトキシ）フェニル］ピリジン−６，２−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタト）｝テルビウム（ＩＩＩ)であることを特徴とする請求項１に記載の検出可能な分子。
- リンカーであるＲ3が６−置換−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミンであり、６位の置換基が、水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ、アリーロキシ、アミノ、炭素数１〜６のアルキル、置換アミノ及び置換チオエーテルからなる群より選ばれ、好ましくは、塩素原子、フッ素原子、エトキシ、２−メトキシエトキシ、２−シアノエトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、チオフェノキシ及びエトキシカルボニルチオメトキシからなる群より選ばれる、ことを特徴とする請求項１に記載の検出可能な分子。
- ランタノイドイオンと、下記式（Ｉ）で表されるキレートリガンドからなる、ことを特徴とする発光性ランタノイドキレート。
ａ） Ｒ1AとＲ1Bは各々、独立的に、水素原子、メチル、エチル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、ヒドロキシル及び−ＯＲ2からなる群より選ばれ；
ｂ） Ｒ2は、−ＣＨ3、−Ｃ（ＣＨ3）3 及び−Ｃ（ＣＲ4）3からなる群より選ばれ、但しＲ4は炭素数１〜６のアルキル、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯ-、
ｃ） Ｒ3は生体特異的結合反応性物質に連結するためのリンカーであり、アミノ、アミノオキシ、カルボキシ、アルデヒド、メルカプト及びそれらの活性誘導体からなる群より選ばれ；そして
ｄ） ランタノイドイオンは、ユーロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロジウム（ＩＩＩ）及びサマリウム（ＩＩＩ）からなる群より選ばれる。 - リンカーであるＲ3が、イソシアナト、イソチオシアナト、ジアゾニウム、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、反応性エステル類、ピリジル−２−ジチオ及び６−置換−４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノからなる群より選ばれる活性誘導体である、ことを特徴とする請求項５に記載の発光性ランタノイドキレート。
- リンカーであるＲ3が６−置換−４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノであり、６位の置換基が、水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ、アリーロキシ、アミノ、炭素数１〜６のアルキル、置換アミノ及び置換チオエーテルからなる群より選ばれ、好ましくは、塩素原子、フッ素原子、エトキシ、２−メトキシエトキシ、２−シアノエトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、チオフェノキシ及びエトキシカルボニルチオメトキシからなる群より選ばれる、ことを特徴とする請求項５に記載の発光性ランタノイドキレート。
- 生体特異的結合アッセイにおける、請求項１〜４のいずれかの検出可能な分子の使用。
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