ES2356021T3 - Reactivos de marcaje de lantánido luminiscentes y su uso. - Google Patents

Abstract

Molécula detectable que comprende un reactante de unión bioespecífico unido a un quelato de lantánido luminiscente que comprende un ión lantánido y un ligando quelante de fórmula (I) en la que, a) R1A y R1B se seleccionan independientemente entre sí del grupo que consiste en hidrógeno, metilo, etilo, -COOH, -COO-, -CH2COOH, -CH2COO-, hidroxilo u OR2; b) R2 se selecciona del grupo que consiste en -CH3, -C(CH3)3, -C(CR4)3, en el que R4 es un alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono, -CH2COOH, -CH2COO - , c) R3 es un conector para el acoplamiento a un reactante de unión bioespecífico seleccionado del grupo que consiste en tiourea (-NH-CS-NH-), aminoacetamida (-NH-CO-CH2-NH-), amida (-NH-CO- y -CO-NH-), tioéter alifático (-S-), disulfuro (-S-S-) y 6-sustituido-1,3,5- triazin-2,4-diamina; y d) el ión lantánido se selecciona del grupo que consiste en europio (III), terbio (III), disprosio (III) y samario (III).

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a quelatos de lantánido detectables que van a unirse a un reactante de unión 5 bioespecífico para formar moléculas detectables y al uso de las moléculas detectables en ensayos de unión basados en bioafinidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 10

En ensayos de unión bioespecíficos, tales como, por ejemplo inmunoensayos, ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, ensayos de unión a receptores, y ensayos de unión celular, los analitos que van a medirse generalmente están presentes a concentraciones muy bajas. Se han desarrollado 15 diversos compuestos de marcaje que permiten que se detecten y se cuantifiquen reactantes de marcaje con alta sensibilidad. La espectroscopía de luminiscencia con resolución temporal que usa quelatos de lantánido se ha aplicado durante varios años en inmunoensayos y ensayos de hibridación de ácidos nucleicos 20 [por ejemplo, I. Hemmilä, T. Stålberg y P. Mottram (eds.), “Bioanalytical Applications of Labelling Technologies”, Wallac, Turku, 1994 y D. Wild (eds), “The Immunoassay Handbook”, Nature Publishing Group, 2001]. Los quelatos de lantánido fotoluminiscentes estables (denominados en el 25 contexto de esta memoria descriptiva simplemente luminiscentes) también tienen otras aplicaciones, por ejemplo citometría y microscopía de fluorescencia. Por tanto, se han realizado varios intentos de desarrollar nuevos quelatos altamente luminiscentes adecuados para esos tipos de 30 aplicaciones fluorométricas con resolución temporal. Éstos incluyen por ejemplo quelatos estables que se componen de derivados de piridina (documentos US 4.920.195; US 4.801.77; US 4.761.481; Bush. C.E. et al. 1992, Anal. Biochem., 202,146; documento WO 92/14841; Hemmilä, et al., 1993, J. Biochem. 35

Biophys. Methods, 26, 283; documentos US 5.571.897; US 5.859.215, Latva, M. et al., 1997, J. Luminescence, 75, 149; Takalo, H. et al., 1996, Helv. Chim. Acta, 79, 789; von Lode, P. et al., 2003, Anal. Chem. 75, 3193; documentos US 7.018.851; WO 2005/021538; US 2005/0181393); bipiridinas 5 (documento US 5.216.134), terpiridinas (documentos US 4.859.777; US 5.202.423; US 5.324.825) o diversos compuestos fenólicos (documentos US 4.670.572; US 4.794.191; IT 1235668) como los grupos de mediación de energía y ácidos policarboxílicos como las partes quelantes. Además, se han 10 dado a conocer diversos derivados de dicarboxilato (documentos US 5.032.677; US 5.055.578; US 4.772.563), criptatos macrocíclicos (documentos US 4.927.923; WO 93/5049; EP 0 493 745), calixarenos (Sato, N. et al., 1993, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 621; Steemers, F.J. et al., 1995, J. Am. Chem. Soc., 15 117, 9408), conjugado de DTPA-carboestirilo 124 (Selvin, P.R., et al., 1994, J. Am. Chem. Soc., 116, 6029) y bases de Schiff macrocíclicas (documento EP 0 369 000) en solicitudes de patentes y/o patentes.

Desde la publicación de quelatos, que contienen dos y 20 tres restos de 4-(feniletinil)piridina separados (Takalo, H. et al., Helv. Chim. Acta, 79, 789), se han aplicado las estructuras quelantes diseñadas en solicitudes de patentes y publicaciones en las que se han reemplazado los sustituyentes feniletinilo por 2-furilos y trialcoxifenilos (documentos WO 25 2005/021538; US 2005/0181393, Jaakkola, L. et al. 2005, Bioconjugate Chem., 16, 700). Además, combinando dos grupos funcionales reactivos para el acoplamiento del marcador a un reactante de unión bioespecífico, se han obtenido quelatos altamente luminiscentes (documento US 7.018.851). Los quelatos 30 con cromóforos de 2,4,6-trimetoxipiridina han mostrado alta luminiscencia especialmente con iones Tb (III) y Dy (III) (documento US 4.761.481; Hemmilä, et al, 1993, J. Biochem. Biophys. Methods, 26, 283; Latva, M. et al., 1997, J. Luminescence, 75, 149, documento US 2005/0181393; Jaakkola, L. 35

et al. 2005, Bioconjugate Chem., 16, 700). El nivel de energía del estado triplete del ligando, la naturaleza del cromóforo y el grupo de unión a la biomolécula tienen efectos significativos sobre las propiedades luminiscentes de los marcadores de Tb (III) (véase, por ejemplo, Sabbatini, N. et 5 al., 1991, J. Luminescence 48 y 49: 463; Hemmilä, et al., 1997, J. of Alloys and Compounds 249, 158). Por tanto, incluso pequeños cambios en la estructura del quelato pueden reducir significativamente la luminiscencia de los marcadores de Tb (III). 10

Se conoce que la adición de cromóforos disminuye la solubilidad de los ligandos y quelatos en agua, aumenta la formación de agregados de reactante de unión bioespecífico durante el proceso de marcaje y las propiedades de unión no específica de las biomoléculas marcadas. Los agregados 15 producirán problemas de purificación y una reducción del rendimiento del material marcado. Además, el aumento de la unión no específica de la biomolécula marcada intensificará la luminiscencia de fondo de los ensayos bioespecíficos y por tanto reduce la sensibilidad del ensayo. 20

OBJETOS Y SUMARIO DE LA PRESENTE INVENCIÓN

Un objeto de la presente invención es proporcionar una molécula detectable que comprende un reactante de unión bioespecífico unido a un quelato de lantánido luminiscente. 25

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un quelato de lantánido luminiscente.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar el uso de la molécula detectable de la invención en un ensayo de unión bioespecífico. 30

Por tanto, esta invención proporciona una molécula detectable que comprende un reactante de unión bioespecífico unido a un quelato de lantánido luminiscente que comprende un ión lantánido y un ligando quelante de fórmula (I)

en la que,

a) R1A y R1B se seleccionan independientemente entre sí del grupo que consiste en hidrógeno, metilo, etilo, -COOH, -COO-, -CH2COOH, -CH2COO-, hidroxilo u OR2; 5

b) R2 se selecciona del grupo que consiste en -CH3, -C(CH3)3, -C(CR4)3, en el que R4 es un alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono, -CH2COOH, -CH2COO-,

c) R3 es un conector para el acoplamiento a un reactante de 10 unión bioespecífico seleccionado del grupo que consiste en tiourea (-NH-CS-NH-), aminoacetamida (-NH-CO-CH2-NH-), amida (-NH-CO- y -CO-NH-), tioéter alifático (-S-), disulfuro (-S-S-) y 6-sustituido-1,3,5-triazin-2,4-diamina; y

d) el ión lantánido se selecciona del grupo que consiste en europio (III), terbio (III), disprosio (III) y samario (III).

La invención también proporciona un quelato de lantánido luminiscente que comprende un ión lantánido y un ligando quelante de fórmula (I) 5

en la que,

a) R1A y R1B se seleccionan independientemente entre sí del grupo que consiste en hidrógeno, metilo, etilo, -COOH, -COO-, -CH2COOH, -CH2COO-, hidroxilo u OR2; 10

b) R2 se selecciona del grupo que consiste en -CH3, -C(CH3)3, -C(CR4)3, en el que R4 es un alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono, -CH2COOH, -CH2COO-,

c) R3 es un conector para el acoplamiento a un reactante de 15 unión bioespecífico seleccionado del grupo que consiste en

grupos amino, aminooxilo, carboxilo, aldehído o mercapto y derivados activados de los mismos; y

d) el ión lantánido se selecciona del grupo que consiste en europio (III), terbio (III), disprosio (III) y samario (III).

La invención proporciona además el uso de la molécula 5 detectable según la invención en un ensayo de unión bioespecífico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El objetivo de la presente invención es proporcionar 10 medios para obtener marcadores de quelato de lantánido mejorados que van a usarse en ensayos de unión basados en bioafinidad específicos, tales como inmunoensayos (ensayos tanto heterogéneos como homogéneos), ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, ensayos de unión a receptores, ensayos 15 inmunocitoquímicos o inmunohistoquímicos que utilizan determinación fluorométrica o fluorométrica con resolución temporal de la luminiscencia específica.

Los quelatos de esta invención tienen como objetivo combinar varias características importantes en un solo 20 marcador, tales como

1. alta absorción a una longitud de onda adecuada, preferible mayor que 300 nm,

2. varias partes de absorción de UV separadas (cromóforos) en la misma estructura de ligando, preferible dos cromóforos, 25

3. transferencia de energía eficaz desde la parte de absorción de UV (sensibilizador de triplete) al ión lantánido,

4. una parte fuertemente quelante para crear a) la estabilidad termodinámica requerida para almacenar los reactantes marcados durante periodos de tiempo prolongados, y 30 b) alta estabilidad cinética para permitir el uso de reactantes en condiciones en las que pueden estar presentes agentes quelantes o iones metálicos competidores,

5. una parte quelante para la protección más completa posible del ión quelado, preferible un ligando nonadentado, 35

6. un grupo funcional que permite un acoplamiento eficaz del quelato que va a usarse como reactante de unión (por ejemplo, anticuerpo) sin destruir sus propiedades de unión ni disminuir las propiedades de luminiscencia del marcador,

7. grupos funcionales para permitir una alta solubilidad en 5 agua e impedir la formación de agregados durante el marcaje de biomoléculas y su unión inespecífica de biomoléculas marcadas.

La presente invención se refiere a moléculas detectables que comprenden un reactante de unión bioespecífico unido a un quelato de lantánido luminiscente tal como se definió 10 anteriormente.

Se dan a conocer métodos aplicables para unir el reactante de unión bioespecífico al lantánido luminiscente en la técnica anterior, por ejemplo en Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press (1996). 15

Preferiblemente, R1A y R1B son iguales.

La expresión reactante de unión bioespecífico, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier sustancia o molécula que puede unirse a otra molécula. El reactante de unión bioespecífico se selecciona normalmente de 20 un grupo que consiste en un anticuerpo, un antígeno, un ligando receptor, un péptido o una proteína de unión específica, una molécula de ácido nucleico, y una sonda de ácido desoxirribonucleico (ADN), una sonda de ácido ribonucleico (ARN), derivados de ácido nucleico [tales como 25 ácido nucleico peptídico (PNA) y ácido nucleico bloqueado (LNA)] y moléculas quiméricas que comprenden ácidos nucleicos (ADN y/o ARN) y/o derivados de ácido nucleico, incluyendo pero sin limitarse a moléculas de sondas quiméricas que comprenden ADN, ARN, PNA y/o LNA. 30

La expresión ensayo de unión bioespecífico, tal como se usa en el presente documento, se refiere a métodos y técnicas que se usan para determinar la presencia o la presencia y cantidad de una molécula de analito en una muestra. Los ensayos de unión bioespecíficos incluyen pero no se limitan a 35

inmunoensayos, ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, ensayos de amplificación de ácidos nucleicos, basados por ejemplo en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa, amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA) o reacción de 5 amplificación por círculo rodante, ensayos de unión a receptores y ensayos de unión celular. Los ensayos de unión bioespecíficos pueden ser homogéneos o heterogéneos. En los ensayos homogéneos, todos los componentes del ensayo están presentes en una fase de disolución y no es necesario separar 10 físicamente las moléculas de marcador unidas de las moléculas de marcador no unidas para detectar acontecimientos de unión bioespecíficos, mientras que, en los ensayos heterogéneos, los acontecimientos de unión bioespecíficos sólo se vuelven detectables tras la separación del marcador unido del marcador 15 no unido.

La presente invención también se refiere al uso de las moléculas detectables de la invención en ensayos de unión bioespecíficos. En estos ensayos, la mejora en comparación con la técnica anterior comprende usar la molécula detectable de 20 la invención en lugar de las moléculas detectables de la técnica anterior.

La presente invención se refiere además a un quelato de lantánido luminiscente tal como se definió anteriormente.

Si el grupo conector R3 de la invención es un derivado 25 activado de un grupo amino, aminooxilo, carbonilo, aldehído o mercapto, puede seleccionarse del grupo que consiste en un isocianato, isotiocianato, diazonio, bromoacetamido, yodoacetamido, ésteres reactivos, piridil-2-ditio y 6-sustituido-4-cloro-1,3,5-triazin-2-ilamino. 30

Los sustituyentes en 6-sustituido-1,3,5-triazin-2,4-diamina y 6-sustituido-4-cloro-1,3,5-triazin-2-ilamino pueden seleccionarse del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alcoxilo, ariloxilo, amino, alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono, amino o tioéteres sustituidos, y preferiblemente se 35

seleccionan del grupo que consiste en cloro, fluoro, etoxilo, 2-metoxietoxilo, 2-cianoetoxilo, 2,2,2-trifluoroetoxilo, tiofenoxilo o etoxicarboniltiometoxilo. El amino o tioéter sustituido está preferiblemente mono o disustituido, preferiblemente seleccionándose independientemente cada 5 sustitución del grupo que consiste en un alquilo o alcoxilo con de 1 a 6 átomos de carbono, fenilo, carbonilo y carboxilo.

Si el grupo R3 va a unirse a un soporte sólido, preferiblemente tiene un grupo reactivo, que es un grupo de polimerización. 10

Si el ligando quelante va a usarse en la síntesis de oligonucleótidos o péptidos como medio para preparar un péptido marcador o un oligonucleótido marcado tal como se describe, por ejemplo, en el documento US 2005/0181393, el puente entre dos cromóforos, es decir R3-Ph-CH2-CH2-, se 15 prefiere que el puente comprenda un grupo funcional tal como describe, por ejemplo, el documento US 2005/0181393.

Según una realización preferida de la invención, el ión lantánido es o bien terbio (III) o bien disprosio (III).

Los siguientes ejemplos demuestran la idoneidad de los 20 reactivos de marcaje para los bioensayos. El ejemplo 8 da a conocer un ensayo de hibridación homogéneo basado en extinción y el ejemplo 9 una detección homogénea de un producto de PCR.

Es digno de mención que un compuesto que corresponde al quelato 7 de los ejemplos con dos restos 2,4,6-25 trimetoxifenilpiridina, es decir {2,2’,2”,2”’-{[2-(4-isotiocianatofenil)etilimino]bis(metilen)bis[4-(2,4,6-trimetoxifenil)piridin-6,2-diil]bis(metilen-nitrilo)}-tetrakis(acetato)}terbio (III), tiene una solubilidad acuosa muy baja, y por tanto, es inadecuado como reactivo de marcaje. 30

Las estructuras y la vía sintética empleadas en los ejemplos se muestran en un esquema de reacción 1. El esquema ilustra la síntesis del compuesto 7 mostrado a modo de ejemplo mediante los ejemplos 1 a 7.

Ejemplos

Ejemplo 1

Síntesis de 4-yodo-3-metoxifenol (1)

Se disolvió 3-metoxifenol (2,0 ml, 18,2 mmoles) en DMF seca (50 ml). Se añadieron yoduro de sodio (3,3 g, 21,9 5 mmoles) y cloramina-T (5,0 g, 21,9 mmoles) a la mezcla y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante una hora. Se diluyó la mezcla de reacción con agua (150 ml), se acidificó con disolución de ácido clorhídrico al 5% y se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). Se lavó la fase orgánica con 10 disolución de tiosulfato de sodio al 5% (200 ml) y se secó sobre sulfato de sodio. Se purificó el producto mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice dos veces (en primer lugar con diclorometano, después con acetato de etilo al 20% en éter de petróleo). El rendimiento fue de 0,82 g 15 (18%). 1H-RMN (CDCl3, 500 MHz):  7,52 (1H, d, J=8,5 Hz), 6,63 (1H, d, J=3,0 Hz), 6,37 (1H, dd, J=8,5 Hz, 3,0 Hz), 5,27 (1H, s), 3,81 (3H, s).

Ejemplo 2 20

Síntesis de (4-yodo-3-metoxifenoxi)acetato de terc-butilo (2)

Se disolvió el compuesto 1 (0,8 g, 3,19 mmoles) en DMF seca (30 ml). Se añadió carbonato de potasio secado (1,32 g, 9,57 mmoles) y se desaireó la mezcla con argón. Se añadió bromoacetato de terc-butilo (0,71 ml, 4,78 mmoles) a la mezcla 25 y se agitó la reacción durante la noche a 70°C. Se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se diluyó con agua (20 ml). Se extrajo el producto con dietil éter (3 x 50 ml) y se secó sobre sulfato de sodio. Se purificó el producto mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice usando 30 diclorometano como eluyente. El rendimiento fue de 1,1 g (96%). 1H-RMN (CDCl3, 500 MHz):  7,66 (1H, d, J=8,5 Hz), 6,39 (1H, dd, J=8,5 Hz, 2,5 Hz), 6,34 (1H, d, J=2,5), 4,57 (2H, s), 3,79 (3H, s), 1,51 (9H, s).

Ejemplo 3

Síntesis de [3-metoxi-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-fenoxi]acetato de terc-butilo (3)

Se disolvió el compuesto 2 (1,05 g, 2,88 mmoles) en DMF seca (20 ml). Se añadieron bis(pinacolato)diboro (0,88 g, 3,46 5 mmoles) y acetato de potasio (0,85 g, 8,64 mmoles) y se desaireó la mezcla de reacción con argón. Se añadió acetato de paladio (19,3 mg, 0,086 mmoles) y se agitó la reacción durante tres horas a 85°C. Se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se diluyó con agua (40 ml) y acetato de 10 etilo (40 ml). Se eliminaron las partículas negras mediante filtración a través de un lecho de Celite. Se separó la fase orgánica, se lavó con agua (30 ml) y se secó sobre sulfato de sodio. Se purificó el producto mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice usando metanol al 3% en 15 diclorometano como eluyente. El rendimiento fue de 0,26 g (25%). 1H-RMN (CDCl3, 500 MHz):  7,79 (1H, d, J=8,5 Hz), 6,59 (1H, dd, J=8,5 Hz, 2,5 Hz), 6,31 (1H, d, J=2,5 Hz), 4,54 (2H, s), 3,83 (3H, s), 1,55 (9H, s), 1,28 (12 H, s).

20

Ejemplo 4

Síntesis de 2,2’,2”,2”’-{[2-(4-aminofenil)etilimino]-bis-(metilen)bis{4-{2-metoxi-4-[(terc-butoxicarbonil)-metoxi]fenil}-piridin-6,2-diil}bis(metilen-nitrilo)}tetra-kis(acetato) de tetra(terc-butilo)(4) 25

Se disolvieron el compuesto 3 (0,11 g, 0,30 mmoles) y 2,2’,2”,2”’-{[2-(4-aminofenil)etilimino]-bis(metilen)bis(4-bromopiridin-6,2-diil)bis(metilen-nitrilo)}-tetrakis(acetato) de tetra(terc-butilo) (0,10 mg, 0,10 mmoles) en DMF seca (5 ml) y se desaireó la mezcla con argón. Se añadieron carbonato 30 de cesio (0,11 g, 0,34 mmoles) y tetrakis(trifenilfosfina)-paladio (4,6 mg, 0,004 mmoles) a la mezcla y se agitó la reacción durante la noche a 80°C. Se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se diluyó con agua (10 ml) y acetato de etilo (10 ml). Se eliminaron las partículas 35

negras mediante filtración a través de un lecho de Celite. Se separó la fase orgánica, se lavó con salmuera (20 ml) y se secó sobre sulfato de sodio. Se purificó el producto mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (en primer lugar metanol al 5% en diclorometano y finalmente al 10%). El 5 rendimiento fue de 90,0 mg (69%). 1H-RMN (CDCl3, 500 MHz):  7,63-7,72 (4H, m), 7,24 (2H, s), 6,90 (2H, d), 6,55 (2H, d), 6,50 (2H, d), 6,41 (2H, s), 4,42 (4H, s), 4,08 (4H, s), 3,96 (4H, s), 3,83 (6H, s), 3,53 (8H, s), 2,68-2,97 (4H, m), 1,45 (54H, m). 10

Ejemplo 5

Síntesis de 2,2’,2”,2”’-{[2-(4-aminofenil)etilimino]-bis(metilen)bis{4-[2-metoxi-4-(carboximetoxi)fenil]piridin-6,2-diil}bis(metilen-nitrilo)}-tetrakis(ácido acético) (5) 15

Se agitó una disolución de compuesto 4 (40,0 mg, 0,031 mmoles) en ácido trifluoroacético (0,40 ml) a temperatura ambiente durante 2 horas. Tras evaporación sin calentamiento, se trituró la mezcla con dietil éter (10 ml) y se filtró. La filtración dejó un producto puro. El rendimiento fue de 53 mg. 20 1H-RMN (d6-DMSO, 400 MHz):  7,87 (2H, m), 7,75 (2H, s), 7,38 (2H, m), 7,17 (2H, m), 6,99 (2H, m), 6,68 (2H, d), 6,61 (2H, m), 4,74 (4H, s), 4,54 (4H, s), 4,09 (4H, m), 3,80 (6H, s), 3,56 (8H, s), 3,09 (4H, m).

25

Ejemplo 6

Síntesis de {2,2’,2”,2”’-{[2-(4-aminofenil)etilimino]-bis(metilen)bis{4-[2-metoxi-4-(carboximetoxi)fenil]piridin-6,2-diil}bis(metilen-nitrilo)}-tetrakis(acetato)}terbio (III) (6) 30

Se disolvió el compuesto 5 (49,2 mg, 0,038 mmoles) en agua (1 ml) y se ajustó el pH a 6,5 con hidrogenocarbonato de sodio sólido. Se añadió cloruro de terbio (III) hexahidratado (15,4 mg, 0,041 mmoles) en agua (0,2 ml) en un plazo de 10 minutos y se mantuvo el pH en 6,5 con hidrogenocarbonato de 35

sodio sólido. Tras agitar la reacción a temperatura ambiente durante dos horas, se elevó el pH hasta 8,5 con hidróxido de sodio 1 M y se retiró el precipitado mediante centrifugación. Se trató el filtrado con acetona y se recogió el producto mediante centrifugación y se lavó con acetona. Se usó el 5 producto en la siguiente etapa sin purificación. El rendimiento fue de 19,6 mg (47%). UV (tampón carbonato 50 mM, pH 9,8): 308, 281. EM-MALDI TOF para C48H48N6O16Tb: calculado 1123,85, hallado 1122,85 (M-1)-.

10

Ejemplo 7

Síntesis de {2,2’,2”,2”’-{[2-(4-isotiocianatofenil)-etilimino]bis(metilen)-bis{4-[2-metoxi-4-(carboximetoxi)-fenil]piridin-6,2-diil}bis(metilen-nitrilo)}tetrakis-(acetato)}terbio (III) (7) 15

Se añadió lentamente el compuesto 6 (18,4 mg, 0,016 mmoles) en agua (0,5 ml) a una mezcla de tiofosgeno (5,0 l, 0,066 mmoles), hidrogenocarbonato de sodio (6,9 mg, 0,082 mmoles) y cloroformo (0,5 ml). Tras agitar durante una hora a temperatura ambiente, se lavó la fase acuosa con cloroformo (3 20 x 1 ml). Entonces se ajustó el pH de la disolución acuosa a 7,0 con ácido acético 1 M y se añadió acetona. Se recogió el producto mediante centrifugación y se lavó con acetona. El rendimiento fue de 16,1 mg (84%). UV (tampón carbonato 50 mM, pH 9,8): 310, 278. EM-MALDI TOF para C49H46N6O16STb: calculado 25 1165,91, hallado 1164,84 (M-1)-.

Ejemplo 8

Eficiencia de extinción

Para caracterizar la idoneidad del quelato de terbio 30 desarrollado para ensayos de hibridación homogéneos basados en extinción, se marcó una sonda de oligonucleótido modificada en el extremo 5’-amino que tenía la secuencia 5’-AAT TTA GAA GTC ATT AGC GAG CAG GCT ACC G-3’ (SEQ ID NO 1) y se purificó en dos reacciones de marcaje y purificación diferentes con dos 35

quelatos de lantánido diferentes: con el quelato según la presente invención (compuesto 7) y con 2,2’,2”,2”’-{{6,6’-{4”-[2-(4-isotiocianatofenil)etil]-1H-pirazol-1”,3”-diil}-bis(piridina)-2,2’-diil}bis(metilen-nitrilo)}tetrakis(acetato) terbio (III) (documento US 5.859.215). La expresión “ensayo de 5 hibridación homogéneo basado en extinción”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un método para la detección de ácidos nucleicos tal como han descrito, por ejemplo, Kiviniemi et al. (Clin Biochem. Nov 2003;36(8):633-40. A homogeneous high-throughput genotyping method based on 10 competitive hybridization. Kiviniemi M, Nurmi J, Turpeinen H, Lovgren T, Ilonen J.) Se marcó la sonda y se purificó con cada quelato tal como describen Nurmi et al. (Anal Chem. 15 Jul 2002;74(14):3525-32. High-performance real-time quantitative RT-PCR using lanthanide probes and a dual-temperature 15 hybridization assay. Nurmi J, Wikman T, Karp M, Lovgren T.). Más adelante en el presente documento, las dos sondas con la misma secuencia de bases pero que portan diferentes quelatos de terbio como marcadores se denominan sonda 1 para la sonda marcada con el quelato de la presente invención (compuesto 7) 20 y sonda 2 para la sonda marcada con el quelato según la técnica anterior.

Con el fin de determinar con cuánta eficacia podían extinguirse las señales producidas por la sonda 1 y la sonda 2 con una sonda de extinción complementaria, se prepararon los 25 cuatro tipos de reacciones siguientes:

1. Una reacción de 50 l que contenía sonda 1 17 nM en tampón para PCR II 1 X y MgCl2 2,5 mM (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.).

2. Una reacción de 50 l que contenía sonda 1 17 nM y sonda 30 de extinción 170 nM en tampón para PCR II 1 X y MgCl2 2,5 mM (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). La sonda de extinción, que era complementaria a la sonda 1 y la sonda 2, tenía la secuencia 5’-TCG CTA ATG ACT TCT AAA TT-3’ (SEQ ID No 2) y en su extremo 3’ portaba el marcador de extinción QSY7. 35

3. Una reacción de 50 l que contenía sonda 2 17 nM en tampón para PCR II 1 X y MgCl2 2,5 mM (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.).

4. Una reacción de 50 l que contenía sonda 2 17 nM y sonda de extinción 170 nM en tampón para PCR II 1 X y MgCl2 2,5 mM 5 (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.).

Tras haberse preparado las reacciones, se midieron sus señales de terbio usando los parámetros de medición de terbio por defecto de un contador Victor 2 Multilabel (PerkinElmer Life and Analytical Sciences Wallac, Finlandia). Se 10 determinaron las máximas relaciones señal/ruido que pueden obtenerse en un ensayo de hibridación homogéneo basado en extinción con la sonda 1 y la sonda 2 dividiendo la señal obtenida a partir de la reacción 1 entre la señal de la reacción 2 (para la sonda 1) y dividiendo la señal obtenida a 15 partir de la reacción 3 entre la señal de la reacción 4 (para la sonda 2).

Los resultados se muestran en la tabla 1. Tal como puede observarse en la tabla, la intensidad de señal emitida por la sonda 1 sola [597241 cuentas por segundo (cps)] es mayor que 20 la señal emitida por la sonda 2 (134716 cps), lo que indica que el quelato según la presente invención (compuesto 7) es superior en comparación con el quelato según la técnica anterior porque puede proporcionar una mayor intensidad de fluorescencia de larga vida útil. Además, la señal emitida por 25 la sonda 1 se extingue de manera más eficaz por una sonda de extinción complementaria que la señal emitida por la sonda 2: la máxima relación señal/ruido que puede obtenerse usando la sonda 1 en un ensayo basado en extinción es de aproximadamente 65 mientras que la sonda 2 teóricamente sólo podría 30 proporcionar una relación señal/ruido de aproximadamente 14. Por tanto, puede concluirse que el quelato según la presente invención es muy adecuado para su uso como marcador en un ensayo de hibridación basado en extinción.

Tabla 1. Eficiencias de extinción que pueden obtenerse con las sondas 1 y 2. La sonda 1 sola (reacción 1), marcada con el quelato de la presente invención (compuesto 7), proporciona una mayor señal que la sonda 2 sola (reacción 3), marcada con un quelato descrito en la técnica anterior. La relación de 5 señal entre la sonda 1 marcada libre (reacción 1) y la sonda 1 extinguida (reacción 2) es mayor que la relación entre las señales obtenidas a partir de una sonda 2 libre (reacción 3) y una sonda 2 extinguida (reacción 4), lo que indica que el quelato según la presente invención es más adecuado para su 10 uso como marcador en un ensayo de hibridación basado en extinción homogéneo que el quelato descrito en la técnica anterior.

Reacción

Contenido Señal de terbio promedio

1

Sonda 1 sola 597 241

2

Sonda 1 y sonda de extinción 9 134

3

Sonda 2 sola 134 716

4

Sonda 2 y sonda de extinción 9 640

Máxima relación señal/ruido teórica para la sonda 1: 65 Máxima relación señal/ruido teórica para la sonda 2: 14

Ejemplo 9 15

Idoneidad del quelato de la presente invención para la detección homogénea de un producto de PCR

Con el fin de caracterizar la idoneidad del quelato de terbio según la presente invención (compuesto 7) para la detección homogénea de un producto de PCR, se comparó la sonda 20 1 (descrita anteriormente en el ejemplo 8) con la sonda 2 (descrita anteriormente en el ejemplo 8) en un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que es específico para la bacteria Listeria monocytogenes. El principio de generación de señales del ensayo de PCR lo han descrito Nurmi 25 et al. (Anal Chem. 15 Jul 2002;74(14):3525-32. High-

performance real-time quantitative RT-PCR using lanthanide probes and a dual temperature hybridization assay. Nurmi J, Wikman T, Karp M, Lovgren T.)

Con el fin de obtener una comparación entre los dos quelatos diferentes, se prepararon cuatro tipos diferentes de 5 reacciones tal como sigue:

1. Reacciones de control negativas con la sonda 1 que no contenían ningún ADN de Listeria monocytogenes

2. Reacciones de control positivas con la sonda 1 que contenían 1000 copias de ADN de Listeria monocytogenes para 10 amplificarse en la reacción

3. Reacciones de control negativas con la sonda 2 que no contenían ningún ADN de Listeria monocytogenes

4. Reacciones de control positivas con la sonda 2 que contenían 1000 copias de ADN de Listeria monocytogenes para 15 amplificarse en la reacción

Las reacciones de PCR de 30 l consistieron en tampón Taq HotMaster 1 X (Eppendorf, Alemania), dNTP 0,2 mM, cebador directo (5’-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC-3’; SEQ ID NO 3) 0,3 M, cebador inverso (5’-GTG TAA TCT TGA TGC CAT CAG G-3’; SEQ 20 ID NO 4) 0,3 M, sonda 1 o sonda 2 28 nM, sonda de extinción 280 nM (descrita anteriormente en el ejemplo 1) y 1 unidad de ADN polimerasa Taq HotMaster (Eppendorf). Se realizó el ciclado térmico en una placa de 96 pocillos en un aparato DNA Engine PTC 200 (MJ Research, EE.UU.). El protocolo de ciclado 25 térmico consistió en una etapa de desnaturalización de 2 minutos inicial a 94°C seguida por 40 ciclos de 30 segundos a 94°C y 1 minuto a 65°C, tras lo cual se enfriaron las reacciones hasta 4°C. Se registraron las señales de terbio tras el ciclado térmico usando un contador Victor 2 Multilabel 30 usando los parámetros de medición de terbio por defecto del instrumento. Se calcularon las relaciones señal/ruido (S/N) para las reacciones de control positivas (reacciones 2 y 4) dividiendo la señal de terbio promedio de la reacción 2 ó 4

entre la señal de terbio promedio de la reacción 1 ó 3, respectivamente.

Los resultados del experimento se muestran en la tabla 2. Tal como puede observarse en la tabla, las reacciones de control negativas que contenían la sonda 1 proporcionaron una 5 señal promedio de 80864 cps, mientras que las reacciones de control positivas respectivas que contenían la sonda 1 produjeron una señal de 1 342 566 cps, dando como resultado una relación señal/ruido de 16,6. La mayor señal en las reacciones de control positivas es indicativa de la 10 amplificación de la secuencia de ADN objetivo y claramente demuestra que el quelato según la presente invención es muy adecuado para su uso como marcador en un ensayo de PCR homogéneo. Cuando se usó la sonda 2 en lugar de la sonda 1, las intensidades de señal y las relaciones señal/ruido fueron 15 menores que con la sonda 1: la señal promedio obtenida a partir de las reacciones de control negativas fue de 32 976 cps mientras que las reacciones de control positivas proporcionaron una señal promedio de 248 393 cps, dando como resultado una relación señal/ruido de 7,5. La clara diferencia 20 entre las relaciones señal/ruido obtenidas con la sonda 1 (S/N 16,6) y la sonda 2 (S/N 7,5) indica que el quelato de la presente invención es superior en comparación con el quelato usado en la sonda 2 porque es más adecuado para su uso como marcador en ensayos de PCR homogéneos: puede proporcionar una 25 mayor intensidad de señal y una mayor relación señal/ruido, lo que permite una detección más sensible de ácidos nucleicos objetivo y permite una discriminación más fácil entre las reacciones positivas y negativas.

Tabla 2. Señales de terbio y relaciones señal/ruido obtenidas a partir de las reacciones de PCR 1, 2, 3 y 4.

Reacción

Señal de terbio promedio S/N

1

80 864 -

2

1 342 556 16,6

3

32 976 -

4

248 393 7,5

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES
2. 1. Molécula detectable que comprende un reactante de unión bioespecífico unido a un quelato de lantánido luminiscente que comprende un ión lantánido y un ligando quelante de fórmula (I) 5

   en la que,

   a) R1A y R1B se seleccionan independientemente entre sí del grupo que consiste en hidrógeno, metilo, etilo, -COOH, -COO-, -CH2COOH, -CH2COO-, hidroxilo u OR2; 10

   b) R2 se selecciona del grupo que consiste en -CH3, -C(CH3)3, -C(CR4)3, en el que R4 es un alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono, -CH2COOH, -CH2COO-,

   c) R3 es un conector para el acoplamiento a un reactante de unión bioespecífico seleccionado del grupo que consiste en tiourea (-NH-CS-NH-), aminoacetamida (-NH-CO-CH2-NH-), amida (-NH-CO- y -CO-NH-), tioéter alifático (-S-), disulfuro (-S-S-) y 6-sustituido-1,3,5-5 triazin-2,4-diamina; y

   d) el ión lantánido se selecciona del grupo que consiste en europio (III), terbio (III), disprosio (III) y samario (III).
3. 2. Molécula detectable según la reivindicación 1, 10 caracterizada porque el reactante de unión bioespecífico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, antígeno, un ligando receptor, un péptido o una proteína de unión específica, una molécula de ácido nucleico, una sonda de ARN o ADN, derivados de ácido nucleico y 15 moléculas quiméricas que comprenden ácidos nucleicos y/o derivados de ácido nucleico.
4. 3. Molécula detectable según la reivindicación 1, caracterizada porque el quelato de lantánido unido al reactante de unión bioespecífico es {2,2’,2”,2”’-{[2-(4-20 isotiocianatofenil)-etilimino]bis(metilen)bis{4-[2-metoxi-4-(carboxi-metoxi)fenil]piridin-6,2-diil}-bis(metilen-nitrilo)}tetrakis(acetato)}terbio (III).
5. 4. Molécula detectable según la reivindicación 1, caracterizada porque el conector R3 es 6-sustituido-25 1,3,5-triazin-2,4-diamina y la sustitución en 6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alcoxilo, ariloxilo, amino, alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono, amino o tioéteres sustituidos, y preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en 30 cloro, fluoro, etoxilo, 2-metoxietoxilo, 2-cianoetoxilo, 2,2,2-trifluoroetoxilo, tiofenoxilo y etoxicarboniltiometoxilo.
6. 5. Quelato de lantánido luminiscente que comprende un ión lantánido y un ligando quelante de fórmula (I) 35

   en la que,

   a) R1A y R1B se seleccionan independientemente entre sí del grupo que consiste en hidrógeno, metilo, etilo, -COOH, -COO-, -CH2COOH, -CH2COO-, hidroxilo u OR2; 5

   b) R2 se selecciona del grupo que consiste en -CH3, -C(CH3)3; -C(CR4)3, en el que R4 es un alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono, -CH2COOH, -CH2COO-,

   c) R3 es un conector para el acoplamiento a un 10 reactante de unión bioespecífico seleccionado del grupo que consiste en grupos amino, aminooxilo, carboxilo, aldehído o mercapto y derivados activados de los mismos; y

   d) el ión lantánido se selecciona del grupo que consiste en europio (III), terbio (III), disprosio (III) y samario (III).
7. 6. Quelato de lantánido luminiscente según la reivindicación 5, caracterizado porque el conector R3 es 5 un derivado activado seleccionado del grupo que consiste en isocianato, isotiocianato, diazonio, bromoacetamido, yodoacetamido, ésteres reactivos, piridil-2-ditio y 6-sustituido-4-cloro-1,3,5-triazin-2-ilamino.
8. 7. Quelato de lantánido luminiscente según la 10 reivindicación 5, caracterizado porque el conector R3 es un 6-sustituido-4-cloro-1,3,5-triazin-2-ilamino y la sustitución en 6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alcoxilo, ariloxilo, amino, alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono, amino o tioéteres 15 sustituidos, y preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en cloro, fluoro, etoxilo, 2-metoxietoxilo, 2-cianoetoxilo, 2,2,2-trifluoroetoxilo, tiofenoxilo y etoxicarboniltiometoxilo.
9. 8. Uso de la molécula detectable según cualquiera de las 20 reivindicaciones 1 a 4, en un ensayo de unión bioespecífico.