JP2010501481A5

JP2010501481A5 -

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Publication number: JP2010501481A5
Application number: JP2009524213A
Authority: JP
Filing date: 2007-08-17
Publication date: 2010-07-29
Anticipated expiration: 2027-08-17

Description

３０μｌのＰＣＲ反応系は、次の成分からなるものである。１×HotMaster Taq バッファー（ドイツ国、Eppendorf社）、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．３μＭのフォワードプライマー（5'-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC-3'、配列番号３）、０．３μＭのリバースプライマー（5'-GTG TAA TCT TGA TGC CAT CAG G-3'、配列番号４）、２８ｎＭのプローブ１またはプローブ２、２８０ｎＭの消光プローブ（上記実施例８に記載）及び１単位のHotMaster Taq ＤＮＡポリメラーゼ（Eppendorf社）。熱サイクル反応を９６穴のプレートを用いてPTC 200 DNA Engine（米国、MJ Research社）で実施した。熱サイクル反応のプロトコルは、初期の９４℃で２分の変性工程及びそれに続く４０サイクルの９４℃で３０秒と６５℃で１分の反応からなり、その後、反応系を４℃に冷却した。熱サイクル反応後には、テルビウム測定用デフォルト設定値を用いたVictor 2マルチラベルカウンターでテルビウムシグナルを計測した。正の対照反応（反応２と反応４）のシグナル−ノイズ比（Ｓ／Ｎ）は、反応２の平均テルビウムシグナル値を反応１の平均テルビウムシグナル値で除し、反応４の平均テルビウムシグナル値を反応３の平均テルビウムシグナル値で除すことで決定した。

Claims

発光性ランタノイドキレートに保持された生体特異的結合反応性物質を含む検出可能な分子であって、該発光性ランタノイドキレートが、ランタノイドイオンと、下記式（Ｉ）で表されるキレートリガンドからなる、ことを特徴とする検出可能な分子。

但し、
ａ）Ｒ_1AとＲ_1Bは各々、独立的に、水素原子、メチル、エチル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ^-、−ＣＨ₂ＣＯＯＨ、−ＣＨ₂ＣＯＯ^-、ヒドロキシル及び−ＯＲ₂からなる群より選ばれ；
ｂ）Ｒ₂は、−ＣＨ₃、−Ｃ（ＣＨ₃）₃及び−Ｃ（ＣＲ₄）₃からなる群より選ばれ、但しＲ₄は炭素数１〜６のアルキル、−ＣＨ₂ＣＯＯＨ、−ＣＨ₂ＣＯＯ^-、

であり；
ｃ）Ｒ₃は生体特異的結合反応性物質に連結するためのリンカーであり、チオウレア（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−）、アミノアセトアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−と−ＣＯ−ＮＨ−）、脂肪族チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）及び６−置換−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミンからなる群より選ばれ；そして
ｄ）ランタノイドイオンは、ユーロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロジウム（ＩＩＩ）及びサマリウム（ＩＩＩ）からなる群より選ばれる。
生体特異的結合反応性物質が、抗体、抗原、受容体リガンド、特異的結合性タンパク質又はペプチド、核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ、核酸誘導体、及び、核酸と核酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むキメラ分子、からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１に記載の検出可能な分子。
生体特異的結合反応性物質に保持された発光性ランタノイドキレートが｛２，２’，２’’，２’’’−｛［２−（４−イソチオシアナトフェニル）エチルイミノ］ビス（メチレン）ビス｛４−［２−メトキシ−４−（カルボキシメトキシ）フェニル］ピリジン−６，２−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタト）｝テルビウム（ＩＩＩ)であることを特徴とする請求項１に記載の検出可能な分子。
リンカーであるＲ₃が６−置換−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミンであり、６位の置換基が、水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ、アリーロキシ、アミノ、炭素数１〜６のアルキル、置換アミノ及び置換チオエーテルからなる群より選ばれる、ことを特徴とする請求項１に記載の検出可能な分子。
６位の置換基が、塩素原子、フッ素原子、エトキシ、２−メトキシエトキシ、２−シアノエトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、チオフェノキシ及びエトキシカルボニルチオメトキシからなる群より選ばれる、ことを特徴とする請求項４に記載の検出可能な分子。
ランタノイドイオンと、下記式（Ｉ）で表されるキレートリガンドからなる、ことを特徴とする発光性ランタノイドキレート。

但し、
ａ）Ｒ_1AとＲ_1Bは各々、独立的に、水素原子、メチル、エチル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ^-、−ＣＨ₂ＣＯＯＨ、−ＣＨ₂ＣＯＯ^-、ヒドロキシル及び−ＯＲ₂からなる群より選ばれ；
ｂ）Ｒ₂は、−ＣＨ₃、−Ｃ（ＣＨ₃）₃ 及び−Ｃ（ＣＲ₄）₃からなる群より選ばれ、但しＲ₄は炭素数１〜６のアルキル、−ＣＨ₂ＣＯＯＨ、−ＣＨ₂ＣＯＯ^-、

であり；
ｃ）Ｒ₃は生体特異的結合反応性物質に連結するためのリンカーであり、アミノ、アミノオキシ、カルボキシ、アルデヒド、メルカプト及びそれらの活性誘導体からなる群より選ばれ；そして
ｄ）ランタノイドイオンは、ユーロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロジウム（ＩＩＩ）及びサマリウム（ＩＩＩ）からなる群より選ばれる。
リンカーであるＲ₃が、イソシアナト、イソチオシアナト、ジアゾニウム、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、反応性エステル類、ピリジル−２−ジチオ及び６−置換−４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノからなる群より選ばれる活性誘導体である、ことを特徴とする請求項６に記載の発光性ランタノイドキレート。
リンカーであるＲ₃が６−置換−４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノであり、６位の置換基が、水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ、アリーロキシ、アミノ、炭素数１〜６のアルキル、置換アミノ及び置換チオエーテルからなる群より選ばれる、ことを特徴とする請求項６に記載の発光性ランタノイドキレート。
６位の置換基が、塩素原子、フッ素原子、エトキシ、２−メトキシエトキシ、２−シアノエトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、チオフェノキシ及びエトキシカルボニルチオメトキシからなる群より選ばれる、ことを特徴とする請求項８に記載の発光性ランタノイドキレート。
生体特異的結合アッセイにおける、請求項１〜５のいずれかの検出可能な分子の使用。