CN1531591A - 依靠电流手段将核酸和其它生物学活性分子导入高等真核细胞细胞核的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及依靠电流手段而能够将DNA和/或其它生物学活性分子转运进入高等真核细胞细胞核的新方法，这种方法不依赖细胞分裂且细胞死亡率低。

Description

依靠电流手段将核酸和其它生物学活性分子 导入高等真核细胞细胞核的方法
本发明涉及使用电流而能够将DNA和/或其它生物学活性分子转运进入高等真核细胞细胞核的新方法，这种方法不依赖细胞分裂且细胞死亡率低。本发明还涉及缩短转染与细胞分析之间的时间的方法，从而使实验大大加速。本发明还描述了可用于DNA和/或其它生物学活性分子的核定位的优化后电脉冲。
                       发明背景
由于细胞核是真核DNA的功能位置，因此外源DNA必须进入细胞核才能进行转录。常规转染方法只能促使DNA穿过细胞膜而进入细胞质。只是因为核膜在高等真核生物的细胞分裂过程中暂时解体，DNA才能被动进入细胞核，从而能够表达其编码的蛋白质。只有很小的DNA分子(寡核苷酸)能够通过核膜上的核孔而进行自由扩散。为了有效转染静止细胞或低速分裂细胞，必需提供使得大型DNA分子能够以足够数量穿过封闭细胞膜而进入细胞核的条件。本文描述的方法能够在高等真核细胞中实现这一目标。
                       现有技术
早就知道能够依靠电流而将DNA由缓冲液导入细胞。但是，早期描述的实验条件限于将DNA转运进入高等真核细胞的细胞质，因此转染DNA的表达仍然依赖细胞分裂过程中核膜的解体。没有一种已知方法提出以电靶向方式将DNA导入高等真核细胞的细胞核。尚不知道为电核转运优化的系统。
电穿孔的开发基于在短时间电脉冲的作用下生物膜的通透性暂时升高的观察结果(Neumann和Rosenheck，1972)。1976年，Auer等人描述了红血球在电流作用下对DNA的摄取。
关于细胞系细胞电穿孔的第一份报告来自1982年(Neumann等人)。使用场强8kV/cm、每次持续5μs的短脉冲转染鼠成纤维细胞系，通常一组三个脉冲，间隔3秒。两周后进行分析。没有观察到电核转运。
通过变压器短路，Potter等人(1984)也形成了8kV/cm场强，并将其用于转染细胞系细胞。但是，电流限于最大0.9A。同样没有观察到电核转运。
在开发过程中，使用较低电压且逐渐延长放电，因为大约1kV/cm的场强显得足以获得细胞膜孔的最佳开启(平均细胞直径10-20μm)。因此，针对使用这些场强的转染而优化了用于进行高等真核细胞电穿孔的大多数商品化装置和提供的方案。
在一个案例(Bertling等人，1987)中，在分裂细胞系中追踪DNA在细胞质和细胞核中分布的动力学。除了提高DNA浓度，不再为了优化细胞核对DNA的早期摄取而进行其它尝试。更具体的说，没有调查电参数是否影响分布。
自1986年起，开始申请有关电穿孔作为转染方法的专利。大体上，它们描述装置结构和脉冲形式。没有针对关于DNA进入细胞核的非有丝分裂转运的问题。
US 4,750,100(Bio-Rad Laboratories，里士满市，美国，1986)描述了通过电容器放电提供最大电压3000V、最大电流125A的特定装置结构。
US 5,869,326(Genetronics公司，圣迭戈市，美国，1996)描述了使用两个分开的能源产生两个、三个或多个脉冲的具体装置结构。但是，US 5,869,326并未显示这些脉冲除了影响DNA进入细胞质的转运外还有其它效果。
US 6,008,038和EP 0 866 123 A1(Eppendorf-Netheler-HinzGmbH，汉堡市，德国，1998)描述了能够产生持续时间10-500μs、最大电压1.5kV的短脉冲的装置，但是同样没有指出某些条件能够导致DNA进入细胞核的转运。
目前知道的方法不能有效的将DNA和/或其它生物学转运进入细胞核且细胞死亡率低。
本发明的另一个目标是提供大大缩短转染与随后转染细胞分析之间的时间的方法。
通过本发明权利要求书的主题内容解决了上述目标。
在本申请中，首次描述了介导有效的DNA核转运的具体电条件、及导致特别低的细胞死亡率的放电和电流。还描述了为低细胞死亡率而优化的缓冲液和实验流程。
                       发明描述
在本文描述的方法中，使用了很高的场强2-10kV/cm，以帮助DNA和/或其它生物学活性分子进入细胞核而不依赖细胞分裂。这些场强显著高于人们在电穿孔中所用的场强，而且还高于足以有效开启细胞膜孔的场强(平均1kV/cm，依照Lurquin，1997)。
因此，本发明的主题是使用电流将生物学活性分子导入真核细胞细胞核的方法，进入细胞核的导入是通过场强2-10kV/cm、持续时间至少10μs和电流至少1A的脉冲来实现的。所用高电压可能导致在核膜的两层膜中都产生孔，或者核孔复合物可能变得更易于分子渗透，从而能够更有效的将生物学活性分子转运进入细胞核。脉冲需要至少10μs持续时间，以实现核转运效果。
术语“生物学活性分子”在用于本文时包括核酸、肽、蛋白质、多糖、脂质或其组合，只要它们在细胞中展示生物学活性即可。
在本发明的一个优选实施方案中，可能优选通过场强3-8kV/cm、持续时间不超过200μs的脉冲来实现将核酸、肽、蛋白质、和/或生物学活性分子导入细胞核。对细胞施加1-2V电压，可导致细胞膜中孔的有效且可逆开启(Zimmermann等人，1981)。这对应于细胞直径10-20μm时平均1kV/cm。特别高的电压会导致不可逆的膜崩溃，甚至在脉冲持续时间短至1ms也会如此(Zimmermann等人，1981)。但是，在使用依照本发明的方法时不会发生这种情况。在依照本发明的方法中，尤其优选将脉冲持续时间保持在最大200μs，这短得足以在甚至2-10kV/cm、优选3-8kV/cm都不会发生显著的不可逆膜损伤，同时又长得足以实现核转运效果。
在该方法的一个优选实施方案中，脉冲之后不间断的跟随持续时间1ms-最大50ms的1A-最大2.5A电流。
使用电流的转染基于两种作用：细胞膜的电穿孔和DNA电泳穿过产生的膜孔。不管其产生和形式如何，所述电穿孔脉冲符合两种条件，使得脉冲开始时的电压足以在相应细胞类型的细胞膜中打开膜孔，而且脉冲的后继过程足以进行DNA电泳。
在本发明的一个优选实施方案中，为了将DNA和/或其它生物学活性分子转运通过细胞膜而进入细胞核，将场强2-10kV/cm施加10-200μs，并在常规条件下进行随后的电泳。
尽管起始电压很高，通过短时间的强脉冲及低强度和/或短时间的后继电流，对通过电核转运进行的转染优化了高细胞存活率。同时，可以根据原代细胞的类型来进行细调。由于短时间、很高电流的脉冲可能有助于DNA的电泳，因此它可能还容许对一些细胞类型大大降低或完全省略后继电流。
在一个优选的形式中，将电击杯装满缓冲液，将细胞和核酸(可能还有其它生物学活性分子)暴露于场强2-10kV/cm、持续时间10-200μs的短脉冲，随后是最大2.5A、可长达50ms的电流。
在一个更优选的形式中，将电击杯装满缓冲液，将细胞和核酸(可能还有其它生物学活性分子)暴露于场强3-8kV/cm、持续时间10-100μs的短脉冲，随后是最大2.2A、可长达30ms的电流。
由于这种转染方法不依赖细胞分裂，因此可以转染分裂细胞和静止或具有低分裂活性的原代细胞。
在本发明的一个实施方案中，转染原代细胞，诸如人外周血细胞，优选T细胞、B细胞、或人血液多能前体细胞。
在另一个优选实施方案中，真核细胞包括来自人、大鼠、小鼠或鸡的神经元胚细胞。
另一个优选实施方案包括人骨髓细胞。
使用依照本发明的方法转染的真核细胞可用于诊断性方法，和用于制备离体基因疗法药物。
使用分裂中的原代细胞和细胞系时可以提高转染效率，因为DNA不必停留在细胞质中(在此它可能降解)直至细胞分裂，而且同样能够分析在分析时未经历细胞分裂的细胞。
此外，有可能在转染后不久即进行分析，从而显著加速实验。在使用表达载体的转染实验中，根据启动子和表达的蛋白质，可以在转染后大约20小时就进行分析。由于转染的DNA停留在细胞质中的时间很短，因此DNA几乎不暴露于核酸酶的作用。
通过电核转运，可以将比只利用细胞分裂时所预期的更大数量的DNA转运进入分裂细胞的细胞核。二者皆显著增加完整表达盒整合的可能性。
术语“电核转运”描述不依赖细胞分裂、而是由电流引起的将生物学活性分子转运进入高等真核细胞细胞核。
优选的是，意欲进入细胞核的生物学活性分子包括核酸、特别是DNA，或者包含至少一个核酸部分。
核酸存在于复合物中或与肽、蛋白质、多糖、脂质、或这些分子的组合或衍生物相关。与核酸复合或相关的分子有助于将转染的核酸整合到细胞基因组中、核内定位或存留、与染色质相关、或调控表达。
在一个优选的实施方案中，与核酸复合、用于将转染的核酸整合到细胞基因组中的分子选自下组：逆转录病毒整合酶、原核细胞转座酶、真核细胞转座酶、序列特异性重组酶、拓扑异构酶、大肠杆菌recA、大肠杆菌recE、大肠杆菌recT、噬菌体λredα、噬菌体λredβ和噬菌体λ末端酶。
在一个特别优选的实施方案中，与核酸复合或相关、用于核内存留或与染色质相关的分子包括EBV蛋白质EBNA-1的结构域。这些结构域包括EBNA-1蛋白质的第8-54位和/或第72-84位、或第70-89位、和/或第328-365位氨基酸(Marechal等人，1999)。
适用于依照本发明的方法的缓冲液是具有如下组成的“缓冲液1”。0.42mM Ca(NO3)2、5.36mM KCl、0.41mM MgSO4、103mM NaCl、23.8mMNaHCO3、5.64mM Na2HPO4、11.1mM d(+)-葡萄糖、3.25μM谷胱甘肽、20mM Hepes、pH7.3。
为了将核酸导入真核细胞细胞核，可以进行如下方案：在电极间距2mm的电击杯中，将1×105-1×107个细胞与可多达10μg DNA在100μl缓冲液1中于室温保温10分钟，然后通过依照本发明的条件进行转染。此后，立即用400μl不含血清的细胞培养基冲洗电击杯而得到细胞，并于37℃保温10分钟。然后，将细胞涂布在37℃的含血清细胞培养基中。
例如，可以依照如下流程进行蛋白质的电核转运：通过依照本发明的条件，将100μl合适缓冲液中可多达10μg蛋白质转染到1×105-1×107个细胞中。此后，立即用400μl不含血清的细胞培养基冲洗电击杯而得到细胞，并于37℃保温10分钟。然后，于37℃将细胞涂布在含血清的细胞培养基中，并在保温6小时后进行分析。
合适的电击杯是例如电极间距2mm或1mm的电击杯，诸如用于原核生物电穿孔的商品化电击杯。
                       缩写表
依照本发明，所用缩写具有如下含义。除了Duden词典中列出的缩写，还使用了下列缩写。
FACS    荧光激活细胞分拣术
FCS     胎牛血清
kV      千伏
ms      毫秒
μs     微秒
PBMC    外周血单核细胞
PE      藻红蛋白
                         图
通过下列附图进一步描述了本发明。
图1a和1b显示了T辅助细胞的转染效率与场强(脉冲持续时间40μs，a)和脉冲持续时间(场强5kV/cm，图b)的关系。
图2a和2b显示了5kV/cm、40μs脉冲之后不间断的跟随不同强度和持续时间的电流产生的T辅助细胞转染效率。
图3显示了经H-2Kk表达载体转染的PBMC的FACScan分析结果。转染后将细胞与与洋地黄毒苷偶联的抗H-2Kk抗体一起保温，然后和与Cy5偶联的抗洋地黄毒苷抗体，以及用于鉴定T辅助细胞的藻红蛋白(PE)偶联抗CD4抗体一起保温，并通过流式细胞计量术进行分析。通过碘化丙锭染色来测定死细胞数目(未染色荧光通道FL3)(SSC＝侧向散射；FSC＝正向散射)。
图4显示了来自人脐带的原代(分裂中)内皮细胞(HUVEC)在通过5kV/cm、70μs脉冲及随后的2.2A、10ms电流而进行的转染后电核转运的FACScan分析结果。转染后将细胞与与洋地黄毒苷偶联的抗H-2Kk抗体一起保温，然后和与Cy5偶联的抗洋地黄毒苷抗体，以及碘化丙锭(未染色荧光通道FL2和FL3)一起保温，并通过流式细胞计量术(FACScan)进行分析(SSC＝侧向散射；FSC＝正向散射)。
图5显示了细胞系(HeLa)在通过4kV/cm、100μs脉冲转染H-2Kk表达载体后3小时的电核转运的FACScan分析结果。4小时后，将细胞与与洋地黄毒苷偶联的抗H-2Kk抗体一起保温，然后和与Cy5偶联的抗洋地黄毒苷抗体，以及碘化丙锭(未染色荧光通道FL2和FL3)一起保温，并通过流式细胞计量术(FACScan)进行分析(SSC＝侧向散射；FSC＝正向散射)。
图6通过分析转录激活蛋白(HPV18-E2)在HeLa细胞中对报道构建物(pC18Sp11uc)的影响显示了它的电核转运。通过4kV/cm、100μs脉冲将蛋白质和质粒导入细胞后6小时进行测量。
图7显示了通过5kV/cm、70μs脉冲及不间断跟随的2.2A、60ms电流，用DNA-蛋白质复合物转染CHO细胞后5.5小时DNA-lac阻遏物复合物进入CHO细胞的电核转运的流式细胞测量图。
图8显示了肽-DNA复合物进入CHO细胞和K562细胞的电核转运的流式细胞测量图。通过5kV/cm、70μs脉冲及随后的2.2A、40ms电流将复合物导入CHO细胞；通过5kV/cm、10μs脉冲及随后的5A、10ms电流将复合物导入K562细胞。转染后4小时进行分析。
                         实施例
下列实施例例示了本发明，而不应看成限制。
实施例1：电核转运与场强和脉冲持续时间的关系
用编码鼠MHC I型蛋白质H-2Kk重链的载体转染新鲜制备、未受刺激(不分裂)的来自人外周血的单核细胞(PBMC)。于室温将1×106个细胞与缓冲液1中的10μg载体DNA一起转移至电极间距2mm的电击杯中，并在所述条件下进行转染。此后，立即用500μl RPMI培养基(不含胎牛血清即FCS)冲洗电击杯而得到细胞，于37℃保温10分钟，然后转移至装有预热培养基(含FCS)的培养皿中。保温5小时后，将细胞和与洋地黄毒苷偶联的抗H-2Kk抗体一起保温，然后和与Cy5偶联的抗洋地黄毒苷抗体，以及用于鉴定T辅助细胞的与藻红蛋白(PE)偶联的抗CD4抗体一起保温，并通过流式细胞计量术(FACScan)进行分析。通过碘化丙锭染色来测定死细胞数目。
图1显示了T辅助细胞的转染效率与场强(脉冲持续时间40μs，图a)和脉冲持续时间(场强5kV/cm，图b)的关系。
实施例2：通过脉冲后跟随电流来提高电核转运的效率
如实施例1中所述，用H-2Kk表达载体转染新鲜制备、未受刺激的PBMC。5kV/cm、40μs脉冲之后不间断的跟随不同强度和持续时间的电流。保温5小时后，依照实施例1分析细胞，并测定T辅助细胞的转染效率(图2)。
实施例3：PBMC的转染
如实施例1中所述，通过5kV/cm、40μs脉冲及随后的2.2A、20ms电流，用H-2Kk表达载体转染新鲜制备、未受刺激的PBMC，并依照实施例1进行分析。
图3显示了CD4+和CD4-PBMC级分中部分转染细胞的分析结果。36％的CD4+细胞和19％的CD4-细胞表达转染的DNA。死亡率26％的四分之三源于转染步骤。
实施例4：来自人脐带的原代(分裂中)内皮细胞(HUVEC)中的电核转运
如实施例1中所述，通过5kV/cm、70μs脉冲及随后的2.2A、10ms电流，用H-2Kk表达载体转染HUVEC，随后和与洋地黄毒苷偶联的抗H-2Kk抗体一起保温4小时，然后和与Cy5偶联的抗洋地黄毒苷抗体，以及碘化丙锭一起保温，并通过流式细胞计量术(FACScan)进行分析。
如图4中所示，58％的细胞表达转染的DNA，死亡率32％。若DNA通过转染到达100％的具有24小时分裂期的细胞细胞质，而且不考虑转染后的再生期，则也只有DNA通过核膜解体最多也只能到达16％的细胞的细胞核。
实施例5：细胞系(HeLa)中的电核转运
如实施例4所述，通过4kV/cm、100μs脉冲转染HeLa细胞，并在3小时后进行分析。如图5中所示，28％的细胞表达转染的DNA，死亡率5.5％。若DNA通过转染到达100％的具有24小时分裂期的细胞中细胞质，而且不考虑转染后的再生期，则在3小时后在最多12.5％细胞中DNA能够通过核膜解体而到达细胞核。
实施例6：各种未受刺激的原代细胞和细胞系的转染效率
依照实施例1中所述流程，使用实施例1中所述设置，用各种表达载体转染1×106个PBMC、其它原代细胞或细胞系细胞。在随后进行的流式细胞计量术分析(FACScan)中，使用特异抗体鉴定各种亚群。在下文表1中列出了平均转染效率。为了分析CD34+前体细胞的转染，转染了2.5-5×106个PBMC。在3.5小时后进行第一次转染效率分析，因为在此时间跨度内细胞系中没有细胞或只有少数细胞经历分裂。转染后3天再次测定用星号(*)标记的数值，它们与24小时时获得的数值一样高。
实施例7：HeLa细胞中HPV18-E2蛋白质的电核转运
例如可以通过转录激活蛋白和报道构建物的伴随转染来证明蛋白质的电核转运，细胞核中激活剂分子的结合可以开启后者的表达。因此，用载体pC18Sp11uc和纯化的HPV18-E2蛋白质转染HeLa细胞，所述载体是在启动子序列上游包含四个乳头瘤病毒转录激活剂HPV18-E2结合位点及发光报道序列的质粒。于室温将1×106个细胞与缓冲液中的200ng载体DNA和8ng蛋白质一起转移至电击杯中，并通过4kV/cm、100μs脉冲进行转染。于37℃、5％CO2保温6小时后，通过测量相对发光活性来分析细胞。
图6显示了载体DNA与蛋白质的共转染，不含蛋白质的制剂代表对照值。在8ng蛋白质的共转染后，观察到发光活性相对于对照有明显升高，证明转录激活剂到达了细胞核，并导致报道序列的表达。因此，依照本发明的方法同样能够将蛋白质导入真核细胞细胞核。
实施例8：抗体的电核转运
例如可以通过如下设置来获得抗体的电核转运。于室温，通过4kV/cm、10μs脉冲及不间断跟随的5A、10ms电流，用100μl缓冲液中针对细胞核特异性蛋白质复合物ND10的抗体转染1×106个HeLa细胞。施加脉冲后立即用400μl不含血清的细胞培养基冲洗电击杯而得到细胞，并于37℃保温10分钟。将细胞涂布于37℃温热的细胞培养基(含血清)中，并于37℃、5％CO2保温5小时。然后，用甲醛/戊二醛固定，用Triton X100透化，与FITC标记的针对抗ND10抗体的特异抗体一起保温，并通过荧光显微镜检术进行分析。
实施例9：CHO细胞中DNA-蛋白质复合物的电核转运
例如可以通过转染的报道质粒-阻遏物复合物的表达遏制来显示DNA-蛋白质复合物的电核转运。为此目的，用启动子与H2Kk标记序列之间具有lac操纵基因序列(已结合了lac阻遏物分子)的载体pSpe(Lac0)1-H2Kk转染CHO细胞。同时用编码人CD4且不含lac操纵基因序列的载体pMACS4.1共转染细胞，使得lac阻遏物分子不能特异结合它。于室温将1×106个细胞与缓冲液中1μg含lac0序列的H2Kk表达载体DNA和1μg不含lac0序列的CD4表达载体DNA及200ng lac阻遏蛋白一起保温30分钟，转移至电击杯中，并通过5kV/cm、70μs脉冲及随后的2.2A、60ms电流进行转染。于37℃、5％CO2保温5.5小时后，用胰蛋白酶消化细胞，染色，并通过流式细胞计量术分析相应标记的表达。通过和与Cy5偶联的抗H-2Kk抗体的保温来分析H2Kk表达，通过和与藻红蛋白(PE)偶联的抗CD4抗体的保温来分析CD4表达。
图7中所示两个实验的结果证明了转染结合了或未结合lac阻遏物的DNA-蛋白质复合物后标记序列的表达。存在特异结合的lac阻遏物(含lac0序列的H2Kk表达载体，质粒1)中，可以看出H2Kk表达相对于不含lac阻遏物的对照的明显遏制；而没有特异结合的lac阻遏物(不含lac0序列的CD4表达载体，质粒2)中，未发生CD4表达的遏制。这显示了DNA-蛋白质复合物到达了细胞核，而且阻遏蛋白导致了标记序列的表达遏制。因此，依照本发明的方法同样能够将DNA-蛋白质复合物导入真核细胞细胞核。
实施例10：肽-DNA复合物的电核转运
例如可以通过转染前PNA(肽核酸)结合报道质粒中启动子与报道基因盒之间的PNA结合序列对报道质粒的表达遏制来证明肽-DNA复合物的核转运。将1μg H-2Kk表达载体在含25μM(低浓度)或50μM(高浓度)PNA肽的10mM Tris/1mM EDTA中于65℃保温15分钟。使用表达载体的两种变异，即包含或不含特异PNA结合序列；还有，使用非特异PNA肽(肽1)和特异结合性PNA肽(肽2)。特异PNA结合导致限制性位点的标记，并通过相应的限制性分析得到确认。所用PNA肽具有如下DNA结合序列：NH2-CCTTTCTCCCTTC-肽(肽1)或NH2-CTCTTCCTTTTTC-肽(肽2)。纯粹的肽部分具有如下序列：NH2-GKPTADDQHSTPPKKKRKVED-COOH。为了转染K562细胞，使用具有如下序列的肽部分：NH2-GKPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVED-COOH。保温后，通过5kV/cm、70μs脉冲及随后的2.2A、40ms电流用复合物转染CHO细胞，通过5kV/cm、100μs脉冲及随后的5A、10ms电流用复合物转染K562细胞。于37℃、5％CO2保温4小时后，将细胞用与Cy5偶联的抗H-2Kk抗体染色，并通过流式细胞计量术分析H-2Kk表达。
图8显示了PNA肽与载体DNA的特异结合和非特异相互作用对报道构建物的表达的影响，从而证明肽-DNA复合物到达了细胞核。因此，依照本发明的方法同样能够将肽-DNA复合物导入真核细胞细胞核。
                             表1
细胞类型              条件                  3.5小时后    24小时后
                                            ％+          ％+
PBMC
CD4+(TH细胞)     1000V 40μs/2.2A 30ms    30-60        35-70*
CD8+(TC细胞)     1000V 70μs/2.2A 10ms    20-70        35-75*
CD14+(单核细胞)   1000V 70μs/1.0A 1ms     30-50        10-20
CD19+(B细胞)      800V 70μs/2.0A 30ms     10-40        10-50*
CD34+(干细胞)     1000V 70μs/2.2A 10ms    40-60        40-50
脐带
HUVEC              800V 70μs/2.0A 10ms     60-70        80-90
鸡胚细胞
神经元             800V 40μs/0.1A 1ms      30           50
成纤维细胞         1000V 50μs/0.1A 10ms    30           60
细胞系
HeLa               1000V 40μs/2.2A 1ms     ＞30         n.d.
CHO                1000V 50μs/1.6A 10ms    20-30        n.d.
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美国专利号6,008,038/EP 0 866 123 A1，Kroger，W.、Jagdhuber，B.、Ricklefs，H-J.，1999，Methods and a circuitarrangement for the electropermeation of living cells(用于活细胞电通透的方法和电路安排)

Claims (18)

1.使用电流将生物学活性分子导入真核细胞细胞核的方法，进入细胞核的导入是通过场强2-10kV/cm、持续时间至少10μs的脉冲和至少1A的电流来实现的。
2.依照权利要求1的方法，其中脉冲的场强是3-8kV/cm。
3.依照权利要求1或2的方法，其中脉冲的持续时间最大200μs。
4.依照权利要求1-3任一项的方法，其中脉冲之后不间断的跟随持续时间1ms-最大50ms的1A-最大2.5A电流。
5.依照权利要求1-4任一项的方法，其中生物学活性分子包括核酸或至少包含核酸部分。
6.依照权利要求5的方法，其中核酸存在于复合物中或与肽、蛋白质、多糖、脂质、或这些分子的组合或衍生物相联系。
7.依照权利要求6的方法，其中与核酸复合或相联系的分子用于将转染的核酸整合到细胞基因组中、核内定位或存留、与染色质相联系、或调控表达。
8.依照权利要求6的方法，其中与核酸复合、用于将转染的核酸整合到细胞基因组中的分子选自下组：逆转录病毒整合酶、原核生物转座酶、真核生物转座酶、序列特异性重组酶、拓扑异构酶9、大肠杆菌recA、大肠杆菌recE、大肠杆菌recT、噬菌体λredα、噬菌体λredβ和噬菌体λ末端酶。
10.依照权利要求6的方法，其中与核酸复合或相联系、用于核内存留或与染色质相联系的分子包括EBV蛋白质EBNA-1的结构域。
11.依照权利要求1-9任一项的方法，其中真核细胞是静止的不分裂细胞。
12.依照权利要求1-9任一项的方法，其中真核细胞是分裂细胞。
13.依照权利要求1-9任一项的方法，其中真核细胞是原代细胞。
14.依照权利要求12的方法，其中真核细胞是人外周血细胞。
15.依照权利要求12的方法，其中真核细胞是人血液多能前体细胞。
16.依照权利要求12的方法，其中真核细胞是来自人、大鼠、小鼠和鸡神经元的胚细胞。
17.依照权利要求12的方法，其中真核细胞是人骨髓细胞。
18.依照权利要求1-16的方法，其中将转染后的真核细胞用于诊断性方法。
19.使用依照权利要求1-17任一项的方法转染的真核细胞用于制备离体基因疗法药物的用途。
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