CN1109101C - 处理带有可变方向的电场的物质的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种利用电场和附加的处理剂处理含膜物质的方法和装置。利用所述方法，多个电极(121-128)排列在要处理物质的周围，并连接到一电极选择装置(110)的输出。电极选择装置的输入连接到一灵敏脉冲序列发生器的输出。将一处理剂加到所述含膜物质。将电脉冲加到电极选择装置，并通过电极选择装置以预定的、计算机控制序列序列路由到电极阵列中的所选择电极，由此以所附加的处理剂和顺序变化方向的电场处理所述含膜物质。所加脉冲通过所述电极选择装置(110)路由到选择电极(121-128)的过程可以通过许多方式来完成。

Description

处理带有可变方向的电场 的物质的方法和装置

本发明涉及将确定形状的脉冲电场应用于物质(尤其是活的细胞)的领域。更具体地讲，本发明尤其涉及电操作(electroperation)、电融合(electrofusion)和电操纵(electromanipulation)领域。

电操作和电融合涉及许多用在操纵原核细胞和真核细胞中的现象。电操作是通过在细胞膜上施加短时电势(脉冲)而对细胞膜去稳定。适当控制去稳定过程，可在膜中造成临时孔，在该孔存在时高分子可通过其中。因此，在电操作中，含膜物质的膜打开以容纳处理剂。电融合是两个或多个细胞通过在一个细胞膜上施加短时电势的融合。在电融合中，含膜物质的膜打开以便与其它含膜物质的膜融合。在这方面，一种含膜物质可看做另一种含膜物质的处理剂。电融合的物理和生物参数类似于电操作的物理和生物参数。

加到细胞膜的电势是通过使用发出多种脉冲形状的装置而施加的。两种最常用的脉冲形状是指数衰减和矩形波。指数衰减脉冲是通过电容放电脉冲发生器产生的。它是最便宜的脉冲发生器并且能让操作者对脉冲参数进行最少控制。矩形波发生器较贵一些，它对脉冲参数进行更多的控制并产生对细胞有较小杀伤力的脉冲。用这两种脉冲形状，在细胞中产生合理孔所需的能量与细胞大小、形状和成分有关。

对于电融合，细胞必须在膜的去稳定之时接触。这是通过诸如离心作用等的物理方式、诸如抗体分流等的生物化学方式或通过介电电泳的电学方式完成的。介电电泳是在细胞中通过在不均匀的电场中的细胞膜上施加低压电势而产生偶极子。偶极子可产生在直流(DC)或交流(AC)电场中。由于DC电场易产生不可接受的热量，故经常将射频AC用于介电电泳。

电操作和电融合的应用很多。其中一部分列出如下：(1)瞬时将DNA或RNA引入真核和原核两种细胞中；(2)永久性地将DNA转染成真核和原核两种细胞；(3)永久或暂时将DNA转染成用于基因疗法的人类和动物细胞；(4)将抗体、其它蛋白质或药物引入到细胞；(5)抗体产生杂交瘤的产生，(6)植物中的花粉电转化；(7)电插入；(8)动物胚胎的制作；(9)粘着细胞的电融合；(10)植物体细胞杂交体的产生；(11)DNA接种；和(12)癌症治疗。

电操作或电融合工作的一种方式是在细胞膜中引入形成孔或孔，对通过给细胞施加电脉冲而引入的细胞孔的特性存在着一些争论，但实际效果是引入细胞的渗透性和与其它类似受影响并紧密接触的细胞的易融合性。在细胞膜中引入孔或细胞膜的融合存在DC电压阈值。阈值之下的电压不能引起实质性的细胞膜扰动。许多细胞在细胞膜上的阈值电势大约是1伏。因此，为在细胞膜上获得1伏的电势而在电极之间每厘米所加的总的DC电压，与细胞直径成比例。小的细胞，比如细菌，要求高的DC电压，而大的细胞，比如许多哺乳动物细胞，要求相对较低的电压。还有其它的细胞具体变化，比如影响细胞所需电压的细胞骨架结构。

当采用其强度足以引起细胞的电操作或电融合的DC电脉冲时，主要问题是该过程经常导致不可接受的细胞死亡百分率。死亡率或高至50％甚至更高。有许多不想要如此高的细胞死亡率的理由。当对细胞进行处理以进一步用于牛体内基因治疗(ox vivo gene therapy)时，细胞的死亡会阻止适当数量的细胞吸入治疗基因物质。当体内基因治疗用于病人时，细胞的死亡不仅造成差的治疗效果，而且也对病人造成伤害。

在电操作和电融合中已经采用许多方法来减少细胞杀伤。最通用的方法是对细胞采用矩形DC脉冲而不是采用指数衰减脉冲。这种方法减少了施加到细胞上的总能量，同时采用足够的DC电压来越过阈值。虽然采用矩形脉冲是改进方式，但在将电能有效应用到细胞期间仍有相当大的细胞杀伤。

当前市售的矩形波脉冲有许多可调参数(电压、脉冲宽度、脉冲总数和脉冲频率)。这些参数一旦被设定，则对每一脉冲期间的每一脉冲都固定。例如，如果每厘米电压为1,000V，脉冲宽度为20微秒，脉冲数等于10，并选择1Hz的脉冲频率，则对于该脉冲期间，10个脉冲中的每一个都固定在每厘米1000V和20微秒。

然而，即便当使用利用固定脉冲参数的矩波脉冲器时，仍可发生不想要的高细胞死亡率。在这方面，很希望将波脉冲以细胞死亡率大大减少的方式控制。

在Sukharev等所写的题为《DNA到细胞的电操作和电泳转移(Electroperation and electrophoretic DNA transfer into cells)》(在“Biophys.J.”的第63卷，1992年11月，第1320-1327页中)的文章中，披露了将三个发生器用于产生DC脉冲。时延发生器控制第一脉冲发生器产生要加到生物Cos-1细胞的第一DC脉冲。该第一脉冲的幅度足以引起细胞上的孔形成。该时延发生器产生一时间延迟，然后控制第二脉冲发生器产生加到细胞上的第二DC脉冲。该第二DC脉冲不足以保留第一脉冲形成的引入孔。然而，第二脉冲足以引起DNA物质的电泳进入先前加了脉冲的细胞中。对于Sukharev et al的文章中所披露的内容应注意到几个关键点。首先，作为第一脉冲的结果形成在细胞中的引入孔，在第一脉冲过去之后在没有其它足以保持该引入孔的脉冲加到细胞上的情况下开始收缩。第二，Sukharev etal的文章没有说明在引入孔形成脉冲之后的细胞生存力的问题。第三，DNA物质能够进入细胞的时期受到仅有两个主要脉冲作用的限制。在这方面，很希望能够提供可保持电操作中形成的引入脉冲的脉冲方案。此外，很希望能够提供致力于提高电操作中的细胞生存力的脉冲方案。此外，很希望能够提供可提供三个或更多个脉冲，以允许电操作中的物质进入细胞的更多时间的脉冲方案。

在Ohno-Shosaku等所写的题为《由电脉冲引入融合技术所产生的人和鼠的淋巴母细胞之间的体细胞杂交(Somatic Hybridization between Humanand Mouse Lymphoblast Cells Produced by an Electric Pulse-Induced FusionTechnique)》(在“《细胞结构和功能》(Cell Structure and Function)”的第9卷(1984年)，第193-196页中)的文章中，披露了采用100Hz，0.8kV/cm的交替电场使生物细胞融合在一起。注意到，交替电流提供了具有相同持续时间、相同幅度和相同脉冲间隔的一系列电脉冲。

在Okamoto等所写的题为《用于带有原始缺损SV40 DNA的人类成纤维细胞系的转染的最优化电操作：带有粘多糖代谢病的人类转移成纤维细胞系的研究(I--VII)(Optimization of Electroporation for Transfection ofHuman Fibroblast Cell Lines with Origin-Defective SV40 DNA：Developmentof Human Transformed Fibroblast Cell Lines with Mucopolysaccharidoses(I--VII))》(在“细胞结构和功能”的第17卷(1992年)，第123-128页中)的文章中，披露了测试多个电参数以获得优化电操作。这些电参数包括电压、脉冲持续时间、脉冲数目和脉冲形状。应注意，对于任何所选的电参数的具体设定，具有所选择参数的所有脉冲都具有相同的持续时间、相同的幅度和相同的脉冲间隔。

在Orias等所写的题为《采用电操作的突变体四膜虫的巨核核糖体RNA基因的替代(Replacement of the macronuclear ribosomal RNA gene of a mutantTetrahymena using electrooperation)》(在“《基因》(Gene)”的第70卷(1988年)，第295-301页中)的文章中，披露了两种不同的电操作装置被应用。应注意到，每一种电操作装置为每一次电操作运行提供一系列电脉冲(脉冲串)。对于任何具体的电操作运行，脉冲串中所有的脉冲都具有相同的持续时间、相同的幅度和相同的脉冲间隔。

在Miller等所写的题为《细菌的高电压电操作：带有质粒DNA的弯曲菌属jejuni的基因转化(High-voltage electroporation of bacteria：Genetictransformation of Campylobacter jejuni with plasmid DNA)》(在“Proc.Natl.Acad.Sci USA”的第85卷，1988年2月，第856-860页中)的文章中，披露了测试许多电脉冲参数以获得优化电操作。这些电脉冲参数包括电场强度和时间常数。应注意到，对于所选择脉冲参数的任何具体设定，具有所选择参数的所有脉冲都具有相同的电场强度和相同的时间常数。

在Ogura等所写的题为《带有圆精子细胞的鼠卵母细胞的电融合之后的正常幼体的诞生(Birth of normal young after electrofusion of mouse oocyteswith round spermatids)》(在“Proc.Natl.Acad.Sci USA”的第91卷，1994年8月，第7460-7462页中)的文章中，披露了将卵母细胞通过暴光于Dulbecco’s PBS(磷酸缓冲盐溶液)媒质中的AC(2MHz，20-50V/cm，提供10秒)和DC(1500V/cm，提供80秒)而被电激活。随着电激活，该细胞被从Dulbecco’s PBS媒质中去掉，并且放入Hepes/Whitten媒质中并被注入单个精子细胞。这个卵母-精子细胞对放入融合媒质，并依次暴露于AC脉冲(2MHz，100V/cm，提供15-20秒)、融合DC脉冲(3750-4000V/cm，提供10微秒)和随后的AC脉冲(2MHz，100V/cm，提供15-30秒)。应用卵母细胞激活脉冲和卵母-精子细胞融合脉冲之间的时间间隔是15-40分钟。对于Ogura等的文章中所披露的内容应注意几点。首先，不进行电操作；相反，进行电融合。而且，精子细胞是通过注入方式，而不是通过电操作方式进入卵母细胞的。第二，仅使用了两个DC脉冲。两个AC脉冲都不具有足够的电压量以提供电操作阈值，比如为200V/cm。公开的两个顺序的DC脉冲不能引导孔形成。在这个细胞融合方法中没有利用孔形成。没有提供保留孔形成的设施或者保持所处理细胞存活力的设施。

在Andreason等所写的题为《用于转染哺乳动物细胞系的电操作的最优化(Optimization of electroporation for transfection of mammalian cell lines)》(在“Anal.Biochem.”的第180卷第2号，1989年8月，第269-275页中)的文章中披露了：发现通过采用方波脉冲的电操作而进行的转染，当相对于指数衰减脉冲时，可通过重复脉冲大大提高。在不同的试验运行中试用了不同的脉冲，以确定不同电场强度的作用。对于给定的试验运行，每一个DC脉冲都与其它DC脉冲具有相同的电压和相同的持续时间。

在Vanbever等所写的题为《利用电操作的美多洛尔的穿皮给药法(Transdermal Delivery of Metoprolol by Electroporation)》(在“《药学研究》(Pharmaceutical Research)”的第11卷第11号(1994年)，第1657-1662页中)的文章中披露了：电操作可用于穿过皮肤组织输送。这篇文章公开了一系列用于确定优化电操作条件的电操作试验。应用了一种可编程以根据指数衰减容性放电产生三种类型的脉冲的电操作装置，这三种脉冲是：单个的HV(高压)脉冲(范围从3500V至100V)；单个的LV(低压)脉冲(范围从450V至20V)；和由第一HV脉冲、脉冲间延迟(1秒)和第二LV脉冲组成的一对脉冲。应注意到所应用的脉冲没有一个是矩形形状。在实际试验运行中，利用一对脉冲，该第二LV脉冲的脉冲幅度是100V(见第1659页的图1和2)。作为在进行的实际试验结果之间对比的结果，在第1659页的第二栏中的结论是：“单脉冲和一对脉冲在促进美多洛尔渗透方面同样有效，表明一对脉冲是不必要的”。此外，从上述同一页同一栏开始到第1660页第一栏得出了进一步的结论，表明：“低压长脉冲(621±39ms)比有着短脉冲时间(3.1±0.1ms)的高压脉冲对促进美多洛尔渗透方面更有效”。从第1660页第一栏第一段开始，作者表明：“用于此研究中的短高压脉冲几乎没有任何效果，而几百伏和几毫秒时间常数的脉冲在穿皮渗透方面具有奇效”。很明显，Vanbever等不提倡使用具有不同幅度的脉冲的脉冲串。而且，Vanbever等的文章中一点儿也没涉及到电操作中的细胞的细胞生存力的问题。

在Bahnson等所写的题为《对电操作中的细胞增加血清从而提高生存和转染效率(Addition of serum to eletroporated cells enhances survival andtransfection efficiency)在“Biochem.Biophys.Res.Commun.”的第171卷第2号，1990年9月14日，第752-757页中)的文章摘要中披露了：血清很快封住电操作中的细胞的膜，并且，随着电操作及时增加血清可提高细胞的存活和转染效率。比要求使用血清更让人希望得到的是提供一种可提高细胞的存活和转染效率的电学方法。

在Knutson et al所写的题为《电操作：参数影响DNA转移到哺乳动物细胞(Electroporation：parameters affecting transfer of DNA into mammaliancells)在“Anal.Biochem.”的第164卷第1号，1987年6月，第44-52页中)的文章摘要中，披露了一种允许高电压放电波形的装置，该高电压放电波形相对于上升时间、峰值电压和下降时间而变化。所做的测试中将哺乳动物细胞暴露于多个电压放电波形，但这多个暴露的波形却没有改善DNA的转移。应注意所用的多个脉冲中的每一个脉冲都与其它脉冲具有相同的电压和相同的持续时间。

在Kubiniec等所写的题为《脉冲长度和脉冲强度对通过电操作进行的转染的影响(Effects of pulse length and pulse strength on transfection byelectroporation)在“《生物技术》(Biotechniques)”的第8卷第1号，1990年1月，第16-20页中)的文章摘要中披露了：研究将脉冲场强E和脉冲长度tau 1/2(指数衰减脉冲的一半时间)用于HeLa(海拉)或HUT-78细胞相对重要性。在该摘要中，没有披露使用多个DC脉冲以进行电操作。

近些年来，在电操作、电融合和介电电泳领域已进行了许多改革，下面所讨论的美国专利就是这样一些改革的代表。

美国专利第4,441,972号公开了一种用于电融合、细胞分选和包括能提供非均匀电场的特别设计的电极的介电电泳的装置，该非均匀电场用于分选细胞。更具体地讲，至少有一个电极具有一个包括多个基本上为同心的沟槽的表面。由于准备这样的包含同心沟槽的电极既昂贵又耗时，故很希望能提供一种能够变化加到活细胞的电场的电融合装置，而不用具有多个同心沟槽的电极。

美国专利第4,441,972号中公开的装置可用于通过介电电泳来进行细胞分选。对于细胞分选，施加到电极的AC电压的频率和强度可变化，以便想要收集的细胞从一开口端到达预定半径距离，然后在电场释放后通过一出口端被收集和提取。DC电脉冲没有用于细胞分选。

美国专利第4,441,972号中公开的装置也可用于电融合。用这种使用方式，将低AC电压加到电极，以允许细胞在电极之间接连排成一行。通常可利用大约250KHz的10V左右的弱AC电场。然后，施加单个的约10到250V的DC短脉冲约50微秒，以使排列的细胞融合。该专利说明，发出脉冲的频率、电压和持续时间可根据要分选或融合的细胞的类型和大小调整，或根据所使用的载波流的类型调整。在该专利中，还公开了包括计算机在内的多种装置，可用于控制电极的输入频率和电压。然而，在美国专利第4,441,972号中，特别关注了电融合，没有披露使用多于单个的DC脉冲以进行电融合。应注意到，美国专利第4,476,004号与美国专利第4,441,972号密切相关，并具有类似的公开内容。

美国专利第4,659,547号中公开了一种用于电融合、电操作等的探测器。公开了一种适当的高电压脉冲源，它能够提供范围为25-475DC、电流达1安、持续时间为1-990毫秒的输出电压脉冲。该文中没有披露使用多个DC脉冲以进行电融合或电操作。

美国专利第4,750,100号中公开了一种高电压和高电流强度的开关装置，该装置能够发出用于电操作的指数衰减脉冲或矩形波脉冲。该文中没有披露使用多个DC脉冲以进行电操作或转染。

美国专利第4,832,814号中公开了一种用于进行活细胞的电融合的电融合细胞。一种电功率源提高一系列三个DC脉冲，每个脉冲为12毫秒和68伏，并在脉冲之间有1秒间隔。应注意到每一个DC脉冲与其它DC脉冲具有相同的电压和相同的持续时间。

美国专利第4,882,281号中公开了一种用于电融合、电操作等的探测器。正如上述美国专利第4,659,547号中公开的，公开了一和适当的高电压脉冲源，它能够提供范围为25-475DC、电流达1安、持续时间为1-990毫秒的输出电压脉冲。该文中没有披露使用多个DC脉冲以进行电融合或电操作。

美国专利第4,910,140号中公开了一种通过施加短持续时间的高强度脉冲而进行原核细胞的电操作的方法。该专利公开的脉冲通常由包括整个所需周期的单个脉冲组成。或者，该脉冲可以由多个具有所需的2-20毫秒范围的累积时间的更短脉冲组成。这样的一系列脉冲相互之间的间隔必须足够短，以使组合的效果能够造成细胞壁的透化。通常，这种脉冲间隔5毫秒或更短，最好是间隔2毫秒或更短。

美国专利第4,955,378号中公开了一种向动物或人体解剖部位发出脉冲，以便进行体内(in vivo)电融合的电极。该专利说明，通常来讲，电融合最好在恒压条件下，通过施加给电极3个20伏幅度、20微秒持续时间的方波(每秒一个脉冲)来完成。应注意到每一个DC脉冲与其它DC脉冲具有相同的电压和相同的持续时间。

美国专利第5,007,995号中公开了一种用于活体细胞的电融合的装置。它没有采用DC脉冲而是采用AC脉冲。通过变化AC频率、施加的AC电压和AC脉冲的持续时间进行了一系列研究。在每一项研究中，将三个变量中的两个保持固定，通过以逐渐增加方式设定另一个变量而改变该变量。该文中没有披露使用多个DC脉冲以进行电融合。

美国专利第5,019,034号中公开了一种用于电操作组织的方法，以便将大分子传输到组织中。将青蛙皮肤用作例子。在进行电操作的过程中，对脉冲的形状、持续时间和频率进行选择。峰值电压也在初始设定中给定。将脉冲逐渐循环加到高电压，直到发生电操作。此时，保持脉冲形状、持续时间、频率和电压，直到已经转移了所需数量的分子。

美国专利第5,124,259号中公开了一种使用特别设定的缓冲器的电操作方法，其中消除了氯化物离子。此文章披露，在进行电操作的过程中，电压可以是100-1000V/cm，而施加电压的时间可以是0.1-50毫秒。该文中没有披露使用多个DC脉冲以进行电操作。

美国专利第5,128,257号中公开了几种用于电操作的容器和电极。电源提供200至2000伏的电压范围。脉冲宽度是在0.1至100毫秒范围之内。该文中没有披露使用多个DC脉冲以进行电操作。

美国专利第5,134,070号中公开了一种其上培养了细菌的特别覆盖的电极。该电极上的细菌经受电操作。在进行电操作的过程中，将一种测量电场强度的装置适当连接到微处理器，以便提供“智能”电操作装置，该装置能够施加进一步增加的电势，直到细胞已经成孔(porated)，并且能够检测在何种电场强度下细胞被成孔(porated)。由于该装置测量引入成孔(poration)所要求的条件，并检测成孔(poration)发生的时间，因此，由于仅将足以引起成孔(poration)的能量引入系统，故实现了大大减少当前介导的细胞死亡率。然而，应当注意，该文中没有披露使用多个DC脉冲以进行电操作。此外，该电操作装置能够记录关于各种细胞系所要求的成孔(poration)电势的信息，以及各种媒介成份对可发生的成孔的类型和大小的影响。然而，应当注意，该设施不能保留已经引入的孔形成。

美国专利第5,137,817号中公开了一种利用特别设定的电极进行电操作，以实施体内电操作的装置和方法。在进行电操作的过程中，将单个的DC电压脉冲加到主细胞上。该文中没有披露使用多个DC脉冲以进行电操作。

美国专利第5,173,158和5,283,194号中的每一个专利都公开了一种进行电操作和电融合的方法，其中，选择利用允许一定大小的细胞而排除其它大小的细胞的电极。一单个脉冲产生引起电操作的电场。该文中没有披露使用多个DC脉冲以进行电操作或者电融合。

美国专利第5,186,800号中公开了一种通过施加短持续时间的高强度电场进行原核细胞的电操作的方法，就象上述美国专利第4,910,140号一样。美国专利第5,186,800号也披露，所施加的脉冲通常由包含整个所需周期的单个脉冲组成。或者，该脉冲可由多个具有所需2至20毫秒范围的累积时间周期的更短脉冲组成。这样的一系列脉冲相互之间的间隔必须足够短，以使组合的效果能够造成细胞壁的透化。通常，这种脉冲间隔5毫秒或更短，最好是间隔2毫秒或更短。在每一次试验中，用单个的电脉冲引起电操作。试验参数包括电脉冲、主细胞浓度、转化物质浓度和后冲击(post-shock)培育期的许多参数。可以看到，电操作中的细胞的生存力和转化力对脉冲初始电场强度很敏感。所得出的结论是，细胞存活力随着场强的增加而稳定下降；并且，在进行的每一次试验中，当脉冲中有30％至40％的细胞存活时可达到最大转化效率。该文中没有披露使用多个DC脉冲以进行电操作。鉴于以上所述，很希望能提供这样一种方法，其中，当实施电操作的脉冲中有大于40％的细胞存活时，可达到最大转化效率。

美国专利第5,211,660号中公开了一种进行体内电操作的方法。该文中没有公开所使用的直流电荷的电参数的详情。

美国专利第5,232,856号中公开了一种采用特别设计的电极的电操作装置。利用许多不同的主细胞和不同的转化物质进行了许多电操作试验。在每一次试验中，仅将单个的DC脉冲施加到主细胞。该文中没有披露使用多个DC脉冲以进行电操作。

美国专利第5,273,525号中公开了一种基于电操作电极用于药物和基因输送的注射器。在使用电操作电极时，采用传统的电源，以提供具有固定脉冲幅度、固定脉冲宽度和固定脉冲间隔的一到一百个连续脉冲。

美国专利第5,304,120和5,318,514号中的每一个都公开了一种用于在人的活细胞中进行体内电操作的电极。在使用电能引起电操作的过程中，电源最好使用重复电场，并且电场的幅度和持续时间足以使活细胞的壁可渗透，以使药物或基因在不被杀死的情况下进入活细胞。该电源包括单极振荡脉冲串和双极振荡脉冲串。应注意，对于所选的脉冲串，脉冲串中的每一个脉冲都与其它脉冲上升到同样的电压并具有同样的持续时间。

上面已经讨论了许多理论因素和许多公开的现有技术，下面将进一步讨论关于引起生物细胞的孔形成的几个理论概念。然而，应当理解，在此所讨论的理论概念中没有一个是用来限制本发明的范围。相反，本发明的范围仅由所附的权利要求及其等效物来限制。

本发明的发明人已经发现，在脉冲期间内改变脉冲参数可以减小细胞的杀伤，并同时保持或提高电操作和电融合效率。细胞杀伤的减小可以与加到细胞的能量的减少有关。更具体地讲，确定每个脉冲所加的总能量的两个参数是脉冲幅度和脉冲宽度。脉冲宽度的变化与脉冲幅度的变化具有不同的影响。随着更宽脉冲的应用减小脉冲宽度，能允许一上阈值电压的施加，同时减少一系列脉冲的总能量。

此外，对于下面将讨论的理论因素，保持细胞中已形成的孔所要求的能量比最初产生孔所要求的能量较少。在改变脉冲宽度的同时保持上述阈值电压，在由更宽脉冲最初形成更小孔的场合下尤其有用。更窄的脉冲有助于在控制方式下进行孔扩张。对于任何特定种类的细胞的理想条件是，发现一组电脉冲参数，这些电脉冲参数能使细胞扩张的大小大到足以允许外源分子(比如小的有机分子或DNA)进入细胞，但并不将孔大小扩张到不能包覆的程度。达到该目标的脉冲参数必须对每一细胞种类通过实验确定。

脉冲幅度的变化能允许一下阈值保持脉冲的施加。一旦将带有上阈值电压的足够能量的脉冲加到细胞，便发生细胞膜耐受性的瞬时下降。由于细胞膜的下降的耐受性，阈值之下的脉冲电压应当足以保持由上阈值脉冲引入的细胞孔。

因此，虽然上述现有技术部分表示使用电脉冲引起电操作已为人们熟知，但上述现有技术并没有教导或建议利用具有下列所需组合特征的脉冲电场处理物质的方法，这些特征是：(1)提供将一系列电脉冲应用于活细胞的过程，其中所述电脉冲产生减小的细胞死亡率；(2)给电脉冲设备的操作员(operator)提供用于所应用的脉冲系列的最大操作员控制的过程；(3)提供在一系列电脉冲期间改变脉冲宽度的过程；(4)提供在一系列电脉冲期间改变脉冲电压的过程；(5)提供控制所述过程的机器；(6)提供维持电操作中形成的引入脉冲的脉冲方案；(7)提供可以提供三个或更多个脉冲以允许物质在电操作中有更多时间进入细胞的脉冲方案；(8)提供提高细胞存活率和转染效率的电学方法；和(9)提供一种电操作方法，其中，当实施电操作的脉冲中有大于40％的细胞存活时，可达到最大转化效率。上述所需要特征可通过带有本发明的脉冲电场的处理剂的独特方法来提供，本发明将从其下述说明中变得更加明白。本发明相对于现有技术的其它优点也可更加明显。

转到电操作技术的另一个方面，其中处理剂加到电操作中的物质上。在由Gunter A.Hofmann、Sukhendu B.Dev和Gurvinder S.Nanda所写的题为《电化学疗法：从实验室到诊所的转移(Electrochemotherapy：Transitionfrom Laboratory to the Clinic)》(在“《IEEE医学和生物学工程(IEEEEngineering in Mdecine and Biology)》”中，1996年11/12月，第124-132页)的文章中，公开了一种用于改变加到沿体内器官排列的一组电极上的电场方向的机械开关配置。该机械开关配置是机械旋转开关形式，它用机械方法选择六指针陈列(six-needle array)电极中的电极。这样的机械开关配置与用于将能量分配给火花塞的汽车配电器关系密切。这样的机械开关配置不允许在电极的脉冲方式选择顺序上有很大变化。

除电操作电场外，在许多场合已应用对电场方向进行反向的概念，比如，心脏的心脏转位术(cardioversion)和电振(defibrillation)、凝胶电泳和场倒位毛细管电泳(field inversion capillary electrophoresis)。

关于心脏方面应用，Kallok的美国专利第5,324,309号公开了一种用于心脏转位和电振的方法和装置。在使用该方法的过程中，将多个脉冲加到沿动物心脏周围位置排列放置的多个电极。微处理器控制的开关装置将脉冲引向预定电极。Kallok的方法和装置中的目的是修改心脏中的电系统，以校正原纤化或其它电行为问题。Kallok没有声明对心脏增加任何处理剂。在这方面，Kallok没有表明改变电场有助于心脏吸入处理剂。

有趣的是，对于凝胶电泳，在相对较长时间周期内(比如，0.6-125秒)和以相对较低电压(比如，3.5-20伏/厘米)施加来自不同方向的电场。并且，有趣的是，对于场倒位毛细管电泳，在相对较长时间周期内(比如，2秒)和以相对较低电压(比如，50伏/厘米)施加反方向电场。而且，对于凝胶电泳和场倒位毛细管电泳，不对含膜物质(比如细胞、组织、器官和脂体质)进行处理。

电脉冲序列在其电势变化中几乎是无限的。在电通讯和雷达领域使用大量脉冲序列。例如，脉冲序列可以连续。连续的脉冲序列可以单极性或双极性。脉冲序列可以包括矩形波或方波(矩形波的特列)。可以在门控制或突发脉冲序列中提供单极性或双极性的预定数量的矩形脉冲。在脉冲序列中，可在不同幅度水平提供脉冲(脉冲幅度调制)；这种形式的脉冲串通常用于调制器和计算机中，以用于计算机通讯。可以以不同的脉冲宽度或持续时间提供脉冲(脉冲宽度调制)；在这种情况下，可保持固定的脉冲间隔。可以以不同的脉冲间隔提供脉冲(脉冲间隔调制)；在这种情况下，可保持固定的脉冲宽度。

一种特定的电脉冲种类称为“灵敏(agile)脉冲序列”。为达到本发明的目的，通过定义方式，灵敏脉冲序列具有下列特征：(1)序列中的脉冲数量可以在2-1000范围内；(2)序列中的脉冲是矩形形状；(3)序列中的每一个脉冲都有一脉冲宽度；(4)在序列中的一个脉冲开始和下一脉冲开始之间有一脉冲间隔；(5)用于序列中脉冲的脉冲幅度大于100V，最好是大于200V；和(6)用于序列中脉冲的脉冲极性可以是单极性或双极性。灵敏脉冲序列中可表现的另一特征是序列中的矩形脉冲的“on(开)”时间小于脉冲间隔的10％。

虽然在通讯和雷达应用中已采用灵敏脉冲序列，但灵敏脉冲序列并没有用于处理物质。更具体地讲，现有技术中没有公开将灵敏脉冲序列用于处理物质，以提供精细控制的强电场，从而改变、操纵或用作催化剂，以带来精确定义和控制的、永久或临时的物质中的变化，但本发明却做到了这些。

更具体地讲，根据本发明，提供了一种用于利用脉冲电场处理物质，尤其是有机物质的方法，其中所述方法包括将具有至少三个脉冲的灵敏脉冲序列施加到一物质的步骤，其中所述灵敏脉冲序列具有下列特征中的一个、两个或三个：(1)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲幅度上相互不同；(2)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲宽度上相互不同；和(3)所述至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔，与所述至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔不同。

更具体地讲，根据本发明，提供了一种用于利用脉冲电场处理物质，尤其是有机物质的方法，包括将具有至少三个脉冲的灵敏脉冲序列施加到一物质的步骤，其中所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲幅度上互不相同。

根据本发明，提供了一种用于利用脉冲电场处理物质，尤其是有机物质的方法，包括将具有至少三个脉冲的灵敏脉冲序列施加到一物质的步骤，其中所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲宽度上互不相同。

根据本发明，提供了一种用于利用脉冲电场处理物质，尤其是有机物质的方法，  包括将具有至少三个脉冲的灵敏脉冲序列施加到一物质的步骤，其中所述至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔，与所述至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔不同。

根据本明更广的方面，提供了一种用脉冲电场处理生物细胞，以在细胞中引起孔形成的方法。所述方法包括将具有至少三个脉冲的灵敏脉冲序列施加到细胞的步骤，其中所述灵敏脉冲序列具有一个、两个或三个下列特征：(1)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲幅度上相互不同；(2)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲宽度上相互不同；和(3)所述至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔，与所述至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔不同，以使所引起的孔保留相对较长的时间周期，从而维持细胞的存活性。

更具体地讲，根据本发明，提供了一种用脉冲电场处理生物细胞，以在细胞中引起孔形成的方法。所述方法包括将具有至少三个脉冲的灵敏脉冲序列施加到细胞的步骤，其中所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲幅度上互不相同，以使所引起的孔保留相对较长的时间周期，从而维持细胞的存活性。

此外，根据本发明，提供了一种用脉冲电场处理生物细胞，以在细胞中引起孔形成的方法。所述方法包括将具有至少三个脉冲的灵敏脉冲序列施加到细胞的步骤，其中所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲宽度上互不相同，以使所引起的孔保留相对较长的时间周期，从而维持细胞的存活性。

此外，根据本发明，提供了一种用脉冲电场处理生物细胞，以在细胞中引起孔形成的方法。所述方法包括将具有至少三个脉冲的灵敏脉冲序列施加到细胞的步骤，其中所述至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔，与所述至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔不同，以使所引入的孔保留相对较长的时间周期，从而维持细胞的存活性。

从上面的描述中可以明白，灵敏脉冲序列是非正弦电脉冲序列类型。在这方面，根据本发明的原理，除灵敏脉冲序列外，可将其它类型的非正弦电脉冲序列用于处理物质。

在这方面，根据本明更广的方面，提供了一种用脉冲电场处理物质的方法。所述方法包括将至少三个非正弦电脉冲序列施加到物质的步骤，所述三个非正弦电脉冲序列的场强等于或大于100V/cm，最好是等于或大于200V/cm。所述三个非正弦电脉冲脉冲序列具有一个、两个或三个下列特征：(1)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲幅度上相互不同；(2)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲宽度上相互不同；和(3)所述至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔，与所述至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔不同。最好，所述物质是有机物质。

根据本明另一更广的方面，提供了一种用脉冲电场处理生物细胞，以便在细胞中引起孔形成的方法。所述方法包括将至少三个非正弦电脉冲序列施加到生物细胞的步骤，所述三个非正弦电脉冲序列的场强等于或大于100V/cm，最好是等于或大于200V/cm。所述三个非正弦电脉冲脉冲序列具有一个、两个或三个下列特征：(1)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲幅度上相互不同；(2)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲宽度上相互不同；和(3)所述至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔，与所述至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔不同，以使所引入的孔保留相对较长的时间周期，从而维持细胞的存活性。

根据本明另一更广的方面，提供了一种利用附加处理剂和电场处理含膜物质的方法。其中所述电场的方向是变化的。在电操作领域，一个更重要的方面是，最大效果是在电场与细胞表面切线垂直情况下的细胞上。当电操作最大时，有助于附加的处理剂进入细胞。由于细胞大体为圆形，因而孔通常形成于离电极最近的细胞的极上。脉冲效果随着细胞表面切线变得与电场平行而下降。电操作效果在与最大效果情况差别90度时为零(在理想球体上)。考虑到这些，实现了在细胞的不同区域表现电场方向的变化，以使电场最大，从而有助于附加的处理剂进入细胞。这种电场方向的变化引起细胞中更多孔的形成，从而增加电操作效率。

本发明的其中电场方向变化的方法包括下列步骤。多个电极以阵列形式排列在要处理的含膜物质周围位置。将电极连接到电极选择装置的输出。电极选择装置的输入连接到灵敏脉冲序列发生器的输出。将一处理剂加到含膜物质。将电脉冲加到电极选择装置。所加的脉冲以预定次序通过电极选择装置路由到电极阵列中的所选择电极，从而以附加的处理剂和顺序改变方向的电场处理该物质。

所加的脉冲以预定次序通过电极选择装置路由到电极阵列中的所选择电极这个过程可用本发明的许多方法来完成。

在一种类型的脉冲路由中，可将第一脉冲加到电极的第一选择组。然后，第二脉冲加到电极的第二选择组。然后，第三脉冲加到电极的第三选择组。这种脉冲路由可概括为，N个脉冲的序列可顺序路由到电极的N个选择组。

作为例子，可以是沿一体内组织排列的8个电极。所加的脉冲可以是至少三个具有等于或大于100V/cm的场强的非正弦电脉冲的高电压灵敏脉冲序列，其中所述至少三个非正弦电脉冲具有一个、两个或三个下列特征：(1)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲幅度上相互不同；(2)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲宽度上相互不同；和(3)所述至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔，与所述至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔不同。灵敏脉冲序列的第一脉冲可路由到第一、第三、第五和第七电极。灵敏脉冲序列的第二脉冲可路由到第二、第四、第六和第八电极。灵敏脉冲序列的第一脉冲可路由到第一、第二、第四和第五电极。利用本发明的装置和方法的仅8个电极的所选择组的脉冲与脉冲之间的可能变量数是一个很大的数。采用更多的电极可以提供更大数目的可能变量数。这种类型的脉冲路由可以概括为，包含灵敏脉冲序列的N个脉冲可顺序路由到电极的N个选择组。利用本发明可以得到的更广的结论是，包含灵敏脉冲序列的N个脉冲可以以任何顺序路由到任何组合的电极的N个选择组。

在体内组织的的另一类型的脉冲路由中，第一高压灵敏脉冲顺序方案可加到电极的第一选择组。然后，第二脉冲方案可加到电极的第二选择组。然后，第三脉冲方案可加到电极的第三选择组。这种类型的脉冲路由可概括为，N个脉冲方案可顺序路由到电极的N个选择组。

作为另一个例子，仍然可以是8个电极沿体内组织排列。第一脉冲方案可路由到第一、第三、第五和第七电极，并经由第二、第四、第六和第八电极返回。第二脉冲方案可路由到第一、第二、第四和第五电极，并经由任意一个或更多个其余电极返回。利用本发明的装置和方法的仅8个电极的所选择组的脉冲方案与脉冲方案之间的可能变量数是一个很大的数。采用更多的电极可以提供更大数目的可能变量数。

当经受高压灵敏脉冲电脉冲处理的对象是体内对象时，比如是动物(包括人类)或植物组织或器官时(其中对细胞进行电操作)，加到电极的脉冲的高压灵敏脉冲序列中的电场方向可以旋转，由此改善体内部分的电操作。

根据本发明的另一方面，提供了一种利用电场处理体外(in vitro)含膜物质的方法。所述含膜物质可包括细胞、组织、器官和脂质体。该体外方法包括下列步骤：

将体外物质安排在位置阵列中；

将多个电极安排在对应于体外物质的位置阵列中；将电极连接到一电极选择装置的输出；

将电极选择装置的输入连接到一电脉冲装置的输出；

将电脉冲加到电极选择装置；和

将所加脉冲以预定顺序通过电极选择装置路由到电极阵列中的所选电极，由此顺序利用位置阵列中的电场处理位置阵列中的体外物质。

在实施本明的体外方法的一种方式中，至少两个加到选择电极的连续脉冲在电场方向上反向。在实施本明的体外方法的另一种方式中，将电极安排成与小槽有关的成对电极。在实施本明的体外方法的一种方式中，将电极安排成与小槽有关的P个电极，其中P大于2。

当电极在测试板中安排成M个加样孔(小槽)的M对电极时，高电压脉冲/电场可以通过电极选择装置的计算机控制以任何顺序路由到任何这些小槽。可以将此应用于运行大量试验，例如，在灵敏度分析中，通过一次使用一个小槽可以大大缩短运行试验的时间。

当经受电脉冲处理的对象是一体外对象时，例如，是一小槽时(其中对细胞进行电操作)，加到电极的脉冲序列中的电场方向可以旋转，由此改善电操作。

当将电极安排成位于小槽相对侧的两个电极时(其中对生物细胞进行电操作)，加到电极的脉冲序列中的电场方向可以顺序反向，由此改善电操作。

根据本发明的另一个方面，提供了一种利用电脉冲处理物质的装置。该主题装置包括一灵敏脉冲序列发生器和一电连接到灵敏脉冲序列发生器的电极选择装置。所述电极选择装置包括一组电连接到所述灵敏脉冲序列发生器的输入连接器、一组至少两个输出连接器和一连接于所述输入连接器和所述输出连接器之间的可选择开关阵列。一组电极电连接到所述电极选择装置的所述至少两个输出连接器。最好，所述可选择开关是可编程的计算机控制开关。或者，所述可选择开关是手动操作开关。

上面的简要描述只是概括说明本发明的较重要的特征，以使下面对本发明的详细描述更好理解，从而能更好地欣赏到本发明对现有技术的贡献。当然，下文中将描述本发明的附加特征，并且这些附加特征是用于所附权利要求书中的主题。

鉴于上述，本发明的一个目的是提供一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供将一系列电脉冲应用到活细胞的过程，其中所述电脉冲产生的细胞死亡率降低了。

本发明的另一个目的是提供一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法给电脉冲设备的操作员提供使所加脉冲系列的操作员控制最大的过程。

本发明的另一个目的是提供一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供在一系列电脉冲中改变脉冲宽度的过程。

本发明的另一个目的是提供一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供在一系列电脉冲中改变脉冲电压的过程。

本发明的另一个目的是提供一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供控制所述过程的机器。

本发明的另一个目的是提供一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供维持电操作中形成的引入孔的脉冲方案。

本发明的另一个目的是提供一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供可以提供三个或更多个脉冲，以允许物质有更多时间进入电操作中的细胞的脉冲方案。

本发明的另一个目的是提供一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供提高细胞存活性和转染效率的电学途径。

本发明的另一个目的是提供一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供一种电操作方法，其中当实施电操作的脉冲中有大于40％的细胞存活时，可达到最大转化效率。

本发明的另一个目的是提供一种选择性地将电脉冲加到体内或体外的电极阵列的方法和装置。

本发明的另一个目的是提供一种旋转加到体内的组织或器官或体外的小槽的电场的方法和装置。

本发明的另一个目的是提供一种顺序施加加到体外小槽的电场和使其反向的方法和装置。

在作为本发明的一部分公开内容的权利要求书中指出了本发明的这些和其它目的以及表征本发明的各种新颖特征。为更好地理解本发明及其操作优点和应用其所达到的特定目的，还应当参照附图及其说明部分，在说明部分中例举了本发明的优选实施例。

在研究下面的对本发明的详细描述后，本发明将变得更好理解，本发明的上述目的及没有列出的其它优点可变得更加明白。这些描述是参照附图描述的，附图中：

图1是用于实施本发明的利用脉冲电场和可编程电极选择装置处理物质的方法的整个装置的方框图。

图2是部分以概略形式说明图1所示的接口控制组件的主要功能单元的方框图。

图2A-2O是与图2的接口控制组件有关的电路图。更具体地讲，图2A是微处理器状态(输入)的电路图。图2B是微处理器的控制(输出)的电路图。图2C是片选解码器的电路图。图2D是脉冲路由接口的电路图。图2E是与正弦波幅度有关的电路图。图2F是与正弦波频率有关的电路图。图2G是HV电源Vprog的电路图。图2H是脉冲电流监视器(P-IMON)的电路图。图2I是HV电源VMON的电路图。图2J是脉冲宽度计数器的电路图。图2K是脉冲输出驱动器的电路图。图2L是总线连接器的电路图。图2M是上电和复位的电路图。图2N是RS232的电路图。图2O是非易性静态RAM。

图3是说明图1所示高电压组件的主要组成的电路图。

图3A-3I是与图3所示高电压组件有关的电路图。更具体地讲，图3A是HV控制和PS VMON的电路图。图3B是充电电容器的电路图。图3C是HV开关的电路图。图3D是电源和脉冲故障停止的电路图。图3E是HV电源编程电压和放电控制的电路图。图3F是脉冲电压监视器(P-VMON)的电路图。图3G是脉冲控制监视器(P-IMON)的电路图。图3H是信号总线接口的电路图。图3I是故障监视电路的电路图。

图4是部分以概略方式说明图1所示可编程脉冲开关的主要组成的方框图。

图4A是图4所示三态开关中的一个开关的电气概略图。

图5说明非正弦脉冲，其中所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲幅度上互不相同。

图6说明非正弦脉冲，其中所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲宽度上互不相同。注意到图6还对应于下文中表I中的组A。

图7说明非正弦脉冲，其中所述至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔，与所述至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔不同。

图8说明装有与本发明的电极选择装置相连的两个电极的单小槽。

图9说明装有与本发明的电极选择装置相连的八个电极的单小槽，其中所述八个电极圆周分布于所述小槽周围不同的位置。

图10A-10F说明通过单小槽移动电场的第一个示范性方案，其中一个两极电场通过所述小槽旋转。

图11A-11F说明通过单小槽移动电场的第二个示范性方案，其中一个四极电场通过所述小槽旋转。

图12A-12C说明通过单小槽移动电场的第三个示范性方案，其中所述电场从一个四极电场到一个三极电场又到一个五极电场变化。

图13说明具有8个测试加样孔的测试板，其中每一个加样孔都具有一连接到电极选择装置上的相应端的电极。

本发明涉及将电脉冲加到活细胞，以用于电操作或电融合的过程。可通过硬件或软件编程方式使脉冲宽度和脉冲电压参数在脉冲与脉冲之间不同。施加变化电压和宽度的脉冲的一个重要目的是使电操作或电融合所需结果最大并对细胞的杀伤破坏最小。这个目的可以通过优化加到细胞的能量来达到，这是通过在初始高能量脉冲之后减小所加能量而进行的。

从电操作和电融合领域的传统理论中可知，必须超过阈值电压以获得细胞电操作或电融合。在实施该传统理论的过程中，通过施加电压在上述阈值之上的脉冲来应用单脉冲。而且，所述单脉冲概念在传统理论中扩展为包括在不计算由第一上述阈值脉冲引入的细胞膜耐受性的变化的情况下的一系列脉冲。在此所描述的主题发明的发明人已经意识到，由第一上述阈值脉冲引入的细胞膜耐受性中的变化在施加随后脉冲过程中应当考虑。

在传统理论中已为人接受的还有，脉冲能量与脉冲电压同样重要。在有限的参数中，降低脉冲宽度与降低脉冲电压同样有效。再次说明，传统的知识没有考虑当施加相等能量的随后脉冲时在第一脉冲之后所改变的耐受性。

通过增加能量可增加细胞中引入的孔直径。若超出取决于细胞类型和大小的临界能量水平，则形成通过无限扩张方式破坏细胞的孔。诸如细胞骨架等的细胞结构限制细胞孔的扩张。通过得到其大小接近但不大于造成无限孔扩张的孔大小的最大数目的孔，可以得到最大成孔。

应当理解本发明的边界和范围并不由理论根据范畴限定。然而，为更好理解本发明的应用和操作，简要的理论解释也是很有帮助的。更具体地讲，根据本发明人在此所提出的新理论范畴，如果所加的脉冲启动细胞中的孔形成，并且该脉冲之后跟随着更小能量的脉冲，则第二脉冲具有使孔以比全初始能量脉冲更慢的速度扩张的作用。能量连续下降的脉冲具有更慢的孔扩张作用，从而允许更大的孔扩张控制，以接近临界最大孔大小。

如上所述，有关电操作的传统理论并没有讨论随着连续扩张孔大小而发生的细胞膜耐受性下降。然而，本文的发明人已领会到，这种下降的耐受性可最终造成所加电压的较小影响，因为局部电压的下降与局部耐受性的下降成比例。这种情况最终将造成扩张孔大小倾向的附加弱化作用。在这方面，传统的所加脉冲串扩张孔的速度太快，以致不能利用孔扩张的这种自然弱化作用。本发明人已领会到，通过分段减小或连续减小脉冲串中的脉冲能量的应用而接近最大孔大小，可以允许最大限度地应用通过减小细胞膜耐受性而产生的孔大小扩张的自然弱化作用。

细胞的电操作是不均一的过程，这有几个原因。第一，细胞大体上为圆形，并且在细胞膜上产生的电动力与细胞膜相对于电流方向的角度成比例。最大电动力是在细胞膜与电流垂直的细胞位点上。第二，细胞膜的形状不规则。某些细胞具有突起，突起上的细胞膜部分与远离最靠近电极的位点的位点处的电流垂直。不规则性是细胞骨架对不均一电操作的影响。

不规则电操作造成了电操作的最大困难，因为只要有一个孔扩张到破裂，细胞就死亡。这就使得研究在孔初始形成之后轻微扩张孔的技术成为迫切需求。本主题发明正好满足了这种需求。

参照附图，图中示出了体现本发明的原理和概念的，用于实施利用脉冲电场处理物质的方法的装置。

用于实施利用脉冲电场处理物质的方法的该装置包括图1所示的美国马里兰州哥伦比亚市的Cyto脉冲技术公司(Cyto Pulse Sciences，Inc.，Columbia，Maryland，USA)的模型PA-4000电操作系统。设计该模型PA-4000电操作系统用于完成更大范围的电操作任务，其中许多任务是不能用现有的设备完成的。可由该模型PA-4000电操作系统进行的一些这种新任务包括：从一个脉冲到下一个脉冲改变脉冲宽度；从一个脉冲到下一个脉冲改变脉冲幅度；从一个脉冲到下一个脉冲改变脉冲间隔；产生高保真脉冲电场，与负载独立无关地有效；提供一脉冲幅度监视器，该脉冲幅度监视器可给出高电压脉冲的准确复制品；提供一脉冲电流监视器，该脉冲电流监视器可给出脉冲电流的准确复制品；提供一计算机产生的灵敏脉冲序列；和，提供每一个所用脉冲序列的自动数据记录和调用。结果，该模型PA-4000电操作系统提供一系列精细控制的、高保真脉冲电场，以对包括植物和哺乳动物细胞的许多物质进行电操作。

该模型PA-4000电操作系统包括三个主要组成部分：高电压灵敏脉冲序列发生器7(已知的Pulse Agile(TM)发生器)；组合的控制计算机和计算机接口4；和一小槽装置。该小槽装置以标准的0.4cm、0.2cm和0.1cm小槽进行操作。通用的接口对其它小槽容器和输送系统都可用。该模型PA-4000电操作系统说明包括在下面的说明表中。

             模型PA-4000电操作系统的说明表脉冲参数

             场强及对应的小槽

             0.4cm       0.2cm       0.1cm低压范围：(步进大小为1v)最小10v          25v/cm      50v/cm      100v/cm最大255v         637v/cm     1275v/cm    2550v/cm高压范围：(步进大小为5v)最小50v          125v/cm     250v/cm     500v/cm最大1100v        2750v/cm    5500v/cm    11000v/cm减小幅度所需时间(先前脉冲到下一脉冲)

             ＜50毫秒最大脉冲电流     120安培脉冲降落         ＜在100微秒的脉冲宽度为5％进入20欧姆(ohms)宽度             1微秒至1000微秒宽度步进大小     1微秒上升时间         ＜100纳秒间隔：最小             0.1秒(宽度变化的函数)最大             4,000秒间隔步进大小     1毫秒模式矩形波最大到99×9个脉冲灵敏脉冲序列

9组；组中的脉冲参数常数为每组1至100个脉冲前端板状态LED(发光二极管)小槽容器打开故障脉冲器准备好继续前进高压使能高压关闭为零(Off Zero)脉冲窗口(WINDOWS)操作器接口脉冲序列的建立用独立文件名自动保存序列文件自动数据记录(Logging)安全指标当小槽容器打开时脉冲不操作前端板序列停止按钮打开高压前检查负载阻抗(耐受性)检测到负载故障时高压脉冲关闭检测到接口故障时高压脉冲关闭

更具体地讲，关于灵敏脉冲序列器(已知的Pulse Agile(TM)发生器)，其概况示于图1。该图示出PA-4000系统构造有可编程脉冲开关。小槽容器可以连接于可编程脉冲开关的输出，或者，如果没有使用可编程脉冲开关，小槽容器可直接连接到脉冲高压输出11。脉冲电压和电流监视器端口10也可以使用。可将一示波器连接到这些端口，以观察脉冲信号的复制品。控制电缆9用于控制可编程脉冲开关。可编程脉冲开关具有N个输出13，可将这些输设定为三态中的一个状态，并且仅为一个状态，该三态为脉冲输出、脉冲返回及断接。

该系统包括三个柜，紧凑型PC1、PA-4000柜3和可编程脉冲开关柜12，PA-4000柜3包括控制微处理器4、接口控制组件5、高压电源7和低压8。

用户接口是装于紧凑型PC中的PulseAgile软件，并且在MS Window操作系统1控制下进行操作。操作器设定脉冲参数并控制过程开始和停止。在方案运行后，一数据记录报告出现于计算机屏幕上。紧凑型PC中的PulseAgile软件产生命令，并将命令通过标准的RS 232串行接口2发送到PA-4000柜4中的Z-80微处理器。Z-80微处理器解释该命令然后控制所有其它组件。此外，Z-80微处理器还监视电路状态，并将状态报告通过RS-232链路回送给PulseAgile操作器接口软件。串行接口的通信可以通过任何终端程序完成。然而，PC中的图形接口软件使接口更加用户友好。

接口控制组件包括微处理器、模拟到数字转换器、数字到模拟转换器、高/低控制和状态线、脉冲发生器和可编程脉冲开关接口。下面参见图2。

微处理器通过40个管脚连接器19、数字总线20连接到所有其它电路。该总线包括8个数据线、5个地址线和6个片选线。该数据总线根据片选和地址线的状态将信息传送到其它电路。一非易失性随机存取存储器(NVRAM)部分18也连接到数字总线20。NVRAM积累关于放电继电器打开和关闭了多少次的信息，以及在打开和关闭的电压为多少的信息。该信息在每一方案运行完毕时打印出来并用于失败分析。

数字到模拟转换器(DAC)22用于将微处理器8位字转换为实际电压，以设定电源。该DAC输出的电压范围为0至6伏。该0至6伏的电压从信号总线24上带到高压电源。高压电源7的0至6伏输入产生0至1100伏的高压输出。有两个备用的DAC连接到数字总线。

模拟到数字转换器(A/D)26用于将高压电源输出电压(监视器信号电平为0至5伏)转换为由微处理器使用的数字字。0至1100伏的高压电源输出造成0至5伏的监视器信号。

模拟到数字转换器(A/D)28用于将前脉冲电流监视器信号(监视器信号电平为0至2伏)转换为由微处理器使用的数字字。该前脉冲是由微处理器在用户开始该方案时产生的。在高电压接通之前，产生一9秒2伏脉冲。该脉冲通过负载(小槽等)传播。由该脉冲造成的电流转换为0至2伏电压信号。该电压与负载耐受性成比例。如果负载耐受性太低(离子集中等是太高)，可造成破坏成孔物质的过电流。如果电流太高，微处理器不接通高电压，并发出“负载电流太高”消息。

微处理器产生几条高/低控制信号线30。一条是由信号总线转移到高压组件6的HVON(高电压接通)。另一条是控制线，也由信号总线转移到高压组件6，并且是故障复位线。该线用于在故障发生时复位锁存器。

有几条状态线32由微处理器读取并用于控制。一条状态线33来自小槽容器。小槽容器的底座中有磁铁。如果手柄滑向打开位置露出小槽，则断开连接。如果该电路没有合上，也就是说手柄全推进，微处理器显示“小槽打开”消息，并且高压不能接通，或者，如果接通也被立即关闭。第二条状态线34连接在可编程脉冲开关中。当PPS并行控制电缆插入时，该线接地。然后，该低电压线由指示PPS可用的微处理器读取。第三条信号线34是故障线。如果在高压组件中检测到故障，该线电压变高。微处理器不断监视该线，如果其变高，显示“故障”消息，并且高压和脉冲发生器立即不能工作。

微处理器控制低压脉冲驱动电路36。该电路具有由微处理器编程的脉冲宽度发生器，随后是产生脉冲的触发器信号、然后设定下一脉冲宽度，随后是触发器信号，等，直到产生所有脉冲。

可编程脉冲开关接口40从微处理器接收安装命令，并通过特定的PPS并行接口9发送该安装命令。该接口包括在脉冲输出编程时变高的一组8条线，和在脉冲返回编程时变高的第二个一组8条线。如果开关I的连线不多于两条，则线保持为低。

高电压组件包括高压开关电路、充电电容器、电源电压监视器、脉冲电压和脉冲电流监视器、放电继电器和故障检测电路。下面参见图3。

当启动高电压时，继电器线圈44被激磁，并打开放电继电器45。然后将电源电压编程电压设在特定的值。然后，高压电源对充电电容器40进行充电。然后，由脉冲驱动信号60通过信号总线打开浮动高压开关48。低压信号通过一opto隔离器49连接到浮动高压开关48。当该高压开关打开时，电流从充电电容器流经负载54、脉冲电流监视器监视电阻52，再到系统接地端53，系统接地端53连接到电源接地端从而完成电流路径。电阻分压器42产生与充电电容器40上的高压成比例的低压信号。分度的电压57连接到信号总线并由微处理器周期性读取。

脉冲电流的分度方式由流经电流监视电阻52的脉冲电流产生。大约20伏的电压(100安)由放大器62缓冲。这是脉冲电流监视器端口。该电压然后由放大器85放大。其输出是脉冲电压监视器端口。

在PA-4000中，脉冲与脉冲的脉冲幅度可以变化，即，从1100伏(最大)到下一个可短到在125毫秒时间内产生的脉冲的50伏(最小)。这是由放电继电器电路44、45、46、47、56、57、58完成的。电压比较器56比较高压电源编程电压64和充电电容器57上的分度电压之间的电压。如果高压电源编程电压64大于或等于电容器分度电压，则比较器输出58为低。当输出58为低并且启动高压时，继电器线圈的相对侧66为高。继电器线圈44上的微分电压激励线圈44并打开继电器45。如果高压电源编程电压64低于充电电容器40上的分度电压，比较器58的输出变高。如果比较器58为高而继电器线圈44的另一侧66为高(高压接通)，则继电器线圈44上没有电压并合上继电器45。当继电器合上时，充电电容器40通过电阻47连接到系统接地端53。放电期间的总电流受到电阻47的限制，以防止继电器触点熔断。充电电容器40和电阻47之间的时间常数可在50毫秒内将电容器上的电压减少95％，其中50毫秒是最小脉冲间隔的一半。如果电源编程电压64所设定的电压造成超出电源7比如400伏，当此电压已达到时比较器输出58变高，并且继电器45打开，充电电容器40不再放电。于是，充电电容器40上的电压可快速设定到最小脉冲间隔内的最大和最小值之间的任何值。

高压组件中有三个故障检测电路，它们是高压开关60、83、81、76，放电继电器75、80、74、68，和负载84、82、78、79。这三个检测电路都连接到锁存电路72。如果三条线68、76、79中的任何一条线变低，则锁存输出35变高。如果锁存输出35变高，编程电压64以硬件方式通过继电器87断开。微处理器通常监视锁存器输出35，如果其变高，显示“故障”消息。该系统由PC复位，PC临时使复位线31变高。

继电器放电故障电路75、80、74、68监视放电继电器45的正确操作。如果继电器45失败，并且通过电阻47连续将电源7和充电电容40连接到接地端53，则可发生对内部电路的破坏。如果继电器45不失败而保持闭合，流经监视电阻46的电流将产生一电压，该电压由RC组合51、52积分，直到电压75大于比较器参考电压80。如果高压电源7设定到最大电压，此过程仅需要几毫秒。

高压开关故障电路60、83、81、76监视高压开关的正确操作。该电路保证在高压开关48不能连续关闭时在负载54上不出现高电压。如果发生了高压开关48不能连续关闭，并且高压电源7接通，则在阻性分度脉冲压器50上出现一电压。该电压83与存在的驱动脉冲相比较。没有驱动脉冲60时，如果电压83在1秒内大于10伏，则比较器81的输出变低。这个过程非常快，并且电源不打开。

负载故障电路84、82、78、79监视通过负载54的电流。如果负载电流过大，而高压脉冲接通，则脉冲是由于小槽等的故障而接通，小槽中的物质将蒸发或内部电路被破坏。如果电流变得过大，监视电阻52上的电压增加到阈值小沟(vale)82之上。当该参考电压过大时，比较器79的输出在不到1秒的时间内变低。

高压电源7是一商用部件，它提供1100伏、110毫安(ma)的电源，并以0到6伏信号编程。低压电源8对所有控制电路提供电压，这些电压是+5伏、+12伏、-12伏。低压电源8也是一个商用单元。

可编程脉冲开关12由高压电缆11和并行控制电缆连接到PA-4000。图4示出可编程脉冲开关12的概况。可编程脉冲开关中可以有N个开关93，这些开关的操作都相同。高压脉冲输出90和脉冲返因91是通过同轴电缆从PA-4000柜5提供的。两条控制线95中的一条是用于选择脉冲输出，而另一条用于选择脉冲返回。如果脉冲输出控制线为高，则脉冲输出连接到电极94，如果脉冲返回控制线为高，则脉冲返回连接到电极94。如果两条线都不为高，则没有任何信号将连接到电极94。如果两条线都为高，则没有任何信号连接到电极94。

三态开关的详细电路图示于图4A。每一个开关具有：两个来自微处理器的输入，它们是脉冲返回选择161和脉冲输出选择162；两个来自高电压电路的输入，它们是高电压脉冲164和高电压脉冲返回163；和一个输出端口167，该输出端口根据来自微处理器的命令连接到高电压脉冲、高电压返回或不连接。还有两个连接到发光二极管(LED)以指示开关状态的指示器166(脉冲)、165(返回)。

来自灵敏脉冲发生器的高电压脉冲和高电压返回连接到所有N个开关。

有两条来自微处理器用于每一个开关的控制线，用于选择脉冲162或选择返回161。如果选择脉冲控制线变高，则两个或非(NOR)门U1A和U1B的输入变高。然后U1A的管脚2变高，而管脚2必须为低从而使管脚3(输出)变高。然后，第二个或非门U1B的管脚4和管脚5变高，从而使管脚6(输出)变低。如果管脚6变低，则非反相的集电极开路驱动器U7C的管脚6为低。当该管脚6为低时，继电器K2的管脚16为低，从而激励继电器线圈并闭合继电器K2。当该继电器闭合时，高压脉冲输入连到输出电极。第二非反相驱动器连接到LED166，该LED在继电器被激励时点亮。

如果微处理器选择返回，发生同样的过程。在那种情况下，继电器K1闭合，将高压脉冲返回连接到输出端口167。

如果微处理器偶然将高压脉冲和高压脉冲返回两条线都设定为高，则或非门U1A的输出变低，非并两个继电器都不被激磁。这是防止两个继电器可能同时被激磁从而造成短路的安全措施。

来自微处理器的两条线有四种可能状态：

脉冲选择线高-脉冲高压连接到输出端口；

脉冲返回选择线高-脉冲返回连接到输出端口；

两条线都不高-脉冲或脉冲返回都不连接到输出端口；

两条线都高-脉冲或脉冲返回都不连接到输出端口。

总之，所有N个开关都通过微处理器独立操作，并在开关的单个输出端口出现高压脉冲、高压返回或不连接中的一种状态。

图5说明非正弦脉冲，其中至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲幅度上互不相同。

图6说明非正弦脉冲，其中至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲宽度上互不相同。注意到图6还对应于下文中表I中的组A。

图7说明非正弦脉冲，其中至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔，与所述至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔不同。

注意到下面的术语基本上是同义的：脉冲选择器装置；电极选择装置110；和可编程脉冲开关柜12。

电极选择装置110被制造并作为马里兰州哥伦比亚市的Cyto脉冲技术公司的产品PA-101销售，该公司还制造和销售本文中描述的模型PA-4000电操作系统。PA-101可外部安装并可与高压灵敏脉冲序列发生器分开购买。PA-101包括一组8个计算机控制的HV开关，这些开关可将任何电极连接到高压脉冲、参考地端、或使电极“悬空”(与任何连接断开)。电极选择装置由如下所述的控制PA-4000的同样的PA-4000控制软件控制。DB-25控制电缆将PA-101连接到PA-4000。

如上所述，模型PA-4000 PulseAgile(TM)电操作系统由马里兰州哥伦比亚市的Cyto脉冲技术公司制造和销售。模型PA-4000系统运行所有的标准方波和许多CD协议。模型PA-4000系统也运行改进的PulseAgile(TM)协议。模型PA-4000 PulseAgile(TM)电操作器完成大范围的电操作任务，其中许多任务是用现有技术的设备无法完成的。该系统允许研究者使用标准协议，并有改变协议中脉冲参数的增强的灵活性。还有更多工具用于优化。该系统提供高保真脉冲电场的很精细控制，以对包括植物细胞、哺乳动物细胞和水溶液中的细菌细胞和组织的许多物质进行电操作。

参见图8，该图示出装有两个电极113、114的单个小槽112。一个电极113连接到电极选择装置110的1号端。第二电极114连接到电极选择装置110的2号端。电极选择装置110可被编程，以将加到两个电极的脉冲的极性顺序反向，从而使每个极性反向的小槽113上的电场方向反向。极性反向可对每一连续脉冲进行，或者，对预定脉冲形状进行。

图9说明装有与八个电极的单小槽133，所述八个电极圆周分布于所述小槽周围不同的位置。第121-128号电极分别连接到电极选择装置的第1-8号端。正/负极可首先分别加到第121和125号电极。然后，正/负极可分别加到第122和126号电极。然后，正/负极可分别加到第123和127号电极。然后，正/负极可分别加到第124和128号电极。

在这点上，可应用极性反向。也就是说，正/负极可分别加到第125和121号电极。然后，正/负极可分别加到第126和122号电极。然后，正/负极可分别加到第127和123号电极。然后，正/负极可分别加到第128和124号电极。

从上述可以清楚看到，将脉冲加到第121-128号电极的方式，使得电场旋转并通过小槽133。

这种正/负极应用的循环方案可重复所需的次数。

图9也可认为是本发明的另一个应用范例。这种大循环可以是来自动物或植物的体内器官的代表。第121-128号电极可以置于三维器官周围。每个电极连接到电极选择装置110上的相应端。电极选择装置110连接到高压灵敏脉冲序列发生器2。用这种方式，高电压、非正弦灵敏脉冲可在高压灵敏脉冲序列发生器2中产生，并通过电极选择装置110路由到选择的第121-128号电极。实际上，来自高压灵敏脉冲序列发生器2的任何所需灵敏脉冲序列可以以任何所需编程顺序路由到任何所需的第121-128号电极的子集。

图10A-10F说明通过单小槽移动电场的第一个示范性方案，其中一个两极电场通过所述小槽旋转。

图11A-11F说明通过单小槽移动电场的第二个示范性方案，其中一个四极电场通过所述小槽旋转。

图12A-12C说明通过单小槽移动电场的第三个示范性方案，其中所述电场从一个四极电场到一个三极电场又到一个五极电场变化。

从上面几个例子可以看出，通过改变电极选择装置110的排列和组合，结合由灵敏脉冲序列发生器提供给电极选择装置110的脉冲，可通过小槽应用大量电场分布方案。

更具体地讲，利用本发明的电极选择装置110，为允许其在体内或体外电场分布中有更大灵活性，至少一个所选择电极用作脉冲接收电极，并且至少一个所选择电极用作脉冲返回电极。而且，在任何电极组合中的任何电极，都必须用作脉冲接收电极、脉冲返回电极或非脉冲发送电极中的一个。

总的来讲，N个所加脉冲可顺序路由到N电极个组。而且，N个电极组中的连续电极组可由不同的单独电极组成。或者，N个电极组中的连续电极组可由相同的单独电极组成。

在图13中，示出具有1-8号测试孔的测试板135。每一个测试孔具有连接到电极选择装置110上的相应的1-8号端的相应的第一电极141-148。每一个测试孔也有连接到电极选择装置110上的9号返回端的相应第二电极151-158。可以以与其它测试孔不同或相同的所需方式供给每一个测试孔脉冲。

回到应用上述装置进行本发明的电操作方法的一个方面所得到的结果，本文所列的表I是试验结果列表，这些试验比较了应用本发明的原理和应用现有技术的原理进行电操作。在实施表I的列表试验的过程中，考虑了与下列主题有关的特定细节：所用细胞；电操作条件；确定成孔细胞比例；和确定电操作中存活的细胞。细节与下列主题有关。

细胞.CHO-K1细胞(ATCC)完全保持在媒质中(CO₂独立媒质(Gibco)加10％热惰性致命腓肠血清，2mM的L-谷酰胺，100单位/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素和0.25μg/ml的两性霉素B)。细胞生长在平坦底端T-150器皿中。对于悬浊液培养(suspension cultures)，用细胞刮削器将细胞从T-150器皿中刮削下来。将细胞悬浊液加到100ml的旋转体器皿中。最终媒质加到总容积为100ml。旋转体器皿以80rpm的搅动速度保持在37℃。旋转体培养物是通过除去90％的细胞悬浊液并将该容积以最终媒质替代而提供。对于电操作，将50ml的悬浊液从对数相(log phase)旋转体除去。对细胞采用血细胞计进行手动计数。对细胞以400xg离心分离10分钟。对细胞以每毫升500万的浓度再次悬浮于无血清媒质(无添加物的CO₂独立媒质)中。

电操作.250μl的细胞悬浊溶液加到带有2mm电极间隙的消过毒的、易处理的电操作小槽(Bio-Rad)中。如果指示，50μl的1％的Trypan蓝溶液(Sigma)或者含有10μg的质粒DNA的溶液加到小槽。小槽加到国产的小槽容器中。电操作的脉冲器和计算机控制如本发明中所描述的。接通脉冲器并设定电压。将脉冲串编程到附加的顶搭接(attached lap top)计算机，并且该脉冲串由计算机控制执行。

确定成孔细胞比例.50μl的1％的Trypan蓝染色溶液(2.4gm的44％的Trypan蓝染色溶液加到100ml的蒸馏水中)加到电操作小槽中的250ml细胞悬浊液中。在施加高压脉冲之前，取10μl的样本来确定在电操作之前发生染色的细胞百分比(死细胞)。将脉冲如所编程序加到细胞。在电操作之后，取10μl的样本来确定电操作中的细胞百分比。细胞由血细胞计手动计数。蓝细胞计数为正，而无色细胞计数为负。通过从正数和负数中减去底数来计算实际的电操作。

确定电操作中存活的细胞.通过确定能够附着到组织培养物板上的细胞百分比来确定电操作中存活的细胞。准备一24孔板，以便通过将1ml的最终媒质加到每一孔来定量进行。将细胞根据所需加到电操作小槽。从小槽中除去10μl(在某些试验中为20μl的样本并放入24孔板的一个孔中。摇动细胞以将其均匀洒到板上。在施加脉冲后，从小槽中取出等量的样本并将其放入27孔板的不同的相邻孔中。细胞在37℃培养一夜。第二天，将细胞在PBS中清洗，并固定于缓冲的福尔马林中1小时。通过对每个孔加入400μl的染液而对细胞以蒸馏水中1％的结晶紫(Crystal Violet)沾染。对细胞孵育5分钟，然后以蒸馏水清洗，直到不能再从板上洗涤出染质。对细胞进行空气干噪，直到辩认出板(reading of the plate)。将1毫升70％的酒精加到每一个孔并孵育5分钟。用酒精blank在592nM对酒精染液混合物的光密度进行测量。在电操作前由OD样本分度电操作之后，计算活细胞的百分比，作为OD样本。

表I

比较成孔百分比和成孔存活细胞百分比。根据本发明，在具有10μs脉冲宽度和400伏脉冲幅度的多组脉冲之前，是40μs脉冲加20μs(对于组A)或只有20μs(对于组B)的单脉冲的长持续时间。现有技术的脉冲组由组C提供。

10ms脉冲数1，2      组A³

              ％成孔   ％存活

0             25.51    81.98

1             55.62    87.91

2             55.62    86.94

4             81.51    85.84

8             88.29    95.14

16            96.31    76.99

              组B⁴

             ％成孔   ％存活

0             16.45    90.97

1             15.72    99.45

2             12.11    92.11

4             29.88    88.46

8             85.08    94.34

16         98       80.01

           组C⁵

           (现有技术)

0          ND       ND

1          5.25     94.05

2          12.03    87.75

4          28.48    77.2

8          70.52    77.36

16         83.96    70.59

1.所有脉冲电压都是400伏。

2.脉冲间隔是0.1秒。

3.组A.根据本发明，10μs的脉冲串之前是，40μs的单脉冲和20μs的单脉冲。

4.组B.根据本发明，10μs的脉冲串之前是20μs的单脉冲。

5.组C.根据现有技术，在没有前脉冲的情况下发送10μs的脉冲串。

在解释表I所列的试验结果过程中，回忆代表现有技术脉冲串的组C数据，该脉冲串的脉冲的固定脉冲幅度为400伏，固定脉冲间隔为0.1秒，而固定脉冲宽度为10微秒。

对于组A的数据，除“0”附加微秒脉冲之外，都表示根据本发明的脉冲串，其中的脉冲具有三种不同的脉冲宽度。对于组A的脉冲，脉冲具有固定脉冲幅度和固定脉冲间隔。

对于组B的数据，除“0”附加微秒脉冲之外，都表示根据本发明的脉冲串，其中的脉冲具有两种不同的脉冲宽度。对于组B的脉冲，脉冲具有固定脉冲幅度和固定脉冲间隔。

注意到，通常来讲，脉冲数越大，成孔细胞的百分比就越大。这对于现有技术脉冲串(组C)和本发明的两种脉冲串(组A和组B)都正确。现有技术脉冲串的最大成孔百分比是83.96％。然而，与此形成明显对比的是，本发明的组A脉冲串的最大成孔百分比是96.31％。本发明的组B脉冲串的最大成孔百分比是98％。很明显，根据本发明，成孔百分比超过了现有技术的成孔百分比。

对于存活性，组C的平均存活百分比是81.39％。对于组A的平均存活百分比，除“0”附加10微秒脉冲数据之外，是86.56％。对于组B的平均存活百分比，除“0”附加10微秒脉冲数据之外，是90.87％。很明显，组A和组B中的本发明的方法所拥有的数据的平均存活百分比，超过了组C中现有技术数据的平均存活百分比。

为从表I中所示的数据中获得进一步的含义，提出了表II。表II与这样的事实有关，即，成功的电操作依赖于成孔细胞的数目和保持存活细胞的数目。在表II中，对于每一组数据，通过将成孔百分比与其相应的存活百分比相乘，得到了最后乘积。这样的乘积提供表示成孔细胞数目和在电操作过程中存活的细胞数目的复合数。这样的复合数更能代表成孔百分比或存活百分比单独的电操作效率。

表II

对于表I中组A、B和C中的每一个数据，分别将成孔百分比与存活百分比相乘。所得乘积给出考虑到成孔程度和细胞存活性的总的电操作效率的复合数。

10μs脉冲数1，2组A      组B         组C

                (％成孔   (％成孔     (％成孔

                ×％存活) ×％存活)   ×％存活)

0                 2091      1493         --

1                 3218      1563         494

2                 4836      1115         1056

4                 6997      2463         2199

8                 8400      8026         5455

16                7415      7841         5927

很明显，每一个组A和组B的乘积(本发明)都超过了组C的乘积。那么，很明显，考虑到成孔程度和细胞存活性，利用本发明脉冲串的总的电操作效率大于利用现有技术的脉冲串的效率。

从上述可以明显看出，本发明通过提供利用脉冲电场处理物质的方法达到了其所有目的，所述方法提供将一系列电脉冲应用到活细胞的过程，其中所述电脉冲产生的细胞死亡率下降。根据本发明，利用脉冲电场处理物质的方法给电脉冲设备的操作员提供所加脉冲系列的最大操作员控制。根据本发明，提供了一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供在一系列电脉冲中改变脉冲宽度的过程。根据本发明，提供了一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供在一系列电脉冲中改变脉冲电压的过程。根据本发明，提供了一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供控制所述过程的机器。根据本发明，提供了一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供维持电操作中形成的引入孔的脉冲方案。根据本发明，提供了一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供可以提供三个或更多个脉冲，以允许物质有更多时间进入电操作中的细胞的脉冲方案。根据本发明，提供了一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供提高细胞存活性和转染效率的电学途径。根据本发明，提供了一种利用脉冲电场处理物质的方法，所述方法提供一种电操作方法，其中当实施电操作的脉冲中有大于40％的细胞存活时，可达到最大转化效率。

虽然上面已结合附图描述了本发明，并结合被认为是本发明的最实用和最优选的实施例具体、详细、充分描述了本发明，但对本领域技术人员来讲，可以在不脱离本发明在此提出的原理和概念的情况下对本发明进行许多修改。因此，本发明的正确范围应当仅由对所附权利要求的最宽解释来确定，以便包括所有这些修改和等效物。

Claims (25)

1、一种利用电场和附加的处理剂处理物质的方法，包括下列步骤：

将多个电极以阵列形式排列在要处理物质的周围位置中，

将所述电极连接到一电极选择装置的输出，

将所述电极选择装置的输入连接到一电脉冲装置的输出，

以所述附加的处理剂接触所述物质，

将电脉冲加到所述电极选择装置，其中，加到所述电极选择装置的电脉冲是以至少三个具有等于或大于100V/cm的场强的非正弦电脉冲的一序列  加到所述物质，其中所述至少三个非正弦电脉冲具有一个、两个或三个下列特征：(1)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲幅度上相互不同；(2)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲宽度上相互不同；和(3)所述至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔，与所述至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔不同，和

将所加脉冲以预定次序通过所述电极选择装置路由到电极阵列中所选择的电极，由此，对所述物质以所述附加的处理剂和顺序改变方向的电场进行处理。

2、如权利要求1所述的方法，其中至少一个所述电极是脉冲接收电极，和其中至少一个所述电极是脉冲返回电极。

3、如权利要求2所述的方法，其中任何电极组合中的任何电极都用作脉冲接收电极、脉冲返回电极、或非脉冲传送电极中的一个。

4、如权利要求1所述的方法，其中所述至少三个非正弦电脉冲的序列是一灵敏脉冲序列。

5、如权利要求4所述的方法，其中所述电脉冲的场强等于或大于200V/cm。

6、如权利要求1所述的方法，其中，选择数目的电极同时接收所加脉冲。

7、如权利要求1所述的方法，其中，N个所加脉冲顺序路由到N个电极组。

8、如权利要求7所述的方法，其中所述N个电极组中的连续电极组包括不同的单个电极。

9、如权利要求7所述的方法，其中所述N个电极组甲的连续电极组包括相同的单个电极。

10、如权利要求1所述的方法，其中，N个脉冲形式适合于顺序路由到N个选择的电极组。

11、一种用电场处理体外含膜物质的方法，包括下列步骤：

将所述体外物质安排在位置阵列中，

将多个电极安排在对应于所述体外物质位置阵列的位置阵列中，

将所述电极连接到一电极选择装置的输出，

将所述电极选择装置的输入连接到一电脉冲装置的输出，

将电脉冲加到所述电极选择装置，其中加到所述电极选择装置的电脉冲是以至少三个具有等于或大于100V/cm的场强的非正弦电脉冲的一序列加到所述物质，其中所述至少三个非正弦电脉冲具有一个、两个或三个下列特征：(1)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲幅度上相互不同；(2)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲宽度上相互不同；和(3)所述至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔，与所述至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔，与所述至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔不同，和

将所加脉冲以预定顺序通过所述电极选择装置路由到所述电极阵列中的所选电极，由此顺序利用位置阵列中的电场处理位置阵列中的体外物质。

12、如权利要求11所述的方法，其中至少一个所述电极用作脉冲接收电极，和其中至少一个所述电极用作脉冲返回电极。

13、如权利要求12所述的方法，其中任何电极组合中的任何电极都用作脉冲接收电极、脉冲返回电极、或非脉冲传送电极中的一个。

14、如权利要求11所述的方法，其中，N个所加脉冲顺序路由到N个电极组。

15、如权利要求14所述的方法，其中所述N个电极组中的连续电极组包括不同的单个电极。

16、如权利要求14所述的方法，其中所述N个电极组中的连续电极组包括相同的单个电极。

17、如权利要求11所述的方法，其中，加到一选择电极的至少两个连续脉冲在电场方向上反向。

18、如权利要求11所述的方法，其中所述电极排列为与一测试板中的M个孔有关的M对电极。

19、如权利要求11所述的方法，其中所述电极排列为与一小槽有关的一对电极。

20、如权利要求11所述的方法，其中所述电极排列为与一小槽有关的P个电极，其中P大于2。

21、一种以体内附加处理剂处理体内组织的方法，包括下列步骤：

将多个电极以阵列形式排列在要处理体内物质的周围位置中，

将所述电极连接到一电极选择装置的输出，

将所述电极选择装置的输入连接到一电脉冲装置的输出，

将一处理剂加到所述要处理的体内物质，

将电脉冲加到所述电极选择装置，其中，加到所述电极选择装置的电脉冲是以至少三个具有等于或大于100V/cm的场强的非正弦电脉冲的一序列，加到所述物质，其中所述至少三个非正弦电脉冲具有一个、两个或三个下列特征：(1)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲幅度上相互不同；(2)所述至少三个脉冲中的至少两个脉冲在脉冲宽度上相互不同；和(3)所述至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔，与所述至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔不同，和

通过所述电极选择装置中的可编程计算机控制的开关，将所加脉冲以预定次序通过所述电极选择装置路由到电极阵列中所选择的电极，由此，对所述物质以所述附加的处理剂和顺序改变方向的电场进行处理。

22、一种以电脉冲处理物质的装置，包括：

一灵敏脉冲序列发生器，

一电连接到所述灵敏脉冲序列发生器的电极选择装置，其中所述电极选择装置包括一组电连接到所述灵敏脉冲序列发生器的输入连接器、一组至少两个输出连接器和一连接于所述输入连接器和所述输出连接器之间的可选择开关阵列，和

一组电连接到所述电极选择装置的至少两个所述输出连接器的电极。

23、如权利要求22所述的装置，其中所述可选择开关是手动操作开关。

24、如权利要求22所述的装置，其中所述可选择开关是计算机控制开关。

25、如权利要求22所述的装置，其中所述可选择开关是可编程的计算机控制开关。

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